ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے ماؤس ماڈل میں پولی (پرو-17 ایسٹراڈیول) کے شدید خوراک پر منحصر نیورو پروٹیکٹو اثرات

خلاصہ

17 -Estradiol (E2) ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے طبی ماڈلز میں نیورو پروٹیکشن فراہم کرتا ہے جب نظامی طور پر انتظام کیا جاتا ہے۔ اس مطالعے کا مقصد پولی (pro-E2) فلم بائیو میٹریلز کا استعمال کرتے ہوئے مستقل مدت کے لیے زخمی ریڑھ کی ہڈی پر مقامی طور پر E2 کا اطلاق کرنا تھا۔

جیسے جیسے لوگ ریڑھ کی ہڈی کی چوٹوں کے بارے میں مزید جان رہے ہیں، ہم لوگوں کی جسمانی اور ذہنی صحت پر اس کے اثرات کو سمجھنے لگے ہیں۔ اگرچہ ریڑھ کی ہڈی کی چوٹیں بہت سے منفی اثرات کا سبب بن سکتی ہیں، خوش قسمتی سے، یادداشت پر ان کے اثرات کو کنٹرول کیا جا سکتا ہے۔

سب سے پہلے، ہمیں یہ واضح کرنے کی ضرورت ہے کہ ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کیا ہے۔ ریڑھ کی ہڈی ریڑھ کی ہڈی میں محفوظ ایک اعصاب ہے جو دماغ سے جسم کے مختلف حصوں تک ہدایات پہنچانے کا ذمہ دار ہے۔ اگر ریڑھ کی ہڈی زخمی ہو جاتی ہے، تو جسم کے کچھ حصے دماغ کے ساتھ اچھے تعلق سے محروم ہو جائیں گے، جس کے نتیجے میں اعضاء کی حرکت، سنسنی، اور خود مختار کنٹرول متاثر ہو گا۔

ریڑھ کی ہڈی کی چوٹوں کا لوگوں کی یادداشت پر خاص اثر پڑ سکتا ہے، خاص طور پر ریڑھ کی ہڈی کی چوٹوں والے مریضوں کی بحالی کے ابتدائی مراحل میں۔ ریڑھ کی ہڈی کی چوٹیں کسی شخص کی توجہ، کام کرنے والی یادداشت، اور جذباتی پروسیسنگ کی صلاحیت کو خراب کرنے کا سبب بن سکتی ہیں، جو کسی شخص کی یادداشت کی صلاحیت کو متاثر کرے گی۔

تاہم، یہ منفی اثرات بتدریج کم ہوتے جائیں گے کیونکہ مریض بحالی کے علاج سے گزرتے ہیں۔ مریض میموری گیمز اور دیگر علمی تربیت میں حصہ لے کر اپنی یادداشت کو بہتر بنا سکتے ہیں۔ ایک ہی وقت میں، جسمانی بحالی جسم کی موٹر اور حسی افعال کو بحال کرنے کے لیے بھی سازگار ہے، اس طرح جذباتی اور علمی افعال کو بہتر بناتا ہے۔

ہمیں ریڑھ کی ہڈی کی چوٹوں والے مریضوں کی حوصلہ افزائی کرنی چاہیے کہ وہ بحالی کے علاج میں فعال طور پر حصہ لیں اور جسمانی اور ذہنی صحت کو بہتر بنانے کے لیے بحالی کی تربیت کو جاری رکھیں۔ براہ کرم یقین کریں کہ درست ادراک اور آپریشن کے بعد کے علاج کی مدد سے، مریض ریڑھ کی ہڈی کی یادداشت پر ہونے والے نقصان کے اثرات پر قابو پا سکتے ہیں اور فعال زندگی گزار سکتے ہیں۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche نمایاں طور پر یادداشت کو بہتر بنا سکتا ہے کیونکہ Cistanche نیورو ٹرانسمیٹر کے توازن کو بھی کنٹرول کر سکتا ہے، جیسے کہ acetylcholine کی سطح میں اضافہ اور ترقی کے عوامل، جو یادداشت اور سیکھنے کے لیے بہت اہم ہیں۔ اس کے علاوہ، Cistanche خون کے بہاؤ کو بھی بہتر بنا سکتا ہے اور آکسیجن کی ترسیل کو فروغ دے سکتا ہے، جو اس بات کو یقینی بنا سکتا ہے کہ دماغ کو مناسب غذائیت اور توانائی حاصل ہو، اس طرح دماغی توانائی اور برداشت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔

یادداشت کو بہتر بنانے کے لیے سپلیمنٹس جانیں پر کلک کریں۔

بالغ نر چوہوں میں ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے بعد، پولی (pro-E2) فلمیں ذیلی طور پر لگائی گئیں، اور چوٹ اور امپلانٹیشن کے 7 دن بعد امیونو ہسٹو کیمسٹری کا استعمال کرتے ہوئے نیورو پروٹیکشن کا اندازہ لگایا گیا۔ جب زخمی کنٹرول کے مقابلے میں.

