ERK-ثالثی کی روک تھام کے ذریعے دوبارہ اتحاد سے ختم ہونے تک خوف کی یادداشت کے مرحلے کی فعال منتقلی

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

کی بازیافتخوفیاداشتدو متضاد میموری کے عمل کو آمادہ کرتا ہے، یعنی، reconsolidation اور extinction. مختصر بازیافت خوف کو برقرار رکھنے یا بڑھانے کے لئے دوبارہ اتحاد کو اکساتا ہے۔یاداشت، جبکہ طویل بازیافت اس یادداشت کو ختم کردیتی ہے۔ اگرچہ بحالی اور معدومیت کے طریقہ کار کی چھان بین کی جا چکی ہے، لیکن یہ معلوم نہیں ہے کہ یادداشت کی بازیافت کے دوران یادداشت کے مراحل کو دوبارہ اتحاد سے معدومیت کی طرف کیسے تبدیل کیا جاتا ہے۔ یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ بازیافت کے بعد ایکسٹرا سیلولر سگنل ریگولیٹڈ کناز (ERK) پر منحصر میموری کی منتقلی کا عمل نر چوہوں میں روک تھام سے بچنے (IA) کے کام میں بحالی کی شمولیت کو روک کر بحالی سے معدوم ہونے تک میموری کے مراحل کے سوئچ کو منظم کرتا ہے۔ سب سے پہلے، منتقلی کی یادداشت کا مرحلہ، جو کہ بحالی کی شمولیت کو منسوخ کر دیتا ہے، لیکن معدومیت کے حصول کے لیے ناکافی ہے، اس کی شناخت بحالی کے بعد کی گئی تھی، لیکن معدومیت کے مراحل سے پہلے۔ دوسرا، اس کے بعد بحالی، منتقلی، اور معدومیت کے مراحلمیموری کی بازیافتامیگدالا، ہپپوکیمپس، اور میڈل پریفرنٹل کورٹیکس (ایم پی ایف سی) میں CAMP- ریسپانسیو عنصر بائنڈنگ پروٹین (CREB) اور ERK فاسفوریلیشن کے ذریعے الگ الگ سالماتی اور سیلولر دستخط دکھائے۔ بحالی کے مرحلے میں CREB فاسفوریلیشن میں اضافہ ہوا، جبکہ معدومیت کے مرحلے نے دماغ کے ان خطوں میں CREB اور/یا ERK فاسفوریلیشن کے مختلف امتزاج کے ساتھ کئی عصبی آبادیوں کو ظاہر کیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ یادداشت کے تین مراحل بشمول منتقلی کے مرحلے نے بازیافت کے فوراً بعد عارضی ERK ایکٹیویشن دکھایا۔ سب سے اہم بات یہ ہے کہ منتقلی میموری کے مرحلے میں امیگڈالا، ہپپوکیمپس، یا ایم پی ایف سی میں ERK کی ناکہ بندی نے IA میموری کی بحالی کی حوصلہ افزائی میں اضافہ کو روک دیا۔ یہ مشاہدات بتاتے ہیں کہ ERK-سگنلنگ پاتھ وے میموری کے مرحلے کی بحالی سے معدومیت کی طرف منتقلی کو فعال طور پر منظم کرتا ہے اور یہ عمل ایک سوئچ کے طور پر کام کرتا ہے جو خوف کی بحالی کو منسوخ کرتا ہے۔یاداشت.

مطلوبہ الفاظ: ERK; معدومیت خوف کی یادداشت؛ reconsolidation منتقلی

1ڈیپارٹمنٹ آف بائیو سائنس، فیکلٹی آف لائف سائنسز، ٹوکیو یونیورسٹی آف ایگریکلچر، ٹوکیو 156-8502، جاپان، اور

2گریجویٹ سکول آف ایگریکلچر اینڈ لائف سائنسز، ٹوکیو یونیورسٹی، ٹوکیو 113-8657، جاپان

اہمیت کا بیان

خوف کی یادداشت کی بازیافتدو مخالف میموری کے عمل کو آمادہ کرتا ہے؛ بحالی اور معدومیت. Reconsolidation برقرار رکھتا ہے / بڑھاتا ہے۔خوف کی یادداشتجبکہ ناپید ہونے سے خوف کی یادداشت کمزور ہو جاتی ہے۔ یہ ابھی تک نامعلوم ہے کہ بازیافت کے دوران میموری کے مراحل کو دوبارہ بحال کرنے سے معدومیت کی طرف کیسے تبدیل کیا جاتا ہے۔ یہاں، ہم نے ایک فعال میموری کی منتقلی کے عمل کی نشاندہی کی ہے جو ایک سوئچ کے طور پر کام کر رہا ہے جو بحالی کو روکتا ہے۔ میموری کی منتقلی کے اس مرحلے نے امیگدالا، ہپپوکیمپس، اور میڈل پریفرنٹل کورٹیکس (ایم پی ایف سی) میں ایکسٹرا سیلولر سگنل ریگولیٹڈ کناز (ERK) فاسفوریلیشن میں عارضی اضافہ ظاہر کیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ منتقلی کے مرحلے میں ان خطوں میں ERK کی روک تھام نے inhibitory گریز (IA) میموری کی بحالی کی ثالثی میں اضافہ کو روک دیا۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ منتقلی کی یادداشت کا عمل ERK-سگنلنگ پاتھ وے کے ایکٹیویشن کے ذریعے بحالی کی شمولیت کو روک کر خوف کی یادداشت کے خوف کی یادداشت کے مراحل کے سوئچ کو فعال طور پر منظم کرتا ہے۔

تعارف

یاداشتبازیافت ایک غیر فعال عمل نہیں ہے بلکہ یہ ایک متحرک عمل ہے جو اصل میموری کو برقرار رکھنے، مضبوط کرنے، کمزور کرنے، یا تبدیل کرنے/اپ ڈیٹ کرنے کی اجازت دیتا ہے (Misanin et al. .، 1979؛ گورڈن، 1981؛ نادر وغیرہ، 2000؛ نادر اور ہارڈٹ، 2009؛ دودائی، 2012؛ فوکوشیما وغیرہ، 2014)۔ اہم بات یہ ہے کہ کنڈیشنڈ محرک (CS) کے مختصر دوبارہ نمائش کے ذریعہ بازیافت شدہ کنڈیشنڈ ڈر میموری لیبل بن جاتی ہے اور اس کی دیکھ بھال یا بڑھانے کے لئے جین کے اظہار پر منحصر بحالی کی ضرورت ہوتی ہے (نادر ایٹ ال۔، 2000؛ دودائی، 2002؛ کدا وغیرہ 2002؛ Suzuki et al.، 2004؛ Tronel et al.، 2005؛ Fukushima et al.، 2014)۔ اس کے برعکس، CS کے ساتھ مسلسل یا بار بار دوبارہ نمائش میموری کو ختم کرنے پر اکساتا ہے، جو خوف کی یادداشت کو کمزور کرتا ہے (پاولوف، 1927؛ ریسکورلا، 2001؛ مائرز اور ڈیوس، 2002)۔ اس طرح، خوف کی یادداشت کی بازیافت دو متضاد میموری کے عمل کو جنم دیتی ہے، یعنی، بحالی اور معدومیت، اگرچہ دونوں عمل ایک جیسی CS کے دوبارہ نمائش کے ذریعے متاثر ہوتے ہیں، لیکن CS کے دوبارہ نمائش کی مدت کے مطابق مختلف ہوتے ہیں۔

