ایک بائیویلنٹ لائیو ایٹینیویٹڈ انفلوئنزا وائرس ویکسین سوائن میں بڑھے ہوئے H1N2 اور H3N2 کلینکل الگ تھلگوں کے خلاف حفاظت کرتی ہے حصہ 1

خلاصہ:

انفلوئنزا اے وائرس (IAVs) بہت سے ممالیہ جانوروں کے لیے سانس کی انتہائی متعدی بیماری کا سبب بن سکتے ہیں۔ خنزیروں میں، IAVs حساس آبادیوں میں زیادہ بیماری اور کم اموات کی بیماری کا باعث بنتے ہیں جو اہم مالی اور پیداواری اثرات مرتب کر سکتے ہیں۔ وہ اتپریورتنوں اور جین کی دوبارہ ترتیب کے مواقع بھی پیش کر سکتے ہیں، وبائی امراض کے ساتھ انفلوئنزا کے تناؤ پیدا کر سکتے ہیں۔

انفلوئنزا اے ایک انتہائی متعدی سانس کی بیماری ہے جو عالمی صحت عامہ کے لیے ایک سنگین خطرہ ہے۔ استثنیٰ سے متعلق مطالعات سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ ایک مضبوط مدافعتی نظام لوگوں کو اس وائرس سے لڑنے کے قابل بناتا ہے جب وہ فلو وائرس سے متاثر ہوتے ہیں، اس طرح بیماری کے واقعات اور شدت کو کم کرتے ہیں۔

قوت مدافعت ہمارے مدافعتی نظام کی بیماری سے لڑنے کی صلاحیت ہے۔ انسانی مدافعتی نظام دو حصوں پر مشتمل ہے: پیدائشی قوت مدافعت اور حاصل شدہ قوت مدافعت۔ پیدائشی مدافعتی نظام وہ ہے جس کے ساتھ ہم پیدا ہوئے ہیں اور اس میں بیماری کے خلاف دفاع کرنے کی پورے جسم کی صلاحیت ہے۔ حاصل شدہ مدافعتی نظام وہ قوت مدافعت ہے جو ہماری زندگیوں میں بتدریج حاصل ہوتی ہے، جس میں بنیادی طور پر مدافعتی خلیات اور اینٹی باڈیز پر مشتمل مزاحیہ استثنیٰ، اور T خلیات اور مدافعتی خلیوں پر مشتمل سیلولر استثنیٰ شامل ہے۔

مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ صحت مند طرز زندگی اور خوراک کو برقرار رکھنے، ورزش کرنے اور کافی وٹامنز اور دیگر غذائی اجزاء حاصل کرنے سے آپ اپنے مدافعتی نظام کو بہتر بنا سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، یہ ویکسین انفلوئنزا وائرس کے خلاف جسم کی قوت مدافعت کو بھی بڑھا سکتی ہے اور بیماری کے واقعات کو کم کر سکتی ہے۔

انفلوئنزا اے وائرس انسانوں اور جانوروں میں مشترک ہوتے ہیں، اس لیے وہ اکثر بدل جاتے ہیں۔ خاص طور پر خزاں اور سردیوں میں لوگوں کی قوت مدافعت کم ہوتی ہے اور انفلوئنزا اے وائرس اس موقع سے فائدہ اٹھا کر آسانی سے حملہ کر سکتا ہے۔ لیکن اگر ہم صحت مند طرز زندگی کو فروغ دینے، ورزش کو مضبوط بنانے، اور فعال طور پر ویکسین لگانے پر اصرار کرتے ہیں، تو ہم اپنی قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتے ہیں اور انفلوئنزا اے وائرس کے حملے سے بہتر طور پر نمٹ سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، اگر آپ کو معلوم ہوتا ہے کہ آپ میں فلو جیسی علامات ہیں، تو آپ کو طبی علاج حاصل کرنا چاہیے اور بروقت علاج کروانا چاہیے، تاکہ آپ کا جسم جلد صحت یاب ہو سکے۔

مختصر یہ کہ انفلوئنزا اے وائرس اور قوت مدافعت کے درمیان باہمی اثر و رسوخ ہے۔ کسی کی قوت مدافعت کو مضبوط بنانا، صحت مند طرز زندگی اور خوراک کو برقرار رکھنا، اور خاص طور پر ویکسینیشن کو قبول کرنا انفلوئنزا اے وائرس کو روکنے اور اس سے لڑنے کے لیے تمام موثر اقدامات ہیں۔ آئیے مثبت بنیں اور انفلوئنزا اے وائرس سے بچاؤ کے حوالے سے ایک صحت مند طرز زندگی کی طرف بڑھیں! یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں قوت مدافعت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے۔ Cistanche نمایاں طور پر قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتا ہے، کیونکہ گوشت کی راکھ میں حیاتیاتی طور پر فعال اجزاء کی ایک قسم ہوتی ہے، جیسے کہ پولی سیکرائیڈ، دو مشروم، ہوانگ لی وغیرہ۔ یہ اجزاء مختلف مدافعتی نظام کو متحرک کر سکتے ہیں۔ سیل جیسے خلیات، ان کی مدافعتی سرگرمی میں اضافہ.

