اینسلیہ فریگرنس وال سے فینولک کمپوزیشنز کی سرگرمی کی رہنمائی شدہ تنہائی۔ اور HepG2 سیلز میں ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ انڈسڈ آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف ان کا سائٹو پروٹیکٹیو اثر حصہ 1

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

خلاصہ: Anneslea fragrans Wall., commonly known as"Pangpo Tea", is traditionally used as folk medicine and healthy tea for the treatment of liver and intestine diseases. The aim of this study was to purify the antioxidative and cytoprotective polyphenols from A.fragrans leaves. After fractionation with polar and nonpolar organic solvents, the fractions of aqueous ethanol extract were evaluated for their total phenolic (TPC) and flavonoid contents(TFC) and antioxidant activities(DPPH, ABTS, and FRAPassays). The n-butanol fraction (BF)showed the highest TPC and TFC with the strongest antioxidant activity. The bio-guided chromatography of BF led to the purification of six flavonoids (1-6) and one benzoquinone lanthanoid (7). The structures of these compounds were determined by NMR and MS techniques. Compound 6 had the strongest antioxidant capacity, which was followed by 5 and 2. The protective effect of the isolated compounds on hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative stress in HepG2 cells revealed that the compounds 5 and 6exhibited better protective effects by inhibiting ROS productions, having no significant difference with vitamin C(p>0.05)، جبکہ 6 نے بہترین اینٹی اپوپٹوس سرگرمی دکھائی۔ نتائج بتاتے ہیں کہ A.fragrans فنکشنل فوڈ اور ہیلتھ نیوٹراسیوٹیکل مصنوعات تیار کرنے کے لیے ایک قیمتی اینٹی آکسیڈینٹ فائٹو کیمیکل ذریعہ کے طور پر کام کر سکتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ:اینسلیہ خوشبو؛ اینٹی آکسیڈینٹ ہدایت یافتہ تنہائی؛ اوکسیڈیٹیو تناؤ؛ flavonoid glycosides

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

1. تعارف

رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کو عام جسمانی اور حیاتیاتی کیمیائی عملوں میں آکسیڈیٹیو سانس کے ذریعے ضمنی مصنوعات کے طور پر تیار کیا جاتا ہے [1]۔ اینڈوجینس فری ریڈیکلز کے طور پر، ROS سیل سگنلنگ اور نارمل رینج میں جسم کی مستقل مزاجی کو برقرار رکھنے میں اہم کردار ادا کرتا ہے [2]۔ اگر ROS کو مؤثر طریقے سے ختم نہیں کیا جاسکتا ہے تو، ضرورت سے زیادہ ROS آکسیڈیٹیو تناؤ کی موجودگی کا باعث بن سکتا ہے، جو سیل کے پھیلاؤ اور اپوپٹوسس کو متاثر کر سکتا ہے [3]۔ آکسیڈیٹیو تناؤ کا مختلف قسم کی بیماریوں سے گہرا تعلق ہے جن میں ذیابیطس، ہائپرلیپیمیا، موٹاپا، کینسر، اور قلبی اور نیوروڈیجنریٹیو امراض شامل ہیں [4]۔ حال ہی میں، بہت سے مطالعات نے اس بات کا ثبوت دیا ہے کہ اینٹی آکسیڈنٹس سے بھرپور غذا میں ضرورت سے زیادہ ROS [5,6] پر ان کی صفائی کی صلاحیت کی وجہ سے فائدہ مند اثرات کی ایک سیریز ہوتی ہے۔

قدرتی اینٹی آکسیڈنٹس میں کئی قسم کے مالیکیول ہوتے ہیں جیسے کہ پولیفینول[]، کیروٹینائڈز [8]، وٹامنز [9]، نائٹروجن پر مشتمل مرکبات [10]، اور کومارینز [9]۔ پولیفینول پودوں کی بادشاہی میں بڑے پیمانے پر تقسیم کیے جاتے ہیں اور ان کی اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات کی وجہ سے صحت کے فوائد کو فروغ دیتے ہیں [11]۔ ان میں سے بہت سے، جیسے resveratrol اور کچھ مشتقات [12]، anthocyanidins [13، isoflavones [14l، catechin [15l، اور quercetin [16]] ROS [1] کی صفائی کے ذریعے اپنے حفاظتی اثر کے لیے مشہور ہیں۔ پچھلے کچھ سالوں سے، پولی فینول کینسر کی روک تھام میں توجہ مبذول کر رہے ہیں[17]، قلبی خرابی[18]، نیوروڈیجینریٹیو امراض [19]، اور عمر بڑھنے [20]۔ لہذا، انسانی صحت کو فروغ دینے کے لیے موثر اینٹی آکسیڈنٹس کی تلاش ایک فوری ضرورت ہے۔

