Cistanche: Endothelial خلیات میں Echinacoside-حوصلہ افزائی نائٹرک آکسائڈ کی پیداوار: اینڈروجن ریسیپٹر اور PI3K-Akt پاتھ وے کے کردار

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU، DANHONG LIAN، YIMEI ZHENG، WEI ZHOU، JINLEI GU اور XIN LIU

تعارف

Cistancheہاف ایم جی۔ ایٹ لنک Orobanchaceae خاندان کی ایک نسل کی ایک بارہماسی پرجیوی جڑی بوٹی ہے۔ ہرباCistanche، کا تناCistanche deserticolaY. c ایم اے اورCistanche tubulosa(Schenk) R. Weight، کو گردے کی کمی، نامردی، مربیڈ لیکوریا اور بوڑھے قبض (1) کے علاج کے لیے ٹانک ایجنٹ کے طور پر استعمال کیا گیا ہے، جو کہ اس کے اینڈروجن نما یا جنسی ہارمون ریگولیٹری اثر (2) کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔Echinacoside(EcH; c35H46O20;

سالماتی وزن، 786.73؛ تصویر 1)، ہربا کے تنوں سے الگ تھلگ phenylethanoid glycosides (PhGs) میں سے ایک ہے۔Cistanche، اور متعدد حیاتیاتی خصوصیات کو ظاہر کرتا ہے، بشمول اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی ایجنگ، اینٹی سوزش، ہیپاٹوپروٹیکٹو اور نیورو پروٹیکٹو اثرات (3)۔ فارماکولوجی کی جدید تحقیقات نے ثابت کیا ہے کہ ہربا کے مختلف اجزاءCistancheبشمول EcH، ایکٹیوسائیڈ، کنکانوز، کانکانوسائیڈ ایف اور سیستانوسائیڈ ایف، ویسورلیکسنٹ سرگرمی کی نمائش کرتے ہیں (4)۔

اینڈوتھیلیم عروقی کا ایک اہم ریگولیٹر ہے، اور نائٹرک آکسائڈ (NO) ایک اہم آرام دہ عنصر ہے جو اینڈوتھیلیل خلیوں کے ذریعے جاری کیا جاتا ہے۔ ہموار پٹھوں کے خلیوں میں پھیلنے سے، NO guanylate cyclase کو چالو کرتا ہے، cyclic guanosine monophosphate (cGMP) کی سطح کو بڑھاتا ہے، اور پھر cGMP پر منحصر پروٹین کنیز (PKGs) کو ہموار پٹھوں میں نرمی کو فروغ دینے کے لیے فعال کرتا ہے (5)۔ اس سے پہلے یہ ظاہر کیا گیا تھا کہ EcH at 350-400 µM براہ راست عروقی ہموار پٹھوں پر کام کرتا ہے اور چوہے کے پلمونری شریان کے ہموار پٹھوں کے خلیات (6) میں ہائپوکسیا سے متاثرہ پھیلاؤ کو روکتا ہے، جبکہ 30-300 µM EcH نے اینڈوتھیلیم میں شدید ویسورلیکسیشن کا سبب بنتا ہے۔ ارتکاز پر منحصر انداز میں برقرار حلقے، اور phenylephrine (7) کی طرف سے معاہدہ aortic حلقوں کے کارپس cavernosum ہموار پٹھوں میں cGMP کی پیداوار میں اضافہ۔ ہموار پٹھوں کے خلیات میں NO-cGMP-PKG-BKca چینلز کو کھول کر، 100 یا 300 µM EcH نے چوہوں کی پلمونری شریانوں میں ناراڈرینالین کی حوصلہ افزائی کے سنکچن کو دبایا، خاص طور پر اینڈوتھیلیم سے محروم حلقوں میں (8)۔ اینڈوتھیلیل خلیے قلبی فعل کے کلیدی ریگولیٹرز ہیں اور، کئی صورتوں میں، یہ پایا گیا ہے کہ اینڈوتھیلیل پر منحصر نرمی ایک قابل منتقلی مادے کی وجہ سے تھی، جیسا کہ NO، اینڈوتھیلیم (9) سے خارج ہوتا ہے۔ تاہم، عروقی انڈوتھیلیل خلیوں میں EcH-حوصلہ افزائی NO کی پیداوار کے اپ اسٹریم مالیکیولر میکانزم کو مزید تفتیش کی ضرورت ہے۔

عروقی اینڈوتھیلیم میں، کوئی نسل بنیادی طور پر اینڈوتھیلیل NO سنتھیس (ای این او ایس) کے ذریعہ ثالثی نہیں کی جاتی ہے۔ کئی گروہوں نے یہ ظاہر کیا ہے کہ فاسفیٹائیڈلینوسیٹول 3-کناز (PI3K) راستہ سیرین تھرونائن پروٹین کناز بی (اکٹ) کو متحرک کرتا ہے، جو سیرین 1177 (Ser1177) (10) پر براہ راست eNOS فاسفوریلیشن کا سبب بنتا ہے۔ اینڈروجن ریسیپٹر (اے آر) نیوکلیئر ریسیپٹر ذیلی فیملی s3 کا ایک رکن ہے، جو جین کے اظہار کو عام طور پر تبدیل کرتا ہے۔ خلیے کی جھلی میں کیویولے کے لیے اے آر لوکلائزیشن اس میں شامل ہے۔

