BMAL کی واضح غیر موجودگی

کے لئے ہربل فارمولیشن دائمی گردے کی بیماری

مطلوبہ الفاظ: سرکیڈین کلاک جینز؛ گردوں کی تقریب؛ انٹیگریٹیو فزیالوجی

1. تعارف

زیادہ تر جسمانی عمل میں سرکیڈین تال نمایاں ہیں۔ ان تالوں کا کنٹرول ایک مرکزی گھڑی کے ذریعے ثالثی کیا جاتا ہے جو دماغ کے suprachiasmatic نیوکلئس میں رہتی ہے، لیکن پیریفرل سرکیڈین گھڑیاں بھی جسمانی فعل میں تال کو متاثر کرتی ہیں [1]۔ مالیکیولر کلاک ٹرانسکرپشن-ٹرانسلیشن فیڈ بیک لوپ پر مشتمل ہوتا ہے۔ مختصراً، بنیادی پروٹین ایرل-ہائیڈرو کاربن-رسیپٹر-نیوکلیئر-ٹرانسلوکیٹر نما پروٹین (ARNTL؛ یا BMAL1) اور سرکیڈین لوکوموٹر آؤٹ پٹ سائیکل کپوٹ (CLOCK) مثبت طور پر پیریڈ اور کرپٹو کروم جینز کی نقل کو منظم کرتے ہیں۔ پیریڈ (PER) اور Cryptochrome (CRY) پروٹین BMAL1/CLOCK کی سرگرمی پر فیڈ بیک اور روکتے ہیں ([2,3] میں جائزہ لیا گیا)۔ سرکیڈین پر قابو پانے والے عمل میں خلل بہت سے پیتھالوجیز سے وابستہ ہے، بشمول قلبی اور گردے کی بیماریاں [4,5]۔ آج تک، ٹارگٹڈ سرکیڈین رکاوٹ کے بعد مختلف اعضاء کے نظاموں کے درمیان کراس ٹاک کو اچھی طرح سے سمجھا نہیں گیا ہے۔ یہ مطالعہ کنکال کے پٹھوں میں کور کلاک پروٹین BMAL1 کے حذف ہونے اور اس گھڑی میں خلل کے گردے پر ہونے والے ممکنہ اثرات پر توجہ مرکوز کرتا ہے۔

کنکال-پٹھوں سے متعلق مخصوص BMAL1-Inducible-nockout (iMS-BMAL1 KO) ماؤس ماڈل کو پہلے بیان کیا گیا ہے کہ وہ عمر بڑھنے میں نظر آنے والی خصوصیات کے حامل ہیں۔ یہ چوہے بدلی ہوئی چال، کم نقل و حرکت، پٹھوں کی کمزوری، اور گلوکوز کی خرابی کی نمائش کرتے ہیں [6,7]۔ گردے کی بیماری بڑھاپے کا مترادف ہے کیونکہ عمر کے ساتھ ساتھ گردے کی بیماریاں بڑھ جاتی ہیں [8]۔ iMS-BMAL1 KO چوہوں میں رپورٹ کی گئی ایک اور خصوصیت یہ ہے کہ وہ کنڈرا کیلکیفیکیشن میں اضافہ ظاہر کرتے ہیں [6]۔ ایسڈ بیس بیلنس اور منرل ہومیوسٹاسس میں گردوں کا کردار ہڈیوں کی صحت کو گردے کی بیماری سے براہ راست جوڑتا ہے۔ اس کے نتیجے میں، ہم نے قیاس کیا کہ iMS-BMAL1 KO چوہے ممکنہ طور پر گردے کی بیماری کا نمونہ ہو سکتے ہیں۔

اس مطالعے کا مقصد یہ طے کرنا تھا کہ آیا کنکال کے پٹھوں میں گھڑی کی رکاوٹ گردوں کی خرابی کا باعث بنتی ہے۔ کنکال کے پٹھوں میں BMAL1 کے حذف ہونے سے گردے میں سوزش کے نشانات میں اضافہ ہوتا ہے۔ تاہم، iMS-BMAL1 KO سے نہ تو گردوں کا فعل متاثر ہوتا ہے اور نہ ہی گردے کی ہسٹولوجی۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ کنکال کے پٹھوں میں گھڑی کی رکاوٹ کے نتیجے میں جانچ کی گئی شرائط کے تحت گردے میں کم سے کم تبدیلیاں آتی ہیں۔