جاری کی گئی E2 خوراک کو بڑھانے کے لیے، بولس ریلیز کرنے والی پولی (pro-E2) فلموں کو پولی (proE2) فلموں میں ان باؤنڈ E2 کو شامل کر کے گھڑا گیا تھا۔

تاہم، زخمی کنٹرول کے مقابلے میں، بولس ریلیز کرنے والی پولی (پرو-ای2) فلموں نے چوٹ کے بعد 7 یا 21 دنوں میں نیورو پروٹیکشن یا سوزش کو محدود نہیں کیا۔ E2 کی زیادہ درست طریقے سے علاج کی خوراک جاری کرنا۔

تعارف

تکلیف دہ ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ (SCI) ایک کمزور حالت ہے جو ریاستہائے متحدہ میں ہر سال 18،000 لوگوں کو متاثر کرتی ہے، جبکہ SCI کا عالمی پھیلاؤ 236 اور 1009 فی ملین کے درمیان ہونے کا تخمینہ لگایا گیا ہے۔

SCI سے متاثر ہونے والے مریضوں کو شدید اعصابی خسارے کا سامنا کرنا پڑتا ہے جن میں احساس کی کمی، آنتوں/مثانے کی خرابی، اور فالج شامل ہیں۔ .

وقت گزرنے کے ساتھ، یہ ایسٹروسائٹس ایک چمکیلی داغ بناتے ہیں جو گھاووں کے کنارے سے باہر محور کی توسیع کو روکتا ہے۔

کئی دہائیوں پر محیط تحقیق نے ثانوی چوٹ کی وجہ سے اعصابی نقصان کو روکنے اور/یا محوری تخلیق نو کو فروغ دینے کے لیے بائیو مالیکیولز کے نظامی انتظامیہ پر توجہ مرکوز کی ہے، جو بالآخر کھوئے ہوئے فنکشن کی بحالی کا باعث بنتی ہے۔ جنسی ہارمون، 17 - estradiol(E2)۔

E2 ایڈمنسٹریشن مرکزی اعصابی نظام کے لیے سوزش کو کم کرکے، 7-9 گلیل سیل ری ایکٹیویٹی کو کم کرکے، 10 آکسیڈیٹیو تناؤ کو محدود کرکے، 11-14 کو کم کرکے اور گلوٹامیٹ کی حوصلہ افزائی کرنے والے ایکزیٹوٹوکسک نیورونل موت کو کم کرکے مرکزی اعصابی نظام کے لیے وسیع پیمانے پر فائدہ مند ہے۔ 16,17 دلچسپ بات یہ ہے کہ E2 کی ایک سے زیادہ خوراکوں کا نظامی انتظامیہ صرف ایک خوراک لینے والے جانوروں کے مقابلے میں 18,19 زیادہ تیزی سے فعال بحالی کو دلاتا ہے۔

چونکہ E2 ایک سے زیادہ خوراکوں کے طریقہ کار کے ذریعے فعال بحالی کو زیادہ مؤثر طریقے سے فروغ دیتا ہے، اس لیے ہمارا مقصد E2 کو مقامی طور پر چوٹ کی جگہ پر (کسی بھی غیر ہدفی اثرات کو روکنے کے لیے) E2 کی متعدد خوراکوں/سسٹمک انجیکشن سے پیدا ہونے والے مسائل کو روکنے کے لیے جاری کرنا تھا۔

اس مقصد کے لیے، ہم نے پولی (پروڈرگ) بائیو میٹریل حکمت عملی کا استعمال کیا جس میں مقامی دوائی (E2) کو پہلے رد عمل والے ایلائل گروپس کے ساتھ فعال کیا گیا اور پھر ایک لچکدار oligo-(ethylene glycol) dithiol کے ساتھ photoinitiatedthiol–ene ریڈیکل اضافے کے ذریعے پولیمرائز کیا گیا، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ .20 ہم نے اعلی مالیکیولر ویٹ پولیمر چینز حاصل کیں، جو پولیمر کے اندر دوبارہ ہونے والی اکائی کے طور پر E2prodrug پر مشتمل ہے۔

ہائیڈرولائٹک انحطاط پر، پولیمر آہستہ آہستہ ارد گرد کے میڈیا میں E2 کو جاری کرتا ہے۔ ریلیز سے صرف دیگر ضمنی مصنوعات کاربن ڈائی آکسائیڈ اور اولیگو (ایتھیلین گلائکول) (oEG) (شکل 1) ہیں۔ فلموں یا مائیکرو فائبرز میں بنائی گئی پولی (پرو-ای2) زنجیریں مہینوں سے سالوں کے ٹائم اسکیل پر وٹرو میں نانومولر کنسنٹریشن پر E2 کو جاری کرسکتی ہیں۔ .20

ان پولی (pro-E2) اسکافولڈز سے جاری ہونے والا E2 بائیو ایکٹیو ہے، اور یہ اسکافولڈز ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ سے متاثرہ آکسیڈیٹیو اسٹریس سے نیوران کی حفاظت کرکے وٹرو میں نیوروٹروفزم اور نیورو پروٹیکشن کو فروغ دیتے ہیں۔ یہاں، ہم نے پولی (pro-E2) فلموں کو contusion SCI کے مورائن ماڈل میں لاگو کیا، چوٹ کے فوراً بعد، اور Vivo میں ان کی نیوروپروٹیکٹو صلاحیت کا اندازہ کیا۔