cistanche tubulosa فوائد پر کلک کریں۔

لہذا، خنزیروں میں انفلوئنزا کے انفیکشن کو روکنا اور اس پر قابو پانا بہت ضروری ہے، اور ایسا کرنے کا سب سے بڑا طریقہ ویکسینیشن ہے۔ IAV کی ذیلی قسمیں جو پوری دنیا میں سوائن میں سب سے زیادہ پائی جاتی ہیں وہ ہیں H1N1، H1N2، اور H3N2؛ تاہم، ان وائرسوں کا جینیاتی تنوع خطے کے لحاظ سے بہت مختلف ہو سکتا ہے۔ ہم نے اس سے قبل دو کینیڈین سوائن انفلوئنزا اے وائرس (swIAV) الگ تھلگ، A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] اور A/Swine/Saskatchewan/SD0191/SD016 (H1N2) کا استعمال کرتے ہوئے ایلسٹیز پر منحصر بائیویلنٹ لائیو اٹینیویٹڈ ویکسین تیار کی تھی۔ ) [SD69]، جو ہم جنس تناؤ سے محفوظ رکھتا ہے۔

اس مطالعے میں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ یہ ویکسین خنزیروں کے تحفظ کو زیادہ موجودہ، بہتے ہوئے غیر ہم جنس H1N2 اور H3N2 تناؤ، A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] اور A/Swine/AB/SD0435/ تک پھیلاتی ہے۔ 2019 (H3N2) [SD435]۔

ویکسین نے سیرم اور پھیپھڑوں میں ایک مضبوط مدافعتی ردعمل پیدا کیا اور وائرل نقل کے ساتھ ساتھ ان تناؤ سے وابستہ پھیپھڑوں کی پیتھالوجی کو بھی کم کیا۔ لہذا، یہ دو طرفہ ویکسین ایک مضبوط امیدوار ہے جو شمالی امریکہ میں سوائن انفلوئنزا ویکسین مارکیٹ کے لیے فائدہ مند ثابت ہوگی۔

مطلوبہ الفاظ:

انفلوئنزا؛ ویکسین سوائن

1. تعارف

انفلوئنزا اے وائرس (IAV) سوائن سمیت کئی پرجاتیوں کے لیے ایک اہم روگجن ہیں۔ انفیکشن خنزیروں میں سانس کی انتہائی متعدی بیماری کا سبب بن سکتا ہے [1]۔ سوائن میں انفلوئنزا انفیکشن بہت کم اموات کے ساتھ ہلکی بیماری کا باعث بنتا ہے، لیکن ریوڑ میں بیماری کی شرح 100 فیصد تک پہنچ سکتی ہے [2]۔ اس کے نتیجے میں متاثرہ خنزیروں میں وزن میں کمی کی وجہ سے کاشتکاروں کے لیے معاشی نقصان ہوتا ہے، پیداوار کی کارکردگی میں کمی، اور بیجوں میں تولیدی ناکامی [3,4]۔

انفلوئنزا کا دیگر سوائن کے سانس کے پیتھوجینز کے ساتھ مشترکہ انفیکشن بھی پورسائن سانس کی بیماری کے کمپلیکس کی نشوونما کا باعث بن سکتا ہے، اور اس کے نتیجے میں اموات اور معاشی نقصانات میں اضافہ ہوتا ہے [5]۔
مزید برآں، خنزیر ایویئن اور انسانی IAVs کے ساتھ ساتھ سوائن IAV (swIAV) کے انفیکشن کے لیے حساس ہوتے ہیں کیونکہ ان کی سانس کی نالی میں ایویئن اور ممالین سیالک ایسڈ گیلیکٹوز کے ربط کی موجودگی [6]۔ یہ ایک سے زیادہ تناؤ سے متاثر ہونے پر دوبارہ ترتیب دینا ممکن بناتا ہے ، جو وبائی امراض کے ساتھ نئے تناؤ کی پیداوار کا باعث بن سکتا ہے [4,7]۔

