بینزیلیٹڈ ڈائی ہائیڈروفلاوونز اور ڈیکلینانونا کیلیسینا (اونوناسی) کی چھال سے حاصل کردہ الکلائیڈز اور ان کی سائٹوٹوکسائٹس

مزید معلومات کے لیے رابطہ کریں۔tina.xiang@wecistanche.com

خلاصہ: Diclinanona calycina RE Fries جو "enviro" کے نام سے مشہور ہے، Annonaceae خاندان کی ایک نسل ہے جو برازیل میں مقامی ہے۔ Annonaceae Amazon پودوں سے بائیو ایکٹیو مرکبات کے لیے ہماری جاری تلاش میں، D.calycina کی چھال کی جانچ کلاسیکی کرومیٹوگرافی تکنیک کے ذریعے کی گئی جس سے تیرہ مرکبات (alkaloids اور flavonoids) برآمد ہوئے جو پہلی بار D. calycina کے ساتھ ساتھ Diclinanona نسل میں بیان کیے گئے تھے۔ ان الگ تھلگ مرکبات کی ساخت MS کے ساتھ مل کر 1D/2D-NMR سپیکٹروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے وسیع تجزیہ کے ذریعے قائم کی گئی تھی۔ الگ تھلگ الکلائڈز کی شناخت ذیلی طبقات سے تعلق رکھنے والے کے طور پر کی گئی تھی: سادہ آئسوکوینولین، تھیلی آن لائن (1)؛ aporphine، anonaine (2)؛ oxoaporphine، liriodenine (3)؛ benzyltetrahydroisoquinolines، (S)-( پلس) -reticuline (4)؛ dehydro-oxonorreticuline (3،4-dihydro-7-hydroxy-6-methoxy-1-isoquinolinyl)(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-methanone)(5 );( جمع )-1S,2R-reticuline Ng-oxide (6); اور ( جمع )-1S,2S-reticuline N-oxide (7);tetrahydro protoberberine, coreximine(8); اور پیوائن، بسنورارجیمونین (9)۔ جبکہflavonoidsبینزیلیٹڈ سے تعلق رکھتے ہیںdihydroflavones، isorhamnetin (10)، dichamanetin (11)، اور uvarinol (12) اور isouvarinol (13) کا مرکب۔ کمپاؤنڈ 5 کو ادب میں پہلی بار قدرتی مصنوع کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔ اہم الگ تھلگ مرکبات کی سائٹوٹوکسک سرگرمی کا کینسر اور غیر کینسر والے سیل لائنوں کے خلاف جائزہ لیا گیا۔ ٹیسٹ کیے گئے مرکبات میں سے، بینزائیلیٹڈ ڈائی ہائیڈروفلاوونز ڈیکامانیٹن (10) اور یووارینول (12) اور آئسوویرینول (13) کے مرکب کے لیے سب سے زیادہ امید افزا نتائج پائے گئے، جس نے ٹیسٹ کے خلاف معتدل سائٹوٹوکسک سرگرمی پیش کی۔کینسر سیللکیریں(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25۔{1}} ug·mL-I)۔ Dichamanetin (11) نے 15.78 ug·mL-I(33.70 umol·LI) اور 18.99 ug∶mL-（40.56 umol کی IC50 اقدار کے ساتھ HL-60 اور HCT116 کے خلاف سائٹوٹوکسک سرگرمی دکھائی۔ L-）، بالترتیب جبکہ uvarinol（12） اور isouvarinol (13) کے مرکب نے HL-60 کے خلاف cytotoxic سرگرمی کا مظاہرہ کیا، جس کی IC5 ویلیو 9.74 ugs.mL-1، اور HCT116 ہے، ایک IC50 کے ساتھ 17.31 ug کی قیمت۔ mL-I ان سائٹوٹوکسک سرگرمیوں کو ان مالیکیولز میں موجود ایک یا زیادہ ہائیڈروکسی بینزائل گروپس کی موجودگی کے ساتھ ساتھ اس پوزیشن سے بھی منسوب کیا جا سکتا ہے جس میں یہ گروپس جڑے ہوئے ہیں۔ reticuline، anonaine اور liriodenine کی cytotoxic سرگرمیاں پہلے ہی قائم ہو چکی ہیں، جس میں liriodenine سب سے زیادہ طاقتور مرکب ہے۔

مطلوبہ الفاظ: Diclinanona calycina alkaloids اور benzylated dihydroflavones؛ سائٹوٹوکسک سرگرمی

مصنوعات کے بارے میں مزید جاننے کے لیے کلک کریں۔

1. تعارف

Annonaceae اشنکٹبندیی اور ذیلی ٹراپیکل درختوں اور جھاڑیوں کا ایک بڑا خاندان ہے، جس میں تقریباً 112 نسلیں اور 2440 انواع شامل ہیں [1]۔ کئی پرجاتیوں کو ان کے کھانے کے پھلوں اور دواؤں کی خصوصیات کے لیے جانا جاتا ہے]2]۔ Annonaceae کی کچھ پرجاتیوں کے ساتھ پچھلی فائٹو کیمیکل تحقیقات نے ثانوی میٹابولائٹس کے مختلف طبقوں کو الگ تھلگ اور خصوصیت کا باعث بنایا، جیسے مونوٹرپینز، ڈائٹرپینز، ٹریٹرپینز، لگنان،flavonoids, asarone سے ماخوذ phenylpropanoids، acetogenins، اور بنیادی طور پر مخصوص isoquinoline سے ماخوذ الکلائڈز [3-7]۔ Annonaceae پرجاتیوں سے الگ تھلگ ان میں سے کچھ ثانوی میٹابولائٹس نے اہم حیاتیاتی سرگرمیوں کی نمائش کی، جیسے سوزش اور یوریس کو روکنے والی خصوصیات [8,9]، ٹرپینوسائڈل [10,11]، لیشمانی سائیڈل [11,12]، ملیریا مخالف [4,13] , antimicrobial [4,14,15], antioxidant and antirheumatic actions [9,15] اور خاص طور پر, مختلف انسانی ٹیومر سیل لائنوں کے خلاف سائٹوٹوکسک سرگرمی [4,6,11,16-21]۔

اگرچہ Annonaceae خاندان کو ایک قدیم اور اچھی طرح سے مطالعہ شدہ خاندان سمجھا جاتا ہے، لیکن اس کی انواع کے ساتھ کچھ فائٹو کیمیکل اور/یا فارماسولوجیکل مطالعہ کیے گئے ہیں[3]۔ فائیٹو کیمیکل اور/یا فارماسولوجیکل اسٹڈیز نے بنیادی طور پر انونا، اسیمینا، اور کیننگا کی نسلوں پر توجہ مرکوز کی ہے، کیونکہ ان کی بڑی اقتصادی اہمیت ہے، اور جنرا ڈوگیٹیا، گوٹیریا، اور زائلوپیا کی کچھ انواع پر[5]۔ فائٹو کیمیکل اور فارماسولوجیکل اسٹڈیز کے سلسلے میں پچھلے 20 سالوں میں زبردست ترقی کے باوجود، تسلیم شدہ پرجاتیوں کی ایک بڑی تعداد کے سلسلے میں اب بھی تحقیق شدہ انواع کی تعداد بہت کم ہے۔ فی الحال، ویب آف سائنس، اسکوپس، اور سائنس فائنڈر کے سائنسی ڈیٹا بیس کے مطابق، صرف 15 فیصد Annonaceae کی انواع بیان کی گئی ہیں جن کا کوئی متعلقہ فائٹو کیمیکل اور/یا فارماسولوجیکل مطالعہ ہے۔