Cistanche قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتا ہے۔

اینسلیہ فریگرنس وال۔ ایک سدا بہار پودا ہے، جو بنیادی طور پر چین کے جنوب میں تقسیم کیا جاتا ہے [21]۔ اس کے آرائشی مقصد کے علاوہ، A.fragrans کے پتوں کو بخار، جگر کی حفاظت، معدہ اور آنتوں کو متحرک کرنے کے لیے چین اور کمبوڈیا [22] کے علاج کے لیے ایک لوک دوا کے طور پر بھی استعمال کیا جاتا ہے، جسے "یونان سماؤ چائنیز ہربل میڈیسن" میں درج کیا گیا ہے۔ .اس کے علاوہ، پتیوں کو چائے کے مشروب کے طور پر بھی پروسیس کیا گیا ہے، جسے "Pangpo Tea" کے نام سے جانا جاتا ہے۔ پچھلی رپورٹوں میں [23]، A.fragrans کے عرق نے اینٹی آکسیڈینٹ اور ملیریا کے خلاف سرگرمیاں ظاہر کی ہیں۔ تاہم، آج تک، A. خوشبوؤں سے اس کے اینٹی آکسیڈینٹ فینولک مرکبات کی اطلاع نہیں ملی ہے۔

اس طرح، اس تحقیق کا مقصد A. fragrans کے پتوں سے ان اینٹی آکسیڈنٹ مرکبات کو الگ تھلگ اور شناخت کرنا تھا جو جگر کی بیماریوں کے علاج کے لیے ان کے روایتی استعمال کے لیے ذمہ دار ہیں۔ چار حصوں، ڈائیکلورومیتھین فریکشن (ڈی ایف)، ایتھائل ایسٹیٹ فریکشن (ای اے ایف)، ایک این بیوٹانول فریکشن (بی ایف)، اور آبی ایتھنول ایکسٹریکٹ کے بقایا پانی کا حصہ (آر ڈبلیو ایف) ان کے کل فینولک (ٹی پی سی) اور کل فلاوونائڈ مواد کے لیے جانچا گیا تھا۔ (TFC) اور ان کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت کے لیے۔ n-butanol فریکشن (BF) میں مضبوط ترین اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کے ساتھ سب سے زیادہ TPC اور TFC تھا۔ BF کے بائیو گائیڈڈ فریکشن نے مرکبات کو صاف کرنے کی اجازت دی۔ مزید برآں، الگ تھلگ مرکبات کا cytoprotective اثر ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (H, O,) - انسانی جگر کے کینسر HepG2 خلیات میں آکسیڈیٹیو تناؤ پر کیا گیا تھا۔ انٹرا سیلولر آر او ایس پروڈکشن اور سیل اپوپٹوسس کا تعین فلو سائٹوومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ اس طرح، اس تحقیق نے A.fragrans پتوں کی نشوونما اور خوراک اور صحت کی صنعت میں ایک فعال اضافی (صحت مند چائے) کے طور پر استعمال کے لیے ایک قیمتی اینٹی آکسیڈینٹ فائٹو کیمیکل جزو فراہم کیا۔

2. نتائج اور بحث

2.1. کسروں اور ذیلی حصوں کی پیداوار کی کارکردگی

نامیاتی سالوینٹس اور کالم فریکشن کے ذریعہ مائع مائع کی تقسیم خام نچوڑ سے بائیو ایکٹیو مرکبات کو افزودہ کرنے کے لئے اہم تکنیک ہیں [24]۔ مائع مائع تقسیم کا استعمال کرتے ہوئے، A. fragrans کے پتوں سے ایتھنول ایکسٹریکٹ (CE) کو بالترتیب چار حصوں (DF، EAF، BF، اور RWF) دینے کے لیے ڈائیکلورومیتھین، ایتھائل ایسیٹیٹ، اور این-بوٹانول کے ساتھ تقسیم کیا گیا۔ حصوں کی پیداوار فیصد 11 سے 27 فیصد تک مختلف پائی گئی۔ بقایا پانی کے حصے (RWF، 27 فیصد) کی سب سے زیادہ پیداوار تھی، اور دوسرے حصوں کی پیداوار اس ترتیب میں تھی: n-butanol fraction (BF، 24 فیصد)، ethyl acetate fraction (EAF، 21 فیصد)، dichloromethane حصہ (DF، 11 فیصد)۔