بحالی اور معدومیت کی عام اور اہم حیاتیاتی کیمیائی خصوصیت CAMP-ردعمل عنصر بائنڈنگ پروٹین (CREB) میڈیٹڈ جین ایکسپریشن (ممیا ایٹ ال۔، 2009) کی ضرورت ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے سیاق و سباق سے متعلق خوف کی یادداشت کی بحالی اور معدومیت کے مراحل کے درمیان متضاد سالماتی، جسمانی اور طرز عمل کے دستخط دکھائے ہیں (سوزوکی ایٹ ال۔، 2004؛ ممیا ایٹ ال۔، 2009) بحالی کے مرحلے کے دوران پروٹین کی ترکیب کو روکنا اصل خوف میں خلل ڈالتا ہے۔یاداشت، جبکہ معدومیت کے مرحلے کے دوران پروٹین کی ترکیب کو مسدود کرنا ایسا کرنے میں ناکام رہتا ہے، حالانکہ متعلقہ خوف کی یادداشت کو دوبارہ فعال کیا گیا تھا۔ CREB ثالثی جین کے اظہار کے فعال ہونے کو ظاہر کرنے والے دماغی علاقوں کی ضرورت از سر نو اور معدومیت کے درمیان مختلف ہے۔ بحالی کا انحصار امیگڈالا اور ہپپوکیمپس پر ہے، جب کہ ناپید ہونا امیگڈالا اور میڈل پریفرنٹل کورٹیکس (ایم پی ایف سی) پر منحصر ہے۔ تاہم، امیگڈالائڈ CREB ایکٹیویشن کا ٹائم کورس بحالی اور ختم ہونے والی میموری کے مراحل کے درمیان مختلف ہے۔ ان مشاہدات نے تجویز کیا کہ بحالی اور ختم ہونے کے مراحل آزاد نہیں ہیں، بلکہ ایک دوسرے کے ساتھ تعامل کرتے ہیں۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ حالیہ مطالعات نے ایک ٹائم ونڈو (ٹرانزیشن فیز) کی نشاندہی کی ہے جو کہ امیگدالا میں ازسرنو سیلولر سگنل ریگولیٹڈ کناز (ERK) ایکٹیویشن نہیں دکھاتی ہے، لیکن سمعی خوف کی یادداشت کی بازیافت کے بعد معدوم ہونے کے مراحل سے پہلے (Merlo et al., 2018) )۔ ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج ممکنہ طریقہ کار کی تجویز کرتے ہیں جن کے ذریعے خوف کی یادداشت کی بازیافت کے دوران یادداشت کے مراحل کو دوبارہ سے ختم ہونے کی طرف تبدیل کیا جاتا ہے۔ دوسرے الفاظ میں، یہ ممکن ہے کہ میموری کی منتقلی کا عمل فعال طور پر اس سوئچ کو منظم کرے۔

ایک روک تھام سے بچنے کے کام میں، چوہوں کو ایک برقی فوٹ شاک موصول ہوتا ہے جب وہ ہلکے ڈبے سے تاریک ڈبے میں داخل ہوتے ہیںیاداشتتاریک ٹوکری سے بچنے کے لیے۔ اس سے پہلے، اس کام کو استعمال کرتے ہوئے، ہم نے یہ ظاہر کیا تھا کہ بحالی اور معدومیت کے مراحل میں اس وقت امتیاز کیا جا سکتا ہے جب ایک ماؤس دوبارہ نمائش کے سیشن کے دوران ہلکے ڈبے سے تاریک ڈبے میں داخل ہوتا ہے (فوکوشیما ایٹ ال۔، 2014)۔ لہذا، یہ کام ہمیں کلاسیکی سیاق و سباق سے متعلق خوف کے کنڈیشنگ پیراڈیم کے برعکس، بحالی اور معدومیت کے مراحل کے تناظر کے مالیکیولر دستخطوں کی خصوصیت کرنے کی اجازت دیتا ہے جس میں CS کے دوبارہ نمائش کے ذریعے مشروط خوف کی یادداشت کو دوبارہ فعال کرنے سے بحالی اور معدومیت دونوں کا آغاز ہوتا ہے۔ مختصر (3 منٹ) کنڈیشنڈ سیاق و سباق کے ساتھ دوبارہ نمائش دوبارہ اکٹھا کرنے پر اکساتی ہے، جب کہ طویل (30 منٹ) یا اس سیاق و سباق کے ساتھ بار بار دوبارہ نمائش معدومیت کا باعث بنتی ہے (ایزنبرگ ایٹ ال۔، 2003؛ پیڈریرا اور مالڈوناڈو، 2003؛ سوزوکی وغیرہ، 2004؛ لی وغیرہ، 2008؛ ممیا وغیرہ، 2009)۔ مزید برآں، ہم نے پایا کہ بازیافت شدہ IA میموری کو اس کام میں میموری کی بحالی کے ذریعے بڑھایا گیا ہے (فوکوشیما ایٹ ال۔، 2014)۔

خوف کی بازیافت کے دوران بحالی سے معدومیت کی طرف منتقلی کے طریقہ کار کو سمجھنایاداشت، ہمارا مقصد IA میموری کی بحالی، منتقلی، اور معدومیت کے مراحل کے مالیکیولر، سیلولر، اور طرز عمل کے دستخطوں کی شناخت اور ان کی خصوصیت کرنا ہے۔ ہم نے امیگدالا، ہپپوکیمپس، اور ایم پی ایف سی میں CREB اور ERK کے ایکٹیویشن کا تجزیہ کیا، دوبارہ تشکیل، منتقلی، اور معدومیت کے مراحل میں اور ان میموری کے عمل میں ERK ایکٹیویشن کے کرداروں کا جائزہ لیا۔

مواد اور طریقے

چوہوں کے تمام تجربات لیبارٹری جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کے لیے گائیڈ (جاپان نیورو سائنس سوسائٹی اور ٹوکیو یونیورسٹی آف ایگریکلچر) کے مطابق کیے گئے۔ اس مطالعے میں کیے گئے تمام جانوروں کے تجربات کو ٹوکیو یونیورسٹی آف ایگریکلچر کی اینیمل کیئر اینڈ یوز کمیٹی (اجازت نمبر 280037) نے منظور کیا۔ تمام جراحی کے طریقہ کار نیمبوٹل اینستھیزیا کے تحت انجام دیئے گئے تھے اور تکلیف کو کم کرنے کی ہر ممکن کوشش کی گئی تھی۔ نر C57BL/6N چوہے دریائے چارلس سے حاصل کیے گئے تھے۔ چوہوں کو پانچ یا چھ کے پنجروں میں رکھا گیا تھا، 12/12 گھنٹے روشنی/تاریک چکر پر رکھا گیا تھا، اور کھانے اور پانی تک رسائی کی اجازت دی گئی تھی۔ جانچ کے وقت چوہوں کی عمر کم از کم آٹھ ہفتے تھی۔ سائیکل کے ہلکے مرحلے کے دوران جانچ کی گئی۔ تمام تجربات چوہوں کے علاج کی حالت سے اندھے کیے گئے تھے۔

IA ٹیسٹ مرحلہ وار IA اپریٹس (OHARA فارماسیوٹیکل) ایک باکس پر مشتمل ہوتا ہے جس میں روشنی اور تاریک کمپارٹمنٹس ہوتے ہیں (دونوں 15.5 12.5 11.5 سینٹی میٹر)۔ لائٹ کمپارٹمنٹ فلوروسینٹ لائٹ (2500 lux; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang et al., 2011; Ishikawa et al., 2016) سے روشن تھا۔ IA کی تربیت کے آغاز سے پہلے، چوہوں کو ایک ہفتے کے لیے ہر دن 2 منٹ کے لیے انفرادی طور پر سنبھالا جاتا تھا۔ تربیتی سیشن کے دوران، ہر ماؤس کو 30 سیکنڈ تک روشنی والے ڈبے میں رہنے کی اجازت دی گئی تھی، اور گیلوٹین کا دروازہ اندھیرے والے ڈبے تک رسائی کی اجازت دینے کے لیے اٹھایا گیا تھا۔ تاریک ٹوکری میں داخل ہونے میں تاخیر کو حصول کا ایک پیمانہ سمجھا جاتا تھا۔ جیسے ہی چوہا تاریک ڈبے میں داخل ہوا، گیلوٹین کا دروازہ بند کر دیا گیا۔ 5 سیکنڈ کے بعد، 2 سیکنڈ (تربیت) کی کل مدت کے لیے ایک فوٹ شاک (0.2 ایم اے) پہنچایا گیا۔ ٹریننگ سیشن کے 24 گھنٹے بعد، ماؤس کو واپس لائٹ کمپارٹمنٹ میں رکھا گیا جب تک کہ وہ تاریک ڈبے میں داخل نہ ہو جائے (اوسط 459 6 15.49 سیکنڈ)۔ ماؤس کے تاریک ڈبے میں داخل ہونے کے فوراً بعد، گیلوٹین کا دروازہ بند کر دیا گیا اور ماؤس اندھیرے کے ڈبے میں مختلف وقت (0، 1، یا 10 منٹ) تک بغیر کسی فوٹ شاک (دوبارہ متحرک ہونے) کے رہا۔ میموری کا اندازہ 48 گھنٹے بعد [پوسٹری ایکٹیویشن لانگ ٹرم میموری (PR-LTM) ٹیسٹ] کے طور پر کیا گیا جب ماؤس کے تاریک ڈبے میں داخل ہونے میں کراس اوور لیٹنسی ہے جب روشنی والے ڈبے میں تبدیل کیا جاتا ہے، جیسا کہ دوبارہ چالو کیا جاتا ہے۔