چونکہ انسانوں میں سانس کی پوری نالی میں سیالک ایسڈ گیلیکٹوز کے ربط کی تقسیم اسی طرح ہوتی ہے، اس لیے انسانوں اور سوائن کے درمیان دو طرفہ اسپل اوور واقعات ممکن ہیں۔ اس کا پہلا معلوم واقعہ 1918 کے انفلوئنزا وبائی مرض کے دوران ہوا جب IAV کو انسانوں سے سوائن کے لیے متعارف کرایا گیا تھا [8]۔ یہ سلسلہ 1990 کی دہائی تک خنزیر کی آبادی میں مستحکم رہا، جب انسانی اور ایویئن H3N2 تناؤ نے H1N1، H1N2، اور H3N2 ذیلی قسموں [8,9] کے ڈبل اور ٹرپل ریسورٹنٹ تناؤ پیدا کرنے کے لیے گردش کرنے والے H1N1 نسب کے ساتھ دوبارہ ترتیب دیا۔

نئے تیار کردہ ٹرپل ریسورٹنٹ جین (TRIG) کیسٹ نے شمالی امریکہ کے سوائن میں تیزی سے IAV تنوع کی مدت شروع کی [10]۔ یہ TRIG کیسٹ بہت مستحکم ہے اور مختلف HA اور NA کے مجموعوں کے متبادل کی سہولت فراہم کرتی ہے [5]۔ 2005 کے بعد سے، اس اندرونی TRIG کیسٹ کے ساتھ بہت سے تناؤ انسانی HA اور NA جینز کے ساتھ جوڑے ہوئے ہیں جو امریکہ میں سوائن کے ریوڑ میں پھیلے ہوئے ہیں [9]۔

اگلا قابل ذکر سپل اوور واقعہ 2009 میں پیش آیا، جب سوائن سے تعلق رکھنے والا H1N1 تناؤ (H1N1pdm2009) انسانوں میں پھیل گیا، جس کے نتیجے میں 2009 میں انفلوئنزا وبائی بیماری پیدا ہوئی [11]۔ انسانی وبائی بیماری H1N1 IAV (H1pdm) کی انسان سے سوائن ٹرانسمیشن (ریورس زونوسس) شمالی امریکہ کے سوائن میں متعدد بار ریکارڈ کی گئی تھی، جس کی وجہ سے ایک نیا نسب اور نئے reassortant swIAVs [8,10,12] کا قیام عمل میں آیا۔

مجموعی طور پر، شمالی امریکی سوائن میں سات اینٹی جینی طور پر الگ H1 کلیڈس اور H3 وائرس کے چار الگ کلیڈز ریکارڈ کیے گئے ہیں [5]۔ حال ہی میں، ایشیا میں ایک swIAV نگرانی کے پروگرام نے H1pdm اور ٹرپل ریزورٹنٹ اندرونی جین کے ساتھ ایک غالب یوریشین ایویئن نما (EA) reassortant genotype 4 (G4) وائرس کی نشاندہی کی۔

اس G4 وائرس کی پیمائش سوائن کے 10.4 فیصد کارکنوں میں کی گئی جس کا تجربہ کیا گیا، اور یہ وبائی امراض کے نشانات پیش کرتا ہے، جس میں انسانوں میں منتقل ہونے کی صلاحیت اور اس وقت گردش کرنے والے انسانی وائرس سے مختلف اینٹی جینیسیٹی ہے [7]۔ اس لیے سوائن انڈسٹری اور صحت عامہ کے نقطہ نظر سے خنزیر میں انفلوئنزا کے انفیکشن کو روکنا اور اس پر قابو پانا بہت ضروری ہے، اور ایسا کرنے کا سب سے بڑا طریقہ ویکسینیشن ہے [4]۔

امریکہ میں، ویکسین کی سب سے عام قسم مکمل غیر فعال وائرس (WIV) ہے، لیکن ایک RNA ویکٹر ویکسین جو HA کو ظاہر کرتی ہے اور NS1-ٹرنکیٹڈ لائیو اٹینیویٹڈ انفلوئنزا وائرس ویکسین (LAIV) کو بھی منظور کیا گیا ہے [4] . شمالی امریکہ سمیت پوری دنیا میں سوائن میں سب سے زیادہ عام IAV کی ذیلی قسمیں H1N1، H1N2، اور H3N2 ہیں [13]۔

ان وائرسوں کا جینیاتی تنوع خطے کے لحاظ سے بہت مختلف ہو سکتا ہے، تاہم، کینیڈا اور امریکہ میں swIAV کے جینیاتی ارتقاء میں فرق ہے، خاص طور پر H1 ذیلی قسم کے وائرسوں میں [12]۔ 2009 اور 2016 کے درمیان کینیڈا میں نگرانی نے اشارہ کیا کہ H1 کے جینیاتی کلیڈز جو امریکہ میں غالب تھے، H1g (1A.3.3.3) اور H1d-1 (1B.2.2)، کینیڈا میں نہیں پائے گئے، اور کینیڈا میں H1 وائرس امریکہ سے بہت زیادہ مختلف تھے [12]۔

