جین کلوننگ، فنکشنل شناخت، ساختی اور اظہار کا تجزیہ Cistanche Tubulosa سے Sucrose Synthase Ⅲ

4 Cistanche tubulosa کے مختلف حصوں اور خشک سالی کے دباؤ کے تحت سیل کلچر سسٹم میں CtSus کا اظہار تجزیہ

4.1 Cistanche tubulosa کے مختلف حصوں میں CtSus کا اظہار تجزیہ

وٹرو میں پورے خلیے کی تبدیلی کے تجربات اور انزیمیٹک کیٹلیٹک رد عمل کے تجربات نے اس بات کی تصدیق کی کہ CtSus جین کے ذریعے انکوڈ شدہ پروٹین UDP-گلوکوز کی ترکیب کو متحرک کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ اس جین اور Cistanche tubulosa میں glycoside مرکبات کے biosynthesis کے درمیان ارتباط کو مزید دریافت کرنے کے لیے، اس جین کے مختلف حصوں میں اظہار کی سطحCistanche tubulosaتجزیہ کیا گیا تھا.

اعلیٰ معیار کا خام مال برائے فروخت

Wecistanche کی معاون خدمت - رعایت کی معلومات حاصل کرنے کے لیے ہم سے رابطہ کریں:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

واٹس ایپ٪ 2ftel٪3a٪7b٪7b0٪7d٪7d

EchinacosideCistanche tubulosa میں سب سے زیادہ نمائندہ گلائکوسائیڈ مرکب ہے، اور اس کا مواد Cistanche tubulosa پودوں کے خشک وزن کے 30% سے زیادہ تک پہنچ سکتا ہے [23]۔ تحقیقی گروپ نے پہلے Cistanche tubulosa پودوں کے مختلف حصوں میں echinacoside کے مواد کی پیمائش کی، اور مخصوص کارکردگی یہ تھی:echinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>فضائی حصہ; ان میں، ہاسٹوریم میں ایکناکوسائیڈ کا مواد سب سے زیادہ تھا۔ ریئل ٹائم فلوروسینس مقداری PCR کو Cistanche tubulosa کے مختلف حصوں سے cDNA کا استعمال کرتے ہوئے ٹیمپلیٹس کے طور پر انجام دیا گیا تھا، اور نتائج کا تجزیہ 2 کے ذریعے کیا گیا تھا۔-ΔΔCT طریقہ، اور تفریق تجزیہ کیا گیا تھا۔ نتائج شکل 4A میں دکھائے گئے ہیں۔ ہاسٹوریم میں CtSus جین کی اظہار کی سطح سب سے زیادہ تھی، اوپر والے حصے سے 1.5 گنا، اور زیر زمین حصے میں اظہار کی سطح اوپر والے حصے کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی، جو کہ phenylethanol glycosides کے جمع ہونے کے انداز کے مطابق ہے۔ کے مختلف حصوں میں echinacoside کی طرف سے نمائندگیCistanche tubulosa.

تصویر 4 C. tubulosa کے مختلف حصوں میں CtSus کے متعلقہ اظہار کی سطح اور PEG6 کے ذریعے علاج کردہ معطلی خلیوں میں000۔ A: C. tubulosa کے مختلف حصوں میں CtSus کے متعلقہ اظہار کی سطح؛ B: C. tubulosa suspension خلیات میں CtSus کی متعلقہ اظہار کی سطح PEG6000 کے ذریعے مختلف ٹائم پوائنٹس n=3، 𝑥̅± s.*P ＜ 0.05، ***P ＜ 0.001 پر علاج کی جاتی ہے۔

اعلی معیار کے CISTANCHE خام مال

4.2 خشک سالی کے تناؤ کے حالات میں Cistanche deserticola معطلی خلیوں میں CtSus کا اظہار تجزیہ