2. مواد اور طریقے

جانور۔ اس مطالعے میں استعمال ہونے والا ماؤس ماڈل فلوکسڈ ایکسون 8 BMAL1 چوہوں [9] کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا جو کنکال کے پٹھوں سے متعلق مخصوص، Cre-recombinase چوہوں (Human skeletal actin–Cre) کے ساتھ کراس کیا گیا تھا۔ آئی ایم ایس BMAL1 KO بنانے کے لیے مطالعہ سے 5 ہفتے پہلے (2 mg/day؛ 5 دن ip.) tamoxifen (سورج مکھی کے بیجوں کے تیل میں 15% ایتھنول میں بنایا گیا) کے انجیکشن کے ذریعے Cre کو چالو کیا گیا تھا۔ گاڑی (سورج مکھی کے بیجوں کے تیل میں 15٪ ایتھنول) انجیکشن کری + چوہوں کو بطور کنٹرول استعمال کیا گیا۔ نر کنواری نوجوان چوہوں کا مطالعہ 17-19 ہفتوں میں کیا گیا تھا، اور بوڑھے چوہوں کا 13-14 ماہ میں مطالعہ کیا گیا تھا۔ تمام تجربات نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ گائیڈ برائے لیبارٹری جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کے ذریعہ کئے گئے تھے اور یونیورسٹی آف فلوریڈا انسٹیٹیوشنل اینیمل کیئر اینڈ یوز کمیٹی اور نارتھ فلوریڈا/ساؤتھ جارجیا ویٹرنز ایڈمنسٹریشن انسٹیٹیوشنل اینیمل کیئر اینڈ یوز کمیٹی کے ذریعہ منظور شدہ اور نگرانی کی گئی تھی۔ چوہوں کو درجہ حرارت- (20–26 ◦C) اور نمی پر قابو پانے والے، 12:12 گھنٹے ہلکے گہرے سائیکل والے کمروں میں رکھا گیا تھا۔ چوہوں کو پانی اور معیاری 18% پروٹین چوہا چاؤ (نمبر 2918، ہارلن ٹیکلاڈ/اینویگو، میڈیسن، WI، USA) تک اشتھاراتی رسائی فراہم کی گئی تھی جب تک کہ دوسری صورت میں نوٹ نہ کیا گیا ہو۔

میٹابولک کیج اسٹڈی۔ نوجوان نر چوہوں کا ایک گروہ (5 کنٹرول اور 5 KS-BMAL1 KO) میٹابولک پنجروں میں پیشاب جمع کرنے اور خوراک/پانی کی مقدار کی نگرانی کے لیے رکھا گیا تھا [10]۔ پاؤڈر پر مبنی جیل ڈائیٹ (اینویگو ٹیکلاڈ کسٹم ڈائیٹ) جس میں 1٪ ایگر شامل تھا تیار کیا گیا تھا اور میٹابولک کیج کے جمع کرنے میں استعمال کیا گیا تھا۔ کنٹرول ڈائیٹ ({{10}}.25% NaCl؛ 0.6% K؛ Envigo 99131) پر جمع کرنے کے آغاز سے پہلے چوہوں کو میٹابولک پنجروں کے مطابق ہونے کے لیے 3 دن کا وقت دیا گیا تھا۔ کنٹرول ڈائیٹ کے ساتھ ریکارڈنگ کے ایک دن کے بعد، چوہوں کا پانچ دنوں تک پوٹاشیم کی کمی والی خوراک (0.25% NaCl; 0.0001% K؛ Envigo 99134) کے ساتھ علاج کیا گیا۔ پیشاب کے نمونے ہر 12 گھنٹے میں دن کی روشنی اور رات کے اوقات کے اختتام پر جمع کیے جاتے تھے (زیٹ جیبر ٹائم 0 اور 12)۔ پیشاب کی پیداوار، کھانے کی مقدار، اور پانی کی مقدار ریکارڈ کی گئی۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق پیشاب کے الیکٹرولائٹ ارتکاز کو شعلہ فوٹو میٹر (کول-پرمر ماڈل 2655- 00، ورنن ہلز، IL، USA) کے ذریعے ماپا گیا۔ چوہوں کو ایتھانائز کیا گیا تھا، اور زیٹ جیبر ٹائم 6 پر ٹشو جمع کیے گئے تھے۔

جسمانی ساخت۔ پوٹاشیم کی کمی والی خوراک کے استعمال سے پہلے اور پانچ دن بعد باشعور نوجوان نر چوہوں میں جسمانی ساخت کی مقدار درست کردی گئی۔ ایکو ایم آر آئی کوانٹیٹیو میگنیٹک ریزوننس باڈی کمپوزیشن اینالائزر (ایکو میڈیکل سسٹمز، ہیوسٹن، ٹی ایکس، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے زیٹ جیبر ٹائم 4–6 پر پیمائش کی گئی [11]۔