جن انواع کا بہت کم مطالعہ کیا گیا ہے ان میں وہ ہیں جن کا تعلق ڈیکلینانونا ڈیلز سے ہے۔ اس نسل کا تعلق ذیلی خاندان Annonoideae کے قبیلے Annoneae سے ہے، اور یہ صرف اشنکٹبندیی جنوبی امریکہ میں پایا جاتا ہے (بنیادی طور پر ایمیزون کے علاقے میں)۔ یہ صرف تین انواع پر مشتمل ایک جینس ہے، Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas اور Diclinanona tessmannii Diels، جو کہ درختوں کے طور پر پائے جاتے ہیں [22-24].D.calycina (مترادف Xulopia calycina Diels) 30 میٹر لمبا درخت، جسے "envireira" اور "enviro" کے نام سے جانا جاتا ہے، برازیل، پیرو اور وینزویلا میں ایمیزون بیسن میں تقسیم کیا جاتا ہے [23]۔ D.calycina سطحی طور پر اس کے پھولوں کے لیے Xylopia سے ملتا جلتا ہے جس کے پھول لمبے اور تنگ پنکھڑیوں والے ہوتے ہیں، لیکن یہ اس کے لکڑی، غیر مہذب، گلوبوز، اور موٹی دیواروں والے مونو کارپس [23,24] کے لیے مختلف ہے۔

D. calycina کے ساتھ پچھلے مطالعات صرف فارماسولوجیکل اسٹڈیز کی رپورٹ کرتے ہیں۔ پہلا مطالعہ مائکروجنزموں مائکوبیکٹیریم سمیگمیٹیس، ایسچریچیا کولی، اسٹریپٹوکوکس سانگوئس، اسٹریپٹوکوکس اورالیس، اسٹیفیلوکوکس اوریئس، اور کینڈیفیوژن کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے میتھانولک، کلوروفارم، اور آبی عرقوں کی اینٹی مائکروبیل سرگرمی کی تحقیقات کو بیان کرتا ہے۔ دوسرا نامیاتی (ڈائیکلورومیتھین: میتھانول 1:1) اور مائیکرو آرگنزم Enterococcus faecalis کے خلاف مائیکرو ڈیلیوشن بروتھ پرکھ (MDBA) اور ڈسک ڈفیوژن پرکھ (DDA) کا استعمال کرتے ہوئے پانی کے نچوڑ کی جراثیم کش سرگرمی کی تحقیقات کی اطلاع دیتا ہے[26]۔ اس طرح، ایمیزون بارش کے جنگل سے اینوناسی سے نئی بایو ایکٹیو قدرتی مصنوعات کی ہماری مسلسل تلاش میں، اس تحقیق کا مقصد D.calycina کی چھال کی فائٹو کیمیکل اور فارماسولوجیکل خصوصیات کی چھان بین کرنا ہے۔ اس رپورٹ میں، تیرہ مرکبات (نو الکلائڈز اور چار بینزیلیٹڈdihydroflavonesD.calycina کے ساتھ ساتھ Diclinanona جینس میں پہلی بار الگ تھلگ اور شناخت کی گئی تھی۔ اس کے علاوہ، B16-F10، HepG2، K562، اور HL{{ کے خلاف اہم مرکبات کی سائٹوٹوکسٹی کی تحقیقات کی گئی تھیں۔ 4}} الامر بلیو پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے ٹیومر سیل لائنز۔

2. نتائج اور بحث

2.1. مرکبات کی ساختی وضاحت

ڈریگنڈورف کے ریجنٹ کا استعمال کرتے ہوئے میتھانولک ایکسٹریکٹ میں نائٹروجن پر مشتمل مرکبات کی موجودگی کا پتہ لگانے کے بعد، کوسٹا ایٹ ال کے طریقہ کار کے مطابق اس پر تیزابیت کی بنیاد پر علاج کیا گیا۔ [12] جس کے نتیجے میں الکلائیڈل اور نیوٹرل فریکشن ہوتے ہیں۔ الکلائیڈل فریکشن میں نائٹروجن پر مشتمل مرکبات کا ایک اعلی ارتکاز دیکھا گیا جسے کرومیٹوگرافک تجزیہ کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ یکے بعد دیگرے کرومیٹوگرافک علیحدگی، جیسا کہ ایکسٹریکشن اور آئسولیشن سیکشن میں بیان کیا گیا ہے، تیرہ کیمیائی اجزاء (1-13، شکل 1)، نو آئسوکوینولائن سے ماخوذ الکلائڈز 1-9، اور چار بینزیلیٹڈ ڈائی ہائیڈروفلاوونز کی تنہائی اور شناخت کا باعث بنے۔ 10-13۔ ان الگ تھلگ مرکبات (شکل 1) کے ڈھانچے کو 1D اور 2D NMR سپیکٹروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے MS (ضمنی ڈیٹا) کے ساتھ ساتھ لٹریچر کے ڈیٹا کے ساتھ موازنہ کے ذریعے وسیع تجزیہ کے ذریعے قائم کیا گیا تھا۔

کمپاؤنڈ 5 بھورے بے رنگ پاؤڈر کے طور پر حاصل کیا گیا تھا اور ڈریگنڈورف کے ریجنٹ کے لیے مثبت تجربہ کیا گیا تھا۔ اس نے LR-ESI (plus )MS میں m/z328 [M plus H]' پر ایک پروٹونیٹڈ مالیکیول دکھایا جو مالیکیولر فارمولہ C18H1NO5 کے ساتھ ہم آہنگ ہے۔ 5 (ٹیبل 1) کا 'H اور 13C-NMR سپیکٹرا ریٹیکولین (4)[27 کے ساتھ مطابقت رکھتا تھا، سوائے نائٹروجن بانڈڈ میتھائل گروپ (CH3-N) کی غیر موجودگی اور سگنل کے پوزیشن 1 میں میتھائن گروپ، جس کو bc 192.8 پر ایک کاربونیل گروپ سے جوڑنے والے imine گروپ کے مخصوص 13C-NMR سپیکٹرم میں δc 165.1 پر سگنل سے تبدیل کیا گیا تھا۔ 'H-NMR سپیکٹرم میں، تین ڈاون فیلڈ ہائیڈروجن δH 6.88（1H,d, J=8.4 Hz, H-5'）,5H7.57（1H,d, J{{33} }۔ ، نے ABX کپلنگ سسٹم کی موجودگی کا انکشاف کیا۔ 6H 6.90(1H,s, H-8) اور 6.71(1H, s, H-5) پر دو سنگل سگنلز 1,2,4,5-ٹیٹرا متبادل فینائل رنگ کی موجودگی کی نشاندہی کرتے ہیں۔ اس کے علاوہ، 5 کے H-NMR سپیکٹرم نے bH 3.93 (3H, s) اور 6H 3.95 （3H,s） پر گونجنے والے دو میتھوکسی گروپس کے لیے سگنل بھی دکھائے، اور δμ 2.79（2H,t، پر گونجنے والے دو میتھیلین گروپس کے لیے سگنلز بھی دکھائے۔ J=7.8 Hz） اور 6H 3.89(2H,t/=7.8 Hz)، بالترتیب H-4 اور H-3 سے منسوب (ٹیبل 1) . ان اعداد و شمار نے اشارہ کیا کہ الکلائڈ 5 میں بینزائلٹیٹراہائیڈروائسوکوئنولائن کنکال ہے [28-30]۔