ہمارے ابتدائی پولی (pro-E2) فلم ڈیزائن نے سوزش کے ردعمل کو متاثر کیے بغیر چوٹ کی جگہ پر (7 دن بعد چوٹ) نیورو پروٹیکشن میں اضافہ کیا۔ چونکہ پولی (pro-E2) فلمیں E2 کے نینوگرامز روزانہ ریلیز کرتی ہیں، ہم نے ریلیز کی ایک اور حکمت عملی تیار کی جہاں unboundE2 کو پولی (pro-E2) میٹرکس میں شامل کیا گیا۔ ہم نے قیاس کیا کہ ان باؤنڈ E2 کی بولس ریلیز اضافی نیورو پروٹیکٹو فوائد فراہم کرسکتی ہے۔

Poly(pro-E2) فلمیں E2 کو برسٹ انداز میں ریلیز کرتی ہیں جس کے بعد پولیمر سے E2 کی کم ارتکاز پر مسلسل ریلیز ہوتی ہے۔ امیونو ہسٹولوجیکل سٹیننگ نے ان بولس ریلیز کرنے والی پولی (پرو-ای2) فلموں کی موجودگی میں ایس سی آئی کے بعد چوٹ کی جگہ پر شدید طور پر (7 دن بعد چوٹ) اور دائمی طور پر (21 دن بعد کی چوٹ) پر موجود نیوران، ایسٹروسائٹس، اور میکروفیجز/مائکروگلیا کا اندازہ کیا۔

نتائج اور بحث

Poly(pro-E2) فلمیں E2 کو نانومولر ارتکاز پر ریلیز کرتی ہیں، ڈورسل روٹ گینگلیون سے نیورونل آؤٹ گروتھ کو فروغ دیتی ہیں، اور وٹرو میں ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ سے متاثر آکسیڈیٹیو اسٹریس سے نیوران کی حفاظت کرتی ہیں۔20 یہاں پیش کردہ مطالعہ پولی (pro-E2) کی صلاحیت کا تعین کرنا چاہتا ہے۔ فلمیں Vivo میں نیورو پروٹیکشن فراہم کرنے کے لئے contusion SCI کے مورین ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے۔

Amoderate contusion SCI کو بالغ مرد چوہوں میں شامل کیا گیا تھا، اور چوٹ لگنے کے فوراً بعد، پولی (pro-E2) فلموں کو براہ راست چوٹ کے اوپر رکھا گیا تھا (شکل 2A)۔ اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ امپلانٹیشن کے بعد پولی (pro-E2) فلمیں برقرار رہیں، روڈامین بی سے لدی پولی (pro-E2) فلموں کو زخمی جانوروں کی ریڑھ کی ہڈی میں لگایا گیا تھا۔ سات دن کے بعد امپلانٹیشن، ریڑھ کی ہڈیوں کو ہلکی مائکروسکوپ (Figure2B) کا استعمال کرتے ہوئے جمع کیا گیا اور امیج کیا گیا۔ تمام جانوروں میں، امپلانٹیشن پروٹوکول کو درست کرنے میں ایمپلانٹڈ روڈامائن بی لوڈڈ پولی (پرو-ای2) فلمیں برقرار رہیں۔

پولی (pro-E2) فلموں کی نیورو پروٹیکشن فراہم کرنے اور سوزش کو کم کرنے کی صلاحیت کو جانچنے کے لیے، پولی (pro-E2) فلمیں (بغیر روڈامین بی) کو ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے بعد لگایا گیا تھا، اور ریڑھ کی ہڈی کو چوٹ اور امپلانٹیشن کے 7 دن بعد اکٹھا کیا گیا تھا۔ طول بلد حصوں (10 μm موٹی) کو کاٹ دیا گیا تھا، چوٹ کے مرکز کے گرد مرکز تھا، اور ریڑھ کی ہڈی میں نیوران اور میکروفیجز کو دیکھنے کے لیے امیونو لیبل لگایا گیا تھا (شکل 3)۔

نیورونل موجودگی کا اندازہ لگانے کے لیے سیکشنز پر NeuN کا لیبل لگایا گیا تھا، اور داغ کے مقداری تجزیے سے یہ بات سامنے آئی کہ پولی (pro-E2) فلموں نے چوٹ کے مرکز کے ارد گرد NeuN مثبت علاقے کو ان زخمی کنٹرولز کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھایا جنہیں فلم امپلانٹس نہیں ملے تھے (شکل 3A؛ p=0.0002)۔ این ایف ایچ (نیوروفیلامینٹ ہیوی چین) کا استعمال کرتے ہوئے محوروں کے لیے اضافی داغ لگنے سے امپلانٹڈ پولی (پرو-ای2) فلموں (فگر 3B؛ p=0.0017) کے شدید نیورو پروٹیکٹو اثر کا بھی انکشاف ہوا۔

ہم نے مشاہدہ کیا کہ نیورو پروٹیکشن میں یہ تبدیلی چوٹ کی جگہ پر اپوپٹوس (کیسپیس 3) میں تبدیلی کی وجہ سے نہیں تھی (سپورٹنگ فگر S1؛ p=0.9966)۔ چالو میکروفیجز (CD68) کے لیے داغدار ہونے سے بھی کوئی ظاہر نہیں ہوا۔ پولی (pro-E2) فلم سے علاج شدہ جانوروں اور غیر علاج شدہ جانوروں کے درمیان اہم فرق (شکل 3C؛ p= 0.7207)۔

ایک ساتھ لے کر، پولی (پرو-ای2) فلمیں سوزش کے ردعمل میں ردوبدل کیے بغیر نیورو پروٹیکشن کو معمولی طور پر بڑھاتی ہیں۔ پولی (پرو-ای2) فلموں نے نیورونل کثافت میں تقریباً 20 فیصد اضافہ کیا، لیکن فلموں میں کوئی واضح اینٹی سوزش اثرات نہیں تھے (مقدار کی بنیاد پر۔ فعال میکروفیجز کے زیر قبضہ علاقہ) (شکل 3)۔

سوزش میں کمی کی یہ کمی اس بات کی نشاندہی کر سکتی ہے کہ E2 کی سوزش اور نیورو پروٹیکٹو خوراکیں الگ الگ ہیں اور یہ دونوں موجودہ فلم کی تشکیل کے ساتھ حاصل نہیں کی گئی تھیں۔ اور زیادہ مضبوط نیورو پروٹیکٹو ردعمل کو فعال کریں۔

E2 کی خوراک میں تیزی سے اضافہ کرنے کے لیے، thepoly(pro-E2) فلموں میں ترمیم کی گئی تاکہ bolus E2 کی ریلیز امپلانٹیشن کے فوراً بعد ہو۔ E2 کے بولس ریلیز کے بعد، پولیمر انحطاط پہلے کی طرح اسی ارتکاز پر E2 کو جاری کرے گا۔ اوپر بیان کردہ تجربہ ان بولس ریلیز کرنے والی پولی (pro-E2) فلموں کا استعمال کر رہا تھا، اور نیورو پروٹیکشن اور سوزش کا اندازہ چوٹ کے بعد 7 دن (dpi) میں کیا گیا تھا۔

تاہم، اضافی فائدے کے بجائے، بولس ریلیز کرنے والی پولی (پرو-ای2) فلموں نے زخمی، علاج نہ کیے جانے والے کنٹرولز کے مقابلے میں NeuN مثبت علاقے میں نمایاں اضافہ نہیں کیا (شکل 4A؛ p=0.6770)۔ بولس ریلیز کرنے والی پولی (proE2) فلموں نے CD68 اظہار میں اضافہ کیا، لیکن یہ اضافہ اعداد و شمار کے لحاظ سے مختلف نہیں تھا (p= 0.1780)۔

GFAP (astrocytes) اور Iba1 (microglia) اظہار میں اضافے کی وجہ سے بولس ریلیز کرنے والی پولی (pro-E2) فلموں کی موجودگی میں glial reactivity اور microglial inflammation میں بڑھتے ہوئے رجحانات کو بھی دیکھا گیا۔ تاہم، یہ اضافہ اعداد و شمار کے لحاظ سے اس سے زیادہ نہیں تھا جو زخمیوں، علاج نہ کیے جانے والے کنٹرولز میں دیکھا گیا تھا (بالترتیب p=0.3233اور p=0.3053)۔ ایک ساتھ لے کر، بولس ریلیز کرنے والی پولی (pro-E2) فلموں نے نیورو پروٹیکشن کو بڑھاوا نہیں دیا، اور ایسٹروسائٹ ری ایکٹیویٹی اور میکروفیج/مائکروگلیہ کی موجودگی کو کم نہیں کیا گیا جیسا کہ ابتدائی طور پر قیاس کیا گیا تھا۔

چونکہ زخمی، علاج نہ کیے جانے والے جانوروں اور زخمی ہونے والے، بولس ریلیز کرنے والے پولی (proE2) فلم سے علاج کیے جانے والے جانوروں کے درمیان فرق شدید، 7 dpi ٹائم پوائنٹ پر نہیں دیکھا گیا، پولی (pro-E2) فلموں کے بعد مزید تفتیش کے لیے ایک دائمی ٹائم پوائنٹ کا انتخاب کیا گیا۔ جاری کر سکتے ہیں E2 long-term.20 اوپر بیان کردہ تجربہ بولس ریلیزنگ پولی (pro-E2) فلموں کے ساتھ دہرایا گیا تھا، لیکن جانوروں کا دائمی اندازہ 21 dpi (شکل 5) پر کیا گیا۔

ریڑھ کی ہڈیوں پر پہلے بیان کردہ اسی قسم کے سیل کے لیے لیبل لگایا گیا تھا۔ تجزیہ کے بعد، زخمی، علاج نہ کیے جانے والے جانوروں کے مقابلے بولس ریلیز کرنے والے پولی (pro-E2) فلم سے لگائے گئے جانوروں میں NeuN کے رقبے کے حصے میں اضافے کی طرف رجحان دیکھا گیا (شکل 5A؛ p=0.0897) مزید برآں، ایسے رجحانات کا مشاہدہ کیا گیا جہاں بولس ریلیز کرنے والی پولی (پرو-ای2) فلموں نے علاج نہ کیے جانے والے، زخمی جانوروں کے کنٹرول کے اعداد و شمار کے مقابلے CD68 اور GFAP اظہار کے علاقے کے حصے کو کم کیا (شکل 5B، C؛ p=0.0859 اور p=0.2780)۔

تاہم، کوئی بھی رجحان اعدادوشمار سے مختلف نہیں تھا۔ دوسری طرف، Iba1 نے بولس ریلیز کرنے والے پولی(pro-E2) سے ٹشو سیکشن کا لیبل لگا کر علاج کیا جانوروں نے علاج نہ کیے جانے والے، زخمی کنٹرول (p < 0.0001) کے اعداد و شمار کے مقابلے میں اظہار میں اضافہ دکھایا۔ ہمارا پچھلا کام ظاہر کرتا ہے کہ پولی(pro-E2) -E2) 15 ملی میٹر × 15 ملی میٹر کور پر کاسٹ ہونے والی فلمیں روزانہ تقریباً 266 این جی E2، 20 ریلیز کرتی ہیں جو یہاں استعمال ہونے والی فلموں (1 ملی میٹر × 1.8 ملی میٹر) سے تقریباً 2 این جی E2 یومیہ ہوتی ہے۔ بولس ریلیز کرنے والی پولی (pro-E2) فلمیں امپلانٹیشن کے بعد 40 ug اضافی انباؤنڈ E2 جاری کرتی ہیں۔

چوہا SCI ماڈلز میں E2 کے استعمال پر توجہ مرکوز کرنے والی تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ کم خوراک والا ایسٹروجن (10 ug/kg) نس کے ذریعے دی جانے والی ری ایکٹیو گلیوسس کو کم کرتا ہے اور سوزش کے واقعات کو کم کرتے ہوئے نیورو پروٹیکشن فراہم کرتا ہے، apoptosis کو روکتا ہے، اور angiogenesis میں اضافہ کرتا ہے۔ منفی اثرات جن میں ڈیپ وینتھرومبوسس اور کینسر 22,23 کی بڑھتی ہوئی شرح اور مردوں میں نسائی جسمانی خصلتوں کی نشوونما شامل ہے۔ یہ قابل ذکر ہے کیونکہ E2 کی زیادہ تر تحقیق نے E2 کو نظامی طور پر یا تو نس کے ذریعے یا انٹرا پیریٹونی طور پر فراہم کرنے پر توجہ مرکوز کی ہے۔

نظامی طور پر E2 کی زیادہ خوراکوں کے استعمال سے حفاظتی خدشات کو مدنظر رکھتے ہوئے، یہ ضروری ہے کہ E2 کے ارتکاز کو مقامی طور پر زخمی ریڑھ کی ہڈی تک پہنچانے کے لیے بہتر بنایا جائے تاکہ ضمنی اثرات کو روکا جا سکے۔ آج تک، صرف ایک مطالعہ نے E2 (2.5 ug یا 25 ug) کو فوکل طور پر پہنچانے کے لیے نینو پارٹیکلز کا استعمال کرتے ہوئے بائیو میٹریل سے E2 فراہم کیا ہے۔ نینو پارٹیکلز سے ریلیز SCI کے چوہے کے ماڈل میں سوزش میں تیزی سے کمی آئی۔9 ہمارے اعداد و شمار (اعداد و شمار 4 اور 5) میں شماریاتی لحاظ سے اہم ردعمل کی کمی E2 کی مقدار میں عدم توازن کی وجہ سے ہو سکتی ہے جسے ہم مقامی طور پر ریڑھ کی ہڈی کو فراہم کر رہے ہیں۔ toomuch E2 (40 ug) شدید طور پر جاری کیا جا رہا ہے جبکہ بہت کم (2 ng) دائمی طور پر جاری کیا جا رہا ہے۔

اگرچہ ہم ان اعداد و شمار سے جو مشاہدہ کرتے ہیں وہ معمولی رجحانات ہیں، یہ مطالعہ Vivo میں نیورو پروٹیکشن کو فروغ دینے کے لیے E2 خوراک کی اہمیت کو اجاگر کرتا ہے۔ E2 کی ابتدائی خوراک کو کم کرنا اور پولی (pro-E2) بائیو میٹریل کے انحطاطی حرکیات کو ایڈجسٹ کرنا اس مسئلے کو کم کرنے میں مدد دے سکتا ہے اور ممکنہ طور پر بہتر نیورو پروٹیکٹو نتائج فراہم کر سکتا ہے۔

اگرچہ یہ مطالعہ صرف اور صرف مردوں میں کیا گیا تھا، لیکن یہ ضروری ہے کہ دونوں جنسوں میں ان پولی (pro-E2) فلموں کے اثر کا اندازہ لگایا جائے تاکہ اس بائیو میٹریل کے لیے ایک درست ترجمہی صلاحیت قائم کی جا سکے۔ تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ ایس سی آئی کے بعد، خواتین میں ایسٹروجن کی بڑھتی ہوئی سطح مردوں کے مقابلے میں ان کے بہتر فعال نتائج کے لیے جزوی طور پر ذمہ دار ہو سکتی ہے۔ اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ ڈلیور شدہ خوراک مردوں اور عورتوں کے لیے یکساں رہے۔