کینیڈا میں ایک نئے H1 کلیڈ (H1a-3) کی نشاندہی کی گئی تھی جو منیٹوبا میں شروع ہوئی تھی اور پورے ملک اور امریکہ میں پھیلنے سے پہلے اس کی تیزی سے ترقی ہوئی تھی۔ H3 وائرس کے حوالے سے، چھ H3 نسبوں کو امریکی سوائن (IV-A سے IV-F) میں دستاویز کیا گیا تھا، اور ان میں سے، تین کینیڈین سوائن میں پائے گئے تھے (IV-B، IV-C، اور IV-E) [12 ]

یہ علاقائی نگرانی کی اہمیت کو اجاگر کرتا ہے اور ویکسین کے موثر پروگراموں کو مطلع کرنے کے لیے گردش کرنے والے تناؤ کے بارے میں آگاہی دیتا ہے اور اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ امریکی سوائن میں گردش کرنے والی IAV پر مبنی ویکسین کینیڈا کے سوائن کی حفاظت نہیں کر سکتیں [12]۔

اس سے پہلے، دو کینیڈین swIAV الگ تھلگ، A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] اور A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2) کا استعمال کرتے ہوئے ایک دوائی ویکسین تیار کی گئی تھی، جو کہ H{{{{ کے نمائندے ہیں۔ 9}} اینٹی جینک گروپ اور مغربی کینیڈا سے ایک نیا H3 اینٹی جینک گروپ (سوائن کلسٹر IV-E)، بالترتیب [14]۔ یہ نوول ویکسین ایک لائیو ٹینیویٹڈ وائرس ویکسین ہے جو SD191 اور SD69، SD191−R342V، اور SD69-K345V کی elastase پر منحصر شکلوں کا استعمال کرتے ہوئے بنائی گئی ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ یہ SD191 اور SD69 دونوں کے خلاف حفاظتی تھا، نیز ایک ہیٹرولوگس H1N2 تناؤ A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2) جو مغربی کینیڈا سے بھی الگ تھلگ تھا [14]۔

اس کے بعد سے، گردش کرنے والے swIAV تناؤ مسلسل بہہ رہے ہیں۔ ویسٹرن کالج آف ویٹرنری میڈیسن، یونیورسٹی آف سسکیچیوان، ساسکاٹون، ایس کے، کینیڈا میں سوائن سے حالیہ کلینیکل الگ تھلگ اکٹھے کیے گئے اور فیلڈ کے نمونوں سے الگ تھلگ کیے گئے۔ A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] H -3 antigenic گروپ کا رکن ہے لیکن SD191 [10,15] کے مقابلے میں 54 کلیدی H1 اینٹی جینک سائٹس میں سے پانچ امینو ایسڈ متبادل ہیں۔ 16]۔

A/Swine/AB/ SD0435/2019 (H3N2) [SD435] IV-E کلسٹر کا رکن ہے لیکن چھ کلیدی H3 اینٹی جینک سائٹس میں سے دو امینو ایسڈ کے متبادل کو شامل کرنے کے لیے چلا گیا ہے [17]۔

اس مطالعے میں، ہم نے جائزہ لیا کہ آیا دوائیویلنٹ ایلسٹیز پر منحصر LAIV نئے طبی الگ تھلگوں کے خلاف برقرار رہے گا، اور یہ اطلاع دے سکتا ہے کہ اس نے سوائن کو محفوظ کیا جب اس نے موجودہ گردش کرنے والے swIAV تناؤ SD467 (H1N2) اور SD435 (H3N2) کو چیلنج کیا ہے۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 خلیات اور وائرس

Madin-Darby کینائن کڈنی (MDCK) (ATCC, #CRL-2936) خلیات کو Minimal Essential Medium (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, USA) میں برقرار رکھا گیا تھا جس میں 10 فیصد فیٹل بووائن سیرم ہوتا ہے۔ (FBS) (تھرمو فشر سائنٹیفک، اوٹاوا، ON، کینیڈا 16000-044)، اور اسے 37 ◦C پر نمی والے 5 فیصد CO2 انکیوبیٹر میں رکھا گیا تھا۔ A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] اور A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV کو ویسٹرن کالج آف ویٹرنری میڈیسن، ساسکاٹون یونیورسٹی، ساسکاٹون میں فیلڈ کے نمونوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ ، SK، کینیڈا۔