ذیلی حصوں (BF-A سے E) کی پیداوار کا تناسب 3.82 سے 48.4 فیصد تک مختلف پایا گیا۔ BF-E نے 48.4 فیصد کی سب سے زیادہ پیداوار پیش کی جس کے بعد BF-D (24.96 فیصد) ہے، جس کی پیداوار دیگر حصوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ ہے۔

2.2.HPLC تجزیہ

ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (HPLC) کا پتہ لگانے کو مقداری تعین کے لیے ایک طاقتور تکنیک ثابت کیا گیا ہے۔ HPLC تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ BF میں مضبوط ترین اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کے ساتھ سب سے زیادہ مرکبات تھے۔ اینٹی آکسیڈینٹ اسسیس اور HPLC تجزیہ کی رہنمائی کے تحت، ذیلی حصوں کو الگ تھلگ کرنے کے لئے اینٹی آکسیڈیٹیو فریکشن کو مزید کرومیٹوگراف کیا گیا تھا۔ BF کو ہائیڈریٹڈ رال D101 کالم کا نشانہ بنایا گیا تاکہ پانچ ذیلی حصے (BF-A سے E) حاصل کیے جاسکیں۔ HPLC تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ BF-Cto E میں سب سے زیادہ اینٹی آکسیڈینٹ مرکبات تھے۔ ان حصوں (BF-C سے E) کے بائیو گائیڈڈ فریکشن نے سات خالص مرکبات کو صاف کرنے کی اجازت دی۔

جیسا کہ شکل 1 میں دکھایا گیا ہے، BF اور سات خالص مرکبات HPLC تجزیہ کے ذریعہ پروفائل کیے گئے تھے۔ برقرار رکھنے کے اوقات اور UV جذب کے منحنی خطوط کے ساتھ موازنہ کی بنیاد پر، ان سات مرکبات کی تصدیق برقرار رکھنے کے اوقات کے ذریعے 7.51 منٹ (corrosive، 7)، 7.92 منٹ ((epi) -catechin، 6)، 9.38 منٹ (confusoside، 1)، 9.57 پر ہوئی۔ min((S)-naringenin-7-O- -D-glucopyranoside, 4), 10.32 min(vaccinii folin, 2), 12.64 min (2',3,4,4'-tetrahydroxydi dihydrochalcone, 5)، اور 13.95 منٹ (1-[4-(-D-glucopyranosyloxy)-2-hydroxyphenyl]-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1-پروپینون،3)(شکل 1A)۔ان میں، مرکبات 1-6 فلیوونائڈز سے تعلق رکھتے ہیں، اور مرکب 7 بینزوکوئنولتھانائڈ ہے۔

2.3. کل فینولک مواد (TPC) اور کل فلاوونائڈ مواد (TFC)

A.fragrans کے پتے روایتی طور پر پراسیسڈ ہیلتھ چائے کے طور پر استعمال ہوتے ہیں اور یہ فینولکس اور flavonoids کا ایک اچھا ذریعہ ثابت ہوئے ہیں [25]۔ spectrophotometric asses کے مطابق، TPC اور TFC کو A. fragrans کے پتوں سے مختلف حصوں اور ذیلی حصوں میں جانچا گیا۔ جیسا کہ جدول 1 میں دکھایا گیا ہے، BF میں 238.12±12 کے ساتھ سب سے زیادہ TPC ویلیو تھی۔{8}}5 mg GAE/g اقتباس کے بعد EAF۔ DF نے 66.52±0.57 mg GAE/g ایکسٹریکٹ کے طور پر سب سے کم TPC قدر ظاہر کی۔ اسی طرح، سب سے زیادہ TFC ارتکاز بھی BF میں 165.19±5.21mg RE/extract کی TFC ویلیو کے ساتھ پایا گیا۔ RWF اور EAF (بالترتیب 66.92±1.38 اور 116.12±2.89mg GAE/ایکسٹریکٹ) کے حوالے سے، ان میں BF (165.19±5.21 mg RE/g اقتباس) سے بھی کم TFC ارتکاز تھا، جبکہ DF میں سب سے کم TFC ارتکاز تھا۔ بطور 47.94±2.84 ملی گرام RE/g ایکسٹریکٹ۔ TPC اور TFCin BF کے مواد DF میں موجود مواد سے تقریباً چار گنا زیادہ تھے۔