پہلے تجربے کے لیے، ہم نے دوبارہ فعال ہونے کے بعد پروٹین کی ترکیب کی روک تھام کے اثر کا جائزہ لیا (0، 1، یا 10 منٹ؛ تصویر 1 کے لیے سیاہ ڈبے میں دوبارہ نمائش)۔ پروٹین کی ترکیب روکنے والا اینیسومائسن (ANI؛ Wako) کو نمکین میں تحلیل کیا گیا تھا (pH کو 7 میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔{12}}–7.4 NaOH کے ساتھ)۔ چوہوں کو تربیت دی گئی جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، اور 24 گھنٹے بعد، ان کو گاڑی (VEH) یا ANI (150 mg/kg, ip) موصول ہوئی جب 0، 1، یا 10 منٹ تک بغیر کسی فٹ شاک کے سیاہ ڈبے میں دوبارہ نمائش کے بعد۔ (دوبارہ چالو کرنا)۔ اس خوراک پر، ANI پہلے 2 گھنٹے کے دوران دماغ میں پروٹین کی 90 فیصد ترکیب کو روکتا ہے (Flood et al., 1973)۔ دوبارہ فعال ہونے کے سیشن کے 48 گھنٹے بعد، انفرادی چوہوں کو ایک بار پھر لائٹ کمپارٹمنٹ میں رکھا گیا اور کراس اوور لیٹینسی کا اندازہ لگایا گیا۔

دوسرے تجربے کے لیے [فاسفوریلیٹڈ CREB (pCREB) اور فاسفوریلیٹڈ ERK (perK) امیونو ہسٹو کیمسٹری؛ انجیر۔ 2–5]، ہم نے دماغ کے ان علاقوں کا جائزہ لیا جو روشنی کے دوبارہ نمائش کے بعد چالو ہو گئے تھے (جب تک کہ چوہے تاریک ڈبے میں داخل نہ ہو جائیں، اندھیرے والے ڈبے میں 0 منٹ کے لیے دوبارہ نمائش ہو جائے) یا تاریک کمپارٹمنٹ (دوبارہ۔ 1 یا 10 منٹ) کے لیے تاریک ڈبے کی نمائش۔ چوہوں کو چار فوکوشیما ایٹ ال میں تقسیم کیا گیا تھا۔ · بازیافت کے بعد خوف کی یادداشت کے مراحل کی منتقلی J. Neurosci.، فروری 10، 2021، • 41(6):1288–1300 • 1289 گروپس۔ تربیت کے 24 گھنٹے بعد، انفرادی چوہوں کو دوبارہ روشنی والے ڈبے کے سامنے لایا گیا اور پھر تاریک ڈبے سے ان کے داخلے کے بعد اندھیرے والے ڈبے میں ٹھہرے رہے 1 منٹ، منتقلی (ٹران) گروپ؛ 10 منٹ، معدومیت (Ext) گروپ]۔ چوہوں کے ایک اور گروپ کو لائٹ/ڈارک کمپارٹمنٹ [نان ری ایکٹیویٹڈ (این آر) گروپ] میں واپس نہیں کیا گیا۔ اس کے بعد چوہوں کو Nembutal (750 mg/kg, ip) کے ساتھ 5، 15، یا 30 منٹ پر دوبارہ فعال کرنے کے بعد بے ہوشی کی گئی۔

تیسرے تجربے کے لیے (U0126 کا مائیکرو انفیوژن؛ انجیر 6,7)، ہم نے امیگڈالا، ہپپوکیمپس، یا ایم پی ایف سی میں ERK کی روک تھام کے اثرات کا جائزہ لیا۔یاداشتبحالی/اضافہ، منتقلی، اور معدومیت۔ MEK inhibitor U0126 (Sigma-Aldrich) کو مصنوعی دماغی اسپائنل سیال میں تحلیل کیا گیا تھا جس میں Tween 80 (Sigma) کے 2.5 ملی لیٹر میں 7.5 فیصد ڈائمتھائل سلفوکسائیڈ (واکو) کے تین قطرے تھے اور پی ایچ کے ساتھ ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ 7.4 NaOH کے ساتھ۔ چوہوں کو تربیت دی گئی جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، اور 24 گھنٹے بعد، انہیں واپس لائٹ کمپارٹمنٹ (دوبارہ فعال کرنے) میں رکھا گیا۔ چوہوں کو U0126 (1 mg) یا VEH کے ساتھ دماغ کے مختلف علاقوں میں فوراً بعد (تصویر 6A, C, E–H, 7A–C) یا 30 منٹ بعد مائیکرو انفیوز کیا گیا تھا۔ (تصویر 6B، D) دوبارہ فعال ہونا۔ دوبارہ فعال ہونے کے 48 گھنٹے بعد، انفرادی چوہوں کو ایک بار پھر لائٹ کمپارٹمنٹ میں رکھا گیا اور کراس اوور لیٹینسی کا اندازہ لگایا گیا (PR LTM)۔ ہپپوکیمپس اور ایم پی ایف سی (0.5 ملی لیٹر) میں مائکرو انفیوژن 0.25 ملی لیٹر فی منٹ کی شرح سے بنائے گئے تھے۔ امیگڈالا (0.2 ملی لیٹر) میں مائکرو انفیوژن 0.1 ملی لیٹر / منٹ کی شرح سے بنائے گئے تھے۔ مائیکرو انفیوژن کے بعد انجکشن کینولا کو 2 منٹ کے لیے جگہ پر چھوڑ دیا گیا اور پھر چوہوں کو ان کے گھر کے پنجروں میں واپس کر دیا گیا۔ MEK inhibitor SL327 (سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی) کو ڈائمتھائل سلفوکسائیڈ میں تحلیل کیا گیا اور نمکین سے پتلا کر دیا گیا۔ چوہوں کو تربیت دی گئی جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، اور 24 گھنٹے بعد، انفرادی چوہوں کو واپس لائٹ کمپارٹمنٹ (دوبارہ فعال کرنے) میں رکھا گیا۔ چوہوں کو ری ایکٹیویشن کے فوراً بعد SL327 (10 یا 20 mg/kg) یا VEH کے ساتھ نظامی طور پر انجکشن لگایا گیا تھا (تصویر 7D–F)۔ دوبارہ فعال ہونے کے 48 گھنٹے بعد، انفرادی چوہوں کو ایک بار پھر لائٹ کمپارٹمنٹ میں رکھا گیا اور کراس اوور لیٹینسی کا اندازہ لگایا گیا (PR-LTM)۔

