ایڈرینل مورفولوجی کلاسیکی 21- ہائیڈروکسیلیس کی کمی والے بالغوں میں طویل مدتی بیماری کے کنٹرول کے اشارے کے طور پر

پس منظر:کے ساتھ بالغوں کی نگرانیکلاسیکی 21-ہائیڈرو آکسیلیس کی کمی(21OHD) طبی اور لیبارٹری کی ترتیبات میں تغیرات کی وجہ سے چیلنجنگ ہے۔ مزید یہ کہ، 21OHD میں ایڈرینل امیجنگ کے لیے رہنما خطوط ابھی تک دستیاب نہیں ہیں۔ ہم نے کلاسیکی 21OHD میں ایڈرینل مورفولوجی اور بیماری کے کنٹرول کی حیثیت کے مابین تعلقات کا جائزہ لیا۔

طریقے:اس سابقہ، کراس سیکشنل مطالعہ میں 90 بالغ 21OHD مریض اور 270 عمر اور جنس سے مماثل صحت مند کنٹرول شامل تھے۔ ہم نے پیٹ کی کمپیوٹنگ ٹوموگرافی کا استعمال کرتے ہوئے ایڈرینل حجم، چوڑائی، اور ٹیومر کی موجودگی کا اندازہ کیا اور ہارمونل حیثیت کے ساتھ ایڈرینل حجم اور چوڑائی کے ارتباط کا اندازہ کیا۔ ہم نے 21OHD مریضوں (17 -hydroxyprogesterone [17-OHP] میں اچھی طرح سے کنٹرول شدہ حالت کی شناخت کے لیے ایڈرینل حجم اور چوڑائی کی تشخیصی کارکردگی کی چھان بین کی۔<10 ng/mL). 

نتائج:21 کی ایڈرینل مورفولوجیOHD کے مریضوں نے ہائپر ٹرافی ظاہر کی۔(45.6%)، نارمل سائز (42.2%)، اور ہائپو ٹرافی (12.2%)۔ 12 مریضوں (13.3٪) میں ایڈرینل ٹیومر کا پتہ چلا۔ 21OHD مریضوں کا ایڈرینل حجم اور چوڑائی کنٹرولز سے نمایاں طور پر زیادہ تھی (18.2±12.2 mL بمقابلہ 7.1±2۔{17}} mL, 4.7±1.9 ملی میٹر بمقابلہ 3.3±0.5 ملی میٹر، پی<0.001 for both). The 17-OHP and androstenedione levels were highest in patients with adrenal hypertrophy, followed by those with normal adrenal glands and adrenal hypotrophy (P<0.05 for both). Adrenal volume and width correlated positively with adrenocorticotropic hormone, 17-OHP, 11β-hydroxytestosterone, progesterone sulfate, and dehydroepiandrosterone sulfate in both sexes (r=0.33–0.95, P<0.05 for all). For identifying well-controlled patients, the optimal cut-off values of adrenal volume and width were 10.7 mL and 4 mm, respectively (area under the curve, 0.82–0.88; P<0.001 for both). 

نتیجہ:ایڈرینل حجم اور چوڑائی نگرانی کے لیے قابل اعتماد مقداری پیرامیٹرز ہو سکتے ہیں۔کلاسیکی 21OHD والے مریض.