اس منصوبے پر ابتدائی تحقیق سے یہ بات سامنے آئی ہے۔پی ای جی 6000 کے ذریعہ خشک سالی کا تناؤکر سکتے ہیںنمایاں طور پر اضافہدیphenylethanol glycosides کا جمع ہوناCistanche معطلی کے خلیات میں. شامل کرنے کے بعد 3 سے 9 دن تک، echinaceaside مواد میں نمایاں اضافہ ہوا۔ 12 سے 15 ویں دن تکechinaceaside کی ترقی کی شرحمواد سست ہو گیا اور 15ویں دن زیادہ سے زیادہ قدر تک پہنچ گیا۔ پھر، جیسے جیسے ثقافت کا وقت بڑھتا گیا، echinaceaside مواد میں نمایاں اضافہ ہوا۔ fructoside کا مواد بتدریج کم ہوتا گیا [24]۔ اس تحقیق کی بنیاد پر، اس مقالے نے علاج نہ کیے جانے والے Cistanche deserticola suspension خلیات کے cDNA اور PEG6000-کی حوصلہ افزائی Cistanche deserticola suspension خلیات کو ریئل ٹائم فلوروسینس مقداری PCR کا پتہ لگانے کے لیے ٹیمپلیٹس کے طور پر استعمال کیا تاکہ Cistanche deserticola suspension میں CtSus جین کی جانچ کی جا سکے۔ خشکی کے دباؤ کے حالات میں خلیات۔ اظہار کی سطح میں تبدیلیاں۔ نتائج شکل 4B میں دکھائے گئے ہیں۔ Cistanche deserticola suspension خلیات میں PEG6000 کی طرف سے حوصلہ افزائی کی گئی، CtSus کا اظہار شامل کرنے کے بعد 6 ویں دن نمایاں طور پر بڑھ گیا، اور 9 ویں دن سب سے زیادہ قدر تک پہنچ گیا، اور پھر کنٹرول کی سطح پر واپس آ گیا۔ ایک ہی سطح کے گروپس۔ مندرجہ بالا نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ خشک سالی کا تناؤ Cistanche deserticola suspension cell line میں CtSus جین کے اظہار کو نمایاں طور پر بڑھا سکتا ہے، جو خشک سالی کے دباؤ کے تحت echinaceaside کے جمع ہونے کے انداز سے مطابقت رکھتا ہے۔ تاہم، CtSus جین کا چوٹی کا اظہار echinaceaside مواد کی چوٹی سے پہلے ظاہر ہوتا ہے، کیونکہ CtSus catalysis کے ذریعے ترکیب شدہ فعال glycosyl ڈونر echinaceaside کے بعد کے بائیو سنتھیٹک راستے میں ملٹی سٹیپ گلائکوسیلیشن رد عمل کے لیے ضروری ایک اہم پیش خیمہ ہے۔ لہذا یہ قیاس کیا جاتا ہے کہ خشک سالی کے دباؤ کا شکار ہونے کے بعد، حیاتیات ترجیحی طور پر بنیادی میٹابولزم سے متعلق جینز کو متحرک کریں گے تاکہ فعال عطیہ دہندگان کو جمع کیا جا سکے، اور پھر اہم ثانوی میٹابولائٹس کو حاصل کیا جا سکے۔

اعلی معیار کے CISTANCHE خام مال

5 CtSus پروٹین کے تین جہتی ڈھانچے کا مطالعہ اور اہم فعال سائٹس کا تجزیہ

گلائکوسائل ڈونر UDP-گلوکوز کی پیداوار کو متحرک کرنے میں CtSus کے فنکشن کی بنیاد پر، CtSus کیٹلیٹک سرگرمی کی ساختی بنیاد کا مزید مطالعہ کیا گیا۔ آن لائن ٹول SOPMA کا استعمال پروٹین کی ثانوی ساخت کی پیش گوئی کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ نتائج سے ظاہر ہوا کہ CtSus کی ثانوی ساخت میں 55.28% -helices، 25.47% random coils، 12.80% extended strands، اور 6.46% -turns (شکل 5A) شامل ہیں، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ -ہیلیسس CtSus، پروٹین میں سب سے اہم ثانوی ساختی اکائیاں ہیں۔ اس کے بعد بے ترتیب کنڈلی، جس میں پروٹین کا ایک بڑا حصہ بھی شامل ہے۔ توسیعی تار اور موڑ پورے پروٹین میں تقسیم کیے جاتے ہیں۔ موجودہ مطالعات کے مطابق، sucrose synthase عام طور پر ایک tetramer کی شکل میں موجود ہے، جسے اس کی فعال شکل سمجھا جاتا ہے۔ لہذا، اس کاغذ نے CtSus پروٹین کی ساخت کی پیشین گوئی کرنے کے لیے AlphaFold2 کا مزید استعمال کیا اور اس کی تین جہتی ساخت پروٹین ٹیٹرمرز حاصل کی۔ PDB (پروٹین ڈیٹا بینک) ڈیٹا بیس کے موازنہ سے پتہ چلا ہے کہ Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 (PDBID 3S28) اور CtSus کے درمیان تسلسل کی مماثلت 77.93٪ تک پہنچ سکتی ہے۔ پیشن گوئی شدہ CtSus ڈھانچے کا موازنہ AtSus1 تین جہتی ڈھانچے سے کیا گیا تھا، اور پروٹین سپرپوزیشن کے بعد جڑ کا مطلب مربع انحراف (RMSD) کی قدر 1.11 Å تھی، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ دونوں کے مقامی ڈھانچے انتہائی مطابقت رکھتے ہیں (شکل 5B)۔