امیونو ہسٹو کیمسٹری انجام دی گئی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (ممیا ایٹ ال۔، 2009؛ سوزوکی ایٹ ال۔، 2011؛ ​​ژانگ ایٹ ال۔، 2011؛ ​​فوکوشیما ایٹ ال۔، 2014؛ اشیکاوا ایٹ ال۔، 2016؛ ہاسیگاوا ایٹ ال۔، 201)۔ اینستھیٹائزیشن کے بعد، تمام چوہوں کو 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ سے پرفیوز کیا گیا تھا۔ دماغوں کو ہٹا دیا گیا، راتوں رات طے کیا گیا، 30 فیصد سوکروز میں منتقل کیا گیا، اور 4 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا۔ کورونل حصوں (30 ملی میٹر) کو کریوسٹیٹ میں کاٹا گیا تھا۔

پی سی آر ای بی اور پرک سٹیننگ کے لیے، فری فلوٹنگ سیکشنز کا علاج 1 فیصد H2O2 کے ساتھ کیا گیا اور رات بھر خرگوش پولی کلونل اینٹی فاسفو-CREB (سیرین 133؛ S133) اینٹی باڈی (1:1000؛ #{{10) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ }}، ملی پور) اور/یا خرگوش مونوکلونل اینٹی فاسفو-ERK1/2 (T202/Y204) اینٹی باڈی (1:300؛ #4370؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی) بلاک کرنے والے محلول میں (فاسفیٹ بفرڈ نمکین پلس 1 فیصد بکری سیرم البومین، 1 mg/ml بوائین سیرم البومین، اور 0.05 فیصد Triton X-100)۔ حصوں کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین سے دھویا گیا اور پی سی آر ای بی کے لیے ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز کنجوگیٹڈ گدھا اینٹی خرگوش آئی جی جی (1:500؛ جیکسن امیونو ریسرچ) یا ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز کنجوگیٹڈ بکری اینٹی خرگوش آئی جی جی کو کمرے کے درجہ حرارت پر h1 کے لیے لگایا گیا۔ پی سی آر ای بی سگنلز کو بائیوٹن ٹائرامائڈ کے ذریعے بڑھایا گیا تھا اور الیکسا فلور کنجوگیٹڈ اسٹریپٹاویڈن (انویٹروجن) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔ PERK سگنلز کو TSA-FCM (انویٹروجن) کے ساتھ بڑھا دیا گیا تھا۔ حصوں کو سلائیڈوں پر لگایا گیا تھا اور بڑھتے ہوئے میڈیم (ملی پور) کا استعمال کرتے ہوئے ڈھانپ دیا گیا تھا۔

کوانٹیفیکیشن انجام دیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (فرینک لینڈ وغیرہ، 2006؛ فوکوشیما وغیرہ، 2014؛ ممیا وغیرہ، 2009؛ ژانگ ایٹ ال۔، 2011؛ ​​سوزوکی وغیرہ۔، 2008)۔ فرینکلن اور پاکسینوس (1997) کے اٹلس کے مطابق ڈھانچے کی جسمانی طور پر تعریف کی گئی تھی۔ تمام امیونو ایکٹیو نیوران کو ایک تجربہ کار نے علاج کی حالت سے نابینا کیا تھا۔

نتائج

IA ٹاسک میں بازیافت کے بعد میموری کے مراحل کی خصوصیت

IA ٹاسک ہمیں اس وقت پر دوبارہ مضبوطی اور معدومیت کے مراحل میں امتیاز کرنے کی اجازت دیتا ہے جب ایک ماؤس ہلکے ڈبے سے تاریک ڈبے میں داخل ہوتا ہے (Fukushima et al., 2014)۔ بحالی سے معدومیت کی طرف میموری کے مراحل کی تبدیلی کے بنیادی طریقہ کار کو سمجھنے کے لیے، ہم نے IA میموری کی بحالی اور معدومیت کے لیے ضروری پروٹین کی ترکیب کو روکنے کے اثرات کا جائزہ لے کر میموری کی بازیافت کے بعد IA میموری کے مراحل کو نمایاں کیا (فوکوشیما ایٹ ال۔ 2014)۔ چوہوں کو پہلے لائٹ کمپارٹمنٹ میں رکھا گیا تھا۔ تاریک ڈبے میں داخل ہونے کے 5 سیکنڈ بعد، ایک مختصر برقی فوٹ شاک پہنچایا گیا (تربیت)۔ چوہوں کو ٹریننگ کے 24 گھنٹے بعد دوبارہ روشنی والے ڈبے کے سامنے لایا گیا (دوبارہ ایکٹیویشن سیشن؛ تصویر 1A) اور تاریک ڈبے میں داخل ہونے کے لیے ان کی کراس اوور تاخیر کا اندازہ لگایا گیا (تصویر 1B)۔ چوہوں کو ان کے گھر کے پنجروں میں واپس لوٹا دیا گیا جب وہ ہلکے ڈبے سے اندھیرے والے ڈبے میں داخل ہوئے (0-منٹ اندھیرے ڈبے میں دوبارہ نمائش؛ بحالی کا مرحلہ) یا 1، 3، یا تاریک ڈبے میں رہے فوٹ شاک موصول کیے بغیر 10 منٹ (ختم ہونے کا مرحلہ؛ تصویر 1C–E)۔ ری ایکٹیویشن سیشن کے فوراً بعد، چوہوں کو VEH یا پروٹین سنتھیسس انحیبیٹر ANI کا سیسٹیمیٹک انجکشن ملا۔ 48 گھنٹے بعد، کراس اوور لیٹنسی کا اندازہ PR-LTM کیا گیا۔

ہمارے پچھلے مطالعہ (فوکوشیما ایٹ ال۔، 2014) سے مطابقت رکھتے ہوئے، لائٹ کمپارٹمنٹ (0 منٹ گروپ) کی دوبارہ نمائش نے IA میموری کی بحالی اور اضافہ کی حوصلہ افزائی کی۔ دو طرفہ ANOVA نے وقت کے اہم اثرات کا انکشاف کیا (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), منشیات (F(1) ,24)=23.197, p, 0.0001) اور منشیات کا وقتی تعامل (F(1,24)=25.022, p, 0.0001; تصویر 1B)۔ پوسٹ ہاک بونفرونی کے ٹیسٹ اور جوڑا بنائے گئے ٹی ٹیسٹ سے یہ بات سامنے آئی کہ VEH اور ANI گروپس، بالترتیب نمایاں طور پر بڑھے یا کم ہوئے، PR-LTM میں کراس اوور لیٹنسی دوبارہ ایکٹیویشن سیشن (ps , 0.05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; تصویر 1B)۔ یہ مشاہدات اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ لائٹ کمپارٹمنٹ میں IA میموری کی بازیافت نے میموری کو بڑھایا، جبکہ پروٹین کی ترکیب کی روک تھام نے بازیافت شدہ میموری میں خلل ڈالا، پچھلے مشاہدے کی تصدیق کرتے ہوئے کہ IA میموری کی بازیافت پروٹین کی ترکیب پر منحصر انداز میں بحالی کے ذریعے میموری کو بڑھاتی ہے۔