فیز ایڈوانس پروٹوکول۔ بوڑھے نر چوہوں کا ایک الگ گروہ اکیلے پنجروں میں رکھا گیا تھا جو چلتے ہوئے پہیے سے لیس تھا جس میں چاؤ (نمبر 2918، ہارلان ٹیکلاڈ) اور پانی تک رسائی تھی۔ پنجروں کو ہلکے کنٹرول والے باکس میں مستقل ہوا کے تبادلے (Actimetrics، Wilmette، IL، USA) کے ساتھ محفوظ کیا گیا تھا۔ لائٹنگ شیڈول کو 12:12 گھنٹے کے لائٹ ڈارک سائیکل پر سبز LED (~200 lux) لائٹ سورس کا استعمال کرتے ہوئے برقرار رکھا گیا تھا۔ بیس لائن کے ایک ہفتے کے بعد، تاریک سائیکل میں 7 گھنٹے کا اضافہ ہوا، اور چوہوں کو ایک ہفتے کے لیے اس نئے 12:12 گھنٹے کے لائٹ ڈارک سائیکل شیڈول پر برقرار رکھا گیا۔ اس عمل کو دوسری بار دہرایا گیا تاکہ 14-گھنٹہ فیز ایڈوانس تیار کیا جا سکے۔ چوہوں کو Zeitbeger کے وقت 2 میں 2–3 کے گروپوں میں ایتھانائز کیا گیا تھا، اور فیز ایڈوانس کے دوسرے ہفتے کے 7-10 دن بعد ٹشو جمع کیے گئے تھے۔

دوبارہ ملاپ کی خصوصیت۔ Bmal1 کے دوبارہ ملاپ کی خصوصیت کی تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے پی سی آر کو 40 این جی کنکال کے پٹھوں کے جینومک ڈی این اے اور پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے مکمل کیا۔ (fwd پرائمر: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG، rev پرائمر: CTGACCAACTTGCTAACAATTA، دوبارہ مجموعہ پرائمر: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT)۔ فلوکسڈ Bmal1 ایلیل کے فارورڈ اور ریورس پرائمر ایک 431-bp پروڈکٹ دیتے ہیں۔ دوسرا فارورڈ پرائمر 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30 دوبارہ جوڑنے والے پروڈکٹ کا پتہ لگانے کے لیے شامل کیا گیا تھا، جو 572 bp پر ایک بینڈ دکھاتا ہے۔ پی سی آر ری ایکشن پروڈکٹس کو 1.7٪ ایگروز جیل پر چلایا گیا تھا، اور جینومک بینڈ اور ایک ری کمبینیشن مخصوص بینڈ کی شناخت نے اس بات کی تصدیق کی ہے کہ تمام ٹاموکسفین سے علاج کیے جانے والے جانور ٹشو سے متعلق KO تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [7,12]۔

امیونو ہسٹو کیمسٹری۔ inhalant isoflurane کے ساتھ بے ہوشی کرنے پر، دائیں گردے جمع کیے گئے اور فوری طور پر آدھے حصے میں کاٹ دیے گئے پھر 4 ◦C پر تقریباً 48 گھنٹے کے لیے پیریڈیٹ لائسین-2% paraformaldehyde میں محفوظ کیا گیا۔ اس کے بعد پروسیسنگ کی تیاری کے لیے سیال کو پی بی ایس میں تبدیل کر دیا گیا۔ ہر جانور کے گردے کے نمونے پیرافین میں سرایت کیے گئے تھے، اور 4- مائیکرو میٹر موٹے حصے کاٹ کر شیشے کی سلائیڈوں پر نصب کیے گئے تھے۔ BMAL1 (D2L7G سیل سگنلنگ؛ 1:3000؛ RRID: AB_2728705، Danvers,MA کو نشانہ بنانے کے لیے حصوں کو یا تو ہیماتوکسیلین اور eosin سے داغ دیا گیا تھا یا 3,30 -diaminobenzidine chromogenic substrate (Vector) سے داغ دیا گیا تھا۔ USA)۔ حصوں کا مشاہدہ لائٹ مائکروسکوپی کے ذریعے کیا گیا (Nikon E600 Nikon DXM1200F ڈیجیٹل کیمرے سے لیس، Melville، New York, NY, USA)۔ گروپ شناخت کنندگانہر سلائیڈ سے ہٹا دیا گیا، اور BMAL1 ایکسپریشن کی جانچ کی گئی یا درج ذیل معیارات کا استعمال کرتے ہوئے نلی نما چوٹ کے لیے سلائیڈز اسکور کی گئیں: نلیوں کا فیصد جس میں نلی نما نیکروسس، برش بارڈر کی کمی، نلی نما بازی، اور پروٹین کاسٹ کی تشکیل کی علامات ظاہر ہوئیں۔

