Cistanche Tubulosa Apoptosis اور Glial Cell-derived Neurotrophic Factor کے ریگولیشن کے ذریعے Dopaminergic Neurons کی حفاظت کرتا ہے: Vivo اور in Vitro-Ⅰ

تعارف

پارکنسنز کی بیماری (PD) ایک عام اعصابی بیماری ہے جو بوڑھے لوگوں میں پائی جاتی ہے جس میں انحطاط کی وجہ سے سبسٹینٹیا نگرا (SN) میں ڈوپیمینرجک نیوران کے نقصان کے پیتھولوجیکل مظاہر ہوتے ہیں۔ بیماری کی شدت کا تعلق SN میں ڈوپامائن (DA) نیورونل سیل کے نقصان سے ہے، جو اس نظریے سے مطابقت رکھتا ہے کہ کسی بھی علامات کے ظاہر ہونے سے پہلے نیوروڈیجینریٹیو عمل کئی سالوں میں آگے بڑھتا ہے (سولے اور مائرز، 1993)۔ بیماری کی ترقی پسند نوعیت بنیادی neurodegenerative عمل کو مسدود کرکے علاج کی مداخلت کے دلچسپ امکانات بتاتی ہے۔ DA نیورون کی بقا پر نیوروٹروفک عوامل کے تھراپی سے حوصلہ افزائی کی جانے والی طاقتور اور مخصوص کارروائیوں کی تلاش اس لیے کافی دلچسپی کا باعث ہے۔

ڈوپامینرجک نیورونز کے تحفظ کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیوبولوسا PHGS75% ECH 30% ایکٹ 12%

نیوروٹروفک عوامل ضروری پروٹین ہیں، بشمول اعصاب کی نشوونما کا عنصر (NGF)، دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک عنصر (BDNF)، اور glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)، جو اعصاب کی نشوونما، اعصابی نشوونما، محوری رہنمائی، اور نیورونل فنکشن کو فروغ دیتے ہیں۔ ڈوپامینرجک نیوران کی حفاظت اور ان کی مرمت کو فروغ دینے والے تمام نیوروٹروفک عوامل میں سے، جی ڈی این ایف کے سب سے مضبوط اثرات ہیں (ہانگ ایٹ ال۔، 2008؛ رنگاسامی ایٹ ال۔، 2010؛ ایلن ایٹ ال۔ GDNF کو وٹرو میں DA نیورونز پر قوی نیوروٹروفک اثرات رکھنے اور Vivo میں نیورو پروٹیکٹو اثرات مرتب کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ جی ڈی این ایف کو چوہوں میں سرجیکل- یا ٹاکسن سے متاثرہ اکسوٹومی (بیک ایٹ ال۔، 1995؛ کیرنز اینڈ گیش، 1995؛ سوئر ایٹ ال۔، 1995) اور جزوی طور پر بعد میں گھاووں سے متاثرہ سیل کی موت سے نیگرل ڈی اے نیوران کو بچانے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ نظامی انتظامیہN-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)چوہوں میں (Tomac et al.، 1995)۔ نیورونل اپوپٹوسس کے بڑھتے ہوئے واقعات اور نیوروٹروفک عوامل کے کم حفاظتی اثرات، جو ممکنہ طور پر مختلف پیتھولوجیکل عوامل سے متحرک ہوتے ہیں، ڈوپیمینرجک نیوران کے انحطاط کو ظاہر کرتے ہیں (ہولڈن ایٹ ال۔، 2006)۔