اس کے برعکس، تاریک ٹوکری کی دوبارہ نمائش نے طویل مدتی معدومیت کی حوصلہ افزائی کی [دو طرفہ ANOVA، وقت (تصویر 1C, F(1,28)=9.575, p=0۔ {50}}04; تصویر 1D, F(1,36)=11.699, p=00016), منشیات (تصویر 1C، F(1,28)=4.674, p=0.039؛ تصویر 1D, F(1,36)=12.285, p {{29} }}.0012)، منشیات کا وقتی تعامل (تصویر 1C، F(1,28)=7.916, p=0.009؛ تصویر 1D, F(1,36) {{41} }}.915، p=0.0079)]، جیسا کہ پہلے مشاہدہ کیا گیا تھا (فوکوشیما وغیرہ، 2014)۔ VEH گروپس جو تاریک ڈبے میں 3 یا 10 منٹ تک رہے، PR-LTM میں ری ایکٹیویشن سیشن کے مقابلے میں کراس اوور لیٹنسی میں نمایاں کمی دیکھی، جب کہ ANI گروپس نے PR-LTM میں ری ایکٹیویشن سیشن کے مقابلے میں کراس اوور لیٹنسی کا موازنہ کیا۔ VEH گروپس (پوسٹ ہاک بونفرونی کا ٹیسٹ، ps , 0.05؛ پیئرڈ ٹی ٹیسٹ، تصویر 1C، VEH، t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796، صفحہ 0.05؛ تصویر 1D، VEH، t(9)=10.211، p، 0.0001، ANI، t(9)=1.02، صفحہ 0.05 )۔ یہ مشاہدات اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ 3 یا 10 منٹ تک تاریک ڈبے میں دوبارہ نمائش نے IA میموری کو ختم کردیا اور پروٹین کی ترکیب کی روک تھام نے طویل مدتی معدومیت کو روک دیا۔ اس طرح، ڈارک کمپارٹ مینٹ میں IA میموری کی بازیافت IA میموری کو جین ایکسپریشن ڈی پینڈنٹ انداز میں بجھا دیتی ہے۔

اہم بات یہ ہے کہ VEH گروپ نے ری ایکٹیویشن سیشن اور ANI گروپ کے مقابلے PR-LTM میں موازنہ کراس اوور لیٹنسی دکھائی جب وہ 1 منٹ تک تاریک ڈبے میں رہے [دو طرفہ ANOVA، وقت (F(1,36) {{ 5}}۔ 0۔{32}}5)، منشیات کا وقتی تعامل (F(1,36)=0.011، صفحہ 0.05)؛ پوسٹ ہاک بونفیرونی کا ٹیسٹ، پی ایس۔ 0.05; پیئرڈ ٹی ٹیسٹ، VEH، t(9)=0.091، p. 0.05, ANI, t(9)=0.328, p. 0.05; تصویر 1E]۔ یہ مشاہدات اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ VEH گروپ نے IA میموری میں نہ تو اضافہ کیا اور نہ ہی ختم ہونا اور ANI گروپ نے IA میموری میں کوئی خلل نہیں دکھایا۔ لہٰذا، 1 ​​منٹ کے لیے تاریک ڈبے میں دوبارہ نمائش نے دوبارہ متحرک IA میموری کی افزائش اور ANI کی حوصلہ افزائی دونوں میں رکاوٹ کو روک دیا، لیکن IA میموری کو بجھایا نہیں، یہ تجویز کرتا ہے کہ یہ 1- منٹ کی دوبارہ نمائش بحالی کی شمولیت کو منسوخ کر دیتی ہے۔ ، لیکن IA میموری کو بجھانے کے لیے ناکافی ہے۔

خلاصہ طور پر، ان نتائج نے اشارہ کیا کہ روشنی کے ٹوکرے میں دوبارہ نمائش دوبارہ بحالی کے مرحلے کو آمادہ کرتی ہے، جب کہ تاریک ٹوکری (3 یا 10 منٹ) میں دوبارہ نمائش ختم ہونے کے مرحلے کو اکساتا ہے۔ اس سے بھی اہم بات یہ ہے کہ تاریک ڈبے میں 1 منٹ تک رہنا بحالی سے معدومیت کی طرف منتقلی کے مرحلے کو آمادہ کرتا ہے، جو معدومیت کو دلائے بغیر یادداشت کی بحالی کے خوف کو روکتا ہے۔

IA میموری کی بازیافت کے بعد امیگدالا، ہپپوکیمپس، اور ایم پی ایف سی میں بحالی، منتقلی، اور معدوم ہونے کے مراحل کے مالیکیولر دستخط

S133 پر CREB فاسفوریلیشن میں سیاق و سباق کے خوف کی یادداشت کی بحالی اور معدومیت ظاہر ہوتی ہے، جو کہ جین کے اظہار کی ایکٹیویشن کا ایک نشان ہے جو بحالی اور طویل مدتی معدومیت کے لیے درکار ہے، لیکن CREB فاسفوریلیشن کی الگ حرکیات کو ظاہر کرتا ہے (ممیا ایٹ ال۔، 20 )۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ERK کے فاسفوریلیشن میں کوئی اضافہ نہیں ہوا ہے، CREB کے ایک اپ اسٹریم ریگولیٹر (Impey et al.، 1998؛ Wu et al. خوف کی یادداشت کے معدوم ہونے تک، حالانکہ یہ فاسفوریلیشن بیسولیٹرل خطے میں اس وقت بڑھ جاتی ہے جب خوف کی یادداشت کو دوبارہ مضبوط اور بجھایا جاتا ہے (Merlo et al., 2014, 2018)۔ ایک اور مطالعہ نے اشارہ کیا کہ ہپپوکیمپل ERK صرف اس وقت چالو ہوتا ہے جب سیاق و سباق سے متعلق خوف کی یادداشت بجھ جاتی ہے، لیکن دوبارہ مضبوط نہیں ہوتی (Tronson et al.، 2009)۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ بحالی، منتقلی، اور ختم ہونے کے مراحل الگ الگ سالماتی اور سیلولر دستخط دکھاتے ہیں۔ لہذا، ہم نے امیونو ہسٹو کیمسٹری کا استعمال کرتے ہوئے بحالی، منتقلی، اور معدومیت کے مراحل میں پی سی آر ای بی اور پی ای آر کے کی سطحوں کی پیمائش اور موازنہ کیا۔ ہم نے چار تجرباتی گروپوں کا استعمال کرتے ہوئے اسی طرح کے تجرباتی نظام الاوقات کو انجام دیا جیسا کہ شکل 1B، D، E میں ہے۔ چوہوں کو تربیت کے بعد 24 گھنٹے پر دوبارہ روشنی والے ڈبے کے سامنے لایا گیا اور پھر وہ تاریک ڈبے میں رہے 1 منٹ، منتقلی (ٹران) گروپ؛ 10 منٹ، معدومیت (Ext) گروپ]۔ چوہوں کے ایک اور گروپ کو لائٹ/ڈارک کمپارٹمنٹ میں واپس نہیں کیا گیا تھا (غیر فعال، NR گروپ)۔ ہم نے دوبارہ فعال ہونے کے سیشن کے 30 منٹ پر امیگڈالا، ہپپوکیمپس، اور ایم پی ایف سی میں pCREB- مثبت (pCREB1) نیوران، perK- مثبت (pERK1) نیوران، اور ڈبل-مثبت (pCREB1/pERK1) نیوران گنے۔

امیگدالا (پچھلی خطہ) CREB کو معدومیت اور بحالی کے مراحل میں چالو کیا گیا تھا، جبکہ ERK کو صرف معدومیت کے مرحلے میں چالو کیا گیا تھا (تصویر 2A–C)۔ ایک طرفہ ANOVA نے گروپ کا ایک اہم اثر ظاہر کیا (تصویر 2B، F(3,29)=14.85، p، 0۔{11}}001)۔ پچھلے نتائج کی طرح (ممیا ایٹ ال۔، 2009)، پوسٹ ہاک نیومین – کیولس ٹیسٹ نے انکشاف کیا کہ ریکون اور ایکسٹ گروپس نے دوسرے گروپس (پی، 0.05) کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ pCREB1 نیوران دکھائے۔ ان مشاہدات نے اشارہ کیا کہ طرز عمل کی سطح پر مشاہدات کی طرح (تصویر 1)، 1 منٹ (منتقلی کے مرحلے) کے لیے تاریک ڈبے کی نمائش CREB فاسفوریلیشن کے "ٹرننگ آن" کو منسوخ کر دیتی ہے جس میں بحالی کے مرحلے میں اضافہ کیا جائے گا۔ اس کے برعکس، دوسرے گروپوں کے مقابلے Ext گروپ میں نمایاں طور پر زیادہ perK1 نیوران دیکھے گئے، حالانکہ Ext گروپ (F(3,29)=3.793, p { میں pCREB1 نیوران کے مقابلے میں بہت کم perK1 نیوران تھے۔ {23}}.0207؛ تصویر 2C)۔