ہارسریڈش-پیرو آکسیڈیز-کنججٹیڈ اینٹی خرگوش ثانوی اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹڈ۔ TBS-T کے ساتھ 30 منٹ کے لیے اضافی دھونے کے بعد، امیجنگ کے لیے 30 سیکنڈ کی نمائش کے وقت کے ساتھ سگنل فائر ای سی ایل ری ایجنٹ (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی) کا استعمال کرتے ہوئے پتہ لگایا گیا۔ کثافت کی پیمائش فجی کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی، اور پروٹین کی کثرت کو پونسیو سٹیننگ میں معمول بنایا گیا تھا۔

ملٹی پلیکس امیونوساز۔ عمر رسیدہ نر چوہوں میں کارٹیکل اور میڈولری علاقوں کو آدھے گردے سے الگ کیا گیا تھا۔ ٹشو کو 300 µL (کورٹیکس) یا 250 µL (میڈولا) بفر (1% پروٹیز – فاسفیٹیس انحیبیٹر کاک ٹیل (تھرمو سائنٹیفک) 1% 1 M ایتھیلینیڈیامینیٹیٹراسیٹک ایسڈ، 0.1% ٹوین فاسٹ میں یکساں کیا گیا تھا۔ بفر شدہ نمکین)۔ ہر نمونے کے لیے پروٹین کی حراستی کا تعین BCA (پیئرس، تھرمو سائنٹیفک) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ تجارتی ملٹی پلیکس امیونواسے کٹس (بلی# کی MCYTOMAG-70K، MBNMAG-41K، اور MKI1MAG-94K; EMD MilliporSigma) کا استعمال کرتے ہوئے منتخب تجزیہ کاروں کے لئے ہوموجنیٹس کی نقل میں پیمائش کی گئی تھی۔ تجزیہ کار 3.1 xPONENT سسٹم (Luminex 200, Austin, TX, USA) MILLIPLEX تجزیہ کار سافٹ ویئر کے ذریعے ڈیٹا کے تجزیہ کے ساتھ۔ اوسط انٹراسسے CVs تھے۔<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