c-Src/PI3K/Akt جھرن کو متحرک کرکے اینڈوتھیلیل سیل فنکشن یا جین ایکسپریشن کا غیر جینومک ریگولیشن، جس کا نتیجہ بالآخر eNOS فاسفوریلیشن اور NO پیداوار (11) میں ہوتا ہے۔ انسانی شہ رگ کے اینڈوتھیلیل خلیوں میں، ٹیسٹوسٹیرون کو PI3K/Akt سگنلنگ کو چالو کرنے اور قلبی نظام پر PI3K کے p85 ذیلی یونٹ اور AR کے براہ راست تعامل کی وجہ سے تیزی سے NO پیداوار پیدا کرنے کی اطلاع دی گئی ہے (12)۔ یہ اطلاع دی گئی تھی کہ EcH ہارمون کی کمی سے متعلق علامات کو بڑھاتا ہے اور ٹیسٹوسٹیرون (2) کی بجائے AR سے مسابقتی پابند ہونے کی وجہ سے اپنے اینڈروجن جیسے اثرات مرتب کرتا ہے۔ لہذا، موجودہ مطالعہ نے یہ قیاس کیا کہ PI3K/Akt کا راستہ EcH کے ذریعہ حوصلہ افزائی شدہ AR پر منحصر eNOS فاسفوریلیشن کے ذریعہ NO پیداوار میں شامل ہوسکتا ہے۔ موجودہ مطالعہ کا مقصد EcH کے درج ذیل اثرات کا جائزہ لینا تھا: i) NO پیداوار اور eNOS فاسفوریلیشن کی شمولیت؛ ii) ای این او ایس فاسفوریلیشن میں اے آر کی شمولیت؛ اور iii) PI3K/Akt پاتھ وے کو انسانی ناف کے رگوں کے اینڈوتھیلیل سیلز (HUVEcs) میں چالو کرنا، جو کہ اینڈوتھیلیل سیل کے افعال اور انجیوجینیسیس (13) کے ضابطے کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک معروف تجرباتی ماڈل ہے۔

مواد اور طریقے

کیمیکل اور ری ایجنٹسEcH (پاکیزگی، 92.5 فیصد) نیشنل انسٹی ٹیوٹ فار دی فوڈ اینڈ ڈرگ کنٹرول میں نیشنل ڈرگ ریفرنس اسٹینڈرڈز سے حاصل کیا گیا تھا۔ ابکم سے p-Akt (Ser473؛ cat. no. ab8805)، Akt (cat. no. ab81283)، p-eNOS (Ser1177؛ cat. no. ab184154) اور eNOS (بلی نمبر ab76198) کے خلاف اینٹی باڈیز خریدی گئیں۔ نیلوٹامائڈ اور آئی سی آئی 182780 کے روکنے والے سگما الڈرچ سے حاصل کیے گئے تھے۔ مرک کے جی اے اے۔ L-NAME کو Adamas-Beta, Ltd. سے خریدا گیا تھا، اور wortmannin کو Pribolab سے خریدا گیا تھا۔

سیل ثقافت اور منشیات علاج.HUVEcs سائنسل ریسرچ لیبارٹریز انکارپوریشن سے حاصل کیے گئے تھے اور 5 فیصد (v/v) فیٹل بووائن سیرم (FBS؛ Gibco، Thermo Fisher Scientific, Inc.) اور 1 فیصد اینڈوتھیلیل سیل میڈیم (EcM؛ سائنسل ریسرچ لیبارٹریز) میں کلچر کیے گئے تھے۔ گروتھ سپلیمنٹ (ECGS) 37˚C پر (5 فیصد CO2 اور 95 فیصد نمی) (14)۔ سنگم پر پہنچنے پر، خلیوں کو ٹرپسن کے ساتھ ہضم کیا گیا اور EcM میں 1 فیصد FBS اور 1 فیصد EcGS کے ساتھ چڑھایا گیا۔ تمام تجربات کے لیے، HUVEcs کو 1x104/ml کے ارتکاز پر چڑھایا گیا اور سنگم تک پہنچنے تک بڑھایا گیا۔ EcH یا دیگر محرکات کے ساتھ علاج سے پہلے، خلیات کو 6 گھنٹے تک FBS اور EcGS کے بغیر فینول ریڈ فری EcM میں انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔

ترقی کی گرفتاری. روک تھام کے تجربات میں، HUVEcs کو مختلف مخالفوں یا روکنے والوں کے ساتھ پہلے سے انکیوبیٹ کیا گیا تھا، بشمول 10 µM nilutamide، 10 µM IcI 182780، 0.5 mM L-NAME یا 5 µM wortmannin، کے لیے ECH کے ساتھ یا اس کے بغیر، 37˚C پر۔ تمام گروپوں میں، بشمول کنٹرول، ڈی ایم ایس او کو 0.001 فیصد کی مساوی تعداد میں سالوینٹ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

کی پیمائش درون خلوی کوئی پیداوار۔

HUVEcs میں سائٹوسولک NO ارتکاز میں متعلقہ تبدیلیوں کی نگرانی فلوروسینٹ NO پروب DAF-FM (کیمین کیمیکل کمپنی) کے ذریعے کی گئی، جیسا کہ پہلے بتایا گیا تھا (12)۔ مختصراً، خلیات کو 5 µM DAF‑FM ڈائیسیٹیٹ کے ساتھ 20 منٹ کے لیے 37˚C پر سیاہ مائیکرو ٹائٹر پلیٹ میں بھرا گیا تھا اور پی بی ایس (پی ایچ 7.4) سے کئی بار دھویا گیا تھا۔ فلوروسینس کا تعین بالترتیب 495 اور 515 nm کی اتیجیت اور اخراج طول موج پر کیا گیا تھا، ایک فلوروسینٹ مائکروپلیٹ ریڈر (Biotek Synergy H4؛ BioTek Instruments، Inc.) اور ایک کمپیکٹ الٹی مائکروسکوپ (Nikon eclipse Ts2R؛ Nikon Corporation) کا استعمال کرتے ہوئے۔