UDP اور fructose (PDBID3S29) کے ساتھ Arabidopsis AtSus1 کی رپورٹ شدہ پروٹین-ligand کرسٹل پیچیدہ ساخت کو ایک ٹیمپلیٹ [16] کے طور پر UDP اور fructose کے ساتھ CtSus کے بائنڈنگ موڈ کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ مالیکیولر ڈاکنگ کے نتائج شکل 5C میں دکھائے گئے ہیں۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ AtSus1 اور CtSus کی سبسٹریٹ بائنڈنگ جیبیں امینو ایسڈ کی قسم، مقامی تقسیم اور ترتیب کے لحاظ سے بہت ملتی جلتی ہیں، اور اوورلیپ زیادہ ہے، یہ ثابت کرتا ہے کہ پودوں میں سوکروز سنتھیس کی ترتیب بہت زیادہ محفوظ ہے۔ پروٹین سبسٹریٹ بائنڈنگ جیب میں دو ligands، UDP اور fructose کی تشکیلات کو شکل 5D میں دکھایا گیا ہے۔ UDP اور CtSus کی مالیکیولر ڈاکنگ سب سے زیادہ فائدہ مند کنفرمیشن AtSus1-UDP کرسٹل کمپلیکس میں UDP کی تشکیل کے ساتھ ایک اچھا اوورلیپ رکھتی ہے، جو مالیکیولر ڈاکنگ کے نتائج کی درستگی کو ثابت کرتی ہے۔ UDP اور پروٹین سبسٹریٹ بائنڈنگ جیب میں اہم امینو ایسڈ کی باقیات کے درمیان تعامل کو شکل 5E میں دکھایا گیا ہے۔ UDP اور CtSus بنیادی طور پر ہائیڈروجن بانڈز اور ہائیڈروفوبک تعاملات سے جڑے ہوئے ہیں۔ سبسٹریٹ بائنڈنگ جیب میں اہم امینو ایسڈ کی باقیات میں شامل ہیں: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678, اور Glu681۔

حوالہ جات

[1] گانا ZH، Lei L، Tu PF. CistancheHoffing کے پودوں میں فارماسولوجیکل سرگرمی کی تحقیق میں پیشرفت۔ اور لنک [جے]۔ Chin Tradit Herb Drugs (中草药)، 2003، 34: 113-115۔

[2] Liu WJ، Liu Y، Song QQ، et al. ¹H-NMR سپیکٹروسکوپی [J] کا استعمال کرتے ہوئے کاشت شدہ اور جنگلی Cistanchetubulosa کے درمیان کیموم کا موازنہ۔ چائنا جے چن میٹر میڈ (中国中药杂志)، 2018، 43:3506-3512۔

[3] گانا Y، Zeng K، Jiang Y، et al. Cistanches Herba، ایک خطرے سے دوچار پرجاتیوں سے لے کر چینی ادویات کے بڑے برانڈ [J] تک۔ Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577۔

[4] لیو وائی، وانگ ایچ، یانگ ایم، وغیرہ۔ Cistanche deserticola polysaccharides PC12 خلیات کو OGD/RP سے متاثر ہونے والی چوٹ [J] سے بچاتا ہے۔ Biomed Pharmacother، 2018، 99: 671-680۔

[5] ین وائی، ہوانگ جے، گو ایکس، وغیرہ۔ پلانٹ نیوکلیوٹائڈ شوگر انٹر کنورژن انزائمز کا ارتقاء [J]۔PLoS One، 2011، 6: e27995۔

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. پلانٹ نیوکلیوٹائڈ شوگر کی تشکیل، باہمی تبدیلی، اور شوگر کی ری سائیکلنگ کے ذریعے بچاؤ [J]۔ Annu Rev Plant Biol، 2011، 62: 127-155۔

[7] گوو ایچ، لی ایل، وانگ پی جی۔ UDP-GlcNAc/Glc4-Epimerase from Escherichia coli O86:B7 [J] کی حیاتیاتی کیمیائی خصوصیات۔ بایو کیمسٹری، 2006، 45: 13760-13768۔

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. UDP-N-acetylglucosamine4-Epimerase کی شناخت جو Bacillus anthracis [J] میں exosporium پروٹین گلائکوسیلیشن میں شامل ہے۔ جے بیکٹیریول، 2009، 191: 7094-7101۔

[9] لی ایل این، کانگ جے کیو۔ Ornithogalumcaudatum [J] میں سوکروز سنتھیس جینز کی ٹرانسکرپٹوم وسیع شناخت۔ RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792۔

[10] Schmölzer K، Gutmann A، Diricks M، et al. سوکروز سنتھیس: بائیوکیٹلیٹک گلائکوسیلیشن پروسیس کی نشوونما کے لیے ایک منفرد گلائکوسائل ٹرانسفریز۔ Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11]کارڈینی CE، Leloir LF، Chiriboga J. دی بائیو سنتھیسس آف سوکروز [J]۔ جے بائیول کیم، 1955,214: 149-155۔[12]سٹین او، گرانوٹ