یہ گروپس HMBC-NMR تجربہ (شکل 2 اور جدول 1) کے دو اور تین بانڈ 'H-13 ارتباط کے نقشے کی بنیاد پر قائم کیے گئے تھے۔ اس تجزیے سے یہ بات سامنے آئی کہ δH 3.89 （H-3）پر ہائیڈروجن نے 6c130.1（4a） اور δc165 پر کاربن کے ساتھ تین بینڈ 'H-13C ارتباط ظاہر کیا۔ {42}}（C-1）اور دو بانڈ lH-13C کاربن کے ساتھ δc 25.4(C-4) کا ارتباط، جو مالیکیول میں امیائن گروپ کی موجودگی کی تصدیق کرتا ہے۔ دوسری طرف، δH 7.57 （H-2'） اور δH 7.60（H-6'） پر سگنلز نے δc 124.3（ پر کاربن کے ساتھ تین بانڈ lH-13C ارتباط ظاہر کیا۔ C-6'）,5c 151,4（C-4'）اور δc192.8（C-7）, and 5c116.0）C-2'）,6c 151.4 (C-4') اور c 192.8(C-7') بالترتیب، مالیکیول میں کاربونیل گروپ قائم کرتے ہوئے (شکل 2 اور جدول 1)۔ لہذا، ان NMR ڈیٹا کی بنیاد پر، مرکب 5

benzyltetrahydroisoquinoline alkaloid 34-dihydro-7-hydroxy-6-methoxy-1-isoquinolinyl)(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-methanone کے طور پر قائم کیا گیا تھا، جو dehydro-oxonorreticuline کے نام سے جانا جاتا ہے۔ اس الکلائڈ کو پہلی بار ادب میں قدرتی مصنوعات کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔ اس کا پہلا اور واحد ریکارڈ Dörnyei et al نے بیان کیا تھا۔ 1982 【31】 مصنوعی اصل کی مصنوعات کے طور پر۔ صرف 'H-NMR ڈیٹا کو کچھ غیر متعین ضربات کے ساتھ بیان کیا گیا ہے۔ اس طرح، تمام 1H- اور 13C-NMR کیمیکل شفٹوں کے لیے مکمل اسائنمنٹس ایک بانڈ (HSOC) اور دو اور تین بانڈ (HMBC) کے H-13C-NMR ارتباط کے تجربات کے ذریعے قائم کیے گئے تھے، اور جدول 1۔

مرکبات 6 اور 7 کی شناخت بالترتیب benzyltetrahydroisoquinoline alkaloids (plus )-1S,2R-reticuline-N -oxide، اور (plus )-1S,2S-reticuline-N -oxide کے طور پر کی گئی تھی۔ ان الکلائڈز کے H-NMR ڈیٹا کا موازنہ لی ایٹ ال کے بیان کردہ ڈیٹا سے کیا گیا۔ اسی ڈیوٹریٹڈ سالوینٹ (CD3OD) کا استعمال کرتے ہوئے اور کچھ تضادات دیکھے گئے (ٹیبل 1)، بنیادی طور پر H-1، H-8، اور H, C-NO کے سلسلے میں۔ ادب میں ان الکلائڈز کے لیے کوئی 13C-NMR ڈیٹا بیان نہیں کیا گیا ہے۔ محدود 1H- اور 13C-NMR ڈیٹا کی بنیاد پر، نیز ان مالیکیولز کے لیے مشاہدہ کیے گئے ابہام کی بنیاد پر، 'H اور 13C 1D اور 2D NMR تجربات ان کی درست تفویض اور ضربات کا تعین کرنے کے لیے کیے گئے۔

دونوں آئسومر 6 اور 7 کے ہائیڈروجن H{{0}} اور H-1 کی درست پوزیشن HMBC سے تین بانڈ 'H-13C ارتباط کے نقشے کی بنیاد پر قائم کی گئی تھی۔ -NMR تجربہ （Figure2）۔ isomer 6 کے لیے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ δH 5.78（H-8） پر ہائیڈروجن نے 6c 79.8（C-1）, δc120 پر کاربن کے ساتھ تین بانڈ 'H-13C ارتباط ظاہر کیا۔ .6（4a）، اور δc 149.4 （C-6）، جبکہ δH 4,13 （H-1）) پر ہائیڈروجن نے کاربن کے ساتھ تین بانڈ 'H-13C کا ارتباط دکھایا c 60.7（C-3）,6c 115.7 （C-8）,δc 120.6（C-4a）، اور 131.2 （C-1')، اس طرح قائم آئسومر 6 کے لیے ہائیڈروجن H-8 اور H-1 کی درست پوزیشن۔ اس انتساب کی مزید تصدیق δH 6.76（H-5) پر ہائیڈروجن کے تجزیے سے کی جا سکتی ہے جو تین بانڈ کو ظاہر کرتا ہے۔ H-13C کاربن کے ساتھ δc 27.0（C-4）,δc 127.1（C-8a）، اور δc 145.7 （C-7）） (شکل2）)۔ isomer7 کے لیے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ δH 6.30 （H-8） پر ہائیڈروجن نے تین بانڈ 'H-13کاربن کے ساتھ δc 79.4（C-1）,δc 122.88 4a）، اور δc 148.9 （C-6）، جبکہ δH 4.46 （H-1） پر ہائیڈروجن نے δc 62.9 پر کاربن کے ساتھ تین بانڈ H-13C کا ارتباط ظاہر کیا۔ {82}}）,5c 115.5（C-8）, bc 122.8（C-4a）, اور 131.4（C-1'）، اس طرح ہائیڈروجن H کی صحیح پوزیشنیں قائم کرتے ہیں آئیسومر 7 کے لیے -8 اور H-1۔ اس انتساب کی تصدیق δH 6.71 （H-5） پر ہائیڈروجن کے تجزیہ سے بھی ہوئی جس نے تین بانڈ lH-13C کو دکھایا کاربن کے ساتھ δc26.3（C-4）، δc 126.9（C-8a）، and6c 146.1（C-7）) (شکل 2)۔ NOESY تجربہ بھی isomers6 اور 7 کی درست سٹیریو کیمسٹری قائم کرنے کے لیے کیا گیا۔ اس تجربے میں، H-1（δH 4.13）اور H, CN(5 3.15) کے مضبوط NOE ارتباط نے اشارہ کیا۔ آئسومر 6 میں آکسیجن کی واقفیت۔ دوسری طرف، 7 کے لیے 2D-NOESY تجربے میں H-1(6H 4.46) اور HAC-N (5H 3.20) کے درمیان NOE کا کوئی واضح تعلق نہیں پایا جا سکا، آئسومر 7 (شکل 2) میں آکسیجن کی سمت کی نشاندہی کرنا۔ ان isomers کی کیمیائی تبدیلیوں میں یہ چھوٹے فرق واضح طور پر آکسیجن اور پوزیشنوں سے متاثر نائٹروجن کی سٹیریو کیمسٹری کی وجہ سے دیکھے جاتے ہیں۔ مرکبات 6 اور 7 کے لیے حاصل کردہ 'H-اور 13C-NMR ڈیٹا کا موازنہ قریبی ڈھانچے کے ساتھ مالیکیولز کے ڈیٹا کے ساتھ جیسا کہ hexapetaline A اور hexapetaline B [30] بغیر کسی ابہام کے جدول 1 میں بیان کردہ ڈیٹا کی حمایت کرتا ہے۔

مرکبات 1-4 اور 8-13 کی شناخت تھیلیفولین (1) [32]، اینونین (2) [33]لیریوڈینین (3) [10,34]، (S)-( جمع) -ریٹیکولین ( (4) (13) [37] ان کے سپیکٹروسکوپک پروفائلز اور ادب میں اقدار کے ساتھ موازنہ کی بنیاد پر۔ lH-اور 13C 1D اور 2D-NMR سپیکٹرا، نیز تمام الگ تھلگ مرکبات کا ماس سپیکٹرا، ضمنی مواد کے طور پر دستیاب ہیں۔

کیموفینیٹک (پلانٹ کیموسسٹمیٹکس/پلانٹ کیموٹیکسونومی کے لیے ایک نئی اصطلاح) کے نقطہ نظر سے، یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ C-benzylated flavanones اور C-benzylated dihydrochalcones کی موجودگی ایک خاص قسم کے flavonoids ہیں جو معروف فلاونون pinocembrin سے ماخوذ ہیں۔ اور خاص طور پر Annonaceae خاندان سے تعلق رکھنے والے Uoaria کی نسلوں میں بیان کیا گیا ہے [3,38-42]۔ D. calycina میں ان مرکبات کی موجودگی Uoaria کے ساتھ قریبی کیموفینیٹک تعلقات کی نشاندہی کرتی ہے۔ دوسری طرف، اس کیموفینیٹک تعلق کی تصدیق کے لیے پودے کے دیگر حصوں کے ساتھ ساتھ Diclinanona کی دوسری نسلوں کے ساتھ مزید تحقیقات کی جانی چاہیے۔ فلاوانونز اور چالکونز اونچے پودوں میں بڑے پیمانے پر پائے جاتے ہیں، لیکن بینزائل گروپوں کا اضافہ بہت کم ہوتا ہے اور ایسا لگتا ہے کہ اینوناسی میں یووریا [3،39-42] اور اب ڈیکلینانونا جینس تک محدود ہے۔ بینزائل گروپ ممکنہ طور پر C6-C1 پاتھ وے سے پیدا ہوتے ہیں، لیکن O-hydroxy فعالیت غیر معمولی ہے۔ Uoaria اور Diclinanona کے ان تمام flavonoids میں B-ring میں متبادل کی عدم موجودگی کو Popowia cauliflora [38] کے flavonoids کے بارے میں پچھلے مشاہدے سے جوڑا جا سکتا ہے۔

isoquinoline سے ماخوذ الکلائڈز کو الگ تھلگ اور اس کام میں بیان کیا گیا ہے پہلے ہی مختلف نسلوں میں Annonaceae کی کئی انواع میں رجسٹرڈ ہو چکے ہیں۔ ان میں سے کچھ، جیسے liriodenine اور anonaine، کو کیموفینیٹک مارکر سمجھا جاتا ہے، اور D.calycina میں ان الکلائیڈز کی موجودگی Annonaceae خاندان [5-7,15,20,27,] میں ان کیموفینیٹک مارکروں کے تعلق کو مزید تقویت دیتی ہے۔ 33-35،43]۔

یہ بات قابل ذکر ہے کہ زیڈورن [44] کے مطابق، کیموفینیٹک اسٹڈیز کو ایسے اسٹڈیز کے طور پر بیان کیا جاتا ہے جس کا مقصد مخصوص ثانوی میٹابولائٹس کی صف کو بیان کرنا ہوتا ہے، جیسا کہ پہلے ہی کئی شائع شدہ کاموں میں مشاہدہ کیا گیا ہے [5-7,15,20 27،33-35،43-46]۔ اس طرح، کیموفینیٹک مطالعات ٹیکسا کی فینیٹک وضاحت میں حصہ ڈالتے ہیں، جو کہ جسمانی، مورفولوجیکل اور کیریولوجیکل نقطہ نظر کی طرح ہے، جنہیں پہلے ہی "قدرتی" نظاموں کے قیام کے لیے بہت اہمیت کے طور پر تسلیم کیا جا چکا ہے، اور جو اس کے لیے انتہائی اہمیت کے حامل ہیں۔ جدید مالیکیولر طریقوں کی مدد سے درجہ بند حیاتیات کی تفصیل [44]۔

2.2 سائٹوٹوکسک پرکھ

الگ تھلگ مرکبات کی ان وٹرو سائٹوٹوکسک سرگرمی (ٹیبل 2)، مرکبات 2، 3،5، اور 8 کے علاوہ (ان کی کم پیداوار کی وجہ سے)، کا جائزہ لیا گیاکینسر سیللائنیں HL-60 (ہیومن پرومائیلوسیٹک لیوکیمیا)، MCF-7 (انسانی چھاتی کا اڈینو کارسینوما)، HepG2 (ہیومن ہیپاٹو سیلولر کارسنوما)، HCT116 (انسانی بڑی آنت کا کارسنوما)، اور غیر کینسر والی سیل لائن MRC{{5} } (انسانی پھیپھڑوں کا فبروبلاسٹ) انکیوبیشن کے 72 گھنٹے بعد الامر بلیو پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے۔

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25۔{1}} ug.mL-1)۔ Dichamanetin (11) نے 15.78 ug·mL-1（33.70 μmol·L-1） کی IC50 اقدار کے ساتھ HL-60 اور HCT116 کے خلاف سائٹوٹوکسک سرگرمی دکھائی اور بالترتیب 18.99 ug·mL-1（40.56 umol.L-1）)۔ uvarinol (12) اور isouvarinol (13) کے مرکب نے HL-60 کے خلاف سائٹوٹوکسک سرگرمی کا مظاہرہ کیا، جس کی ICs0 قدر 9.74ug∶mL-1، اور HCT116 ہے، جس کی ICs0 قدر 17.31 ug∶mL-60 ہے۔ {30}}۔ بینزیلیٹڈ ڈائی ہائیڈروفلاوونز میں سے، صرف isorhamnetin (10) نے HepG2 کے خلاف 19.79 ugs:mL-1(54.65 umol.L-1) کی IC50 قدر کے ساتھ سائٹوٹوکسک سرگرمی دکھائی۔ لٹریچر کے مطابق، بینزیلیٹڈ ڈائی ہائیڈروفلاوونز کو سائٹوٹوکسک خصوصیات کے ساتھ بیان کیا گیا ہے [39-42]۔ اس کام میں بیان کیے گئے لوگوں میں، isorhamnetin (10)، dichamanetin (11)، اور uvarinol (12) کو انسانی ٹیومر سیل لائنوں کے ناسوفرینکس (KB) اور P-388 لیمفوسیٹک لیوکیمیا کے سرطان کے خلاف وٹرو سائٹوٹوکسک خصوصیات کے اندر بیان کیا گیا ہے۔ (PS) بالترتیب 5.3 اور 4.1,4.8 اور 1.8، اور 5.9 اور 9.7 کی IC50 اقدار کے ساتھ، ug.mL-1، بالترتیب [39,40]۔ ان مختلف سرگرمیوں کو مالیکیولز میں موجود ایک یا زیادہ ہائیڈروکسی بینزائل گروپس کی موجودگی کے ساتھ ساتھ اس پوزیشن سے بھی منسوب کیا جا سکتا ہے جس میں یہ گروپس جڑے ہوئے ہیں۔ تاہم، اس مشاہدے کی تصدیق کے لیے مزید تحقیقات کی ضرورت ہے۔

isoquinoline سے ماخوذ alkaloids anonaine (2)، liri-adenine (3)، اور (S)-(plus) -reticuline (4) کی ان وٹرو سائٹوٹوکسک سرگرمی کو حال ہی میں Menezes et al نے بیان کیا ہے۔[2{{16] }}]، سوزا وغیرہ۔ [6] اور کوسٹا وغیرہ۔ [43] لیریوڈینائن پر زور دینے کے ساتھ، جس نے کینسر سیل لائنوں B{{1{18}}}F10(ماؤس میلانوما)، HepG2 (ہیومن ہیپاٹو سیلولر کارسنوما)، HL{{13} کے خلاف طاقتور سائٹوٹوکسک سرگرمی کا مظاہرہ کیا۔ }} (ہیومن پرومائیلوسیٹک لیوکیمیا)، اور K562 (انسانی دائمی مائیلوسیٹک لیوکیمیا） کے ساتھ IC5s0 کی قدریں 10.0 μmol.L سے کم ہیں ، اور K562 نے 19.0 umol.L سے کم کی IC50 قدروں کے ساتھ-1[20]۔ (S)-( پلس) -Reticuline نے صرف HepG2 کے خلاف IC50 اقدار کے ساتھ 15.35 μmol L-1 【 6,20】۔

3. مواد اور طریقے

3.1 عام تجرباتی طریقہ کار

میتھانول (MeOH) میں آپٹیکل گردشیں 589 nm پر P{{0}} پولی میٹر (Jasco, Tokyo, Japan) کے ساتھ ریکارڈ کی گئیں۔ 1D اور 2D NMR تجربات CDCl میں حاصل کیے گئے تھے۔ 11.75 T پر چلنے والے AVANCE I HD NMR سپیکٹرومیٹر (Bruker, Billerica, MA, USA) پر (chloroform-d) یا CD, OD (methanol-du, and CD, COCD3 (acetone-d6) کا 298 K پر CDCl پلس ڈراپ (بالترتیب 500 اور 125 میگاہرٹز پر 13C ہاتھ) اور ایک Bruker AVANCE I 600 NMR سپیکٹرومیٹر پر جو 14.1 T('H اور13Cat 60 پر کام کرتا ہے) بالترتیب {63}} اور 150 میگاہرٹز۔ تمام lH- اور13C-NMR کیمیکل شفٹ （δ） پی پی ایم میں ٹیٹرا میتھائلسیلین سگنل کے حوالے سے 0۔{78}} پی پی ایم اندرونی حوالہ کے طور پر پیش کیے جاتے ہیں، اور کپلنگ کنسٹنٹ (D) ہرٹز میں دیے گئے ہیں۔ NMR سپیکٹرو میٹر ایک 5- ملی میٹر ملٹی نیوکلیئر الٹا پتہ لگانے والے پروب (1D اور 2D NMR تجربات) کے ساتھ زیڈ گریڈینٹ کے ساتھ لیس تھا۔ ایک بانڈ (HSQC) اور دو اور تھری بانڈ (HMBC)1H-13C-NMR ارتباط کے تجربات کو بالترتیب اوسط جوڑے مستقل' JcH اور LRJ (cH of 140 اور 8 Hz کے لیے بہتر بنایا گیا تھا۔ کم ریزولوشن ماس سپیکٹرو میٹری (LC-MS) تجزیہ کے لیے الگ تھلگ مرکبات کے نمونوں کو میتھانول (HPLC گریڈ) میں دوبارہ معطل کر دیا گیا، جس سے سٹاک پیدا ہوا۔ k حل (1 mg·mL-1)۔ سٹاک سلوشنز کے ایلی کوٹس (5 uL) کو مزید 5 ug·mL میں گھٹا دیا گیا- اور الیکٹرو اسپرے آئنائزیشن سے لیس ماڈل TSO کوانٹم ایکسیس (تھرمو سائنٹیفک، سان ہوزے، CA، USA) میں ٹرپل کواڈروپول ماس سپیکٹرو میٹر میں براہ راست انفیوژن کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ (ESI) یا وایمنڈلیی پریشر کیمیکل آئنائزیشن (APCI) ذرائع۔ ESI-MS حالات: سپرے وولٹیج، 5kV؛ میان گیس، 10 صوابدیدی یونٹ (arb)؛ معاون گیس، 5arb؛ جھاڑو گیس، 0arb؛ کیپلیری درجہ حرارت، 250 ڈگری؛ کیپلیری وولٹیج، 40 V؛ ٹیوب لینس، 70 V؛ ماس رینج، m/z 100 سے 1000۔ APCI-MS حالات: خارج ہونے والا کرنٹ، 5 μA؛ بخارات کا درجہ حرارت، 350 ڈگری؛ میان گیس پریشر، 25 صوابدیدی یونٹ （arb）؛ آئن سویپ گیس پریشر، 0.0 ارب؛ آکس گیس پریشر، 10 ارب؛ کیپلیری درجہ حرارت، 250 ڈگری سینٹی گریڈ؛ ٹیوب لینس آفسیٹ، 70 V؛ سکیمر آفسیٹ، 0 وی؛ ماس رینج، m/z 100 سے 1000۔ Argon کو تصادم گیس کے طور پر استعمال کیا گیا تھا، اور MS/MS سپیکٹرا 25 سے 30 eV کے درمیان تصادم کی توانائیوں کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا تھا۔ سلیکا جیل 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, USA, 70-230 mesh) کالم کرومیٹوگرافی (CC) کے لیے استعمال کیا گیا تھا، جبکہ سلیکا جیل 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Germany, 0.25 mm, aluminium) پتلی لیور کرومیٹوگرافی(PTLC)(Macherey-Nagel, 1.00 mm, glass) کے ساتھ تجزیاتی اور تیاری کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ مرکبات کو UV254/365 روشنی کے تحت نمائش کے ذریعے، p-anisaldehyde reagent کے ساتھ چھڑکنے کے بعد ایک گرم پلیٹ پر گرم کرکے، اور Dragendorff کے reagent کو چھڑک کر تصور کیا گیا۔

3.2.پلانٹ کا مواد

موجودہ تحقیقات میں، D.calycina کے نباتاتی مواد (چھال) کو 27 مئی 2017 کو Adolpho Ducke Reserve (جغرافیائی نقاط:02 ڈگری 53'36.1S اور 59 ڈگری 58'28.9"W)، Manaus، Amazonas State پر جمع کیا گیا تھا۔ ، برازیل، اور پروفیسر ڈاکٹر انتونیو کارلوس ویبر کی طرف سے شناخت کی گئی، جو کہ Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM) کے شعبہ حیاتیات کے ماہر پودے کے ماہر ہیں۔ رسائی (نمونہ) کو A70EDCD ریکارڈ کے ساتھ Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) میں رجسٹر کیا گیا تھا۔

3.3 نکالنا اور تنہائی

D.calycina کی چھال کو ابتدائی طور پر کمرے کے درجہ حرارت پر 24 گھنٹے کے لیے خشک کیا جاتا تھا اور پھر 40 ڈگری کے درجہ حرارت پر 48 گھنٹے کے لیے ہوا میں گردش کرنے والے تندور میں خشک کیا جاتا تھا، اور بعد میں اسے چار چاقو کی چکی کی چکی (مارکونی، پیراسیکابا، ایس پی) میں پلورائز کیا جاتا تھا۔ , برازیل) پاوڈر مواد حاصل کرنے کے لئے (1340 گرام). پھر، MeOH (8 × 4 L) کے بعد ہیکسین (8 × 4 L) کے ساتھ ایک مکمل میکریشن انجام دیا گیا۔ حاصل کیے گئے ایکسٹریکٹو سلوشنز کو کم پریشر (40-50 ڈگری) پر روٹری ایوپوریٹر میں مرتکز کیا گیا تاکہ بالترتیب ہیکسین (24.85 جی) اور می او ایچ (199.43 جی) نچوڑ دیا جا سکے۔

Dragendorff کے ری ایجنٹ کے ساتھ انکشاف کردہ TLC تجزیہ نے MeOHextract میں الکا لوئیڈز کی زیادہ موجودگی کی نشاندہی کی۔ لہذا، MeOH اقتباس (188.30 g) کے ایلی کوٹ کو ابتدائی طور پر الکلوائیڈل (5.46 جی) اور غیر جانبدار (4.47 جی) فریکشن دینے کے لیے ایسڈ بیس نکالنے کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ اس کے بعد، الکلائیڈل فریکشن (50g) کے حصے کو سلکا جیل کرومیٹوگرافک کالم (CC) کا نشانہ بنایا گیا جس کا علاج پہلے 10 فیصد NaHCO3 محلول [12] کے ساتھ کیا گیا تھا، جسے ہیکسین (100 فیصد)، ہیکسین-CHCl، (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, and 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 فیصد) , CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, and 10:90,0/u), EtOAc (100 فیصد)،EtOAc-MeOH(95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80، اور 10:90، v/o)، اور آخر میں MeOH 250 فریکشن دیتا ہے (ہر ایک میں 30 ملی لیٹر)۔ 95:05، 90:10 کے تناسب میں CH2Cl2-MeOH کے مرکب کا استعمال کرتے ہوئے TLC تشخیص کے بعد، 85:15، اور 80:20 ایلیونٹ سسٹم (v/o) کے طور پر، اسی طرح کے نمونوں کو 16 فریکشن (F1 سے F16) دینے کے لیے جمع کیا گیا تھا۔