مستقل طور پر، نمایاں طور پر زیادہ ڈبل مثبت نیوران (pCREB1/perK1) Ext گروپ (F(3,29)=6.698، p=0 میں دیکھے گئے۔{14}}0 14؛ تصویر 2D)، جبکہ نمایاں طور پر زیادہ pCREB1/ perK– (pCREB واحد مثبت) نیوران Recon اور Ext گروپس (F(3,29)=13.689, p, 0 میں دیکھے گئے۔ {48}}001؛ تصویر 2E)۔ اس طرح، بحالی کے مرحلے میں pCREB1/perK– نیوران کی صرف ایک آبادی دکھائی گئی۔ اس کے برعکس، معدومیت کے مرحلے نے pCREB1/perK– اور pCREB1/perK1 نیوران کی دو آبادیوں کو دکھایا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ERK صرف pCREB1 نیوران کے ذیلی سیٹ میں چالو ہوتا ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ اسی طرح کے نتائج امیگدالا کے باسولیٹرل ریجن میں دیکھے گئے (تصویر 2G, F(3,29)=13.042, p, 0.0001; Fig. 2H, F(3,29) {{32} }.824، p=0.0201؛ تصویر 2I, F(3,29)=12.633, p, 0.0001; تصویر 2J, F(3,29)=12 .505، ص، 0.0001)۔

معدومیت کے مرحلے میں ERK کی Biphasic ایکٹیویشن ERK CREB کا ایک اپ اسٹریم ایکٹیویٹر ہے اور اس طرح، خوف کی یادداشت کے استحکام اور بحالی کے لیے ERK ایکٹیویشن کی ضرورت ہے (Schafe et al.، 200{{31) }}؛ Duvarci et al.، 2005)۔ تاہم، متضاد طور پر، امیگدالا، ہپپوکیمپس، یا ایم پی ایف سی میں دوبارہ ایکٹیویشن کے مرحلے میں کوئی ERK ایکٹیویشن نہیں دیکھا گیا جب دوبارہ ایکٹیویشن سیشن کے بعد perK کی پیمائش 30 منٹ پر کی گئی تھی (تصویر 2-4)۔ لہذا، ہم نے ERK اور CREB فاسفوریلیشن کے ٹائم کورسز کی جانچ کی۔ ہم نے اسی طرح کا تجربہ کیا جیسا کہ اعداد و شمار 2-4 میں ہے، سوائے اس کے کہ pCREB اور perK کی سطحیں دوبارہ فعال ہونے کے سیشن کے بعد 5، 15، اور 30 منٹ پر ناپی گئیں ({{ کے لیے تاریک ڈبے میں دوبارہ نمائش 66}}، 1، یا 10 منٹ؛ تصویر 5A)۔ اعداد و شمار 2-4 میں دکھائے گئے اعداد و شمار سے مطابقت رکھتے ہوئے، پی سی آر ای بی 1 نیوران میں نمایاں اضافہ 30 منٹ پر دیکھا گیا، لیکن 5 منٹ پر نہیں، ریکن (امیگڈالا، ایم پی ایف سی اور ہپپوکیمپس) اور ایکسٹ (امیگڈالا اور ایم پی ایف سی) میں دوبارہ فعال ہونے کے بعد ) گروپس، لیکن ٹران گروپ نہیں (تصویر 5E، ایک طرفہ ANOVA، amygdala، 5 منٹ، F(3,23)=0.346, p. 0.05, 30 منٹ, F(3,23)=15.272, p, 0.0001; mPFC, 5 منٹ, F(3,23)=1.169, p. 0.05, 30 منٹ, F(3,23)=32۔ 346, p, 0.0001; ہپپوکیمپس, 5 منٹ, F(3,23)=0.154, p. 0.05, 30 منٹ, F(3,23)=16.197, p, 0.0001; غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ، امیگڈالا، دوبارہ اتحاد، 5 بمقابلہ 30 منٹ، t(12)=7.807، p، 0.0001، ختم ہونا، 5 بمقابلہ 30 منٹ، t(12)=5.405، p { {73}}.0002؛ mPFC، reconsolidation، 5 vs 30 min, t(12)=5.727, p, 0.0001, extinction, 5 vs 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013؛ hippocampal CA1 خطہ، reconsolidation، 5 بمقابلہ 30 منٹ، t(12)=2.339، p=0.0374)۔

دلچسپ بات یہ ہے کہ NR گروپ (تصویر 5F، amygdala، F(3,23) کے مقابلے میں ری ایکٹیویشن سیشن کے 5 منٹ بعد امیگدالا، ایم پی ایف سی اور ریکن، ٹران، اور ایکسٹ گروپس کے ہپپوکیمپس میں pERK1 نیورونز میں نمایاں اضافہ دیکھا گیا۔=10.961، p=0۔{28}}001; mPFC, F(3,23)=7.525, p=10. {13}}.0011؛ ہپپوکیمپس، F(3,23)=6.924، p=0.0017)۔ ان مشاہدات نے اشارہ کیا کہ ERK کو میموری کے تمام مراحل میں ری ایکٹیویشن سیشن کے فوراً بعد چالو کیا جاتا ہے۔ تاہم، پی ای آر کے 1 نیوران کی تعداد میں یہ اضافہ ری ایکٹیویشن سیشن کے بعد 15 منٹ پر بیسل لیول (این آر گروپ کے ساتھ موازنہ) پر واپس آگیا (تصویر 5 ایف، ایمیگڈالا، ایف(3,20)=2.676، p 0.05؛ mPFC، F(3,23)=0.683, p. 0.05; hippocampus, F(3,20)=0.74, p. 0.05)۔ مزید برآں، اعداد و شمار 2-4 میں دکھائے گئے نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، امیگڈالا، ایم پی ایف سی، اور ہپپوکیمپس میں صرف ایکسٹ گروپ میں ری ایکٹیویشن سیشن کے 30 منٹ بعد نمایاں طور پر زیادہ perK1 نیوران دیکھے گئے (تصویر 5F، amygdala، F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; ہپپوکیمپس, F( 3,23)=6.206، صفحہ=0.003)۔ اس طرح، بحالی اور منتقلی کے مراحل ERK کی عارضی ایکٹیویشن کو صرف ابتدائی وقت (5 منٹ) پر ظاہر کرتے ہیں، جب کہ معدومیت کا مرحلہ ERK کی بائفاسک ایکٹیویشن کو ظاہر کرتا ہے ابتدائی (5 منٹ) اور دیر سے (30 منٹ) دوبارہ فعال ہونے کے بعد ٹائم پوائنٹس۔ اجلاس. ان مشاہدات نے اشارہ کیا کہ ERK ایکٹیویشن کے ریگولیشن کے طریقہ کار از سر نو/منتقلی اور معدومیت کے مراحل میں مختلف ہیں۔ اجتماعی طور پر، ہمارے مشاہدات نے یہ ظاہر کیا کہ بحالی، منتقلی، اور معدومیت کے مراحل الگ الگ سالماتی دستخط دکھاتے ہیں۔

IA میموری کی بحالی اور ختم ہونے کے مراحل میں ERK ایکٹیویشن کے کردار

بحالی/منتقلی اور معدومیت کے مراحل نے بالترتیب monophasic اور biphasic ERK ایکٹیویشن کو دکھایا۔ اس کے بعد ہم نے ایم پی ایف سی میں ابتدائی (5 منٹ) اور دیر سے (30 منٹ) ERK ایکٹیویشن کے کرداروں کا موازنہ کیا اور ERK کو روکنے کے اثرات کا جائزہ لے کر دوبارہ اتحاد اور معدومیت کے مراحل میں موازنہ کیا۔

بحث

اس مطالعے میں، ہم نے IA میموری کی بازیافت کے بعد بحالی سے معدوم ہونے کے مراحل میں میموری کی منتقلی کے طریقہ کار کی چھان بین کی۔ ہم نے سب سے پہلے بازیافت کے بعد IA میموری کے مراحل کے طرز عمل کے دستخطوں کی خصوصیت کی۔ ہمارے پچھلے مطالعہ (فوکوشیما ایٹ ال۔، 2014) سے مطابقت رکھتے ہوئے، IA میموری کی بازیافت کی حوصلہ افزائی کی بحالی اور روشنی کی دوبارہ نمائش کے ذریعے معدومیت (0 منٹ تاریک ڈبے میں) اور تاریک ( بالترتیب 3 یا 10 منٹ) کمپارٹمنٹس۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ IA میموری کو نہ تو بڑھایا گیا اور نہ ہی بجھایا گیا اور پروٹین کی ترکیب کی روک تھام کے خلاف مزاحمت کا مظاہرہ کیا جب چوہوں کو صرف 1 منٹ کے لیے تاریک ٹوکری میں دوبارہ بے نقاب کیا گیا۔ لہٰذا، یہ مشاہدات بتاتے ہیں کہ تاریک ڈبے میں ایک 1- منٹ کی دوبارہ نمائش بحالی کی شمولیت کو منسوخ کر دیتی ہے، لیکن IA میموری کو بجھانے کے لیے ناکافی ہے۔ مزید برآں، ہم نے پایا کہ 0، 1، یا 10 منٹ تک تاریک ٹوکری میں دوبارہ نمائش کے بعد ابتدائی وقت (5 منٹ) پر ERK کو امیگدالا، ہپپوکیمپس اور ایم پی ایف سی میں چالو کیا گیا تھا۔ مستقل طور پر، دماغ کے ان خطوں میں ERK کی روک تھام نے IA میموری کی بحالی/اضافہ اور معدومیت کو روک دیا۔ سب سے اہم بات یہ ہے کہ امیگڈالا، ہپپوکیمپس، اور ایم پی ایف سی میں ERK کی روک تھام نے 1- منٹ کے تاریک ڈبے میں دوبارہ نمائش کے بعد IA میموری کی بحالی میں ثالثی میں اضافہ کو روک دیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ مختصر (1 منٹ) دوبارہ نمائش کے بعد ERK ایکٹیویشن IA میموری کی بحالی کی روک تھام کے لئے تاریک ٹوکری کی ضرورت ہے۔ اس کے برعکس، گہرے ڈبے میں 1- منٹ کی دوبارہ نمائش IA میموری کو بجھانے کے لیے ناکافی تھی، حالانکہ تاریک کمپارٹمنٹ (3 یا 10 منٹ) میں دوبارہ دوبارہ نمائش نے اس میموری کو بجھا دیا۔ اس لیے، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ تاریک ڈبے میں 1- منٹ کی دوبارہ نمائش میموری کی منتقلی کے عمل کو اکساتی ہے جو کہ بحالی/اضافہ کو منسوخ کرتا ہے لیکن معدومیت کی تعلیم کا آغاز نہیں کرتا ہے۔ اجتماعی طور پر، ہم تجویز کرتے ہیں کہ میموری کی منتقلی کا عمل ERK کی ثالثی کی روک تھام کے ذریعے بحالی سے معدومیت تک میموری کے مراحل کو تبدیل کرنے میں معاون ہے۔

ہمارے موجودہ مشاہدات کی طرح، سمعی خوف کنڈیشنگ کا استعمال کرتے ہوئے ایک حالیہ مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ سنگل (1) یا طویل (10) CS پریزنٹیشنز بالترتیب، امیگدالا کے باسولیٹرل علاقے میں پی ای آر کے کی سطح میں اضافے کے ذریعے، یادداشت کی بحالی اور معدومیت کا باعث بنتی ہیں۔ اس کے برعکس، انٹرمیڈیٹ (4–7) CS پریزنٹیشنز امیگدالا کے باسولیٹرل ریجن میں پرک کی سطح کو تبدیل نہیں کرتی ہیں۔ اہم بات یہ ہے کہ انٹرمیڈیٹ CS پریزنٹیشنز میں ERK کی روک تھام نے خوف کی یادداشت کو متاثر نہیں کیا۔ اس مطالعہ نے تجویز کیا کہ خوف کی یادداشت کی بازیافت کے بعد یادداشت کے مرحلے کی بحالی سے معدومیت کی طرف منتقلی ہوتی ہے (Merlo et al.، 2018)۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نے اس تلاش کو بڑھایا اور تجویز کیا کہ منتقلی کا مرحلہ فعال طور پر ERK سگنل کی نقل و حمل کے راستے کو چالو کرنے کے ذریعے میموری کے مراحل کو بحالی سے معدومیت کی طرف تبدیل کرتا ہے۔ سابقہ ​​نتائج (Merlo et al.، 2018) کے برعکس، ہم نے پایا کہ منتقلی کے مرحلے میں امیگدالا، ہپپوکیمپس، اور ایم پی ایف سی میں ERK فاسفوریلیشن شامل ہے۔ یہ تضادات ERK فاسفوریلیشن کی جانچ کرنے والے ٹائم پوائنٹس کے فرق کی وجہ سے ہو سکتے ہیں۔ پچھلی تحقیق میں CS پریزنٹیشن کے 12 منٹ بعد (Merlo et al., 2018) پر پی ای آر کے کی سطح کی پیمائش کی گئی تھی، جب کہ ہمارے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ اس وقت کے قریب (دوبارہ نمائش کے 15 منٹ بعد) پر پی ای آر کے کی بڑھتی ہوئی سطح بنیادی سطح پر واپس آگئی ہے۔ مزید برآں، یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ IA ٹاسک IA میموری کی افزائش کے مشاہدے کے قابل بناتا ہے reconsolidation کے ذریعے، اس طرح ہمیں یہ پتہ چلتا ہے کہ منتقلی کے مرحلے میں ERK کی روک تھام IA میموری کی افزائش کو روکتی ہے۔

پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ 20-60 منٹ پر امیگدالا کے باسولیٹرل خطے میں ERK فاسفوریلیشن میں اضافہ ہوا ہے جب کہ خوف کی یادداشت کے معدوم ہونے کے سیکھنے کے بعد (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018)، جبکہ ہپپوکیمپس ظاہر کرتا ہے۔ سیاق و سباق کے خوف کی یادداشت کے معدوم ہونے کے سیکھنے کے بعد 1 گھنٹے پر یہ ایکٹیویشن (فشر ایٹ ال۔، 2007؛ ٹرونسن ایٹ ال۔، 2009)۔ موجودہ مطالعے میں، ہم نے اسی طرح کے مشاہدات حاصل کیے ہیں کہ معدومیت کے مرحلے میں دوبارہ متحرک ہونے کے سیشن کے بعد 30 منٹ پر perK میں اضافہ کیا جاتا ہے۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ERK فاسفوریلیشن دیر سے ختم ہونے والے مرحلے (20-60 منٹ) کا ایک عام سالماتی دستخط ہے۔

مزید برآں، ہم نے مشاہدہ کیا کہ ERK ایکٹیویشن معدومیت کے مرحلے میں ری ایکٹیویشن سیشن کے بعد ابتدائی اور دیر سے وقت کے پوائنٹس (5 اور 30 ​​منٹ) پر دو طرفہ طور پر ہوتا ہے، جب کہ یہ ایکٹیویشن مونو فیزیکل طور پر بحالی کے مرحلے میں ابتدائی وقت پر ہوتا ہے (تصویر 5) . مستقل طور پر، ERK کو دماغی خطوں میں روکنا ان وقتی نکات پر دوبارہ اتحاد اور معدومیت کے مراحل نے بالترتیب بحالی/اضافہ اور طویل مدتی معدومیت کو روک دیا (تصویر 6A، C–H)۔ ان مشاہدات سے پتہ چلتا ہے کہ بالترتیب IA میموری کی بحالی ثالثی میں اضافہ اور معدومیت کے لیے مونوفاسک اور بائفاسک ERK ایکٹیویشن کی ضرورت ہے۔ یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ ERK CREB فاسفوریلیشن کے اپ اسٹریم ریگولیٹر کے طور پر کام کرتا ہے۔ لہذا، ابتدائی میموری کے مرحلے میں ERK کی عارضی ایکٹیویشن، کم از کم جزوی طور پر، CREB کے اس فاسفوریلیشن میں حصہ ڈال سکتی ہے، جو کہ بحالی اور طویل مدتی معدومیت کے لیے درکار جینوں کے اظہار کو متحرک کرتی ہے۔