اعداد و شمار نے BF-E میں سب سے زیادہ TPC اور TFC کی موجودگی کو 262.03±1.72mg GAE/g ایکسٹریکٹ کے طور پر دکھایا ہے۔ بالترتیب 180.52± 6.30 mg RE/g اقتباس، اس کے بعد BF-D(219.84±4.01 اور 157.01±2.50 mg RE/g اقتباس، بالترتیب)، BF-C (210.69±6.31 اور 151.01 ±6.31 اور 151.01mg/3، RE±4. بالترتیب)، جبکہ BF-B اور BF-A سب سے کم TPC اور TFC قدریں تھیں (ٹیبل 1)۔

2.4.اینٹی آکسیڈینٹ ایکٹیوٹی

زیادہ تر پولی فینول، خاص طور پر فلاوونائڈز اور فینولک ایسڈ، مقبول اینٹی آکسیڈینٹ فوڈز (نٹراسیوٹیکلز) میں استعمال ہوتے ہیں اور انسانی فوائد کا ایک سلسلہ پیش کرتے ہیں [17]۔ ہمارے پچھلے مطالعہ میں، A.fragrans کے پتے پولی فینول کا ایک اچھا ذریعہ ثابت ہوئے ہیں[26]۔ تاہم، A. fragrans کے پتوں اور اس کے فائٹو کیمیکلز سے حاصل ہونے والے عرق کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کی ابھی تک تحقیق نہیں کی گئی ہے۔ مختلف اینٹی آکسیڈیٹیو ری ایکشن میکانزم کی وجہ سے، اے بی ٹی ایس، ڈی پی پی ایچ، اور ایف آر اے پی کے تین اسسز کو ملا کر A. fragrans کے پتوں سے فرکشنز اور subfractions کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا اندازہ لگایا گیا۔

Among the fractions, BF showed the most potent antioxidant activity in ABTS, DPPH, and FRAP radical-scavenging activities with 1808.46±96.52,951.42±87.75, and 1822.96± 29.24 μmol TE/g extract （Table 1）.PDF showed the lowest antioxidative activity in ABTS and FRAP assays（139.23±8.62 μmol TE/g extract and 180.05± 9.46 μmol TE/g extract, respectively)(Table 1). Whereas the radical scavenging activities of four fractions (DF, EAE, BF, and RWF) in the DPPH radical-scavenging assay were found to vary from 613.38± 45.35 to 951.42±87.75 μmol TE/g extract, respectively, having no significant difference (p>0.05). These results suggested that the phytochemicals from A. fragrans leaves might be insensitive to DPPH. To further obtain the active metabolites, BF was selected for further fractionation. The BF was subjected to D101 macroporous adsorbing resin column chromatography eluting by a gradient of the methanol-aqueous system to yield five subfractions(BF-A to E). Hence, the ABTS radical-scavenging activity of these subfractions can be ranked as BF-E> BF-C>BF-D FRAP پرکھ میں کم کرنے والی سرگرمی نے انکشاف کیا کہ BF-Dhad سب سے مضبوط اینٹی آکسیڈیٹیو سرگرمی ہے، جس کے بعد BF-C اور BF-E آیا۔ یہ قابل ذکر ہے کہ تین ذیلی حصوں (BF-C سے E) نے ماں کے حصے سے زیادہ اینٹی آکسیڈیٹیو سرگرمی پیش کی۔ (BF)۔ ایک ساتھ لے کر، اینٹی آکسیڈیٹیو فائٹو کیمیکلز کو الگ تھلگ اور شناخت کرنے کے لیے BF-C سے E کو کالم کرومیٹوگرافی میں جمع کرایا گیا۔

2.5 الگ تھلگ مرکبات کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی

تمام الگ تھلگ مرکبات (مرکبات 1-7) کو اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت کے لیے ABTS، DPPH ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمی، اور FRAP اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کے ذریعے جانچا گیا۔ تمام اعداد و شمار کو ٹیبل 2 میں بیان کیا گیا ہے۔ مرکبات 6 اور 2 نے سب سے زیادہ اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی دکھائی، اس کے بعد 5۔ کمپاؤنڈ 4 میں معتدل اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی دکھائی گئی اور مرکبات 1، 3، اور 7 کو ABTS اور DPPH ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمیوں کے ساتھ غیر فعال سمجھا گیا جو 200 μmol سے کم ہے۔ TE/g اقتباس۔ Vc کا استعمال کرتے ہوئے (بالترتیب 2932.91 ±93.63 اور 1873.56±121.68 umol TE/g ایکسٹریکٹ کے ساتھ) مثبت کنٹرول کے طور پر، کمپاؤنڈ6 میں ABTS اور DPPH میں سب سے مضبوط اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی تھی اور DPPH ریڈیکل سکیوینگنگ assays.53±03±193±13±30. TE/g اقتباس (p<0.05）, respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract,="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover,="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">