ابتدائی CC سے فریکشن F5 (181.2 mg) hexane-CH، Cl2 (50:50 سے 10:90,v/o) کے ساتھ ایک نئے سلیکا جیل کا نشانہ بنایا گیا تھا جس کے اوپر وہی طریقہ کار استعمال کیا گیا تھا جو ہیکسین (100 فیصد)، ہیکسین کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔ -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, and 10:90,v/o), CH,Cl ,(100 فیصد)، CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80, and 10:90 ,o/),EtOAc(100 فیصد)، EtOAc-MeOH(85:15,70:30,50:50, 30:70, اور 15:85, /o)، اور MeOH (100 فیصد) 118 فریکشنز ( 15 ملی لیٹر ہر) جو 12 ذیلی حصوں (F5.1 سے F5.12) میں جمع کیے گئے تھے، 95:05 اور 90:10 کے تناسب میں CH2Cl2-MeOH کے مرکب کا استعمال کرتے ہوئے TLC تجزیہ کی تشخیص کے مطابق۔ .1 (28.9 ملی گرام) ہیکسین (100 فیصد) کے ساتھ تیار شدہ TLC کا نشانہ بنایا گیا جس میں CH,Cl-MeOH(95:05,v/v,two elutions) 2(1.4 mg) اور 3 (1.7 mg) کے ساتھ استعمال کیا گیا، بالترتیب ذیلی حصے F5.4 (21.5 mg) ہیکسین-CH،C(80:20,vo)، F5.5 (16.7 ملی گرام) ہیکسین-CH،Cl (80:20.70:30.60؛ 40. اور 50:50) کے ساتھ ایلوٹڈ ,v/)، اور F5.6(15.4 mg) hexane-CHCl2 (50:50,40:60، اور 30:70، v/o) کے ساتھ تیار کیے گئے (53.6 mg) اور تیار کردہ TLC کا بھی نشانہ بنایا گیا۔ CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, دو elutions) کے ساتھ پیداوار 3 (8.9 ملی گرام)۔

ابتدائی CC سے فریکشن F6(2099.1 mg) hexane-CHCl(10:90,v/))، CH2Cl، (100 فیصد )، اور CH,Cl2-EtOAc (90:10 سے 10:90, o/o) کو ایک نئے سلیکا جیل CC کا نشانہ بنایا گیا تھا جو اوپر اسی طریقہ کار کو استعمال کرتے ہوئے 140 فریکشنز (30 فرکشنز) والے سالوینٹس سسٹم کے ساتھ بیان کیا گیا تھا۔ ایم ایل ہر ایک)۔ 95:05، 90:10، اور 85:15 کے تناسب میں CH2Cl2-MeOH کے مرکب کا استعمال کرتے ہوئے TLC تشخیص کے بعد ایلیونٹ سسٹم (o/o) کے طور پر، ملتے جلتے نمونوں کو 13 ذیلی حصوں (F6) دینے کے لیے جمع کیا گیا تھا۔ .1 سے F6.13)۔ ذیلی فریکشن F6.6(1541.3 mg) کو ایک نئے سلیکا جیل CC کا نشانہ بنایا گیا جو اوپر اسی طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے اسی سالوینٹس سسٹم کے ساتھ 120 فریکشن (30 ملی لیٹر ہر ایک) پر مشتمل ہے جس کا TLC (اوپر اسی طریقہ کار کو استعمال کرتے ہوئے) نے تجزیہ کیا تھا جس میں 12 نئے ذیلی حصے (F6.6.1 سے F6.6.12)۔ ذیلی فریکشن F6.6.2 (17.0 mg) کو ہیکسین-CH,Cl,(60:40 اور 50:50,v/v) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا جس کو CH2Cl2-MeOH (90:10, v/o، ایک اخراج) جس کے نتیجے میں 3 (1.4mg) نکلتا ہے۔ ذیلی حصہ F6.6.3(643.3 mg) ہیکسین-CH2Cl2 (50:50، 40:60، 30:70، 20:80، اور 10:90) کے ساتھ خارج ہوتا ہے۔ o/v)، CH2Cl2 (100 فیصد)، اور CH2Cl2-EtOAc(90:10 اور 80:20,o/o) کو CH2Cl2-MeOH (90) کے ساتھ تیاری کے TLC کے تحت کیا گیا :10, vfo, one elution) ایک نیا ذیلی حصہ F6.6.3.1(161.8 mg) حاصل کرتا ہے جو EtOAc-MeOH(90:10, v/o, one elution) کے ساتھ 4(148.2) کے ساتھ تیار کردہ ایک نئے تیاری کے TLC کا نشانہ بنتا ہے۔ mg) CH2Cl2-EtOAc (70:30 اور 60:40,o/o) کے ساتھ ذیلی فریکشن F6.6.4 (90.2 mg) کو CH2Cl-MeOH (90:10) کے ساتھ تیار کردہ TLCeluted کا نشانہ بنایا گیا۔ v/o، ایک اخراج) بالترتیب 1 (1.4 ملی گرام) اور 4 (50.1 ملی گرام) پیدا کرتا ہے۔ CH،Cl-EtOAc(60:40 اور 50:50، o/o) کے ساتھ ذیلی فریکشن F6.6.5(83.4 mg) کو بھی CH،Cl2-MeOH (90:10) کے ساتھ تیار کردہ TLCسیلیٹڈ کا نشانہ بنایا گیا۔ ufo, one elution) بالترتیب 1(1.5 mg) اور 4 (45.5 mg) دوبارہ برداشت کرنا۔ ذیلی فرکشن F6.6.6 (101.4 mg) CH,Cl2-EtOAc (50:50 اور 40:60, v/)) کے ساتھ تیار کردہ TLC کا نشانہ بنایا گیا جس کو CH,Cl-MeOH (90: 10، vfo، ایک elution) 8 (3.4 mg) اور دیگر ذیلی فریب F6.6.6.1 (48.8 mg) دینا۔ اس ذیلی حصے (F6.6.6.1) کو ابتدائی طور پر EtOAc-MeOH (85) کے ساتھ تیار کرنے والے TLCeluted کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ :15, vo, one elution) اور بعد میں CHCl-MeOH(90:10,v/v,one elution) نتیجہ دوبارہ 4(37.4 mg) میں نکلتا ہے۔ اس عمل کے دوران، کرومیٹوگرافک پلیٹ کو ابتدائی طور پر موبائل فیز EtOAc-MeOH (85:15، v/o، one elution) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔ اس اخراج کے بعد، کرومیٹوگرافک پلیٹ کو سالوینٹس کو دوبارہ منتقل کرنے کے لیے خشک کیا گیا اور اس کے بعد موبائل فیز CH,Cl,-MeOH(90:10,vf,one elution) کے ساتھ ایک نئے اخراج کا نشانہ بنایا گیا جس کا نتیجہ 4.Subfraction F6.6.7 ( 109.0 ملی گرام) CH,Cl2-EtOAc(40:60,30:70,20:80 اور 10:90,vfo) کے ساتھ تیار کردہ CH,Cl2-MeOH کے ساتھ تیار کردہ TLC کا نشانہ بنایا گیا (90:10,vo, one elution) ایک اور subfraction F6.6.7.1 (24.8 mg) دینا جو ابتدائی طور پر EtOAc-MeOH (85:15, v/o, one elution) کے ساتھ تیار کردہ ایک نئے تیاری والے TLC کے تابع تھا اور بعد میں CH2Cl2-MeOH (90:10,vfo, one elution) نتیجہ 9 (11.1 mg)۔ 9 کے لیے استعمال کیا جانے والا الگ تھلگ طریقہ کار وہی تھا جیسا کہ پہلے 4 کے لیے بیان کیا گیا تھا۔ EtOAc-MeOH (60:40 اور 50:50، v/o) کے ساتھ ذیلی فریکشن F6.6.10 (92.0 mg) کو CH کے ساتھ ایک تیاری کے TLC کا نشانہ بنایا گیا تھا، Cl,-MeOH (90:10, v/o, one elution) بالترتیب 5(1.7 mg) اور 6 (7.8 mg) پیدا کرتا ہے۔ EtOAc-MeOH (50:50,40:60,30:70,20:80, اور 10:90,v/o) کے ساتھ ذیلی فریکشن F6.6.11(326.0 mg) کو CHCl- کے ساتھ تیار کرنے والے TLC کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ بالترتیب MeOH (90:10,v/o,one elution) vielding1(2.4 mg) اور7 (12.5 mg)۔