C. tubulosa ایک جڑی بوٹی کی دوا ہے جو Cistanche جینس کے کئی پودوں سے نکلتی ہے۔ یہ گردوں کی کمی کے سنڈروم کے لیے ایک اہم علاج کا اختیار ہے جس کا روایتی چینی طب (TCM) میں اینڈروجن ہارمونز سے گہرا تعلق ہے۔ آج تک، C. tubulosa پر بہت سی طبی اور بنیادی تحقیق نے نیوروڈیجنریٹیو بیماریوں کی سرگرمیاں ظاہر کی ہیں۔ PD کے علاج میں TCM گردے کو نقصان پہنچانے والے نسخوں کی شناخت اس طرح PD کے لیے ایک متبادل طبی علاج فراہم کر سکتی ہے۔Echinacoside (ECH)دواؤں کی جڑی بوٹی C. tubulosa میں پایا جانے والا ایک اہم حیاتیاتی جزو ہے۔ مطالعات نے Cistanche اور ECH کے گلائکوسائیڈز کے علاج کے اثرات دکھائے ہیں،verbascoside(VER)، اور icariin (ICA) الزائمر کی بیماری (AD)، PD، اور دیگر عروقی ڈیمنشیا کے مریضوں پر (Urano اور Tohda، 2010؛ Wang et al.، 2013؛ Wu et al.، 2014)۔ وو وغیرہ۔ (2014) نے تجویز کیا کہ C. tubulosa extracts جس میں کافی ECH اور ایکٹیوسائیڈ موجود تھے، A -42 کی وجہ سے ہونے والی علمی خرابی کو کم کرتے ہیں جو کہ امائلائیڈ ڈپوزیشن کو روکتے ہیں اور کولینرجک اور ہپپوکیمپل ڈوپامینرجک نیورونل فنکشن کو ریورس کرتے ہیں۔ تاؤ وغیرہ۔ (2015) نے پایاphenylethanoid glycosidesC. tubulosa (Ph Gs-Ct) سے چوہے کے ماڈلز کے دماغی بافتوں میں AQP4 کے پروٹین اور mRNA اظہار کو کم کرکے اونچائی والے دماغی ورم کو روکا۔

نیچرل CISTANCHE TUBULOSA ایکسٹریکٹ اسنیکس یادداشت کو بہتر بناتا ہے PHGS75% ECH 30% ACT 12%

پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ چینی جڑی بوٹیوں کے مرکبات، جن میں C. tubulosa، epimedium، اور rhizoma polygonati کے تین اجزاء شامل ہیں، ڈوپامینرجک نیوران کو پہنچنے والے نقصان کو کم کرتے ہیں اور نیوروٹروفک عوامل کے اظہار کو منظم کرکے ڈوپامائن کی بڑھتی ہوئی سطح (Wu et al., 2013)۔ اس طرح، یہ ابھی تک معلوم نہیں ہوسکا ہے کہ آیا C. tubulosa کی حوصلہ افزائی والے neuroprotective اثرات دیرپا ہیں اور GDNF کی انتظامیہ کے ذریعے nigral DA نیورونز کا بچاؤ PD جانوروں کی علامات کے لیے متعلقہ موٹرک رویوں کے قابل قدر تحفظ کو کس حد تک برداشت کرسکتا ہے۔ اس تحقیق میں ایک TCM کڈنی ٹونیفائینگ ریسیپی، C. tubulosa nanopowder کا استعمال کیا گیا، جسے چین میں ایک قومی پیٹنٹ (پیٹنٹ نمبر: 2011103028541) ملا ہے اور اس نے پہلے PD میں ایک خاص علاج کا اثر دکھایا ہے۔ موجودہ مطالعہ، لہذا، C. tubulosa کے علاج کے نیورو پروٹیکٹو اور تخلیق نو کے اثرات کی جانچ کرنے اور MES23.5 خلیوں اور طرز عمل سے متعلق حتمی چوہوں پر apoptosis کی تحقیقات کے لیے، اور GDNF کے ضابطے کی جانچ کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا، جیسا کہ ہدف ٹیسٹوں کی بیٹری سے ماپا جاتا ہے۔ .