مزید برآں، فلیوونائڈز (1-6) کے اینٹی آکسیڈینٹ ساخت اور سرگرمی کے تعلق کو روکے جانے والے اثرات کی مختلف ڈگریوں کے ذریعے زیر بحث لایا جاتا ہے۔ کمپاؤنڈ 2 نے مرکبات 1، 3، اور 5 کے مقابلے زیادہ اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی پیش کی، جس نے تجویز کیا کہ 2 میں ڈائی ہائیڈروچلکونز میں 3،4-ڈائی ہائیڈروکسی گروپس ABTS، DPPH ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی، اور FRAP اینٹی آکسیڈینٹ کے خلاف اہم کردار ادا کر سکتے ہیں۔ سرگرمی، اور C-4'in 2 میں بدلا ہوا گلوکوز اس کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت [4] میں اہم کردار ادا کر سکتا ہے۔ مزید برآں، کمپاؤنڈ 6 نے دیگر مرکبات کے مقابلے میں سب سے زیادہ اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کی نمائش کی، جس نے تجویز کیا کہ فلاوان-3-اول (کیٹیچن) شاید ڈائی ہائیڈروچلکونز اور فلاوانونز [27] کے مقابلے میں بہتر ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمی کا مظاہرہ کرتے ہیں۔ خلاصہ طور پر، اچھی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی والے مرکبات 2، 5، اور 6 کو اگلی تحقیق میں H2O2 کے ذریعہ آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف سائٹو پروٹیکٹو اثرات کے لیے مزید منتخب کیا گیا۔

2.6۔ اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی اور TPC/TFC مشمولات کے درمیان تعلق

TPC اور TFC کا ارتکاز FRAP (r{{0}.982 اور 0.977) اور ABTS (r=0.959 اور بالترتیب 0.965)۔ ارتباط میٹرکس نے بھی ABTS اور FRAP اقدار (r =0.992) کے درمیان مضبوط ارتباط ظاہر کیا۔ مزید برآں، ایک ملٹی ویریٹیٹ تجزیہ (PCA)، جو ٹیبل 1 کے ڈیٹا سے نکالا گیا تھا، کیا گیا۔ جیسا کہ شکل 2 میں دکھایا گیا ہے، PCA نے کل تغیرات کے 94.44 فیصد کی وضاحت کی، جس میں PC1 کا 84.73 فیصد تغیر اور PC2 کا حصہ 9.71 فیصد ہے۔ EAF اور RWF کے ساتھ FRAP، ABTS، اور DPPH اسسز اوپری دائیں کواڈرینٹ پر رکھے گئے ہیں، اور BF اور BF-Cto E کے ساتھ TPC اور TFC ارتکاز بالترتیب PC1 مثبت اسکور میں نچلے دائیں کواڈرینٹ پر واقع ہیں۔ دریں اثنا، کم TPC اور TFC ارتکاز کے ساتھ DF اور BF-A سے B تک PC1 منفی سکور کے محور کے ساتھ واقع ہیں۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ TPC اور/یا TFC ارتکاز اینٹی آکسیڈینٹ کی صلاحیت کے ساتھ قریبی تعلق رکھتے ہیں، اور TPCor TFC کا ارتکاز حصوں اور ذیلی حصوں میں جتنا زیادہ ہوگا، ان کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت کی قدریں اتنی ہی زیادہ ہوں گی۔ ان نتائج نے انکشاف کیا کہ A. fragrans کے پتوں کے مختلف حصوں اور ذیلی حصوں میں اعلی فینولک اور flavonoid مواد اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی میں حصہ ڈال سکتے ہیں۔

شکل 2. کل فینولکس، فلیوونائڈز، اور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی پر PCA تجزیہ۔ مختلف حروف والے معنی اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (p<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">

یہ مضمون مالیکیولس 2021، 26، 3690 سے لیا گیا ہے۔ https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules