Aspergillus Favus "Endophyte of Jojoba" Taxol کی اینٹی کینسر سرگرمی کو بڑھانا - شعاع ریزی کے ذریعے ثالثی سونے کے نینو پارٹیکلز کے ساتھ کنجوگیشن کے ذریعے

Taxol متبادل چینی جڑی بوٹیاں Cistanche

مطلوبہ الفاظ:Aspergillus favus · Jojoba · Endophytic fungi · گولڈ نینو پارٹیکلز · Taxol · -Iradiation · Nutritional Optimization

تعارف

ٹیکسول سب سے زیادہ کمرشلائزڈ براڈ اسپیکٹرم میں سے ایک ہے۔کینسر مخالف ادویات[1]۔ ٹیکسول کی سرگرمی سیلولر ٹیوبلین -سبونٹس ہیٹروڈیمر کے ساتھ پابند ہونے کے لئے اس کی منفرد خصوصیت سے واضح کرتی ہے، ٹیوبلین پولیمرائزیشن کو فروغ دیتی ہے، اس طرح ٹیومر خلیوں کی مائٹوٹک تقسیم میں خلل پڑتا ہے [2]۔ ٹیکسول نے چھاتی، پھیپھڑوں، سر، اور گردن، بچہ دانی کے کینسر، اور کپوسی کے سارکوما کی جدید شکلوں کے خلاف ایک مضبوط سرگرمی کا مظاہرہ کیا [3]۔ ٹیکسول سب سے پہلے یو کے درختوں کی چھال سے تیار کیا گیا تھا Taxus brevifolia "family Taxaceae" [4, 5]; تاہم، ٹیکسول کی کم پیداوار ہے کہ<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as دمہ,سوزش، اورکینسر[32]۔ اس طرح، اس کام کا بنیادی مقصد ٹیکسول کی پیداوار کے لیے منفرد میٹابولک استحکام کے ساتھ جوجوبا پلانٹ سے ایک نئے فنگل الگ تھلگ کو تلاش کرنا تھا، تاکہ ان کی ٹیکسول کی پیداوار کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے مختلف طریقوں کا جائزہ لیا جا سکے، اور ساتھ ہی، نکالے گئے ٹیکسول مرکبات کی انسدادی سرگرمی کو بڑھانا تھا۔ گولڈ نینو پارٹیکلز کے ساتھ جوڑ کے ذریعے، گاما شعاع ریزی کے ذریعے ثالثی۔

مواد اور طریقے

اینڈو فیٹک فنگی کی تنہائی اور ثقافت

جوجوبا کے مختلف حصوں (سیمنڈسیا چائننس) جیسے پتے، چھال، ٹہنیاں اور کلیاں، فیکلٹی آف ایگریکلچر، قاہرہ یونیورسٹی سے اکٹھی کی گئیں اور اینڈو فیٹک فنگس کے ماخذ کے طور پر استعمال کی گئیں۔ پودوں کے پرزے جمع کیے گئے اور بہتے ہوئے پانی کے نیچے دھوئے گئے، سطح کو 70 فیصد ایتھنول سے 1 منٹ تک جراثیم سے پاک کیا گیا اور پھر جراثیم سے پاک پانی سے دھویا گیا [28]۔ جراثیم سے پاک پودوں کی سطح کے حصوں کو جراثیم سے پاک حالات میں چھوٹے چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹ کر آلو ڈیکسٹروز ایگر (PDA) میڈیم، Czapek's-Dox، اور malt extract agar media [33–36] کی پلیٹوں پر رکھا گیا تھا، اور پلیٹوں کو 30 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ 10 دن. پودوں کے حصوں کی سطح کی جراثیم کشی کی تاثیر کا اندازہ کلی کرنے والے پانی کو سینٹرفیوگ کر کے لگایا گیا، پھر 500 ul جراثیم سے پاک پانی کو پریزیٹیٹ میں شامل کیا گیا اور PDA میڈیم [37] میں چڑھایا گیا۔ پیوریفائیڈ اینڈو فیٹک فنگل آئسولیٹس کو پی ڈی اے سلینٹ پر 7 دن تک ٹیکہ لگایا گیا اور 4 ڈگری پر محفوظ کیا گیا۔

اینڈوفیٹک فنگی سے ٹیکسول کی اسکریننگ، نکالنا اور مقدار درست کرنا

جوجوبا میں رہنے والی برآمد شدہ اینڈو فیٹک فنگس کو آلو ڈیکسٹروز شوربے (PDB) پر اگ کر ٹیکسول کی پیداوار کے لیے اسکرین کیا گیا تھا [38]۔ 7 دن پرانے فنی گیل آئسولیٹس میں سے ہر ایک کے ایک پلگ کو 100 ملی لیٹر PDB/250 ملی لیٹر ایرلن میئر ٹاسکس میں ٹیکہ لگایا گیا تھا، 15 دن تک 30±1 ڈگری پر، لرزنے والے حالات میں (120) آر پی ایم)۔ انکیوبیشن کے بعد، ثقافتوں کو فلٹر کیا گیا، اور فلٹریٹ میں 0.2 فیصد سوڈیم بائک کاربونیٹ کے ساتھ ترمیم کی گئی تاکہ فیٹی ایسڈ کو تیز کیا جا سکے۔ ٹیکسول کو ڈائیکلورومیتھین کے ساتھ نکالا گیا ہے، اور نامیاتی مرحلے کو جمع کیا گیا اور خشک ہونے کے لیے بخارات بنا دیا گیا، اور باقیات کو میتھانول میں دوبارہ تحلیل کر دیا گیا [17، 39]۔ ٹیکسول کو TLC نے مرک 1 ملی میٹر (20×20 سینٹی میٹر) پری لیپت سلیکا جیل پلیٹس (TLC سلیکا جیل 60 F254، Darmstadt، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے الگ کیا اور شناخت کیا، جس کا پتہ UV الیومینیشن سے 254 nm [39] پر پایا گیا۔ ٹیکسول کے پوٹیٹو دھبوں کو TLC سلیکا جیل پلیٹوں سے کھرچ کر میتھانول میں تحلیل کر دیا گیا، 10 منٹ کے لیے بھرپور طریقے سے گھمایا گیا، اور 5 منٹ کے لیے 1000 rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سیلیکا کے تیز ذرات کو ہٹا دیا گیا تھا، اور C18 ریورس فیز کالم (Eclipse Plus C18 4.6 کے HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 Plus Quater nary Pump, Korea) کے ذریعے ٹیکسول کی مقدار اور طہارت کی جانچ کے لیے سپرنٹنٹ لیا گیا تھا۔ ×150 ملی میٹر، 3.5 μm، بلی # 959,963–902)۔ موبائل فیز کا استعمال کیا گیا میتھانول/ایسیٹونیٹرائل/پانی (25:35:40، v/v/v) 20 منٹ [40] کے لیے 1.0 ملی لیٹر/منٹ کی فو ریٹ پر، اور ٹیکسول فریکشنز 227 این ایم پر ماپا گیا، اور ان کے کیمیائی شناخت اور ارتکاز کی تصدیق مستند نمونے کے مقابلے میں برقرار رکھنے کے وقت اور جذب کی چوٹی کے علاقے سے ہوئی۔

بازیافت شدہ اینڈوفائٹک فنگس کی مورفولوجیکل اور سالماتی شناخت

اینڈو فیٹک فنگل آئسولیٹس کی شناخت ان کی انواع کی سطح پر ان کی میکرو اور مائیکرو مورفولوجیکل خصوصیات کی بنیاد پر PDA، Czapek's-Dox، اور malt extract media پر حوالہ کی چابیاں [33–36] کے مطابق بڑھ کر کی گئی۔ سب سے زیادہ طاقتور ٹیکسول پیدا کرنے والے فنگل الگ تھلگ کی شناخت کی مزید سالماتی طور پر تصدیق کی گئی تھی جس کی بنیاد پر اندرونی نقل شدہ اسپیسر (ITS) [41، 42] کی ترتیب تھی۔ فنگل جینومک ڈی این اے (جی ڈی این اے) کو مائع نائٹروجن میں مائسیلیا (~0.2 جی) کو پلورائز کرکے نکالا گیا، پھر 1 ملی لیٹر CTAB نکالنے والے بفر (2 فیصد CTAB، 2 فیصد PVP40، 0) {21}}.2 فیصد 2-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl in 100 mM Tris−HCl, pH 8.0)۔ PCR پرائمر سیٹ ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ اور ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ تھے۔ پی سی آر ری ایکشن میں 2×PCR ماسٹر مکسچر کے 10 ul (i-Taq™، Cat. No. 25027)، 2 ul gDNA، 1 ul ہر پرائمر (10 pmol/ul)، اور جراثیم سے پاک کشید کے ساتھ 20 ul تک مکمل کیا جاتا ہے۔ پانی. پی سی آر کو 2 منٹ کے لیے 94 ڈگری پر ابتدائی ڈینیچریشن، 30 سیکنڈ کے لیے 94 ڈگری پر ڈینیچریشن، 10 سیکنڈ کے لیے 55 ڈگری پر اینیلنگ، 35 سائیکلوں کے لیے 30 سیکنڈ کے لیے 72 ڈگری پر توسیع، اور 2 کے لیے 72 ڈگری پر فینل ایکسٹینشن کے لیے پرو گرام کیا گیا تھا۔ منٹ 1×TBE بفر (Ambion Cat# AM9864) میں 1.5 فیصد ایگروز جیل کے ذریعے PCR ایمپلیونز کا تجزیہ کیا گیا، 1 kb DNA سیڑھی (Cat. # PG010-55DI) کا استعمال کرتے ہوئے اور جیل دستاویزی نظام کے ذریعے تصور کیا گیا۔ ایمپلی کنز کو اپلائیڈ بایو سسٹم سیکوینسر، ہائی ایس کیو وی بیسز، ورژن 6.0 کے ذریعے ایک ہی پرائمر سیٹ کے ساتھ صاف اور ترتیب دیا گیا تھا۔ حاصل کردہ ترتیبوں کو NCBI ڈیٹا بیس پر بلا ضرورت تلاش کیا گیا، MEGA 6.0 سافٹ ویئر میں درآمد کیا گیا، اور Clustal W پٹھوں کے الگورتھم کے ساتھ منسلک کیا گیا [43] اور phylogenetic Tree کو MEGA 6.0 [44] کے پڑوسی میں شامل ہونے کے طریقہ کار کے ساتھ بنایا گیا۔

نکالے گئے ٹیکسول کی کیمیائی ساخت

ٹیکسول کے پوٹیٹو دھبوں کو TLC سلیکا جیل پلیٹوں سے کھرچ کر صاف کیا گیا تھا، اور مستند ٹیکسول کے مقابلے میں پاکیزگی اور ارتکاز کا تعین UV-Vis تجزیہ کے ذریعے λ 227 nm (RIGOL، Ultra-3000 سیریز) پر کیا گیا تھا۔ [39]۔ اسی شرائط کے تحت خالی میڈیا کو سپیکٹرو فوٹومیٹرک تجزیوں کے لیے منفی بیس لائن کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ خالص ٹیکسول نمونوں کے FT-IR سپیکٹرم کا تجزیہ JASCO FT-IR 3600 سپیکٹرو فوٹومیٹر نے کیا۔ ٹیکسول کا نمونہ KBr چھروں کے ساتھ گراؤنڈ کیا گیا تھا، جسے ویکیوم کے نیچے ڈسکس میں دبایا گیا تھا، اور مستند کے مقابلے میں جذب کو 400 سے 4000 cm−1 [3] کے علاقے میں ماپا گیا تھا۔ مستند ٹیکسول کے مقابلے میں نکالے گئے ٹیکسول کی کیمیائی ساخت کی تصدیق HNMR سپیکٹروسکوپی (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) سے ہوئی۔ نمونوں کو سی ڈی سی ایل 3 میں حل کیا گیا تھا، کیمیکل شفٹوں کو پی پی ایم (δ-اسکیل) میں دیا جاتا ہے، اور جوڑے کے مستقل کو ہرٹز (Hz) میں ظاہر کیا جاتا ہے۔

ٹیکسول کی پیداوار پر میڈیا کی مختلف اقسام کا اثر

ہر فنگل آئسولیٹ کے 7 دن پرانے کلچرز سے دو آگر پلگ (9 ملی میٹر) کو 100 ملی لیٹر میڈیم/250 ملی لیٹر ایرلن میئر فلاسک آف پوٹیٹو ڈیکسٹروز (PDB)، Czapekʼs-Dox (CZD)، M1D، اور مالٹ ایکسٹریکٹ (ME) میں سہ رخی میں ٹیکہ لگایا گیا تھا۔ ) شوربہ میڈیا۔ ہر ایک میڈیا سے غیر منقولہ کنٹرول جو فنگل بیضوں سے پاک ہوتے ہیں منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیے جاتے تھے، انہی حالات میں 15 دن کے لیے 30 ڈگری پر انکیوبیٹ ہوتے تھے۔ انکیوبیشن کے بعد، فنگل ثقافتوں کو فلٹر کیا گیا تھا، اور ٹیکسول کو نکالا گیا تھا اور جیسا کہ اوپر بتایا گیا ہے اس کا تعین کیا گیا تھا۔

ٹیکسول کی پیداوار کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے غذائی حالات کی بائیو پروسیس آپٹیمائزیشن

پوٹینٹ فن گیل آئسولیٹ کے ذریعہ ٹیکسول کی پیداوار کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے میڈیم کمپوزیشن کی اصلاح کا عمل جوابی سطح کے طریقہ کار کے ذریعے Placket-Burman ڈیزائن کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جس کے بعد مرکزی جامع ڈیزائن [17–20, 45]۔ RSM ڈیزائنوں سے، طاقتور فنگل آئسولیٹ کے ذریعہ ٹیکسول کی پیداوار کو متاثر کرنے والے مثبت اور اہم متغیرات کا اندازہ ڈیزائن ماہر 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA) کے شماریاتی سافٹ ویئر پیکج کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ ہر تجربہ تین حیاتیاتی نقلوں میں چلایا گیا تھا اور اوسط اقدار پر غور کیا گیا تھا۔ مطلوبہ حالات میں انکیوبیشن کے بعد، فنگل بایوماس کو فلٹر کیا گیا تھا، اور ٹیکسول کو TLC اور HPLC کے ذریعہ نکالا گیا تھا اور اس کی مقدار اوپر بیان کی گئی ہے۔

پلاکیٹ برمن ڈیزائن

پلیکیٹ برمن ڈیزائن کو اکثر میڈیا کے اجزاء کی اصلاح کے لیے استعمال کیا گیا ہے تاکہ فنگل کی افزائش اور بائیو ایکٹیو ثانوی میٹابولائٹس کی پیداوار، ٹیکسول کی پیداوار کو متاثر کرنے والے اہم متغیرات کا جائزہ لیا جائے [18, 20, 46]۔ فیکٹر کا انتخاب معیار اور مقداری اسکریننگ میں استعمال ہونے والے میڈیا پر مبنی تھا۔ گیارہ عوامل شامل کیے گئے ہیں۔ مالٹ ایکسٹریکٹ، پیپٹون، سوکروز، سویٹون، گلوٹامائن، بیف ایکسٹریکٹ، اور درجہ حرارت، پی ایچ، انکیوبیشن ٹائم، اور ہلانے کی رفتار کی قدریں اور عوامل دو سطحوں پر مختلف تھے، اور کم از کم اور زیادہ سے زیادہ سطحوں کی حدیں منتخب کی گئیں۔ شماریاتی ڈیزائن-ماہر 7.0 کا استعمال 12 تجربات کا ایک سیٹ تیار کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ ہر تجربے کے لیے، ٹیکسول کی پیداوار کا تعین تین حیاتیاتی نقلوں میں کیا گیا تھا، اور ٹیکسول کی پیداوار کی اوسط پر غور کیا گیا تھا۔

اعداد و شمار کا ریگریشن تجزیہ شماریاتی سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ ہر متغیر کا اثر درج ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے (بائیو میٹریکا، 2020) کا حساب لگایا گیا:

جہاں، E ٹیسٹنگ متغیر کا اثر ہے، M پلس، اور M− ٹرائلز کا ٹیکسول ارتکاز ہے جس میں پیرامیٹر بالترتیب اپنی اعلیٰ اور نچلی سطح پر تھا، اور N وہ تجربات کی تعداد ہے جو کیے گئے تھے۔ پیداوار پر ہر متغیر کے اثر کا تعین ان کی متعلقہ E-values ​​کا حساب لگا کر کیا گیا تھا۔

جہاں Tot high اعلی سطح پر کل جوابات ہیں، Tot low کم سطح پر کل جوابات ہیں، اور No نمبر ٹرائلز ہیں۔

مرکزی جامع ڈیزائن اور ٹیکسول کی پیداوار کو متاثر کرنے والے عوامل کے درمیان تعامل

منتخب فنگل آئی ایس او دیر سے ٹیکسول کی پیداوار کو متاثر کرنے والے سب سے اہم مثبت عوامل کو جوابی سطح کی قسم سی سی ڈی ماڈل تجرباتی ڈیزائن [47] کا استعمال کرتے ہوئے بہتر بنایا گیا۔ CCD کا استعمال کرتے ہوئے، درمیانے درجے کے اجزاء کی ارتکاز کو بہتر بنایا گیا، اور ان کے زیر مطالعہ تعاملات کو تین متغیروں کے لیے کل 20 تجربات پیدا کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ طاقتور فنگل الگ تھلگ سے ٹیکسول کی پیداوار کے لیے متغیرات کی بہترین سطحوں کا تعین کرنے کے لیے، تین جہتی (3D) ردعمل کی سطح کے منحنی خطوط کو مختلف عوامل کے درمیان تعامل کا مطالعہ کرنے اور ٹیکسول کی پیداوار کو متاثر کرنے والے ہر عنصر کی متغیر حالت کا تعین کرنے کے لیے منصوبہ بنایا گیا تھا۔ 3D گراف ایک مثالی سطح پر تین عوامل کے مستقل کو پکڑ کر اور دیگر دو عوامل کی مختلف سطحوں کے لئے ٹیکسول کی پیداوار کے حاصل کردہ ردعمل کو ترتیب دے کر کئے گئے تھے۔

ٹیکسول کی پیداوار پر گاما شعاع ریزی کا اثر

ٹیکسول پیدا کرنے والے طاقتور اینڈو فیٹک آئسولیٹس کو 60کوبالٹ سورس (گاما سیل 4000-A-انڈیا) کے ساتھ گاما ریڈی ایشن کی مختلف خوراکوں (0.25–3.0 kGy) کے مقابلے میں شعاع ریزی کا سامنا کرنا پڑا۔ غیر شعاعی ثقافت کے کنٹرول کے لیے؛ تجربات کے وقت خوراک کی شرح 1.2 کلو گرام فی گھنٹہ۔ غیر شعاع ریزی والے بیضہ کے انوکولم کے بطور کنٹرول کے مقابلے، معیاری ثقافتی حالات میں شعاع زدہ ثقافت کے ذریعے اصلاح شدہ میڈیا کو ٹیکہ لگایا گیا تھا۔ ثقافتوں کو روٹری شیکر (120 rpm) پر 15 دن کے لئے 30 ± 2 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ انکیوبیشن کے بعد، ثقافتوں کو فلٹر کیا گیا تھا اور ٹیکسول کو TLC اور HPLC کے ذریعہ نکالا، صاف کیا گیا تھا اور اس کی مقدار درست کی گئی تھی جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔

گولڈ نینو پارٹیکلز (AuNPs) کی ترکیب اور خصوصیات؛ ٹیکسول کے ساتھ جوڑ

Taxol کی کینسر مخالف سرگرمی

جگر کے کارسنوما (HPG2) کے خلاف پیوریفائیڈ Taxol اور Taxol-PVP-AuNPs کی سرگرمی کا تعین 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ -2،5-ڈفینائل ٹیٹرازولیم برومائڈ (MTT) پرکھ [48]۔ کنویں کی پلیٹ کو 103 سیل فی کنویں کے ساتھ سیڈ کیا گیا تھا، اور رات بھر 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا، پھر دوائیوں کی مختلف مقداریں شامل کی گئیں، اور پلیٹوں کو 48 گھنٹے کے لیے دوبارہ انکیوبیٹ کیا گیا۔ ایم ٹی ٹی ریجنٹ (25 ul) کو شامل کیا گیا تھا، اور 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور تیار شدہ فارمازان کمپلیکس کا جامنی رنگ λ570 nm پر ماپا گیا تھا۔ IC50 کی قدر کا اظہار منشیات کی مقدار سے کیا گیا جو مثبت کنٹرول میں معمول پر آنے والے ٹیومر خلیوں کی ابتدائی تعداد کے 50 فیصد کی ترقی کو کم کرتی ہے۔

Taxol اور Taxol-AuNPs کنجوگیٹس کی اینٹی مائکروبیل سرگرمی

Taxol اور Taxol-AuNPs conjugates کی antimicrobial سرگرمی کا اندازہ مختلف بیکٹیریل الگ تھلگوں کے خلاف کیا گیا تھا۔ Bacillus subtilis ATCC 6633 اور Staphylococcus epidermidis، Pseudomonas aeruginosa، Escherichia coli، اور Enterobacter agglomerans، Candida albicans کے علاوہ۔ ~0.5 میکفرلینڈ (1–1.5)× 1{{10}}8 CFU/ml λ6{18 پر معیاری انوکولم حاصل کرنے کے لیے ٹیسٹ کیے گئے بیکٹیریل سیلز جراثیم سے پاک پیپٹون پانی میں معطل کیے گئے تھے۔ }}0 nm۔ مائکروبیل پیتھوجینز کی نشوونما کی روک تھام (ملی میٹر) کا اندازہ ایگر ڈسک بازی کے طریقہ سے کیا گیا۔ 6.0 ملی میٹر قطر کے ساتھ جراثیم سے پاک معیاری اینٹی بائیوٹک ڈسکوں کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ جراثیم سے پاک اینٹی بائیوٹک ڈسکس (6.0 ملی میٹر) منفی اور مثبت کنٹرول کے طور پر 20 ul میتھانول اور amoxicillin-clavulanic acid (AMC) سے بھری ہوئی تھیں۔ ڈسکس ٹیکسول، ٹیکسول-PVP-AuNPs، اور AuNPs (1.0 ug/ml) کے اسی ارتکاز کے ساتھ بھری ہوئی تھیں۔ تین حیاتیاتی نقل تیار کی گئیں۔ پلیٹوں کو 24 گھنٹے کے لئے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور روک تھام کے زون کی پیمائش کی گئی تھی۔ Amoxicillin clavulanic acid (AMC) اور nystatin کا ​​استعمال Taxol کی antimicrobial سرگرمی کو معمول پر لانے کے لیے کیا گیا تھا۔ نمو کی روک تھام کے زون کا تعین ورنیئر کیلیپر (ملی میٹر) سے کیا گیا تھا۔

شماریاتی تجزیہ

طاقتور ٹیکسول پروڈیوسرز کی مورفولوجیکل اور مالیکیولر شناخت

ٹیکسول پیدا کرنے والے قوی فنگل الگ تھلگ کی مورفولوجیکل خصوصیات کی جانچ میکروسکوپیکل اور خوردبینی وضاحتی کلیدوں کے مطابق کی گئی، جیسا کہ مواد اور طریقوں میں بیان کیا گیا ہے، اور A. favus (تصویر 2) کے ساتھ اس کی شکلیاتی قربت کا انکشاف کیا۔ فنگل الگ تھلگ PDA پر 30 ڈگری پر 10 دن تک اگایا گیا تھا اور میکروسکوپیکل اور خوردبینی خصوصیات نے اس کی شناخت کو ظاہر کیا جیسے کنڈیئل ہیڈز، برانچنگ کا طریقہ، کلنک کی شناخت، اور کونڈیل آنٹولوجی، اور فروٹنگ باڈیز کی تشکیل، یونیورسل کے مطابق۔ مورفولوجیکل کیز [33]، اور ایسپرگیلس فاووس سے مماثل پائی گئیں۔ طاقتور ٹیکسول پیدا کرنے والے الگ تھلگ A. favus کی مزید شناخت ان کے ITS تسلسل کی بنیاد پر کی گئی تھی، gDNA کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کرتے ہوئے۔ A. favus کے PCR amplicons (~550 bp) کو حل کیا گیا، صاف کیا گیا اور ترتیب دیا گیا (تصویر 2)۔ A. favus کا ITS تسلسل NCBI ڈیٹا بیس پر تلاش کیا گیا غیر فالتو دھماکہ تھا، A. favus کے ساتھ 99 فیصد مماثلت، صفر E. اقدار کے ساتھ، اور 95 فیصد استفسار کی کوریج۔ اس طرح، خوردبینی اور مالیکیولر تجزیوں سے، ہدف کے الگ تھلگ کی تصدیق A. favus کے طور پر ہوئی اور GenBank پر الحاق نمبر MW485934.1 کے ساتھ جمع کر دی گئی، ساتھ ہی، الگ تھلگ Assiut University Mycological Center (AUMC)، مصر میں جمع کر دیا گیا ہے۔ جمع کرانے کا نمبر AUMC13892۔ موجودہ الگ تھلگ A. favus isolates MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551 کے ساتھ 99 فیصد مماثلت رکھتا تھا

تصویر 1 جوجوبا پلانٹ کا ایک مورفولوجیکل منظر۔ طاقتور ٹیکسول پیدا کرنے والی اینڈوفائٹک فنگس کی B پلیٹ کلچرز؛ A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) اور A. oryzae Bd (25) PDA پر 8 دن کے بعد 30 ڈگری پر انکیوبیشن۔ فنگل الگ تھلگ PDB پر اگائے گئے تھے، اور معیاری حالات میں انکیوبیٹ کیے گئے تھے، اور ٹیکسول کو TLC (C) کے ذریعے نکالا اور چیک کیا گیا تھا۔ طاقتور فنگل آئسولیٹس سے ٹیکسول کا D HPLC کرومیٹوگرام۔ ٹیکسول کی E پیداوار HPLC سے مقدار کے مطابق۔ F, UV-Vis اسپیکٹرل تجزیہ فنگل الگ تھلگ سے نکالے گئے ٹیکسول کا۔ مستند کے مقابلے میں نکالے گئے ٹیکسول کا G FT-IR تجزیہ

تصویر 2 A. کی میکرومورفولوجیکل خصوصیات PDA پر 3، 5 اور 8 دن کی ترقی کے بعد جوجوبا کے ایک اینڈوفائٹ کو فاووس کرتی ہیں۔ مائیکرو مورفولوجیکل خصوصیات، A. favus کا 400X میگنیفیکیشن کے ذریعے کونڈیل ہیڈ۔ 500 bp کے A. favus ITS ریجن کا C PCR amplicon، 1 kb سیڑھی (Cat.#. SM0312) کو نارمل کرنا۔ زیادہ سے زیادہ امکان کے طریقہ سے ITS A. favus کا فائیلوجینیٹک تجزیہ [44]