مطلوبہ الفاظ:ایڈرینل ہائپرپالسیا، پیدائشی؛ایڈرینال کورٹیکس; ادورکک حجم؛ اینڈروجن

تعارف

پیدائشی ایڈرینل ہائپرپالسیا ایک ہے۔autosomal recessive بیماریخراب سٹیرایڈوجنیسیس کی وجہ سے، اور 21- ہائیڈروکسیلیس کی کمی (21OHD) تقریباً 95% کیسز [1] کے لیے ہوتی ہے۔ چونکہ 21OHD والے بالغ افراد میں انزائم کی کمی اور طبی خصوصیات کا ایک وسیع میدان ہوتا ہے، اس لیے ایڈرینل اینڈروجن کو دبانا اور بیک وقت بہترین سٹیرایڈ تبدیل کرنا مشکل ہے۔ کم علاج کے نتیجے میں اینڈروجن کی زیادتی اور ایڈرینل کی کمی ہوتی ہے، جب کہ زیادہ علاج اٹروجینک کشنگ سنڈروم اور میٹابولک سنڈروم کا سبب بنتا ہے، جس کے اجزاء میں موٹاپا اور ہائی بلڈ پریشر [2,3] شامل ہیں۔ روایتی طور پر، 17 -ہائیڈروکسائپروجیسٹرون (17-OHP) کو ہارمون کنٹرول کے علاج کے اشارے کے طور پر ماپا جاتا ہے۔ حالیہ مطالعات میں، androstenedione، 21-deoxycortisol، اور 11-oxygenated androgens کو بیماریوں کے کنٹرول کے لیے قابل اعتماد مارکر کے طور پر تجویز کیا گیا ہے۔ تاہم، یہ ہارمون پیمائش کلینیکل پریکٹس میں دستیاب نہیں ہیں [4]۔ مزید برآں، ان ہارمونز کے زیادہ سے زیادہ ہدف کی سطح کا تعین نہیں کیا گیا ہے کیونکہ حوالہ کی حد اور نمونے لینے کا وقت مختلف ہوتا ہے [4]۔ اس طرح، بیماری کے کنٹرول کی عکاسی کرنے کے لیے ایک اور مارکر کی ضرورت ہے۔

ایڈرینل والیومٹری کا استعمال عام ایڈرینل غدود کے طول و عرض کا جائزہ لینے اور مخصوص بیماریوں کی نشاندہی کرنے کے لیے کیا گیا ہے جو ایڈرینل پیرینچیما [5-9] کو متاثر کر سکتے ہیں۔ 21OHD [4] والے مریضوں میں ایڈرینل امیجنگ کی معمول کے مطابق سفارش نہیں کی جاتی ہے، لیکن ان مریضوں میں سمجھا جا سکتا ہے جن کی بیماری پر قابو پانے کی طویل تاریخ، متضاد تھراپی، یا انگوٹھے کے اصول کے طور پر قابو پانے میں مشکل بیماری ہے [10]۔ پچھلے مطالعات میں ایڈرینل حجم اور ہارمون کی حیثیت [11,12] کے مابین ارتباط کی تحقیقات کی گئی ہیں۔ تاہم، 21OHD والے مریضوں میں ایڈرینل حجم کی طبی اہمیت کو اچھی طرح سے ظاہر نہیں کیا گیا ہے۔

ہم نے کلاسیکی 21OHD مریضوں اور صحت مند کنٹرول کے درمیان اعضاء کی چوڑائی اور حجم سمیت ایڈرینل مورفولوجی کا موازنہ کیا۔ مزید برآں، ہمارا مقصد 21OHD والے مریضوں میں ایڈرینل حجم اور بائیو کیمیکل پیرامیٹرز کے درمیان تعلق پر مزید شواہد اکٹھا کرنا اور تشخیصی قدر کا جائزہ لینا تھا۔ادورکک حجمکی طرحطویل مدتی بیماریکنٹرول مارکر.

طریقے

آبادی کا مطالعہ کریں۔

سیول نیشنل یونیورسٹی ہسپتال کے ادارہ جاتی جائزہ بورڈ نے اس سابقہ ​​مطالعہ کی منظوری دی اور باخبر رضامندی کی ضرورت کو ختم کر دیا (IRB نمبر: H-2004-147-1118)۔ نومبر 2016 اور مارچ 2021 کے درمیان، ہم نے 21HD والے 308 مریضوں کی نشاندہی کی جنہوں نے ہمارے مرکز کے اینڈوکرائن کلینک کا دورہ کیا۔ ان میں سے 95 مریضوں نے درج ذیل کو پورا کیا۔شمولیت کے اصول: (1) age >18 سال؛ (2) ایڈرینل امیجنگ کے لیے پیٹ کی کمپیوٹیڈ ٹوموگرافی (CT) کرائی گئی۔ اور (3) CT اسکین کے دن ہی ہارمونل جانچ کرائی گئی۔ ہم نے غیر کلاسیکی 21OHD والے تین مریضوں اور دو ایسے مریضوں کو خارج کر دیا جن کا یکطرفہ ایڈرینالیکٹومی ہوا تھا۔ اس مطالعے میں حتمی کل 90 مریض شامل تھے (44 مرد اور 46 خواتین؛ اوسط عمر، 29.7 ± 7.9 سال)۔

کے موازنہ کے لیےادورکک مورفولوجیاورحجم، اس مطالعہ میں 270 عمر اور جنسی مماثل کنٹرول (135 مرد اور 135 خواتین جن کی اوسط عمر 31.7 ± 3.9 سال تھی) شامل تھے جنہوں نے صحت کی جانچ کے لئے پیٹ کی سی ٹی کروائی۔ ہم نے ایڈرینل ماسز یا کسی معروف اینڈوکرائن بیماری والے مریضوں کو خارج کر دیا جو ان کے ایڈرینل غدود کو متاثر کر سکتے ہیں۔

کلینیکل اور بائیو کیمیکل ڈیٹا

ہم نے ہر مریض کے الیکٹرانک میڈیکل ریکارڈز کا جائزہ لیا اور سی ٹی امیجنگ کے دورے سے ڈیٹا حاصل کیا۔ باڈی ماس انڈیکس (BMI) کو جسمانی وزن کے طور پر تقسیم کیا گیا تھا جس کی اونچائی مربع (kg/m2) ہے۔ ہم نے 20- منٹ کے آرام کے بعد بیٹھنے کی پوزیشن میں ایک خودکار تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے بلڈ پریشر کی پیمائش کی۔

ہم نے ہر مریض کے موجودہ گلوکوکورٹیکوڈ اور فلڈروکارٹیسون ریگیمین کا بھی جائزہ لیا۔ روزانہ glucocorticoid خوراک کے مساوی کا حساب اس طرح کیا گیا: hydrocortisone, 1; prednisolone/prednisone, 4; اور ڈیکسامیتھاسون، 70 [13]۔ Glucocorticoid خوراک کے مساوی اور fludrocortisone خوراک کو جسم کی سطح کے علاقے (BSA) کے ذریعہ معمول پر لانے کے لئے تقسیم کیا گیا تھا۔

صبح کے روزے کے خون کے نمونے لیبارٹری ٹیسٹوں کے لیے تیار کیے گئے تھے اس سے پہلے کہ مریض سٹیرائیڈ دوائیں لیں۔ لیبارٹری ٹیسٹوں میں پلازما ایڈرینوکورٹیکوٹروپک ہارمون (ACTH)، 17- OHP، androstenedione، 11 -hydroxytestosterone (11 -OHT)، 11 -hydroxy androstenedione (11 -OHA)، شامل تھے۔ ٹیسٹوسٹیرون، پروجیسٹرون سلفیٹ (Preg-S)، کل ٹیسٹوسٹیرون، اور پلازما رینن کی سرگرمی۔ ہم نے 21OHD مریضوں کو سیرم 17-OHP لیولز [4] کے مطابق اچھی طرح سے کنٹرول شدہ اور ناقص کنٹرول والے گروپوں میں درجہ بندی کیا، کنویں کے لیے کٹ آف کے طور پر 10 ng/mL سے کم 17-OHP لیول کا استعمال کرتے ہوئے -کنٹرولڈ گروپ جو اوپری نارمل حد سے دو گنا زیادہ سطح کے مطابق ہے [3]۔

ہم نے موٹاپا، ہائپرگلیسیمیا، ہائی بلڈ پریشر، اور ڈیسلیپیڈیمیا کو میٹابولک بیماری کے طور پر شامل کیا، جو میٹابولک سنڈروم [14] کے ہم آہنگی کے معیار سے تبدیل کیا گیا تھا۔ ہر میٹابولک بیماری کی تعریف ضمنی مواد میں بیان کی گئی ہے۔

سی ٹی پروٹوکول

21OHD والے تمام مریضوں کو ملٹی ڈیٹیکٹر سی ٹی سکینرز (64 سے 128 چینلز) کا استعمال کرتے ہوئے یا تو غیر کنٹراسٹ (n=83) یا کنٹراسٹ بڑھا ہوا پیٹ سی ٹی (n=7) سے گزرا۔ کنٹرول گروپ میں، تمام مریضوں کو پیٹ کے CT (n=270) کے برعکس بڑھایا گیا۔ سی ٹی اسکین ڈایافرام کے اوپری حصے سے سمفیسس پبیس کے کمتر مارجن تک اسکین رینج کے ساتھ سوپائن پوزیشن میں کیے گئے تھے۔ حرکت اور غلط رجسٹریشن کے نمونے کو کم سے کم کرنے کے لیے تمام اسکینز ایک ہی سانس میں حاصل کیے گئے تھے۔ تفصیلی ترتیبات حسب ذیل تھیں: کولیمیشن، 64×0.625 ملی میٹر، یا 128×0.6 ملی میٹر؛ گینٹری گردش کا وقت، 0.5 سیکنڈ؛ پچ، 0.891 یا 0.65؛ ٹکڑا موٹائی، 3 ملی میٹر؛ تعمیر نو کا وقفہ، 3 ملی میٹر؛ اور میٹرکس، 512×512۔

80 سے 120 kVp ٹیوب انرجی اور آٹومیٹک ٹیوب کرنٹ ماڈیولیشن ٹیکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں جو ہر وینڈر کے لیے دستیاب ہیں (Care Dose 4D، Siemens Medical Solutions، Erlangen, Germany; Dose Right and Tube Current Modulation, Philips Medical Systems, Best, The Netherlands; یا AutomA, GE میڈیکل سسٹمز, Milwaukee, WI, USA)۔ کنٹراسٹ میں اضافہ شدہ CT کے لیے، پورٹل فیز امیجز کو کنٹراسٹ میڈیم کا انتظام کرنے کے 70 سیکنڈ بعد حاصل کیا گیا۔ 350 mgI/mL کے ارتکاز میں آئوڈینیٹڈ کنٹراسٹ میڈیم کو 30 سیکنڈ کے دوران 1.5 mL/kg کی کل خوراک پر ایک خودکار پاور انجیکٹر کے ذریعے اوپری حصے کی پردیی رگ میں دیا گیا۔

امیجنگ تجزیہ

دو ریڈیولوجسٹ (TMK اور SYK بالترتیب جینیٹورینری امیجنگ کے 6 اور 16 سال کے تجربے کے ساتھ) جو متعلقہ طبی معلومات سے نابینا تھے نے تصویری آرکائیونگ اور کمیونیکیشن سسٹم (Infinitt, Infinitt Healthcare, Seoul, Korea) کا استعمال کرتے ہوئے تمام CT امیجز کا جائزہ لیا۔

ایڈرینل مورفولوجی کو اعضاء کی چوڑائی 5 ملی میٹر سے زیادہ یا اس کے برابر، 2 ملی میٹر سے زیادہ یا اس کے برابر کے مطابق ہائپر ٹرافی، نارمل سائز اور ہائپوٹرافی میں درجہ بندی کیا گیا تھا۔<5 mm, and <2 mm, respectively [8]. We measured the widths of the adrenal limbs at the widest part of the medial or lateral limbs perpendicular to the long axis of the limb in both adrenal glands and calculated the average of those measurements (Fig. 1). The readers carefully examined whether adrenal masses were present. A diagnosis of myelolipoma was considered when the readers detected gross fat inside the mass; otherwise, it was considered an adenoma. In the case of a disagreement, a third radiologist (J.Y.C., 26 years of genitourinary imaging experience) who was also blinded to the patient's clinical information provided input.

ایڈرینل غدود کی حجمی تشخیص کے لیے، ایک ریڈیولوجسٹ (TMK) نے تجارتی طور پر دستیاب سافٹ ویئر (MEDIP، Medical IP، Seoul, Korea) کا استعمال کرتے ہوئے محوری سی ٹی امیجز میں ہر طرف ایڈرینل پیرانچیما کو دستی طور پر الگ کیا۔ والیومیٹرک پیمائش کرنے کے لیے، ہم نے دستی طور پر ایڈرینل غدود کے حاشیے کو غدود کی سطح سے جتنا ممکن ہو سکے متوجہ کیا تاکہ ملحقہ فیٹی ٹشو، جگر، کمتر وینا کاوا، تلی، اور لبلبے کی دم کو خارج کیا جا سکے۔ ہم نے احتیاط سے ٹیومر سے گریز کیا کیونکہ ہم پیرنچیمل حجم پر توجہ مرکوز کرنا چاہتے تھے۔ adre nal parenchymal حجم کے دونوں اطراف کو ملا کر کل adre nal حجم کی گنتی کی گئی۔ ہم نے پیرینچیما سے آزادانہ طور پر ایڈرینل ٹیومر کو بھی الگ کیا، اور ٹیومر کے کل حجم کو تمام منقسم ٹیومر کے مجموعہ کے طور پر شمار کیا گیا۔ تمام عمل ایک معیاری پیٹ کی کھڑکی کی ترتیب میں 300 کی چوڑائی اور 40 کی سطح کے ساتھ انجام دیے گئے تھے۔ انٹر آبزرور کی وشوسنییتا کا اندازہ کرنے کے لیے، ایک اور ریڈیولوجسٹ (SYK) نے اسی طریقے سے 90 21 OHD مریضوں کی اضافی پیمائش کی۔

مزید برآں، ہم نے ایک مخصوص سافٹ ویئر پروگرام (DEEPCATCH، میڈیکل آئی پی) کا استعمال کرتے ہوئے پورے جسم کی ساخت کا تجزیہ کیا۔ سافٹ ویئر پروگرام دستی انقطاع [15] کے مقابلے میں 97% کی اوسط سیگمنٹیشن درستگی کے ساتھ جسم کے اجزاء کی مکمل طور پر خودکار سیگمنٹیشن فراہم کرتا ہے۔ کنکال کے پٹھوں کا L3 سیکشنل ایریا (cm2 )، پیٹ کی ویسریل چربی، اور subcutaneous fat خود بخود مقدار میں طے ہو گئی۔ پیٹ کی چربی کے کل حصے کا حساب پیٹ کی ویسریل چربی اور ذیلی چربی والے علاقوں کا خلاصہ کرکے کیا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، کمر کا طواف (سینٹی میٹر) کولہے کی ہڈی کے اوپری سرے کی سطح میں خود بخود ناپا گیا۔ ایک اینڈو کرائنولوجسٹ (ایچ این جے) نے خودکار تقسیم کے نتائج کی تصدیق کی۔ ہم نے 21OHD مریضوں کی جسمانی ساخت کا موازنہ اچھی طرح سے کنٹرول شدہ اور ناقص کنٹرول والے گروپوں کے درمیان کیا۔

بائیو کیمیکل اسیسز

پلازما ACTH کی سطح کو امیونوراڈیومیٹرک پرکھ (Cisbio Bioassays, Saclay, France) کا استعمال کرتے ہوئے 3.7% اور 3.8% کے انٹرا- اور انٹر-اسے کوفیشینٹس آف ویری ایشن (CVs) کے ساتھ ماپا گیا۔ Radioimmunoassay (RIA) CT کٹس (Asbach Medical Products GmbH, Obrigheim, Germany) کا استعمال سیرم 17- OHP اور dehydroepiandrosterone سلفیٹ (DHEA-S) کی سطحوں کی پیمائش کے لیے کیا گیا تھا۔ OHP لیولز کے لیے انٹرا اور انٹر اسے CVs بالترتیب 4.6% اور 7.7% تھے، اور DHEA-S لیولز کے لیے متعلقہ CVs 3.6% اور 6.5% تھے۔ سیرم کل ٹیسٹوسٹیرون کی سطح کو TESTO-CT2 کٹ (Cisbio Bioassays) سے ماپا گیا تھا۔ کل ٹیسٹوسٹیرون کے لیے انٹرا اور انٹر اسے CVs بالترتیب 3.1% اور 5.2% تھے۔ پلازما رینن کی سرگرمی کا اندازہ PRA RIA کٹ (TFB Inc., White Lake, MI, USA) کے ساتھ بالترتیب 3.8% اور 6.7% کے انٹرا اور انٹر-اسے CVs کے ساتھ کیا گیا تھا۔ ایڈرینل سٹیرائڈز، بشمول اینڈروسٹینیڈین، 11 -OHT، 11 -OHA، ٹیسٹوسٹیرون، اور Preg-S کو مقداری طور پر مائع کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (LC-MS) کے ذریعے بنایا گیا تھا، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [16]۔ سیرم کے انفرادی ارتکاز کی بنیاد پر، ہم نے 11 -ہائیڈروکسی ٹیسٹوسٹیرون اور ٹیسٹوسٹیرون (11 -OHT/T) کے میٹابولک تناسب کا بھی تخمینہ لگایا تاکہ ورشن 11 -ہائیڈروکسیلیس سرگرمی کی نشاندہی کی جا سکے۔