مغربی دھبہ تجزیہجیسا کہ پہلے رپورٹ کیا گیا تھا (15)، خلیات کے سنگم monolayers کو برف کے ٹھنڈے PBS میں دو بار دھویا گیا تھا اور RIPA بفر (P0013d؛ Beyotime Institute of Biotechnology) کے ساتھ لیس کیا گیا تھا۔ سپرنٹنٹ میں پروٹین کی حراستی کو بائیسنچونک ایسڈ پرکھ کے طریقہ (16) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا تھا۔ اس کے بعد، فی لین میں 30 µg پروٹین کو لوڈ کیا گیا، 10 فیصد پولی کریلامائڈ جیلوں کا استعمال کرتے ہوئے الگ کیا گیا اور پولی وائنلائیڈین ڈائی فلورائیڈ جھلیوں پر منتقل کیا گیا۔ جھلیوں کو 25˚C پر 1 گھنٹہ کے لیے 5 فیصد سکمڈ دودھ کے ساتھ بند کر دیا گیا تھا۔ اکٹ کے خلاف مونوکلونل اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیشن کے بعد (1:1،000 dilution)، p-Akt (1:500 dilution)، eNOS (1:2،000 dilution) یا p-eNOS (1) :1،000 dilution) رات بھر 4˚C پر، جھلیوں کو TBST (0.1 فیصد ٹوین پر مشتمل ہے) سے 4 بار ~15 منٹ فی واش 25˚C پر دھویا گیا۔ اس کے بعد، جھلیوں کو ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز-کنججیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈیز (1:5،000 کمزوری؛ اینٹی ماؤس اینٹی باڈی، بلی نمبر A0216، یا اینٹی خرگوش اینٹی باڈی، بلی نمبر A0208، بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ بائیوٹیکنالوجی کی) 25˚C پر 1 گھنٹہ کے لیے، اور ایک بہتر کیمیلومینیسینس کٹ (بلی نمبر 32209، تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریشن) کا استعمال کرتے ہوئے پتہ چلا۔ امیج جے جیل تجزیہ سافٹ ویئر، ورژن 1.8{43}} (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ) کا استعمال کرتے ہوئے بینڈ کی شدت کی مقدار درست کی گئی۔

چھوٹا مداخلت (si) آر این اے تیاری اور منتقلیلمبے ڈبل پھنسے ہوئے RNAs کو AR اور ایسٹروجن ریسیپٹر (ER) کے ہدف mRNA کے ذریعے ٹیبل I میں دکھائے گئے سلسلے کے ساتھ ترکیب کیا گیا تھا۔ siRNA دستک ڈاؤن کے حالات میں HUVECs کو 70 فیصد سنگم پر منتقل کرنا شامل ہے جو غیر اینٹی مائکروبیل میں برقرار ہے۔ 60 ملی میٹر کولیجن لیپت کلچر ڈشز میں کلچر میڈیم۔ 5 nM AR-siRNA یا 10 nM ER-siRNA کی Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen؛ Thermo Fisher Scientific, Inc.) کے ساتھ منتقلی الگ سے کی گئی تھی، کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق۔ ٹرانسفیکشن کی کارکردگی کا اندازہ ریورس ٹرانسکرپشن کوانٹیٹیٹو-PcR تجزیہ (RT-qPcR) سے کیا گیا، جیسا کہ پہلے بتایا گیا تھا (17)۔ تھرمو سائیکلنگ کے حالات حسب ذیل تھے: 95˚C پر 10 منٹ؛ 5 سیکنڈ کے لیے 95˚C اور 1 منٹ کے لیے 60˚C کے 40 چکر، اور 15 سیکنڈ کے لیے 95˚C پر پگھلنے والا وکر، 1 منٹ کے لیے 60˚C اور 15 سیکنڈ کے لیے 95˚C؛ ہر نمونے کے لئے تین آزاد حیاتیاتی نقلیں انجام دی گئیں۔ اس کے بعد کے تجربات منتقلی کے 48 گھنٹے بعد کیے گئے۔ پرائمر جوڑوں کو پرائمر پریمیئر v5.0 سافٹ ویئر (PREMIER Biosoft) کا استعمال کرتے ہوئے درج ذیل ترتیبوں کے ساتھ ڈیزائن کیا گیا تھا: AR فارورڈ، 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' اور ریورس، 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER فارورڈ، 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' اور ریورس، 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; اور GAPdH فارورڈ، 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' اور ریورس، 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'۔

شماریاتی تجزیہتمام ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ گروپوں کے درمیان شماریاتی موازنہ کرسکل والس ٹیسٹ یا ٹوکی کے پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے ساتھ دو طرفہ انووا کا استعمال کرتے ہوئے متعدد موازنہ کے لیے کیے گئے۔ پی<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

نتائج

ای سی ایچ آمادہ کرتا ہے نہیں پیداوار اور ای این او ایس فاسفوریلیشن۔جیسا کہ تصویر 2A اور B میں دکھایا گیا ہے، 1 µM ECH نے HUVEcs میں انٹرا سیلولر NO کی پیداوار کو منفی کنٹرول سیلز کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھایا، جبکہ EcH کے محرک اثر کو L-NAME کے ساتھ پہلے سے علاج کے ذریعے کنٹرول کی سطح پر کم کیا گیا۔ زیادہ سے زیادہ ارتکاز حاصل کرنے کے لیے، ارتکاز پر EcH کے ساتھ علاج کے بعد 60 منٹ پر eNOS فاسفوریلیشن کا تجربہ کیا گیا۔

{{0}}، 0۔{7}}1، 0.1، 1 اور 10 µM۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 0.01‑10 µM کے ارتکاز پر EcH ارتکاز پر منحصر انداز میں Ser 1177 میں نمایاں طور پر eNOS فاسفوریلیشن کی حوصلہ افزائی کر سکتا ہے، جس میں زیادہ سے زیادہ eNOS فاسفوریلیشن 10 µM EcH انڈکشن (تصویر اور 2c) میں مشاہدہ کیا گیا ہے۔ مزید برآں، Ser1177 پر eNOS فاسفوریلیشن کی جانچ مغربی بلٹ تجزیہ کے ذریعے 0، 5، 15، 30، 60 اور 120 منٹ پر 1 µM EcH کے ساتھ انکیوبیشن کے بعد کی گئی۔ یہ دیکھا گیا کہ eNOS فاسفوریلیشن تیزی سے EcH کے ذریعے 5 منٹ پر متحرک ہوا، اور انکیوبیشن کے 30 منٹ تک بڑھتا رہا (تصویر 2E اور F)۔ اس کے بعد، EcH علاج کے باوجود، eNOS فاسفوریلیشن کی نسبتاً شدت 30 منٹ کے بعد سے مستحکم رہی؛ لہذا، EcH نے کل eNOS اظہار کو متاثر نہیں کیا (تصویر 2c اور E)۔

اے آر ثالثی کرتا ہے ECH کی حوصلہ افزائی نہیں پیداوار اور eNOSموجودہ مطالعہ (تصویر 3) میں HUVEcs میں AR اور ER کے اظہار کو روکنے میں AR-siRNA-1 اور ER-siRNA-2 کے مداخلت کرنے والے اثرات سب سے زیادہ کامیاب تھے۔ اس کے بعد، EcH-حوصلہ افزائی eNOS ایکٹیویشن اور NO پروڈکشن میں AR کی شمولیت کا جائزہ لینے کے لیے AR inhibition-of-f-function analysis اور AR Los-of-Function analysis کے لیے siRNA کا ایک مخالف لگایا گیا۔ جیسا کہ تصویر 4A میں دکھایا گیا ہے، 1 µM ECH نے HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ای سی ایچ چالو کرتا ہے دی PI3K/Akt راستہموجودہ مطالعہ میں، Ser473 پر اکٹ فاسفوریلیشن کا ٹیسٹ EcH انکیوبیشن کے 60 منٹ بعد 0، 0 کے ارتکاز پر کیا گیا۔{9}}1، 0.1۔ ، 1 اور 10 µM۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ EcH (0{10}} µM) نمایاں طور پر اکٹ فاسفوریلیشن کو آمادہ کر سکتا ہے۔ p-Akt کے متعلقہ اظہار کی سطح EcH علاج کے 1 اور 10 µM پر پہنچ گئی (تصویر 5A اور B)۔ مزید برآں، HUVEc ثقافتوں میں 1 µM EcH کے اضافے کے بعد 0، 5، 15، 30، 60 اور 120 منٹ پر اکٹ فاسفوریلیشن کا مغربی بلاٹ تجزیہ کے ذریعے معائنہ کیا گیا۔ جیسا کہ تصویر 5c اور d میں دکھایا گیا ہے، EcH نے انکیوبیشن کے 5 منٹ بعد اکٹ فاسفوریلیشن میں تیزی سے اضافہ کیا، اور p-Akt کی زیادہ سے زیادہ پروٹین لیول 60 منٹ پر دیکھی گئی۔ اس کے برعکس، EcH نے کل اکٹ اظہار کو متاثر نہیں کیا (تصویر 5A اور c)۔ مزید برآں، eNOS فاسفوریلیشن پر PI3K پاتھ وے کے ممکنہ اثر کی چھان بین کے لیے، HUVEcs کا EcH ایپلیکیشن سے پہلے PI3K inhibitor wortmannin کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا تھا۔ Wortmannin کو EcH-حوصلہ افزائی NO پیداوار کو بنیادی سطح تک کم کرنے کے لیے پایا گیا (تصویر 5E)۔ EcH-حوصلہ افزائی DAF-FM فلوروسینس (تصویر 5F) کی جانچ کرتے وقت فلوروسینس مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے اسی طرح کا رجحان دیکھا گیا۔ مزید برآں، wortmannin HUVEcs (تصویر 5G اور H) میں تیز رفتار eNOS فاسفوریلیشن کو ختم کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ مذکورہ بالا نتائج بتاتے ہیں کہ EcH PI3K/Akt پاتھ وے کے ذریعے eNOS فاسفوریلیشن اور NO پیداوار کو چالو کر سکتا ہے۔

بحث

EcH ہربا سے الگ تھلگ ایک قدرتی مرکب ہے۔Cistancheمختلف فارماسولوجیکل خصوصیات کے ساتھ۔ اس سے پہلے یہ ظاہر کیا گیا تھا کہ EcH نے خون کی نالیوں کے ہموار پٹھوں کے خلیوں (7,8) میں NO-cGMP-PKG-BKca چینلز کھول کر اینڈوتھیلیم پر منحصر عروقی نرمی کا اثر ڈالا۔ موجودہ نتائج اس بات کا ثبوت فراہم کرتے ہیں کہ ECH نے عروقی انڈوتھیلیل خلیوں میں PI3K/Akt سگنلنگ پاتھ وے کی شمولیت کے ساتھ NO پیداوار کو دلانے کے لئے eNOS کی AR پر منحصر ایکٹیویشن کا استعمال کیا۔