سیاق و سباق سے متعلق خوف کنڈیشنگ کا استعمال کرتے ہوئے ہماری پچھلی دریافتوں کی طرح (ممیا ایٹ ال۔، 2009)، CREB کو دوبارہ تشکیل دینے (amygdala/hippocampus/mPFC) اور معدومیت (amygdala/mPFC) میموری کے مراحل میں چالو کیا گیا تھا، جبکہ ERK کو صرف معدومیت کے مرحلے میں چالو کیا گیا تھا۔ ری ایکٹیویشن سیشن کے 30 منٹ بعد۔ مستقل طور پر، pCREB1/pERK– نیوران کی صرف ایک آبادی کو بحالی کے مرحلے میں دیکھا گیا، جب کہ معدومیت کے مرحلے میں الگ الگ نیوران کی آبادی دیکھی گئی: pCREB1/pERK– اور pCREB1/pERK1 نیورون امیگدالا میں (تصویر 2)؛ ہپپوکیمپس میں pCREB- /perK1 نیوران (تصویر 3)؛ اور mPFC میں pCREB1/perK–، pCREB– /perK1، اور pCREB1/perK1 نیوران (تصویر 4)۔ یہ مشاہدات، خاص طور پر pCREB–/ perK1 اور pCREB1/perK– نیورونز کا متضاد مشاہدہ، تجویز کرتا ہے کہ CREB اور ERK کی ایکٹیویشن کو دماغ کے ہر حصے میں مختلف طریقے سے منظم کیا جاتا ہے جب میموری ختم ہو جاتی ہے اور یہ کہ ERK کے آخری مرحلے کی ایکٹیویشن مخصوص اور الگ ہوتی ہے۔ یادداشت کے دیگر عملوں کے مقابلے میں خوف کی یادداشت کے معدوم ہونے کے لیے کردار جیسا کہ ذیل میں زیر بحث آیا ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے مشاہدہ کیا کہ ہپپوکیمپس اور امیگڈالا کے مقابلے ایم پی ایف سی میں pERK1 نیوران زیادہ پائے جاتے ہیں، کیونکہ mPFC نے ہپپوکیمپس اور امیگدالا کے مقابلے میں پی ای آر کے 1 نیوران (معدوم ہونے کا مرحلہ) اور پی سی آر ای بی 1 نیوران (دوبارہ تشکیل دینے کا مرحلہ) کا زیادہ تناسب دکھایا، یہ تجویز کرتے ہوئے ایم پی ایف سی میں ERK کا فعال ہونا میموری کے خاتمے میں زیادہ مخصوص کردار ادا کرتا ہے۔

یہ ابھی تک واضح نہیں ہے کہ آیا نیوران کی ایک ہی یا مختلف آبادیوں کی بحالی، منتقلی، اور ختم ہونے والی یادداشت کے مراحل میں متحرک ہیں۔ پچھلے مطالعہ نے امیگدالا میں "خوف کے نیوران" اور "ختم ہونے والے نیوران" کے ایکٹیویشن کی نشاندہی کی جب خوف کی یادداشت بالترتیب دوبارہ فعال یا بجھ جاتی ہے (ہیری ایٹ ال۔، 2008)۔ لہذا، یہ ممکن ہے کہ ERK اور CREB مختلف دنیاوی پروفائلز کے ساتھ نیوران کی مختلف آبادیوں میں متحرک ہوں (یعنی، "ری کنسولیڈیشن نیوران" اور ختم ہونے والے نیوران)۔ جیسا کہ اوپر تبادلہ خیال کیا گیا ہے، pCREB1 نیوران، بشمول pCREB1/perK1 نیوران، بالترتیب بحالی اور معدومیت کے نیوران کے طور پر جین کے اظہار کو چالو کرنے کے ذریعے IA میموری کی بحالی اور طویل مدتی معدومیت کو منظم کر سکتے ہیں۔ اس کے برعکس، pCREB– /pERK1 نیوران میں ERK ایکٹیویشن CREB کی ثالثی ٹرانسکرپشنی ایکٹیویشن کی منسوخی میں حصہ ڈال سکتا ہے جو کہ بحالی کے لیے ضروری ہو گا کیونکہ یہ ERK ایکٹیویشن خاص طور پر ختم ہونے کے آخری مرحلے میں دیکھا جاتا ہے۔ ERK نے معدومیت کے مرحلے میں جین ایکسپریشن کی ایکٹیویشن کو منسوخ کرنے کے لیے ری کنسولڈیشن نیوران میں چالو کیا ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ پچھلے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ ہپپوکیمپل ERK ایکٹیویشن c-fos کی شمولیت کو روکتا ہے جب سیاق و سباق سے متعلق خوف کی یادداشت ختم ہوجاتی ہے (Gueea et al. یہ ضروری ہے کہ نیورونل آبادیوں کی نشاندہی کی جائے جو بحالی، منتقلی اور معدومیت کو منظم کرتی ہیں اور ان نیورونز کے مالیکیولر دستخطوں اور فعال اہمیت کی چھان بین کرنا ضروری ہے۔ مزید برآں، اس مطالعے میں شناخت شدہ عصبی آبادیوں کے درمیان تعامل نامعلوم ہیں۔ یہ ممکن ہے کہ "معدومیت (منتقلی) نیوران" بحالی نیوران کے فنکشن کو تبدیل کریں تاکہ ان کے درمیان تعاملات کے ذریعے بحالی کو روکا جا سکے (ایزنبرگ ایٹ ال۔، 2003؛ مرلو ایٹ ال۔، 2014)۔ لہذا، امیگدالا، ایم پی ایف سی، اور ہپپوکیمپس میں اور ان کے درمیان ان تعاملات کی جانچ کرنا بھی ضروری ہے۔

اس سے پہلے، ہم نے دکھایا کہ ہپپوکیمپس سیاق و سباق کے خوف کے معدوم ہونے کے سیکھنے کے بعد CREB فاسفوریلیشن اور آرک اظہار میں کوئی تبدیلی نہیں دکھاتا ہے، اور مستقل طور پر، معدومیت کے مرحلے میں ہپپوکیمپس میں پروٹین کی ترکیب کی روک تھام طویل مدتی معدومیت کو روکنے میں ناکام رہتی ہے (ممیا ایٹ ال۔ ، 2009)۔ ان مشاہدات نے اس امکان کو بڑھایا ہے کہ طویل مدتی معدومیت کے لیے ہپپوکیمپس کی ضرورت نہیں ہے۔ تاہم، ہم نے دکھایا کہ ERK IA میموری کے معدوم ہونے کے سیکھنے کے بعد ہپپوکیمپس میں چالو ہوتا ہے، اور مستقل طور پر، ہپپوکیمپس میں ERK ایکٹیویشن کو مسدود کرنا طویل مدتی معدومیت کو روکتا ہے۔ لہذا، ہمارے موجودہ مشاہدات یادداشت کے خاتمے میں ہپپوکیمپس کے لیے ضروری کردار کی نشاندہی کرتے ہیں۔ ہماری پچھلی دریافتوں کے ساتھ مل کر، ہم تجویز کرتے ہیں کہ ہپپوکیمپس یادداشت کے ختم ہونے کے لیے ضروری ہے لیکن جین کے اظہار کو چالو کرنے کے ذریعے "معدوم ہونے والی یادداشت" کو مستحکم کرنے کے لیے استحکام جیسے عمل کے لیے نہیں۔