طریقے

پولی (pro-E2) فلموں کی تعمیر۔

پولی (pro-E2) پولیمر P1 کو ترکیب کیا گیا تھا اور اس کی خصوصیت کی گئی تھی جیسا کہ پہلے تفصیل میں بیان کیا گیا ہے۔ 20 جیل پرمییشن کرومیٹوگرافی (GPC) کے مطابق پولیمر کا وزن-اوسط مالیکیولر وزن MW ~ 80 kDa اور Đ ~ 3 ہے۔ پولی (pro-E2) فلمیں پولیمر کو کلوروفارم (5 wt %/wt؛ پولیمر/کلوروفارم) میں تحلیل کرکے، محلول کو 15 ملی میٹر × 15 ملی میٹر گلاس کورسلپس (100 μL حل فی کور سلپ) پر ڈال کر اور انہیں چھوڑ کر بنائی گئی تھیں۔ ویکیوم کے نیچے رات بھر خشک کرنا (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
ان باؤنڈ E2 کے ساتھ پولی(pro-E2) فلمیں بنانے کے لیے، ڈراپ کاسٹنگ سے پہلے پولیمر سلوشن (0.0625 wt %/wt; E2/chloroform) میں ان باؤنڈ E2(Abcam, Cambridge, MA) شامل کرکے فلمیں بنائی گئی تھیں۔ کور سلپس پر حل. امپلانٹیشن سے پہلے، فلموں والی کور سلپس کو 30 منٹ کے لیے الٹرا وائلٹ (UV) تابکاری کا استعمال کرتے ہوئے جراثیم سے پاک کیا گیا تھا اور فلموں کو جراثیم سے پاک بائیو سیفٹی کیبنٹ میں کور سلپس سے چھیل دیا گیا تھا۔ پولی (pro-E2) فلموں کو پھر 1 ملی میٹر × 1.8 ملی میٹر کے ٹکڑوں میں کاٹا گیا جو کہ بالغ ماؤس میں امپلانٹیشن کے لیے موزوں ہے جیسا کہ ذیل میں بیان کیا گیا ہے۔

Contusion Spinal Cord Injury and Poly(pro-E2) فلمیں امپلانٹیشن۔

تمام جراحی اور بعد از آپریشن نگہداشت کے طریقہ کار کو Rensselaer PolytechnicInstitute اور The Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) نے منظور کیا تھا۔ ایس سی آئی کو متاثر کرنے کے لیے، بالغ نر C57BL/6 چوہوں (10- سے 12-ہفتہ پرانے)، جیکسن لیبارٹری سے خریدے گئے (اسٹاک نمبر 000664؛ بار ہاربر، ME)، ایک انٹرا پیریٹونیل انجیکشن کے ساتھ اینستھیٹائز کیے گئے تھے۔ کیٹامین (80 ملی گرام/کلوگرام) اور زائلازین (10 ملی گرام/کلوگرام)۔ جانوروں کی کمر مونڈ دی گئی اور 70٪ ایتھنول اور بیٹاڈائن کا استعمال کرتے ہوئے aseptically تیار کیا گیا۔

37 ڈگری پر برقرار رکھنے والے ہیٹنگ پیڈ پر جانور کو رکھنے کے بعد، کشیرکا کالم کو بے نقاب کرنے کے لیے جلد اور پٹھوں کی تہوں کو کھول دیا گیا، اور ریڑھ کی ہڈی کو بے نقاب کرنے کے لیے چھاتی کے نویں (T9) ورٹیبرا پر ڈورسل لیمینیکٹومی کی گئی۔ ایک اعتدال پسند (75 kdyn) contusionSCI کو اس سطح پر Infinite Horizons impactor (Precision Systems and Instrumentation, Lexington, KY) کا استعمال کرتے ہوئے آمادہ کیا گیا۔

ہیموسٹاسس حاصل ہونے کے بعد، ڈورا کھول دیا گیا (فگر 2) اور پولی (پرو-ای2) فلم یا بولس ریلیز کرنے والی پولی (پرو-ای2) فلم (1 ملی میٹر × 1.8 ملی میٹر) ڈورا کے نیچے اور ریڑھ کی ہڈی کے اوپر رکھی گئی چوٹ کی جگہ. کنٹرول جانوروں میں، ڈورا کھول دیا گیا تھا لیکن پولی (پرو-ای2) فلمیں نہیں لگائی گئی تھیں۔ اس کے بعد پٹھوں کی تہوں کو جراثیم سے پاک سیون کا استعمال کرتے ہوئے بند کر دیا گیا تھا، اور جلد کو جراثیم سے پاک دھات کے زخم کے کلپس کا استعمال کرتے ہوئے بند کر دیا گیا تھا۔

چوہوں کو 2 ملی لیٹر جراثیم سے پاک نمکین کا انجکشن ذیلی طور پر لگایا گیا اور انہیں ان کے پنجروں میں واپس کر دیا گیا اور راتوں رات 37 ڈگری پر گرم سلائیڈ پر رکھا گیا۔ مناسب ہائیڈریشن کو یقینی بنانے اور انفیکشن کو روکنے کے لیے، چوہوں کو چوٹ کے بعد پہلے 5 دن (dpi) کے لیے روزانہ 1-2 ملی لیٹر جراثیم سے پاک نمکین اور جینٹوسن (1 ملی گرام/کلوگرام) کے ساتھ انجکشن لگایا جاتا تھا۔ تجربات کی مدت کے لیے دن میں دو بار مثانے کو دستی طور پر ظاہر کیا جاتا تھا۔ تمام جانوروں کو روائتی حالات میں 12-گھنٹہ ہلکے تاریک چکر پر رکھا گیا تھا جس میں خوراک اور پانی تک رسائی تھی۔