ویکسین وائرس SD191−R342V اور SD69- K345V کو بچایا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [14]۔ تمام وائرس MDCK خلیات میں 0.2 فیصد بوائین سیرم البومین (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) کی موجودگی میں 1 µg/mL L-[(ٹولوئن{) کے ساتھ اگائے گئے تھے۔ {11}}سلفونامائڈ)-2-فینائل] ایتھائل کلورومیتھائل کیٹون (TPCK) - ٹرپسن (WT وائرس) یا 0.5 µg/mL انسانی نیوٹروفیل ایلسٹیز (ایلسٹیز پر منحصر وائرس) (سگما-الڈرچ، E8140)۔
2.2 جانوروں کی آزمائش کا ڈیزائن

پریری سوائن سینٹر انکارپوریٹڈ (ساسکاٹون، ایس کے، کینیڈا) سے چوبیس چار ہفتے پرانے swIAV-منفی خنزیر حاصل کیے گئے تھے۔ ان خنزیروں کو تصادفی طور پر منتخب کیا گیا تھا اور انہیں چار گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا جس میں سات خنزیر فی ویکسین شدہ گروپ، اور پانچ سور فی فرضی ویکسین شدہ گروپ تھے۔

گروپ کی تفویض کو شکل 1A میں بیان کیا گیا ہے۔ ان گروپوں کو ویکسینیشن گروپس کی بنیاد پر الگ الگ کمروں میں رکھا گیا تھا (گروپ اے پلس بی اور سی پلس ڈی اکٹھے رکھے گئے تھے) اور انفیکشن سے پہلے سات دن کے لیے موافق ہونے کی اجازت دی گئی۔

پانچ ہفتوں کی عمر (دن 0) کے ساتھ ساتھ آٹھ ہفتوں کی عمر (21 ویں دن) میں، گروپ A اور B میں خنزیروں کو 4 ملی لیٹر MEM کے ساتھ انٹرا ٹراکیلی طور پر فرضی ٹیکے لگائے گئے تھے، جبکہ گروپس C اور D کے ٹیکے لگائے گئے تھے۔ ہر ایک SD191−R342V اور SD69-K345V کے 4 mL MEM میں 1 × 106 PFU پر مشتمل ایک دوائی ویکسین کے ساتھ۔ دس دن بعد (31 دن)، خنزیر کو یا تو MEM (مذاق) یا SD435-WT (H3N2) یا SD467-WT (H1N2) کے 1 × 106 PFU کے ساتھ چیلنج کیا گیا۔

خنزیروں کو چیلنج کے بعد پانچ دن تک مانیٹر کیا گیا، ملاشی کا درجہ حرارت روزانہ لیا گیا اور 1، 3 اور 5 دن دونوں نتھنوں سے ناک کے جھاڑو لیے گئے۔ سیرم وائرس نیوٹرلائزیشن (SVN) پرکھ اور انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA)۔

چیلنج کے بعد 5 دن پر، تمام خنزیروں کو انسانی طور پر خوش کیا گیا، اور پھیپھڑوں کو نکالا گیا اور swIAV- خصوصیت والے مجموعی گھاووں کی موجودگی کے لیے ان کا جائزہ لیا گیا۔ پھیپھڑوں کے ٹشو کے نمونے بھی وائرس کی تنہائی کے لیے جمع کیے گئے تھے (شکل 1B)۔

2.3 اخلاقیات کا بیان

تمام جانوروں کے طریقہ کار کو یونیورسٹی آف سسکیچیوان کے یونیورسٹی اینیمل کیئر کمیٹی (UACC) اور اینیمل ریسرچ ایتھکس بورڈ (AREB) نے منظور کیا تھا۔ اس پروٹوکول کو 12 نومبر 2021 کو منظور کیا گیا تھا (جانوروں کے استعمال کا پروٹوکول #20190064)۔ تمام طریقہ کار کینیڈین کونسل آف اینیمل کیئر (CCAC) کے ذریعہ ویکسین اینڈ انفیکٹس ڈیزیز آرگنائزیشن (VIDO)، یونیورسٹی آف سسکیچیوان، Saskatoon، SK، کینیڈا میں مطلوبہ معیارات کے مطابق انجام دیے گئے۔

2.4 نمونے لینے

ہر نتھنے سے ناک کے جھاڑو کو 1 mL MEM میں رکھا گیا تھا جس میں 1× اینٹی بائیوٹک اینٹی مائکوٹک (تھرمو فشر سائنٹیفک، اوٹاوا، آن، کینیڈا، 15240-062) اور −80 ◦C پر منجمد کیا گیا تھا جب تک کہ qRT-PCR انجام نہیں دیا جاتا۔ تمام خنزیروں کو ایتھنول (240 ملی گرام/ملی لیٹر سوڈیم پینٹوباربیٹل؛ 2 ملی لیٹر فی 4.5 کلوگرام) کی نس کے ذریعے انسانی طور پر خوش کیا گیا تھا۔ موت کی موت کے بعد، پھیپھڑوں کو مکمل طور پر ہٹا دیا گیا تاکہ جامنی سرخ، مضبوط گھاووں کے ساتھ ساتھ نمونیا دونوں کا تعین کیا جا سکے۔

فیصد کا تعین پھیپھڑوں کے لاب کے وزن کے ساتھ ساتھ پھیپھڑوں کے پورے حجم کی بنیاد پر کیا گیا تھا [18]۔ وائرل ٹائٹریشن کے لیے دائیں اپیکل، کارڈیک اور ڈایافرامیٹک لابس سے پھیپھڑوں کے نمونے بھی لیے گئے تھے۔ پھیپھڑوں کے ان نمونوں کو 10 فیصد w/v MEM کی مساوی مقدار میں ملایا گیا تھا جس میں ٹائٹریشن کے لیے 1× اینٹی بائیوٹک-اینٹیمائکوٹک شامل تھے۔

چترا 1۔ خنزیروں کی گروپ بندی اور نئے طبی الگ تھلگوں کے خلاف دوطرفہ LAIV کی حفاظتی افادیت کا جائزہ لینے کے لیے آزمائشی ڈیزائن۔ خنزیروں کو (n=5 MEM/MEM گروپوں کے لیے اور n=7 bivalent/bivalent گروپوں کے لیے) intratracheally 4 mL MEM کے ساتھ یا 1 × 106 PFU پر مشتمل دوائیولنٹ ویکسین کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا تھا۔ ہر ایک SD191−R342V اور SD69-K345V دن 0 اور 21 کو۔ 31ویں دن، خنزیروں کو MEM یا SD435 (H3N2) یا SD467 (H1N2) میں سے 1 × 106 PFU کے ساتھ انٹرا ٹراچیلی چیلنج کیا گیا۔ (ا)

جانوروں کی اس آزمائش کے لیے حفاظتی ٹیکوں، چیلنج اور نمونے لینے کا شیڈول۔ چوبیس چار ہفتے پرانے swIAV-منفی خنزیر کو انفیکشن سے پہلے سات دن تک موافق ہونے کی اجازت دی گئی۔ پانچ ہفتوں کی عمر (دن 0) کے ساتھ ساتھ آٹھ ہفتے کی عمر میں (21 ویں دن)، گروپ A اور B میں خنزیروں کو 4 mL MEM کے ساتھ انٹرا ٹراکیلی طور پر فرضی ویکسین لگائی گئی تھی، جبکہ گروپ C اور D کے ٹیکے لگائے گئے تھے۔ 4 mL MEM میں ہر SD191−R342V اور SD69-K345V کے 1 × 106 PFU پر مشتمل ایک دوائی ویکسین کے ساتھ۔

دس دن بعد (31 دن)، خنزیر کو یا تو MEM (مذاق) یا SD435-WT (H3N2) یا SD467-WT (H1N2) کے 1 × 106 PFU کے ساتھ چیلنج کیا گیا۔ چیلنج کے بعد پانچ دنوں تک خنزیروں کی نگرانی کی گئی، ملاشی کا درجہ حرارت روزانہ لیا گیا اور 1، 3 اور 5 دن دونوں نتھنوں سے ناک کے جھاڑو لیے گئے۔ پہلے (20 دن) اور دوسرے (30 دن) کے ٹیکے لگانے کے بعد سیرم اکٹھا کیا گیا۔ چیلنج کے بعد کے دن 5 (دن 36) پر تمام خنزیروں کو انسانی طور پر ایتھانائز کیا گیا تھا، اور پھیپھڑوں کو تشخیص کے لیے نکالا گیا تھا۔ (B) BioRender.com کے ساتھ تخلیق کیا گیا۔

2.5 انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA)

کوٹنگ اینٹیجنز بنانے کے لیے، SD435 اور SD467 کو MDCK خلیات میں پھیلایا گیا اور سوکروز گریڈینٹ الٹرا سینٹرفیوگریشن کا استعمال کرتے ہوئے پاک کیا گیا۔ وائرس کا غیر فعال ہونا 1:1000 (v/v) (تھرمو فشر سائنٹیفک، AAB2319703) کے ارتکاز میں وائرس میں 97 فیصد -propiolactone شامل کرنے سے ہوا۔ اس مرکب کو راتوں رات 4 ◦C پر ہلایا گیا، 37 ◦C پر دو گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تاکہ -propiolactone کے ہائیڈولیسس کو آسان بنایا جا سکے، پھر استعمال ہونے تک −80 ◦C پر محفوظ کیا جائے۔