برتن کی دیوار کی سب سے اندرونی تہہ کے طور پر، اینڈوتھیلیم خون کے بہاؤ میں ہونے والی تبدیلیوں کو تیزی سے محسوس کر سکتا ہے اور اس کا جواب دے سکتا ہے، جس کے نتیجے میں عروقی ٹون (18) کو منظم کرنے کے لیے بنیادی ہموار پٹھوں کے خلیوں تک سگنل کی ترسیل ہوتی ہے۔ یہ بڑے پیمانے پر رپورٹ کیا گیا ہے کہ متعدد اینڈوتھیلیل سے ماخوذ واسوڈیلیٹری مرکبات موجود ہیں، جن میں سب سے زیادہ پروٹو ٹائپیکل مادہ ہوتا ہے۔NO ہونے کی وجہ سے، eNOS کے endothelial isoform سے بنتا ہے، جس کا نتیجہ فاسفوریلیشن (19) میں ہوتا ہے۔ عام حالات میں، eNOS غیر فعال رہتا ہے جب caveolin کا ​​پابند ہوتا ہے، اور endothelial میں مندرجہ ذیل واقعات کے ساتھ چالو ہوتا ہے۔سیلز: i) eNOS caveolin-1 سے الگ ہو جاتا ہے اور ca2 پلس /caM سے منسلک ہوتا ہے؛ ii) ہیٹ شاک پروٹین (HSP)90 eNOS کو فروغ دیتا ہے۔dimerization اور اکٹ کو بھرتی کرنے کے لیے ایک steric فارمیشن کی حمایت کرتا ہے؛ اور iii) ایکٹیویشن کی حالت کو تقویت دینے کے لیے کیلسینورین ڈیفاسفوریلیٹس Thr495 (20)۔ موجودہ مطالعہ میں، 1 µM ECH کے ساتھ علاج کیے جانے والے HUVECs میں کوئی پیداوار نمایاں طور پر نہیں بڑھائی گئی۔ یہ رجحان پچھلے نتائج کی طرح تھا، جہاں EcH نے NO کی رہائی میں اضافہ کیا اور چوہے کی چھاتی کی شہ رگ کے حلقے (7) میں cGMP کی ترکیب کو متحرک کیا۔ مزید برآں، دو فاسفوریشن سائٹس، Ser1177 اور Thr495، eNOS سرگرمی (20) کو منظم کرنے کے لیے خاص طور پر اہم معلوم ہوتی ہیں، اور موجودہ مطالعے سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ EcH نے Ser1177 میں ارتکاز پر منحصر انداز میں شدید eNOS فاسفوریلیشن کی حوصلہ افزائی کی۔ اس کے علاوہ، eNOS پروٹین کی سطح پر اثرات سے وابستہ محرکات بنیادی طور پر eNOS mRNA کے استحکام کا تعین کرتے ہیں، اور اگر محرک کو طویل عرصے تک برقرار رکھا جاتا ہے، eNOS mRNA ٹرانسکرپشن mitogen-activated protein kinase اور جوہری عنصر κB (20) کے ذریعے ہوتا ہے۔ ایک ساتھ لے کر، یہ مشاہدات اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ Ser1177 پر eNOS کی ایکٹیویشن EcH کی طرف سے حوصلہ افزائی کی گئی NO ترکیب کے لیے ذمہ دار ہے۔

مزید برآں، مطالعے کی بڑھتی ہوئی تعداد نے یہ ثابت کیا ہے کہ اے آر کا اظہار متعدد انسانی بافتوں میں اینڈوتھیلیل خلیوں میں ہوتا ہے، جو اینڈروجنز اور ان کے ینالاگس کے لیے ممکنہ کردار کی تجویز کرتا ہے، جو کہ انسانی اینڈوتھیلیل کی ماڈیولیشن میں اے آر ثالثی کے عمل کے ذریعے کام کرتے ہیں۔ سیل ہومیوسٹاسس (21)۔ نان کلاسیکل PI3K/Akt پاتھ وے میں، AR PI3K ریگولیٹری سبونائٹ p85 (22) کے ساتھ براہ راست بات چیت کر کے PI3K کو فعال کر سکتا ہے۔ موجودہ مطالعہ نے یہ ظاہر کیا کہ ایک AR مخالف یا AR siRNA نے HUVEcs میں EcH کے ذریعہ NO پیداوار اور eNOS فاسفوریلیشن کو کم کیا۔ یہ پہلے بتایا گیا ہے کہ ایسٹروجن eNOS فاسفوریلیشن کی حوصلہ افزائی کرتے ہیں اور اینڈوتھیلیل سیل (23) میں کلاسک ER ایکٹیویشن کے ذریعے NO پیداوار کو متحرک کرتے ہیں، اور ECH کی انتظامیہ رحم میں ER کے اظہار کو نمایاں طور پر بڑھاتی ہے (24)۔ تاہم، موجودہ مطالعے میں، EcH-حوصلہ افزائی eNOS ایکٹیویشن اور NO پروڈکشن پر ER کے مقابلے میں AR کا اثر زیادہ نمایاں تھا۔ اس کے علاوہ، یہ مشاہدہ کیا گیا کہ EcH نے HUVEcs میں AR سے منسلک eNOS ایکٹیویشن کے ذریعے منٹوں کے اندر شدید NO پیداوار کا سبب بنتا ہے، جو اینڈوتھیلیل سیلز میں ردعمل کی غیر جینومک نوعیت کے مطابق ہے۔ اے آر سائیٹوپلازم میں ایچ ایس پی 90، ایچ ایس پی 70 اور کناز ایس آر سی سمیت سکیفولڈنگ پروٹین کے ساتھ منسلک ہے، اور اسے ٹیسٹوسٹیرون ٹریٹمنٹ (23) کے 5 منٹ کے اندر اے آر کمپلیکس سے جھلی تک پہنچایا جا سکتا ہے۔ 'ٹارگٹ فشینگ' حکمت عملی کی بنیاد پر، HSP90 کی شناخت PhGs کے ساتھ مل کر کیے گئے ہدف کے طور پر کی گئی، جس نے اشارہ کیا کہ EcH AR کو سہاروں کے پروٹین (25) سے الگ کرنے میں سہولت فراہم کر سکتا ہے۔ ایک اور تحقیق نے تجویز کیا کہ ہائپوتھیلمس میں، EcH امینو ایسڈز میٹ-894 اور ویل-713 میں اے آر جیب کے ساتھ مل سکتا ہے اور سائٹوپلاسمک اے آر کی نیوکلئس (26) تک نقل و حمل کو روک سکتا ہے۔ تاہم، بنیادی میکانزم جس کے ذریعے EcH سائٹوپلاسمک اے آر ٹرانسلوکیشن کو جھلی میں ثالثی کرتا ہے اس کے لیے مزید تفتیش کی ضرورت ہے۔ اس لیے، اس طریقہ کار کو واضح کرنے کے لیے مزید تحقیق کی ضرورت ہے جس کے ذریعے EcH AR پر منحصر eNOS ایکٹیویشن حاصل کرتا ہے اور یہ کہ عروقی اینڈوتھیلیل سیلز میں HSP90 کے پابند ہونے سے کیسے منسلک ہو سکتا ہے۔

PI3K/Akt پاتھ وے سب سے اہم سگنلنگ جھرنوں میں سے ایک ہے، جس کی ایکٹیویشن فاسفیٹائیڈلینوسیٹول-3,4,5-ٹرائی فاسفیٹ پیدا کرکے Ser/ کے N-ٹرمینل پلکسٹرین ہومولوجی ڈومین کو باندھنے کے لیے آمادہ کرتی ہے۔ Thr kinase Akt. یہ پلازما جھلی (27) میں اکٹ کی بھرتی کی سہولت فراہم کرتا ہے۔ PI3K/Akt پاتھ وے EcH کے ذریعے NO-انحصار نرمی کے کنٹرول میں اہم کردار ادا کر سکتا ہے۔

موجودہ مطالعے سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ جب خلیات کو PI3K inhibitor wortmannin کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تو EcH کی حوصلہ افزائی NO کی پیداوار میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ ایک پچھلی رپورٹ نے یہ ظاہر کیا کہ 15 ملی گرام/کلوگرام EcH نے PI3K/Akt سگنلنگ پاتھ وے کو 5‑fluorouracil سے دبائے ہوئے بون میرو سیلز (28) میں فعال کیا۔ موجودہ مطالعہ میں، PI3K روکنے والوں نے Ser1177 پر Ech-حوصلہ افزائی eNOS فاسفوریلیشن میں نمایاں کمی کی۔ مزید برآں، اکٹ کی سرگرمی کو بنیادی طور پر اپ اسٹریم ریگولیٹری راستوں، خاص طور پر Ser473 (20) میں PI3K پر منحصر فاسفوریلیشن کے ذریعے منظم کیا گیا تھا۔ موجودہ مطالعہ میں، EcH نے خوراک پر منحصر انداز میں Ser473 میں اکٹ فاسفوریلیشن کی حوصلہ افزائی کی۔ اسی طرح، ایک پچھلے مطالعہ نے یہ ظاہر کیا کہ 5، 10 یا 20 µM EcH نے ممکنہ طور پر p-Akt اور SLc8A3 (29) کو بڑھا کر خوراک پر منحصر انداز میں انوکسیا/ریپرفیوژن علاج کے خلاف قلبی حفاظتی اثر ڈالا۔ اکٹ جین کا نقلی ضابطہ بڑی حد تک نامعلوم ہے (30)؛ لہذا، موجودہ مطالعہ اکٹ پر EcH کے پوسٹ ٹرانسکرپشن ریگولیٹری اثرات پر مرکوز ہے۔ مذکورہ بالا نتائج کو مدنظر رکھتے ہوئے، یہ اندازہ لگایا گیا کہ HUVEcs پر EcH کا اطلاق PI3K/Akt پاتھ وے کو چالو کرنے کا باعث بن سکتا ہے، جو ای این او ایس کو فاسفوریلیٹ کرتا ہے اور اس کے نتیجے میں، NO پیداوار میں اضافہ ہوتا ہے۔

آخر میں، EcH ایک قدرتی پروڈکٹ ہے جو بنیادی طور پر ہربا سے الگ تھلگ ہے۔Cistanche.Endothelial خلیات میں EcH-حوصلہ افزائی NO کی پیداوار کے ممکنہ طریقہ کار میں درج ذیل چیزیں شامل ہو سکتی ہیں (تصویر 6): i) EcH AR کے ایک فعال ligand کے طور پر کام کرتا ہے جو سیل کی جھلی میں caveolae میں مقامی ہوتا ہے۔ ii) PI3K Ser473 پر اکٹ کے ہائیڈروفوبک ڈومین سے منسلک ہوتا ہے اور سیل کی جھلی میں اکٹ کی بھرتی کی سہولت فراہم کرتا ہے۔ iii) PI3K/Akt کیسکیڈز کی بھرتی AR پر منحصر eNOS فاسفوریلیشن کو متحرک کرتی ہے۔ اور iv) NO کی نسل کو endothelial خلیوں میں eNOS کے ذریعے ثالثی کیا جاتا ہے۔ یہ مشاہدہ کہ EcH PI3K/Akt پاتھ وے کی شمولیت کے ساتھ eNOS کے AR پر منحصر فاسفوریلیشن کے ذریعے NO پیداوار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے EcH کے vasorelaxant اثرات کو مزید سمجھنے میں معاون ثابت ہو سکتا ہے۔ مزید برآں، Endothelial سے ماخوذ NO راستوں کو نشانہ بنانے والا EcH غیر جینومک اثرات کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ لہذا، موجودہ مطالعہ ان میکانزم کو واضح کرنے میں مدد کر سکتا ہے جن کے ذریعے EcH اپنے فارماسولوجیکل اثرات کو دل کی بیماری کو روکنے کے لیے استعمال کرتا ہے۔

اعترافات

قابل اطلاق نہیں۔

فنڈنگ

موجودہ مطالعہ کی حمایت چین کی نیشنل نیچرل سائنس فاؤنڈیشن (گرانٹ نمبر 81503333) نے کی۔

دستیابی کی ڈیٹا اور مواد

موجودہ مطالعہ کے دوران تیار کردہ اور تجزیہ کردہ ڈیٹا سیٹ متعلقہ مصنف سے معقول درخواست پر دستیاب ہیں۔

مصنفین شراکتیں

LG اور XL نے تجربات کو تصور کیا اور ڈیزائن کیا۔ dL اور YZ نے تجربات کئے۔ ڈبلیو زیڈ اور جے جی نے ڈیٹا کا تجزیہ کیا۔ ایل جی نے مسودہ تیار کیا۔ XL نے مسودہ کا جائزہ لیا اور اس میں ترمیم کی۔ تمام مصنفین نے حتمی مخطوطہ کو پڑھا اور منظور کیا۔

1202 GUوغیرہ al: ECHINACOSIDE AR-dependent PI3K/AKT پاتھ وے کے ذریعے نائٹرک آکسائیڈ کی پیداوار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے

اخلاقیات منظوری اور رضامندی کو حصہ لینا

قابل اطلاق نہیں۔

صبر رضامندی کے لیے اشاعت

قابل اطلاق نہیں۔

مقابلہ کرنا مفادات

مصنفین اعلان کرتے ہیں کہ ان کی کوئی مسابقتی دلچسپی نہیں ہے۔

حوالہ جات

1. چینی فارماکوپیا کمیشن:Cistancheہربا میں: چین کی عوامی جمہوریہ کا فارماکوپیا 1. ٹھوڑی۔ میڈ. سائنس پریس، بیجنگ، پی پی 135، 2015۔

2. جیانگ Z، Wang J، Li X اور Zhang X: Echinacoside اورCistanche tubulosa(شینک)R. وائٹ بیسفینول A-حوصلہ افزائی شدہ خصیوں اور نطفہ کو نقصان پہنچاتا ہے جو گوناڈ ایکسس ریگولیٹڈ سٹیرائیڈوجینک انزائمز کے ذریعے چوہوں میں ہوتا ہے۔ J Ethnopharmacol 193: 321-328، 2016۔

3. لیو جے، یانگ ایل، ڈونگ وائی، ژانگ بی اور ما ایکس: ایچیناکوسائیڈ، اعصابی اور دیگر عوارض کے علاج کے لیے ایک بے مثال قدرتی پروڈکٹ۔ مالیکیولز 23: piiE1213، 2018۔

4. Yoshikawa M، Matsuda H، Morikawa T، Xie H، Nakamura S اور Muraoka O: فینیلیتھانوائڈ اولیگوگلائکوسائیڈز اور ایسائلیٹڈ اولیگوسگرزCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475، 2006۔

5. آرنلڈ ڈبلیو پی، متل سی کے، کاٹسوکی ایس اور مراد ایف: نائٹرک آکسائیڈ گوانائیلیٹ سائکلیز کو چالو کرتا ہے اور مختلف بافتوں کی تیاریوں میں گوانوسین 3':5'-سائیکلک مونو فاسفیٹ کی سطح کو بڑھاتا ہے۔ Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207، 1977۔

6. Gai XY، Tang F، Ma J، Zeng KW، Wang SL، Wang YP، Wuren TN، Lu dX، Zhou Y اور Ge RL: ہائپوکسیا کے تحت چوہے کے پلمونری شریان کے ہموار پٹھوں کے خلیوں پر ایکیناکو سائیڈ کا اینٹی پرولیفیریٹو اثر۔ J Pharmacol Sci 126: 155-163، 2014۔

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ اور Tu PF: Echinacoside NO-cGMP راستے کے ذریعے چوہے کی شہ رگ کے حلقوں میں اینڈوتھیلیم پر منحصر نرمی کو نکالتا ہے۔ پلانٹا میڈ 75: 1400-1404، 2009۔

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y اور Ge RL: Echinacoside NO-cGMP-PKG- کو کھول کر چوہے کی پلمونری شریانوں کے ویسورلیکسیشن کو اکساتا ہے۔ BKca چینلز اور انٹرا سیلولر ca2 پلس کی سطح کو کم کرنا۔ ایکٹا فارماکول گناہ 36: 587-596، 2015۔

9. ماروہاشی T، Kihara Y اور Higashi Y: اینڈوتھیلیم سے آزاد واسوڈیلیشن کا اندازہ: طریقہ کار سے طبی نقطہ نظر تک۔ J Hypertens 36: 1460-1467، 2018۔

10. احمد KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J اور آکسیڈیٹیو تناؤ سے متاثرہ چوٹ کے خلاف انسانی نال کے انڈوتھیلیل خلیوں پر مشتق: اینٹی آکسیڈیشن اور PI3k/Akt/eNOS/NO سگنلنگ پاتھ ویز کی شمولیت۔ Biomed Pharmacother 106: 1734-1741، 2018۔

11. Yu J، Akishita M، Eto M، Koizumi H، Hashimoto R، Ogawa S، Tanaka K، Ouchi Y اور Okabe T: Src kinase-mediates androgen receptor-dependent non-genomic activation of signaling cascade جس کی وجہ سے endothelial نائٹرک آکسائیڈ سنتھیس ہوتا ہے۔ . بائیو کیم بائیوف ریس کمیون 424: 538-543، 2012۔

12. Yu J، Akishita M، Eto M، Ogawa S، Son B، Kato S، Ouchi Y اور Okabe T: vascular endothelial خلیات میں endothelial nitric oxide synthese کی اینڈروجن ریسیپٹر پر منحصر ایکٹیویشن: phosphatidylinositol کا کردار {{3} }kinase/Akt pathway.Endocrinology 151: 1822-1828, 2010.