EtOAc (100 فیصد) اور CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15, اور 75:25,ofo) کے ساتھ ابتدائی CCeluted سے F7 (692.4 mg) کو ایک نئے سلیکا جیل کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ اسی طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے جیسا کہ ابتدائی CC کے لیے بیان کیا گیا ہے اسی سالوینٹس سسٹم کے ساتھ 110 فریکشن (30 ملی لیٹر ہر ایک)۔ 95:05، 90:10، اور 85 کے تناسب میں CH2Cl2-MeOH کے مرکب کا استعمال کرتے ہوئے TLC تشخیص کے بعد :15 ایلیونٹ سسٹم (o/o) کے طور پر، اسی طرح کے سیمپلز کو 12 ذیلی فریکشن (F7.1 سے F7.12) دینے کے لیے جمع کیا گیا تھا۔ EtOAc (50:50,40:60, اور 30:70,v/o فیصد) کو CHCl-MeOH(95:05, vfo, one elution) کے ساتھ 10(5.4 mg) اور 11( کے ساتھ تیار کردہ TLC کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ 120.6 ملی گرام) بالترتیب۔ F7.9(144.2 mg) CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80, اور 10:90, v/o فیصد) کے ساتھ بھی تیار کیا گیا تھا جس میں CH,Cl,-MeOH( کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔ 95:05,vo, one elution) بالترتیب 11 (91.2 mg) اور 12 اور 13 (39.4 mg) کا مرکب۔

تھیلیفولین (1): بھورا بے رنگ پاؤڈر؛' H-NMR اور 13C-NMR ادب کے مطابق [32]؛ LR-ESI (جمع) -MS [M جمع H]* جمع m/z 208۔

اینونائن (2): بھورا بے رنگ پاؤڈر؛ 1H-NMR اور 13C-NMR ادب کے مطابق [33]؛ LR-ESI( جمع) -MS [M جمع H] جمع m/z 266۔

Liriodenine (3): پیلے رنگ کے کرسٹل (CH,Cl-MeOH 3:1)؛ 1H-NMR اور 13C-NMR ادب کے مطابق [10,34]؛ LR-ESI (جمع) -MS [M جمع H] جمع m/z 276۔

(S)-( پلس) - ریٹیکولائن (4): بھورا بے رنگ پاؤڈر؛ [ ]p25 جمع 71,60(c 0.05 g/100 mL, MeOH); ادب کے مطابق 1H-NMR اور 13C-NMR

3،4-Dihydro-7-hydroxy-6-methoxy-1-isoquinolinyl)(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-methanone (Dehydro-oxonorreticuline)(5 ): براؤن بے رنگ پاؤڈر؛ 'H اور 13C-NMR ڈیٹا، ٹیبل 1 دیکھیں؛ LR-ESI (جمع) -MS [M جمع H] جمع m/z 328۔

(پلس){{0}}S,2R-Reticuline N-oxide(6): بھورا بے رنگ پاؤڈر؛ [lp25 پلس 136.4 (c0.146g/100 mL, MeOH)؛ 1Hand 13C-NMR ڈیٹا، ٹیبل 1 دیکھیں؛ LR-APCI(plus)-MS [M پلس H] جمع m/2346

(پلس){{0}}S,2S-Reticuline N.-oxide (7): بھورا بے رنگ پاؤڈر؛ p25 جمع 394.5 (c 0.03g/100 mL, MeOH)؛'H اور 13C-NMR ڈیٹا، دیکھیں جدول 1؛ LR-APCI (جمع) -MS [M پلس H] جمع m/z346۔

Coreximine (8): ہلکا پیلا بے رنگ پاؤڈر؛[ ]p25 پلس 201.1(c 0.08g/100mL, MeOH)'H-NMR اور 13C-NMR ادب کے مطابق[34,35]؛ LR- ESI(plus)-MS [M Plus H] جمع m/z 328۔

Bisnorargemonine (9): بھورا بے رنگ پاؤڈر؛ 1H-NMR اور 13C-NMR ادب کے مطابق [36]؛ LR-APCI(plus)-MS [M plus H] پلس m/z 328۔

Isochamanetin (10): ہلکا پیلا بے رنگ پاؤڈر؛ [ p25-12.4(c 0.5 g/100 mL, MeOH)'H-NMRand 13C-NMRin ادب کے مطابق[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361۔

Dichamanetin (11): پیلا بے رنگ پاؤڈر؛ [ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH)؛ 1H-NMR اور 13C-NMR ادب کے مطابق [37]؛ LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467۔

یوویرینول (12) اور آئسوورینول (13) کا مرکب: پیلا بے رنگ پاؤڈر؛ H-NMR اور 13C-NMR ادب کے مطابق [37]؛ LR-ESI(-)-MS [MH] - m/z 573۔

3.4. In Vitro Cytotoxic Assay

3.4.1.خلیہ

HL-60 (ہیومن پرومائیلوسائٹک لیوکیمیا)، MCF-7 (انسانی چھاتی کا اڈینو کارسینوما)، HepG2 (ہیومن ہیپاٹو سیلولر کارسنوما)، HCT116 (انسانی بڑی آنت کا کارسنوما)، اور MRC-5 (انسانی پھیپھڑوں کا فبروبلاسٹ) سیل لائنیں امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (اے ٹی سی سی، ماناساس، وی اے، یو ایس اے) سے حاصل کی گئی تھیں، اور اے ٹی سی سی اینیمل سیل کلچر گائیڈ کی تجویز کے مطابق ان کی ثقافت کی گئی تھی۔ آلودگی سے پاک خلیوں کے استعمال کی توثیق کرنے کے لئے مائکوپلاسما اسٹین کٹ (سگما-الڈرچ) کا استعمال کرتے ہوئے تمام سیل لائنوں کا مائکوپلاسما کے لئے تجربہ کیا گیا۔

3.4.2 سائٹوٹوکسیٹی پرکھ

cytotoxicity پرکھ کے لیے، Alamar blue طریقہ سے سیل کی قابل عملیت کی مقدار درست کی گئی تھی، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا [{{0}}]۔ تمام تجربات کے لیے، خلیات کو 96-کنویں پلیٹوں میں چڑھایا گیا تھا۔ کیمیائی اجزاء کو ڈائمتھائل سلفوکسائڈ (DMSO، Vetec Ouimica Fina Ltda.، Duque de Caxias، RJ، Brazil) میں تحلیل کیا گیا اور ہر کنویں میں شامل کیا گیا اور 72 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ Doxorubicin (doxorubicin hydrochloride، طہارت 95 فیصد سے زیادہ یا اس کے برابر، لیبارٹری IMA SAIC، بیونس آئرس، ارجنٹائن) کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ علاج کے اختتام پر، ریسازورین کا 20 μL اسٹاک محلول (0.312 mg/mL) (Sigma-Aldrich Co.) کو ہر ایک کنویں میں شامل کیا گیا تھا۔ 570 nm اور 600 nm پر جذبوں کو ایک SpectraMax190 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ 95 فیصد اعتماد کے وقفوں کے ساتھ (CI95 فیصد) سافٹ ویئر گراف پیڈ پرزم (سائنس کے لیے بدیہی سافٹ ویئر؛ سان ڈیاگو، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے۔

4. نتائج

D.calycina کی چھال کی فائٹو کیمیکل تحقیقات نے تیرہ مرکبات (1-13) کو الگ تھلگ اور شناخت کرنے کا باعث بنا۔ نو isoquinoline سے ماخوذ الکلائیڈز (1-9) اور چارflavonoids(10-13)۔ الکلائیڈز کا تعلق درج ذیل ذیلی طبقوں سے ہے: سادہ آئسوکوئنولائن، تھالی آن لائن (1)؛ ایپورفین، اینونین (2)؛ oxoaporphine، liriodenine (3)؛ benzyl-tetrahydroisoquinolines, (plus)-reticuline(4), de hydro-oxonorreticuline(3,4-dihydro-7-hydroxy-6-methoxy-1-isoquinolinyl)({{13} }ہائیڈروکسی-4-میتھوکسیفینیل)-میتھانون)(5)، 1S,2R-reticuline Ng-oxide(6)، اور 1S,2S-reticuline N.-oxide (7)؛ tetrahydro protoberberine، coreximine (8)؛ اور pavine، bisnorargemonine (9). جبکہ flavonoids کا تعلق بینزائیلیٹڈ ڈائی ہائیڈروفلاوونز، isorhamnetin (10)، dichamanetin (11)، اور uvarinol (12) اور isouvarinol (13) کے مرکب سے ہے۔ الگ تھلگ مرکبات کو پہلی بار D.calycina کے ساتھ ساتھ Diclinanona genus میں بھی بیان کیا گیا ہے۔