ویکسینیشن اور چیلنج کی وجہ سے swIAV مخصوص IgG کی سطح کی پیمائش کرنے کے لیے، سور کا سیرم پہلے (دن 20) اور دوسرے (30 دن) ویکسینیشن کے بعد، اور نیکراپسی (36 دن) سے پہلے لیا گیا تھا۔

کاربونیٹ/بائکاربونیٹ کوٹنگ بفر میں گھلائے ہوئے پیوریفائیڈ پروپیولیکٹون غیر فعال وائرس SD435 (1 µg/mL)، اور SD467 (2 µg/mL)، (pH 9.6) کو امولون-2 96-کنویں پلیٹوں پر 1{{ پر لگایا گیا تھا۔ 12}}0 µL/well (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Canada, 3655) اور رات بھر 4 ◦C پر انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ رات بھر انکیوبیشن کے بعد، لیپت والی پلیٹوں کو TBST (0.1 M Tris، 0.17 M NaCl، اور 0.05 فیصد Tween 20) کے ساتھ چار بار دھویا گیا، جس میں سیرم یا BALF کے چار گنا سیریل ڈائیوشنز شامل کیے گئے۔ ڈپلیکیٹ میں پلیٹ، اس کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر دو گھنٹے کا انکیوبیشن۔ سیرم کو 1:10 کے ابتدائی کم کرنے پر شامل کیا گیا تھا، اور BALF کو بغیر ملاوٹ کے شامل کیا گیا تھا۔

پچھلے مطالعہ میں پہلے سے طے شدہ مثبت کنٹرول سیرا اور مناسب منفی کنٹرولز، سیرم، اور بی اے ایل ایف کے نمونے غیر ویکسین شدہ خنزیروں سے ہر پلیٹ پر چلائے گئے تھے [14]۔ پلیٹوں کو ٹی بی ایس ٹی سے چار بار دھویا گیا، جس کے بعد بکری اینٹی سوائن آئی جی جی (ایچ پلس ایل) فاسفیٹیس کا لیبل لگا ہوا ایفینیٹی پیوریفائیڈ اینٹی باڈی (1:5000) (سگما ایلڈرچ، ایس اے بی3700435) یا ماؤس اینٹی سور آئی جی اے (سیروٹیک، ایم سی اے (ایم سی اے) 1:300) کو ٹی بی ایس ٹی میں ملایا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر ایک گھنٹے کے لیے چھوڑ دیا گیا۔

IgA ELISAs کو بائیوٹینیلیٹڈ بکری اینٹی ماؤس IgG (H plus L) اینٹی باڈیز (CALTAG, Burlingame, CA, USA, M30015) اور streptavidin alkaline phosphatase محلول (Jackson ImmunoResearch, West Grove) کے اضافے سے تیار کیا گیا تھا۔ PA) دونوں کمرے کے درجہ حرارت پر ایک گھنٹے کے لیے۔ انکیوبیشن کے بعد، IgG اور IgA دونوں پلیٹوں کو TBST سے چار بار دھویا گیا، جس میں p-nitrophenyl فاسفیٹ سبسٹریٹ (PNPP) [10 mg/mL p-nitrophenyl phosphate di(tris) نمک کرسٹل لائن (Sigma-Aldrich)، 1 فیصد ڈائیتھانولامین ( Sigma-Aldrich)، 0.5 mg/mL MgCl2، اور pH 9.8] (1 mg/mL) شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر دو گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔

رد عمل کو 0.3 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) کے اضافے کے ذریعے روک دیا گیا تھا، اور پلیٹوں کو 490 nm کے حوالہ کے ساتھ 405 nm پر ایک سپیکٹرو فوٹومیٹر میں پڑھا گیا تھا۔ نمونے کے ٹائٹر کو سب سے زیادہ کمزوری کے طور پر بیان کیا گیا تھا جس پر اس نمونے کا OD طے شدہ کٹ آف سے زیادہ تھا (معروف منفی نمونے کا اوسط OD پلس معیاری انحراف سے دو گنا)۔

2.6۔ وائرس نیوٹرلائزیشن (VN) پرکھ

MDCK خلیات (3.5 × 104 ) کو 96- کنویں پلیٹوں میں چڑھایا گیا تھا۔ سیرم اور BALF کو 30 منٹ کے لئے 56 ◦C پر حرارت غیر فعال کر دیا گیا تھا۔ پلیٹ میں سیرم اور BALF کے دو گنا ڈائلیشنز کو چار گنا میں شامل کیا گیا، اور 60 µL پتلا سیرم یا BALF SD435 یا SD456 کے مساوی حجم کے ساتھ 100 TCID50 پر مشتمل 37 ◦C پر 1 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔

اس کے بعد 100 µL مرکب کو MDCK خلیوں میں شامل کیا گیا، اور cytopathogenic اثر (CPE) کو 48 گھنٹے اور 72 گھنٹے پوسٹ انفیکشن (pi) میں دستاویز کیا گیا۔ نیوٹرلائزیشن اینٹی باڈی ٹائٹر ہر سیرم کے نمونے کی سب سے زیادہ کمزوری تھی جس نے 4 میں سے کم از کم 2 کنویں میں CPE سے خلیات کو مکمل طور پر محفوظ کیا۔

2.7۔ وائرل تعین

جمع کرنے پر، پھیپھڑوں کے نمونے فوری طور پر برف پر رکھے گئے اور پروسیسنگ تک −80 ◦C پر منجمد کر دیے گئے۔ پروسیسنگ کے لیے، پھیپھڑوں کے ہر ٹشو کا وزن کیا گیا اور MEM کی 10 فیصد (w/v) ارتکاز کو 1× اینٹی بائیوٹک-اینٹیمائکوٹک (تھرمو فشر سائنٹیفک، 15240-062) کے ساتھ شامل کیا گیا۔ پھیپھڑوں کے ٹشو کو ٹشو لائزر II (کیجین، ہلڈن، جرمنی) میں 30 ہرٹج پر 5 منٹ کے لیے ہم آہنگ کیا گیا، اس کے بعد 4 ◦C پر 10 منٹ کے لیے 5000×g پر سینٹرفیوگریشن کیا گیا۔ ہوموجنائزڈ سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا اور مزید تجزیہ تک −80 ◦C پر ذخیرہ کیا گیا۔

ناک کی جھاڑیوں کو 15 سیکنڈ کے لیے گھمایا گیا اور 4◦C پر 25 منٹ کے لیے 1600×g پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹینٹس کو جمع کیا گیا اور مزید تجزیہ تک −80 ◦C پر ذخیرہ کیا گیا۔ وائرل ٹائٹرز کا تعین پھیپھڑوں کے لیے TCID50 پرکھ اور ناک کی جھاڑیوں کے لیے مقداری RT-PCR کے ذریعے کیا گیا تھا۔

2.8۔ آر این اے نکالنا اور مقداری RT-PCR (qRT-PCR)
چیلنج کے بعد ناک کی جھاڑیوں میں SD467 اور SD435 کی وائرل RNA کی سطح کا تعین کرنے کے لیے، qRT-PCR کیا گیا۔ معروف ٹائٹر کے SD435 اور SD467 سے نکالے گئے RNA کا استعمال کرتے ہوئے ایک معیاری وکر بنایا گیا تھا۔ مختصراً، RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Toronto, ON, Canada, 74136) کو 200 µL ناک دھونے سے vRNA نکالنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

یونیورسل انفلوئنزا پرائمر یونی 12 اور سپر اسکرپٹ III ٹرانسکرپٹیس (انویٹروجن، برلنگٹن، آن، کینیڈا) [19] کا استعمال کرتے ہوئے آر این اے کو سی ڈی این اے میں تبدیل کیا گیا۔ qPCR کو StepOnePlusTM ریئل ٹائم پی سی آر سسٹم (اپلائیڈ بایو سسٹم، CA، USA) پر پاور SYBR گرین پی سی آر ماسٹر مکس (اپلائیڈ بایو سسٹم)، 5 µL cDNA، اور 1 µL 10µM فارورڈ اور ریورس پرائمر کے ساتھ سہ رخی میں انجام دیا گیا۔ پی سی آر کے رد عمل 40 سائیکلوں کے لئے 58 ◦C کے اینیلنگ درجہ حرارت پر چلائے گئے تھے۔ کیو پی سی آر پرائمر کے تمام سلسلے درخواست پر دستیاب ہیں۔

2.9 شماریاتی تجزیہ

گراف پیڈ پرزم 8 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔ مان-وٹنی اور کرسکل-والس نان پیرامیٹرک ٹیسٹ استعمال کیے گئے۔ اہم فرق کو * (p < 0 05)، ** (p < 0 01)، *** (p < 0.001) سے ظاہر کیا گیا ہے۔ ، یا **** (p <0.0001)۔ ns=اہم نہیں ہے۔

For more information:1950477648nn@gmail.com