Pittarella P، Squarzanti dF، Molinari c، Invernizzi M، Uberti F اور Reno F: HUVEc میں وٹامن ڈی کی وجہ سے غیر منحصر پھیلاؤ اور منتقلی۔ جے سٹیرائڈ بائیو کیم 149: 35-42، 2015۔

14. He Y، Luan Z، Fu X اور Xu X: uncoupling پروٹین 2 کا اوور ایکسپریشن انسانی نال کی رگوں کے اینڈوتھیلیل سیلز کے ہائی گلوکوز سے متاثرہ اپوپٹوسس کو روکتا ہے۔ Int J Mol Med 37: 631-638، 2016۔

15. Xiao-Hong d، chang-Qin X، Jian-Hua H، Wen-Jiang Z اور Bing S: Icariin PI3K/AKT-eNOS سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے میں شامل ہومو سسٹین سے متاثرہ اینڈوتھیلیل سیلولر سنسنی میں تاخیر کرتا ہے۔ فارم بائیول 51: 433-440، 2013۔

16. Smith PK، Krohn RI، Hermanson GT، Mallia AK، Gartner FH، Provenzano Md، Fujimoto EK، Goeke NM، Olson BJ اور Klenk DC: Bicinchoninic acid کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی پیمائش۔ اینل بائیو کیم 150: 76-85، 1985۔

17. Gu L، Zhong X، Lian d، Zheng Y، Wang H اور Liu X: Triterpenoid biosynthesis اور ڈوبے ہوئے خمیر میں نائٹرک آکسائیڈ کے ذریعے حاصل کردہ نقلی ردعملگانوڈرما lucidum. پروسیس بائیو کیم 60: 19-26، 2017۔

18. Ellinsworth DC، Sandow SL، Shukla N، Liu Y، Jeremy JY اور Gutterman dd: Endothelium-derived hyperpolarization and Coronary vasodilation: epoxye-icosatrienoic acids، hydrogen peroxide، اور gap کے متنوع اور مربوط کردار۔ مائیکرو سرکولیشن 23: 15-32، 2016۔

19. فریڈ جے کے اور گٹرمین ڈی ڈی: کمیونیکیشن کلیدی ہے: واسوڈیلیشن میں انٹر سیلولر سگنلنگ کے طریقہ کار۔ J cardiovasc Pharm 69: 264-272، 2017۔

20. کوئلن اے، فرومی بی اور ڈیبریٹ آر: اینڈوتھیلیم مائیکرو اینوائرمنٹ سینسنگ جس سے نائٹرک آکسائیڈ میڈیٹیڈ واسوڈیلیشن ہوتا ہے: اعصابی اور بائیو مکینیکل سگنلز کا جائزہ۔ نائٹرک آکسائیڈ 45: 20-26، 2015۔

21. Torres-Estay V، carreno dV، Francisco IF، Sotomayor P، Godoy AS اور Smith GJ: انسانی اینڈوتھیلیل سیلز میں اینڈروجن ریسیپٹر۔ J Endocrinol 224: 131-137، 2015۔

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H اور Gui YT: اینڈروجن کا غیر جینومک عمل تیز فاسفوریلیشن اور اینڈروجن ریسیپٹر کی اسمگلنگ کے ضابطے کے ذریعے ثالثی کرتا ہے۔ سیل فزیول بائیو کیم 43: 223-236,2017۔

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, Costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP اور Ghedini Pc: PI3K/Akt راستے کی ایکٹیویشن جس میں ایسٹروجن ریسیپٹرز کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہے سی جی ایم پی سگنلنگ کی ویسکولر ایکٹیویشن۔ Vascul Pharmacol 110: 42-48، 2018۔

24. لی ایف، یانگ ایکس، یانگ وائی، گوو سی، ژانگ سی، یانگ زیڈ اور لی پی: اوورییکٹومائزڈ چوہوں میں ایچیناکوسائیڈ کی اینٹی آسٹیو پورٹک سرگرمی۔ فائٹو میڈیسن 20: 549-557، 2013۔

25. Zeng KW، Liao LX، Wan YJ، Jiang Y اور Tu PF: فارماکولوجیکل اہداف کی شناخت اور phenylethanoid glycosides کی افادیت کا تجزیہسیستانچسہربا 'ٹارگٹ فشینگ' حکمت عملی پر مبنی ہے۔ چن ٹریڈیٹ ہربل ادویات 49: 173-178، 2018۔

26. جیانگ زیڈ، زو بی، لی ایکس، کربی جی ایم اور ژانگ ایکس: ایچیناکوسائیڈ ہائپوتھلامک اینڈروجن ریسیپٹر کو نشانہ بنا کر چوہوں میں سپرم کی مقدار کو بڑھاتا ہے۔ سائنس کا نمائندہ 8: 3839-3850، 2018۔

27. coffer PJ، Jin J اور Woodgett JR: Protein kinase B (c-Akt): phosphatidylinositol 3-kinase ایکٹیویشن کا ملٹی فنکشنل ثالث۔ بائیو کیم جے 335، 1-13، 1998۔

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y اور Qian J: Echinacoside 5- FU کی حوصلہ افزائی مائیلوسوپریشن چوہوں میں ہیماٹوپوائٹک فنکشن کو بہتر بناتا ہے۔ لائف سائنس 123: 86-92، 2015۔

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W اور Zhou H: P-AKT اور SLc8A3 کو اپ-ریگولیٹ کرنے کے ذریعے H9c2 خلیوں میں anoxia/reperfusion چوٹ کے خلاف echinacoside کے حفاظتی اثرات۔ Biomed Pharmacother 104: 52-59، 2018۔

30. ابیرتھنا پی اور ایس یو وائی: قلبی فعل میں اکٹ کا اہم کردار۔ Vascul Pharmacol 74: 38-48، 2015۔