ٹشو کی کٹائی۔

7 یا 21 ڈی پی آئی کے مقرر کردہ ٹرمینل ٹائم پوائنٹس پر، چوہوں کو کیٹامین/زائلازین (1.5× سرجیکل ڈوز) ​​کی مہلک خوراک کے ساتھ انجکشن لگایا گیا اور 0.1 ایمفوسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS؛ pH 7.4) کے ساتھ ٹرانسکارڈیلی طور پر پرفیوز کیا گیا۔ اس کے بعد 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7.4)۔ ریڑھ کی ہڈیوں کو ہٹا دیا گیا، 4% PFA میں 2 گھنٹے کے لیے پوسٹ فکس کیا گیا، اور پھر راتوں رات 0.2M فاسفیٹ بفر (PB؛ pH 7.4) میں منتقل کر دیا گیا۔

ریڑھ کی ہڈیوں کو 30% سوکروز میں 4 ڈگری پر 48 گھنٹے کے لیے کرائیو پروٹیکٹ کیا گیا اور پھر 10 ملی میٹر کے حصوں میں بلاک کر دیا گیا جو چوٹ کی جگہ کے ارد گرد موجود تھے اور ڈورسل کالم اوپر کی طرف تھے۔ ان حصوں کو ٹشو-ٹیک بہترین کٹوتی کرنے والے درجہ حرارت کے درمیانے درجے (VWR International, Radnor, PA) میں سرایت کیا گیا تھا اور خشک برف پر تیزی سے منجمد کر دیا گیا تھا۔ تمام ریڑھ کی ہڈیوں کو مائکروم HM505E کریوسٹیٹ پر 10 μm پر سیکشن کیا گیا تھا، جسے ColorFrost PlusThe Slides (Smofisher) پر رکھا گیا تھا۔ والتھم، ایم اے)، اور پھر −20 ڈگری پر اس وقت تک محفوظ کیا جاتا ہے جب تک کہ امیونوسٹیننگ کے لیے استعمال نہ ہو۔

امیونو ہسٹو کیمسٹری اور کوانٹیفیکیشن۔

سلائیڈوں کو 1 گھنٹے کے لیے گرم سلائیڈ پر پگھلا دیا گیا اور پھر 0.1 MPBS میں 3 بار دھویا گیا۔ اینڈوجینس پیرو آکسیڈیز کی سرگرمی کو RT میں 15 منٹ تک میتھانول میں 6٪ H2O2 میں پتلی سلائیڈوں کو انکیوبیٹ کرکے بجھایا گیا۔ 0.1 M PBS میں 3 بار دھونے کے بعد، حصوں کو 4% BSA اور 0.1% Triton X-100 کے ساتھ 0.1 M PBS میں 1 کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ h کے بعد 4 ڈگری یا RT (ٹیبل 1) پر پرائمری اینٹی باڈیز کا راتوں رات انکیوبیشن۔

سلائیڈوں کو RT پر 1 گھنٹے کے لیے مناسب بایوٹینیلیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈیز (1:1000؛ ویکٹر لیبارٹریز، برلنگیم، CA) کے ساتھ لگایا گیا تھا۔ پابند اینٹی باڈی کو دیکھنے کے لیے، سلائیڈوں کو ویکٹاسٹین ایلیٹ-اے بی سی (ویکٹر لیبارٹریز) کے ساتھ 1 گھنٹے کے لیے لگایا گیا تھا اور 10 منٹ کے لیے ImmPACT3,3′-diaminobenzidine (DAB) یا Vector SG سبسٹریٹ (ویکٹر لیبارٹریز) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔

ان حصوں کو 70٪ اور 90٪ ایتھنول میں ترتیب وار 2 × 2 منٹ انکیوبیشن کے ذریعے پانی کی کمی، 100٪ ایتھنول میں 2 × 3 منٹ، اس کے بعد ہسٹوکلیئر میں 3 × 3 منٹ، اور آخر میں پرماؤنٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک) کے ساتھ احاطہ کیا گیا۔ فی جانور کے چھ حصے، زخمی ریڑھ کی ہڈی میں 100 μm کے فاصلے پر، مقدار کے تجزیہ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔

امیونو لیبل والے حصوں کو ایک Axioplan 2 امیجنگ مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے امیج کیا گیا جس میں AxioCamdigital کیمرہ اور AxioVision ورژن 4.8.2 سافٹ ویئر (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany) اور 5× مقصد ہے۔

ہر سیکشن میں مثبت پکسلز کی تعداد کو MIPAR امیج اینالیسس سافٹ ویئر (MIPAR, Worthington, OH) کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیا گیا تاکہ فی سیکشن کے فیصد مثبت ایریا فریکشن کا حساب لگایا جا سکے۔ ہر ایک داغ کے لئے ہر جانور کے چھ حصوں کے اوسط فیصد مثبت علاقے کا حساب لگایا گیا اور اس کی اطلاع دی گئی۔

شماریاتی تجزیہ۔

تمام ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر رپورٹ کیا جاتا ہے۔ شماریاتی تجزیہ گراف پیڈ پرزم 9 شماریاتی سافٹ ویئر (گراف پیڈ سافٹ ویئر، سان ڈیاگو، CA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ تمام تجربات میں، فی گروپ میں 5-6 جانور استعمال کیے گئے، جو کم از کم دو مختلف جانوروں کے لاٹوں سے شروع ہوئے۔ کنٹرول اور پولی (pro-E2) فلم گروپس کے درمیان فرق کو جانچنے کے لیے، طالب علم کا ٹی ٹیسٹ (اعداد و شمار 3، 4، اور 5) استعمال کیا گیا۔ اہمیت p 0.05 سے کم یا اس کے برابر پر قائم ہوئی۔