مواد اور طریقے

مواد، ری ایجنٹس، اور سامان

C. tubulosa بیجنگ Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Beijing, China سے خریدا گیا تھا۔ ECH، VER، اور ICA نیشنل انسٹی ٹیوٹ فار فوڈ اینڈ ڈرگ کنٹرول، چین سے آئے ہیں۔ MES23.5 ڈوپیمینرجک نیورونل سیل لائن پروفیسر بیاو چن، لیبارٹری آف نیوروبیولوجی، کیپٹل میڈیکل یونیورسٹی، بیجنگ، چین کا تحفہ تھا۔ پچاس C57BL/6 نر چوہے (ہر ایک کا وزن 20-25 گرام) شنگھائی SLAC لیبارٹری اینیمل کمپنی لمیٹڈ (لائسنس نمبر: SCXK2012-0002)، شنگھائی، چین سے خریدا گیا تھا۔

MPP+، MTT، اور گلوٹامین سگما-الڈرچ (کارلسباد، CA، USA) سے خریدے گئے تھے۔ DMEM/F12 میڈیم اور فیٹل بووائن سیرم Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) سے خریدے گئے تھے۔ اور MPTP، DA سٹینڈرڈ اور homovanillic acid (HVA) سٹینڈرڈ سگما-Aldrich (Carlsbad, CA, USA) سے خریدے گئے تھے۔ ایکٹین، بیکس، بی سی ایل 2، جی ڈی این ایف، جی ڈی این ایف فیملی ریسیپٹر الفا (جی ایف آر 1) اور ریٹ اینٹی باڈیز سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریشن (بیورلی، ایم اے، یو ایس اے) سے خریدی گئی تھیں۔ 3,3'-diaminobenzidine (DAB) سٹیننگ ریجنٹ کٹ Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, China) سے خریدی گئی تھی۔ اور SDS-PAGE جیل کے نمونے کی تیاری کی کٹ، الٹراسینسیٹیو اینہانسڈ کیمیلومینیسینس (ECL) کا پتہ لگانے والی کٹ اور bicinchonic acid (BCA) پرکھ بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی (بیجنگ، چین) سے خریدے گئے تھے۔

اس مطالعہ میں درج ذیل آلات کا استعمال کیا گیا: ELX800 مائکروپلیٹ ریڈر (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2 انکیوبیٹر (ہیریئس، ہناؤ، جرمنی)؛ جیل DOC 2000 جیل امیجنگ تجزیہ نظام، الیکٹروفورسس سیل اور الیکٹروفورسس ٹینک (Bio-Rad، Hercules, CA, USA)؛ DU-650 پروٹین تجزیہ کار (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R ہائی سپیڈ ریفریجریٹڈ سینٹری فیوج (ایپینڈورف، ہیمبرگ، جرمنی)؛ SXQM ڈوئل پلانیٹری بال مل (چانگشا، ٹینکن پاؤڈر ٹیکنالوجی کمپنی، لمیٹڈ، ہنان، چین)؛ MM400 مکسر مل (Retsch GmbH، ہان، جرمنی)؛ Agilent 1200 ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); پاور پیک بیسک الیکٹروفورسس، پاور پیک بیسک ٹرانس میمبرین ٹرانسفر سسٹم، یونیورسل ہڈ II کیمیلومینیسینس امیجر، S1000 تھرمل سائیکلر آر این اے ریورس ٹرانسکرپشن سسٹم (بائیو ریڈ)؛ موٹک میڈ 6.0 ٹشو اور سیل امیج اینالیسس سسٹم (موٹک چائنا گروپ، کمپنی، لمیٹڈ، زیامین، چین)۔