الگ تھلگ مرکبات کی سائٹوٹوکسک سرگرمی (سوائے اینونین، لیریوڈینائن، 1،2-ڈائی ہائیڈرو-آکسونوریٹیکولین، اور کوریکسمین) کا کینسر کے خلاف جائزہ لیا گیا (HL-60، MCF-7، HepG2، اور HCT116) اور غیر کینسر (MRC-5) ​​سیل لائنز۔ ان میں سے، سب سے زیادہ امید افزا نتائج بینزائیلیٹڈ ڈائی ہائیڈروفلاوونس ڈیکامینٹین (10) کے لیے دیکھے گئے، اور

uvarinol (12) اور isouvarinol (13) کا مرکب جس نے کینسر کے خلیوں کی لائنوں کے خلاف اعتدال پسند سائٹوٹوکسک سرگرمی ظاہر کی （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25۔{1}} ug·mL-')۔ Dichamanetin (11) نے HL-60 اور HCT116 کے خلاف 15.78ug·mL-1 （33.70 μmol-L-1） اور 18.99 ug·mL-I（4.50 کی IC50 اقدار کے ساتھ سائٹوٹوکسک سرگرمی دکھائی۔ بالترتیب L-1）، جبکہ یوویرینول (12) اور آئسوویرینول (13) کے مرکب نے HL-60 کے خلاف سائٹوٹوکسک سرگرمی کا مظاہرہ کیا، جس کی IC50 قدر 9.74 ug∶mL-I، اور HCT110، کے ساتھ قدر 17.31 ug·mL-1۔ ٹیومر سیل لائنوں پر یہ نتائج پہلی بار بینزیلیٹڈ ڈائی ہائیڈروفلاوونز کے لیے بھی بیان کیے گئے ہیں۔ reticuline، anonaine اور liriodenine کی cytotoxic سرگرمیاں پہلے قائم کی گئی تھیں، جس میں liriodenine سب سے زیادہ طاقتور مرکب ہے۔

اس کام میں حاصل کردہ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ خاندان Annonaceae کی نسلیں سائٹوٹوکسک خصوصیات کے ساتھ حیاتیاتی طور پر فعال مرکبات کا ایک امید افزا ذریعہ ہیں، اور حیاتیاتی اسیس کے دیگر ماڈلز میں ان کی تحقیقات کو جاری رکھنے کا مشورہ دیتے ہیں۔

حوالہ جات

1. Couvreur, TLP; پیری، ایم ڈی؛ Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; رچرڈسن، جے ای؛ ایرکنز، آر ایچ جے پھولوں والے پودوں کے خاندان کی ابتدائی ارتقائی تاریخ Annonaceae: مستحکم تنوع اور بوریوٹروپک جیوڈیسپرسل۔ J. Biogeogr 2011، 38، 664–680۔ [کراس ریف]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF منسٹری ڈی ایگریکلچر: ریو ڈی جنیرو، برازیل، 1984۔

3. Leboeuf، M.؛ غار، اے. بھومک، پی کے؛ مکھرجی، بی؛ مکھرجی، آر۔ دی فائٹو کیمسٹری آف دی اینوناسی۔ فائٹو کیمسٹری 1982، 21، 2783–2813۔ [کراس ریف]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; میک لافلن، JL Annonaceous acetogenins: ایک جائزہ۔ جے نیٹ پیداوار 1990، 53، 237–278۔ [کراس ریف]

5. لوسیو، ASSC؛ المیڈا، JRGDS؛ دا کونہ، ای وی ایل؛ Tavares, JF; فلہو، اینوناسی کے جے ایم بی الکلائڈز: ان کی حیاتیاتی سرگرمیوں کا واقعہ اور ایک تالیف۔ الکلائڈز میں؛ Knolker، H.-J.، Ed.؛ ایلسیویئر: ایمسٹرڈیم، نیدرلینڈز، 2015؛ باب 5; جلد 74، صفحہ 233–409۔ [کراس ریف]

6. سوزا، CAS؛ نارڈیلی، وی بی؛ پاز، ڈبلیو ایچ پی؛ پنہیرو، ایم ایل بی؛ Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; سورس، ایم بی پی؛ بیزرا، ڈی پی؛ چار، جے ایس؛ کولن، ایچ ایچ ایف؛ ET رحمہ اللہ تعالی. Asarone سے ماخوذ phenylpropanoids اور isoquinoline سے ماخوذ alkaloids Duguetia pycnastera (Annonaceae) کی چھال سے اور ان کی cytotoxicities۔ کوئم۔ نووا 2020، 43، 1397–1403۔ [کراس ریف]

7. آراوجو، ایم ایس؛ سلوا، ایف ایم اے؛ کولن، ایچ ایچ ایف؛ کوسٹا، EV Isoquinoline- Guatteria olivacea (Annonaceae) کی چھال سے حاصل کردہ الکلائڈز۔ بائیو کیم۔ سسٹم ایکول 2020، 92، 104105۔ [کراس ریف]

8. Ngouonpe، AW؛ Mbobda, ASW; ہیپی، جی ایم؛ Mbiantcha, M.; Tatuedom، ٹھیک ہے؛ علی، ایم ایس؛ لطیف، ایم. Tchouankeu, JC; Kouam, SF دواؤں کے پودے Duguetia staudtii (Annonaceae) سے قدرتی مصنوعات۔ بائیو کیم۔ سسٹم ایکول 2019، 83، 22-25۔ [کراس ریف]

9. سینٹوس، RC؛ سوزا، اے وی؛ اینڈریڈ سلوا، ایم. کروز، KCV؛ کسویا، CAL؛ کارڈوسو، CAL؛ ویرا، ایم سی؛ Formaggio, ASN Antioxidant, anti-rheumatic and anti-inflammatory انوسٹی گیشن of extract and dicentrinone from Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & کانٹا. f J. Ethnopharmacol 2018، 211، 9-16۔ [کراس ریف]

10. کوسٹا، ای وی؛ پنہیرو، ایم ایل بی؛ سوزا، ADL؛ باریسن، اے. کیمپوس، ایف آر؛ ویلڈیز، آر ایچ؛ Ueda-Nakamura, T.; ڈیاس فلہو، بی پی؛ ناکمورا، اینونا فوٹیڈا مارٹ کی شاخوں سے آکسواپورفین اور پیریمائڈائن- -کاربولین الکلائڈز کی CV ٹریپینوسائڈل سرگرمی۔ (Annonaceae)۔ مالیکیولز 2011، 16، 9714–9720۔ [کراس ریف]

11. سلوا، ڈی بی؛ ٹولی، ای سی او؛ ملیتا، جی سی جی؛ Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; موریس، MO؛ Albuquerque, S.; سیکیرا، جے ایم ایکسٹریکٹ اور الکلائڈز کی اینٹیٹیمورل، ٹرپینوسائیڈل اور اینٹی لیشمیئل سرگرمیاں ڈوگیٹیا فروسیا سے الگ تھلگ ہیں۔ فائٹو میڈیسن 2009، 16، 1059–1063۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

12. کوسٹا، ای وی؛ پنہیرو، ایم ایل بی؛ زاویر، سی ایم؛ سلوا، جے آر اے؛ امرال، ACF؛ سوزا، ADL؛ باریسن، اے. کیمپوس، ایف آر؛ فریرا، اے جی؛ ماچاڈو، جی ایم سی؛ ET رحمہ اللہ تعالی. اینٹی لیشمیئل سرگرمی کے ساتھ اینونا فوٹیڈا سے ایک پیریمائڈین- -کاربولین اور دیگر الکلائڈز۔ جے نیٹ پیداوار 2006، 69، 292–294۔ [کراس ریف]