اضافی مواد

ضمنی مواد کے لیے PubMed Central پر ویب ورژن سے رجوع کریں۔

اعترافات

مصنفین نے وینمن لائی کا ماؤس سرجری میں مدد کے لیے شکریہ ادا کیا۔

فنڈنگ

اس کام کو کریگ ایچ نیلسن فاؤنڈیشن فیلوشپ (گرانٹ 468116) اور فالج زدہ ویٹرنز آف امریکہ ریسرچ فاؤنڈیشن فیلوشپ (گرانٹ 3171) سے MKG اور NIH R01 (گرانٹ NS092754) اور نیو یارک اسٹیٹ اسپائنل کورڈ انجری ریویو بورڈ سے تعاون حاصل ہوا۔ تمام جانوروں کا کام اوہائیو اسٹیٹ یونیورسٹی نیورو سائنس ڈیپارٹمنٹ سرجیکل کور کی مدد سے انجام دیا گیا جس کی مدد سے NINDS گرانٹ P30NS104177 ہے۔

حوالہ جات

(1)۔ قومی ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے شماریاتی مرکز۔ (2020) ایک نظر میں ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے حقائق اور اعداد و شمار، برمنگھم میں الاباما یونیورسٹی، برمنگھم، AL۔

(2)۔ کرپس RA، Lee BB، Wing P، Weerts E، MacKay J، اور Brown D (2011) A Global Map for Traumatic Spinal Cord Injury Epidemiology: Towards a Live Data Repository for Injury Prevention. ریڑھ کی ہڈی۔ 49، 493–501۔ [پب میڈ: 21102572]

(3)۔ ڈونووان ڈبلیو ایچ (2007) ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ - ماضی، حال اور مستقبل۔ جرنل آف سپائنل کورڈ میڈیسن 30، 85-100۔

(4)۔ Pickelsimer E, Shiroma EJ, and Wilson DA (2010) ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ والے افراد کی طبی طور پر شرکت کے مضر صحت حالات کی ریاست بھر میں تحقیقات۔ J. ریڑھ کی ہڈی کا میڈ۔ 33 (3)،221–231۔ [پب میڈ: 20737795]

(5)۔ سلور جے، اور ملر جے ایچ (2004) Glial Scar سے آگے کی تخلیق نو۔ نیٹ Rev. Neurosci. 5 (2),146–156۔ [پب میڈ: 14735117]

(6)۔ ورما اے کے، داس اے، والیس جی، بیری جے، ورٹیجل اے اے، رے ایس کے، اور بنک این ایل (2013) ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ: موجودہ علاج، مستقبل کے علاج، اور بنیادی سائنس فرنٹیئرز کا جائزہ۔ نیورو کیم۔ Res. 38، 895-905۔ [پب میڈ: 23462880]

(7)۔ Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M, andBeyer C (2018) ایسٹروجن ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے بعد مقامی سوزش کے اظہار اور ایکٹیویشن کو کم کرتا ہے۔ مول نیوروبیول۔ 55 (2)، 1364–1375۔ [پب میڈ: 28127698]

(8)۔ لی جے وائی، چوئی ایچ وائی، جو بی جی، اور یون ٹی وائی (2018) ایسٹروجن مائیکروگلیہ اور ایسٹروسائٹ ایکٹیویشن کو روک کر ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے بعد پیدا ہونے والے نیوروپیتھک درد کو کم کرتا ہے۔ بائیوکیم۔ بائیوفیس۔ ایکٹا،مول۔ بنیاد ڈس. 1864 (7)، 2472–2480۔ [پب میڈ: 29653184]

(9)۔ Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A, and Banik N (2015) Rat SpinalCord Injury میں Nanoparticle Estrogen پلازما، Cerebrospinal Fluid، اور Tissue.J میں تیز تر سوزش کے اثرات کو ختم کرتا ہے۔ نیورو ٹراما 32 (18)، 1413–1421۔ [پب میڈ: 25845398]

(10)۔ سریبنک ای اے، سمانتارے ایس، داس اے، سمتھ جے، میٹزیل ڈی ڈی، رے ایس کے، اور بنک این ایل (2010) ریڑھ کی ہڈی کی دائمی چوٹ کا ایسٹروجن کے بعد کا علاج چوہوں میں لوکوموٹر فنکشن کو بہتر بناتا ہے۔ J. Neurosci. Res. 88 (8)، 1738–1750۔ [پب میڈ: 20091771]

(11)۔ Honda K، Shimohama S، Sawada H، Kihara T، Nakamizo T، Shibasaki H، اور Akaike A (2001) Cultured Cortical Neurons میں Estrogen کے ذریعے Nongenomic Antiapoptotic سگنل کی نقل و حمل۔ J.Neurosci Res. 64 (5)، 466–475۔ [پب میڈ: 11391701]

(12)۔ سریبنک ای اے، ونگرا جے ایم، میٹزیل ڈی ڈی، رے ایس کے، اور بنک این ایل (2003) ایسٹروجن بطور نیورو پروٹیکٹو ایجنٹ ریڑھ کی ہڈی کی چوٹ کے علاج میں۔ این۔ NY Acad. سائنس 993,125–133۔ [پب میڈ: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com