کی تیاریC. tubulosaنینو پاؤڈر

C. tubulosa کا وزن کیا گیا، پھر صاف کیا گیا اور پانی کی کمی کی گئی۔ روایتی pulverization کے بعد، C. tubulosa باریک پاؤڈر کو ایک 200-جالی کی چھلنی سے گزر کر منجمد کر کے خشک کیا گیا۔ C. tubulosa نینو پاؤڈر تیار کرنے کے لیے درجہ حرارت پر قابو پانے والے ویکیوم اور اعلی توانائی والی بال مل کا استعمال کیا گیا۔ سب سے پہلے، کچے C. tubulosa نینو پاؤڈر کو ایک ویکیوم بال ملنگ ٹینک میں رکھا گیا تھا جو کاربائیڈ پیسنے والی گیندوں سے لدا ہوا تھا۔ پیسنے والی گیندوں اور C. tubulosa نینو پاؤڈر کے درمیان تناسب 15:1 سے 5:1 تک تھا۔ باریک پاؤڈر حاصل کرنے کے لیے، ہائی انرجی بال مل کی رفتار اور دورانیہ بالترتیب 300 rpm اور 20 منٹ پر مقرر کیا گیا تھا۔ نانوسکل مواد کی پروسیسنگ کے لیے باریک پاؤڈر کا وزن کیا گیا تھا اور اسے مکسر مل میں 25/s کی فریکوئنسی اور 20s کے دوہرانے کے ساتھ تین تکرار کے لیے پروسیس کیا گیا تھا۔ PBS کا استعمال 25 mg/mL سٹاک حل کو تحلیل کرنے اور تیار کرنے کے لیے کیا گیا تھا، اس کے بعد 30 منٹ الٹراسونیکیشن، آٹوکلیونگ، اور آخر میں −20◦C پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔

کے فعال اجزاء کا کوالٹی کنٹرولC. tubulosaHPLC کی طرف سے

ECH اور VER میں فلر کے طور پر octadecylsilane-bonded silica کے ساتھ gradient elution، موبائل فیز A کے طور پر میتھانول، اور موبائل فیز B کے طور پر 0.1% فارمک ایسڈ محلول موجود تھا۔ پتہ لگانے کی طول موج 330 nm تھی۔ آئی سی اے میں فلر کے طور پر اوکٹاڈیسیلسیلین بانڈڈ سلیکا کے ساتھ گریڈینٹ ایلیوشن اور موبائل فیز کے طور پر ایسٹونائٹرائل واٹر (30:70) شامل تھا۔ پتہ لگانے کی طول موج 270 nm تھی۔ ٹیسٹ کے لیے نمونہ، کنٹرول، اور منفی کنٹرول ہر ایک کو 10 µL کے طور پر ماپا گیا۔

سیل کلچر اور ایم ٹی ٹی پرکھ MPP کی قابل عملیت کی پیمائش کے لیے+- علاج شدہ خلیات

MES23.5 خلیوں کو 5% فیٹل کاف سیرم، 1% گلوٹامین، 2% 50× ساتو کے محلول، اور DMEM/F12 میڈیم 2% پینسلن/سٹریپٹومائسن کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا تھا۔ انہیں سیر شدہ نمی کے ساتھ 5% CO2 انکیوبیٹر میں 37◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ خلیوں کو الگ تھلگ کیا گیا تھا اور 0.25٪ ٹرپسن کے ساتھ گزر گیا تھا اور سیل کی معطلی کو لوگاریتھمک ترقی کے مرحلے میں کاٹا گیا تھا۔ 1 × 105 کی کثافت والے الگ تھلگ خلیات کو پولی لیسین لیپت 96- ویل پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا، جس کے بعد مختلف حتمی ارتکاز (6.25، 12.5، 25، 50، 100، 200، 400 اور 800 µmol/L) کا اضافہ کیا گیا۔ ) MPP+ میڈیا کا۔ MES23.5 خلیات جو 24 گھنٹے اور 48 گھنٹے کے لیے نارمل کلچر میڈیم کے ساتھ لگائے گئے تھے ان وٹرو تجربات میں منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیے گئے تھے۔ علاج کے مختلف گروپوں کے خلیوں کو 4 گھنٹے کے لئے ایم ٹی ٹی ریجنٹ کے ساتھ لگایا گیا تھا۔ بعد میں کنوؤں میں موجود محلول کو ضائع کر دیا گیا اور 150 µL DMSO شامل کیا گیا اور 10 منٹ کے لیے دوہرایا گیا۔ 570 nm کی طول موج پر ہر نمونے کی جاذبیت کو خودکار مائکروپلیٹ ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ سیل کے قابل عمل ہونے کا فیصد (%)=کا مطلب ہے تجرباتی گروپ کی جاذبیت/منفی کنٹرول گروپ کی اوسط جاذبیت × 100%۔