رینل مائٹوکونڈریا تنہائی اور ریسپرومیٹری۔ تازہ رینل کارٹیکل ٹشو کو چوہوں سے مرحلہ وار پیش قدمی کے بعد الگ کیا گیا تھا۔ مائٹوکونڈریا کو مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے ٹشو (#ab110169؛ Abcam, Waltham, MA, USA) کے لیے Mitochondria Isolation Kit کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ مائٹوکونڈریل تیاری کی پروٹین کی حراستی کا تعین بی سی اے پروٹین آسے کٹ (پیئرس، تھرمو سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ الگ تھلگ کے مائٹوکونڈریل سانس کا تعین پہلے کیلیبریٹڈ زائلوگراف چیمبر میں 37 ◦C (Oroboros O2K؛ Oroboros Instruments، Innsbruck، Austria) میں ڈپلیکیٹ میں کیا گیا تھا جس میں سانس لینے والے بفر (MiR05;{44}}5; mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM lacto bionic acid, 20 mM تورین, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sucrose, اور 1 g/L BSA بنیادی طور پر چکنائی سے پاک، pH 7.1) [13]۔ سانس کے بفر کی آکسیجن کا ارتکاز ہوا کی سنترپتی (~ 200 µM) اور 50 µM کے درمیان رکھا گیا تھا۔ آکسیجن کی کھپت کی شرح (OCR؛ ρmol O2/s/mg mitochondrial protein) کو مندرجہ ذیل سبسٹریٹ-uncoupler-inhibitor-titration (SUIT) پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا تھا (قوسین میں درج ری ایجنٹس کا ارتکاز چیمبرز کے اندر حتمی ہے: (1) LEAK (L الیکٹران ٹرانسپورٹ سسٹم (ETS؛ E) کے پیچیدہ I (CI) کے ذریعے الیکٹران کے بہاؤ کو سپورٹ کرنے کے لیے NADH سے منسلک سبسٹریٹس پائروویٹ (5 mM)، malate (2 mM)، اور glutamate (10 mM) کے ساتھ TCA سائیکل محرک کے بعد تنفس کا اندازہ لگایا گیا۔ ); (2) آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن (OXPHOS؛ P) کو ایڈینوسین ڈائی فاسفیٹ (ADP؛ 2.5 mM) کے ساتھ متحرک کیا گیا تھا اور PCI کے طور پر ریکارڈ کیا گیا تھا۔ (3) ETS (PCI+II) کے کمپلیکس I اور II کے ذریعے سکسینیٹ (10 ایم ایم) معاون کنورجنٹ الیکٹران کے بہاؤ کا اضافہ؛ (4) مائٹوکونڈریل تیاری کے معیار کا اندازہ سائٹوکوم سی (10 µM) کو شامل کرکے مائٹوکونڈریل بیرونی جھلی کی سالمیت کی جانچ کے ذریعے کیا گیا تھا۔ (5) uncoupler carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP؛ 0.1 mM اسٹاک محلول کے 0.5 µL-اسٹیپس) کو مرحلہ وار اس وقت تک ٹائٹریٹ کیا گیا جب تک کہ زیادہ سے زیادہ غیر جوڑے ہوئے سانس تک نہ پہنچ جائے اور زیادہ سے زیادہ ETS صلاحیت (ECI+) کے طور پر ریکارڈ کیا جائے۔ II)؛ (6) روٹینون (0.5 µM) کے اضافے نے ETS کے کمپلیکس I کو روکا، اور باقی OCR کو کمپلیکس II سبسٹریٹ (ECII) کے ذریعے تعاون یافتہ زیادہ سے زیادہ ETS صلاحیت کے طور پر ریکارڈ کیا گیا؛ (7) antimycin A (2.5 µM) کے اضافے نے ETS کے پیچیدہ III کو روکا اور اس طرح تمام الیکٹران کی نقل و حمل کو پیچیدہ IV تک پہنچایا، اور باقی OCR کو بقایا، غیر مائٹوکونڈریل آکسیجن کی کھپت (ROX) کے طور پر ریکارڈ کیا گیا اور تمام سابقہ ​​OCRs سے منہا کر دیا گیا۔ ; (8) پھر آکسیجن کی کھپت کو N,N,N0,N0 -Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD; 0.5 mM; ascorbate (2 mM) کی موجودگی میں بے قابو آٹو آکسیڈیشن سے بچنے کے ساتھ دوبارہ متحرک کیا گیا۔ TMPD کا) سائٹوکوم c کو کم کرنے کے لئے ایک مصنوعی سبسٹریٹ کے طور پر؛ (9) TMPD/ ascorbate کی موجودگی میں کیمیائی پس منظر کی آکسیکرن کی شرح کا اندازہ پیچیدہ IV inhibitor sodium azide (100mM) کو شامل کرکے کیا گیا تھا، اور اسے پچھلے بہاؤ سے منہا کر دیا گیا تھا، جس کے نتیجے میں cytochrome c oxidase سرگرمی (ECIV) کی زیادہ سے زیادہ صلاحیت ہوتی ہے۔ DatLab بمقابلہ 7.4 (Oroboros Instruments) کا استعمال کرتے ہوئے آکسیجن کی کھپت کا ڈیٹا حاصل اور تجزیہ کیا گیا۔ بہاؤ کنٹرول تناسب (FCR) کو زیادہ سے زیادہ ETS صلاحیت (ECI+II) کی نسبت کسی بھی دی گئی سانس کی حالت میں آکسیجن کی کھپت کے طور پر شمار کیا گیا تھا۔

بہاؤ سائٹوومیٹری۔ پھیپھڑوں کے بافتوں کو ہضم کیا گیا تھا، اور بہاؤ سائٹومیٹرک تجزیہ کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [14]۔

شماریاتی تجزیہ۔ گرافیکل ڈیٹا کو اوسط ± SEM کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ دو طرفہ انووا، جب ممکن ہو بار بار اقدامات کے ساتھ، چار گروہوں کے درمیان اختلافات کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ سیڈک کے متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال ماؤس گروپس کا علاج گروپوں سے موازنہ کرنے کے لئے کیا گیا تھا۔ طالب علم کا ٹی ٹیسٹ دونوں گروپوں کا موازنہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ تجزیہ گراف پیڈ پرزم ورژن 9.2 سافٹ ویئر (گراف پیڈ سافٹ ویئر انکارپوریٹڈ، سان ڈیاگو، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔

شماریاتی اہمیت p < 0.05 کے طور پر بیان کی گئی تھی۔

Wecistanche کی معاون خدمت:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950