میٹابولک بیماری کی تعریف

Patients with a BMI >25 کلوگرام / ایم 2 کو موٹاپا سمجھا جاتا تھا۔ ہائپرگلیسیمیا، جس میں ذیابیطس mellitus اور prediabetes شامل ہیں، کی تعریف ہیموگلوبن A1c کی قدر 5.7 فیصد سے زیادہ یا اس کے برابر، روزہ رکھنے والے پلازما گلوکوز کی سطح 100 mg/dL سے زیادہ یا اس کے برابر، یا کسی بھی زبانی اینٹی ڈائیا بیٹک ادویات کا استعمال۔ یا انسولین تھراپی۔ ہائی بلڈ پریشر کی تعریف 130 mm Hg سے زیادہ یا اس سے زیادہ یا اس کے برابر اور/یا diastolic بلڈ پریشر 85 mm Hg سے زیادہ یا اس کے برابر یا کسی بھی اینٹی ہائپرٹینشن ادویات کے استعمال کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔ ڈسلیپیڈیمیا کو غیر معمولی لپڈ پینل کے طور پر بیان کیا گیا تھا (کل کولیسٹرول 240 ملی گرام/ڈی ایل سے زیادہ یا اس کے برابر، کم کثافت لیپو پروٹین کولیسٹرول 160 ملی گرام/ڈی ایل سے زیادہ یا اس کے برابر، ٹرائگلیسرائڈز 150 ملی گرام/ڈی ایل سے زیادہ یا اس کے برابر یا زیادہ، کثافت لیپو پروٹین کولیسٹرول<40 mg/dL) or the use of lipid-lowering agents.

شماریاتی تجزیہ

گروپ موازنے کے لیے، ہم نے فشر کے عین مطابق ٹیسٹ کو زمرہ وارانہ متغیرات کے لیے اور آزاد ٹی ٹیسٹ یا Mann–Whitney U ٹیسٹ کو مسلسل متغیرات کے لیے استعمال کیا، جیسا کہ مناسب ہو۔ ایڈرینل مورفولوجی کے مطابق 21OHD مریضوں میں 17-OHP اور androstenedione کا موازنہ کرنے کے لیے Conover پوسٹ ہاک تجزیہ کے ساتھ Kruskal–Wallis ٹیسٹ کیا گیا۔ ہم نے فینوٹائپ، حیض کی باقاعدگی، اور ایڈرینل ٹیومر کی موجودگی کے مطابق کل ادورکک حجم کے ذیلی گروپ کے تجزیے کئے۔ ہم نے ارتباط کے تجزیے کے لیے اسپیئر مین ارتباط کے گتانک کا استعمال کیا، جس کے لیے غیر عام طور پر تقسیم شدہ متغیرات (تمام بائیو کیمیکل پیرامیٹرز اور ایڈرینل والیوم) کو لاگ میں تبدیل کیا گیا تھا۔

عام آبادی میں 21OHD مریضوں کے ساتھ امتیازی سلوک کرنے کے لیے ایڈرینل حجم اور چوڑائی کی تشخیصی درستگی کا اندازہ لگانے کے لیے ایک ریسیور آپریٹنگ خصوصیت کا تجزیہ کیا گیا تھا، ساتھ ہی ساتھ اچھی طرح سے کنٹرول والے گروپ اور کم از کم ایک میٹابولک بیماری والے مریضوں کی پیش گوئی کرنے کے لیے۔ انٹرآبزرور معاہدے کا اندازہ انٹرا کلاس کوریلیشن کوفیشینٹ (ICC) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، جس میں ICC کی قدریں ہیں۔<0.4, 0.4–0.6, 0.6–0.8, and >0.8 کو بالترتیب ناقص، اعتدال پسند، اچھے، اور بہترین معاہدے کی نشاندہی کے طور پر تعبیر کیا گیا۔ تمام شماریاتی تجزیے SPSS ورژن 25 (IBM, Armonk, NY, USA) اور P اقدار کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے۔<0.05 were considered statistically significant.