MPP+ میڈیم کی متعلقہ ارتکاز کو MES23.5 سیلز میں 24-گھنٹہ علاج کے لیے اسی انداز کا استعمال کرتے ہوئے شامل کیا گیا جیسا کہ ان وٹرو کلچر کے لیے ہے۔ علاج کے بعد کنویں میں موجود محلول کو ضائع کر دیا گیا۔ C. tubulosa nanopowder کے مختلف ارتکاز (10, 50, 100, 200, 250, 500, اور 1000 µg/mL) پر مشتمل میڈیا کو مختلف کنوؤں میں MES23.5 خلیوں میں شامل کیا گیا اور 24 گھنٹے اور 48 گھنٹے تک انکیوبیٹ کرنے کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ MES23.5 خلیات جو 24 گھنٹے اور 48 گھنٹے کے لیے نارمل کلچر میڈیم کے ساتھ لگائے گئے تھے منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیے گئے تھے۔ MES23.5 خلیات جو MPP + میڈیم کے ساتھ لگائے گئے تھے گاڑی کے طور پر استعمال کیے گئے تھے۔ پیمائش ہر نمونے کے لئے سہ رخی میں کی گئی تھی۔ سیل کی عملداری کا حساب لگانے کے لئے متعلقہ علاج اور کنٹرول گروپوں کی جاذبیت کی پیمائش کی گئی۔

نیچرل سیسٹینچ ٹیوبولوسا ایکسٹریکٹ اینٹی فیٹیگ PHGS75% ECH 30% ایکٹ 12%

TH اظہار امیونوسائٹو کیمسٹری کے ذریعہ ماپا گیا۔

جب C. tubulosa nanopowder 100, 200, اور 250 µg/ml میں تھا، سیل کی بقا کی شرح میں نمایاں اضافہ ہوا (شکل 2G)۔ اس طرح، بعد کے تجربات میں، ہم نے تین ارتکاز کا تجربہ کیا: کم خوراک، درمیانی خوراک، اور زیادہ خوراک والے گروپ۔ C. tubulosa گروپوں میں سے ہر ایک کے لیے تین نقلوں کا تجربہ کیا گیا۔ جراثیم سے پاک، پولی لیسین لیپت کور سلپس کو 6- کنویں کی پلیٹوں میں رکھا گیا تھا۔ اس کے بعد ، ہر کنویں میں 5 × 104 خلیوں کو سیڈ کیا گیا اور 24 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ روایتی تازہ میڈیم کو نارمل کنٹرول گروپ میں تبدیل کیا گیا تھا اور 100 μmol/L MPP+ میڈیم کی حتمی حراستی کو بقیہ علاج گروپوں میں 24 گھنٹے تک انکیوبیٹ کرنے کے لیے تبدیل کیا گیا تھا۔ اس کے بعد روایتی تازہ میڈیا کو نارمل کنٹرول اور گاڑیوں کے گروپس میں تبدیل کیا گیا، اور 100، 200، اور 250 µg/mL C. tubulosa نانو پاؤڈر کو خلیات کے ساتھ 24 گھنٹے تک کم، اعتدال پسند اور زیادہ خوراک میں انکیوبیٹ کیا گیا۔ C. tubulosa علاج گروپوں، بالترتیب. مختلف گروپوں کے MES23.5 خلیوں کو PBS میں تین بار دھویا گیا تاکہ سپرنٹنٹ کو ہٹایا جا سکے اور مزید 15 منٹ کے لیے 4% paraformaldehyde میں طے کیا جائے۔ پی بی ایس کے ساتھ دھونے کے بعد، خلیات کو پیرو آکسیڈیس بلاکر کے ساتھ 37◦C پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر پی بی ایس کے ساتھ دوبارہ دھویا گیا۔ ایک 0.2% Triton X-100 محلول 10 منٹ تک سیل پارمیبلائزیشن کے لیے استعمال کیا گیا، اس کے بعد PBS سے دھویا گیا۔ عام بکرے کا سیرم ہر نمونے میں شامل کیا گیا تھا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک سینک دیا گیا تھا۔ اس کے بعد عام بکرے کے سیرم کو ہٹا دیا گیا اور PBS میں 1:400 پتلا ہوا بنیادی اینٹی باڈی ہر نمونے میں شامل کیا گیا اور رات بھر 4◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ منفی کنٹرول گروپ کے خلیوں کو راتوں رات 4◦C پر PBS کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ پی بی ایس کے ساتھ دھونے کے بعد، خلیوں کو 20 منٹ کے لیے 37◦C پر نمی کے چیمبر میں بایوٹین لیبل والے سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد ہر نمونے کو پی بی ایس میں دھویا گیا اور ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز-اسٹریپٹاویڈن کنجوگیٹس (ورکنگ سلوشن C) کے ساتھ 20 منٹ کے لیے 37◦C پر لیبل لگایا گیا۔ پی بی ایس سے دھونے کے بعد، خلیات تقریباً 1–10 منٹ تک اندھیرے میں ڈی اے بی ریجنٹ کے ساتھ داغے ہوئے تھے اور ہلکی مائکروسکوپی کے تحت بھورے رنگ کی نشوونما کی نگرانی کی گئی۔ اس کے بعد ہر نمونے کو 1-2 منٹ کے لئے آست پانی میں دو بار دھویا گیا اور نیوکلی کو 0.5-1 منٹ کے لئے ہیماتوکسیلین محلول کے ساتھ انسداد کیا گیا۔ پانی میں ہر نمونے کو اچھی طرح سے دھونے کے بعد، خلیات کو فرق کے لیے 1% ہائیڈروکلورک ایسڈ الکحل اور 1% آبی امونیا میں ڈبو دیا گیا، اس کے بعد خلیوں کو پانی میں اچھی طرح دھویا گیا۔ اس کے بعد ہر نمونے کے خلیوں کو 2 منٹ کے لیے 70٪ ایتھنول، 2 منٹ کے لیے 80٪ ایتھنول، 2 منٹ کے لیے 90٪ ایتھنول، دو بار 2 منٹ کے لیے 95٪ ایتھنول، اور 2 منٹ کے لیے 100٪ ایتھنول میں دو بار پانی کی کمی کی گئی۔ اس کے بعد خلیوں کو زائلین محلول میں دو بار 2 منٹ کے لیے ڈبو دیا گیا اور غیر جانبدار رال کے ساتھ شیشے کی سلائیڈ پر لگایا گیا۔ ہلکی مائیکروسکوپی کے تحت، ہر نمونے میں 5-10 موثر بصری فیلڈز کی تصویری کیپچرنگ اور بے ترتیب انتخاب کیا گیا تاکہ ڈوپامینرجک نیورونز میں منتخب پروٹین کے اظہار کا تعین کیا جا سکے جو کہ بھورے ذرات کی شدت سے ظاہر ہوتا ہے اور پروٹین کے مواد کو اس کی اوسط گرے ویلیو سے نیم مقدار میں طے کرتا ہے۔ .

MES23.5 سیلز کی اپوپٹوس کی شرح فلو سائٹومیٹری سے ماپا گیا

پیروی کرنے والے خلیوں کو ایک بار پی بی ایس سے دھویا گیا تھا۔ سیل آئسولیشن کے لیے، کمرے کے درجہ حرارت پر ای ڈی ٹی اے فری ٹرپسن محلول کی ایک مناسب مقدار شامل کی گئی تھی اور اس محلول کو آہستہ سے پائپ کیا گیا تھا تاکہ پیروکار خلیات کو الگ ہونے دیا جائے۔ اس کے بعد ٹرپسنائزیشن کو روکنے کے لیے سیل کلچر میڈیم شامل کیا گیا۔ مرکب کو ایک نئی سینٹری فیوج ٹیوب میں منتقل کیا گیا اور پھر الگ تھلگ خلیوں کو جمع کرنے کے لیے 1500 rpm پر 5 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو ضائع کرنے کے بعد، سیل گولی کو پی بی ایس کا استعمال کرتے ہوئے آہستہ سے دوبارہ معطل کیا گیا، اور خلیوں کی گنتی کی گئی۔ لگ بھگ 1 × 105 سے 5 × 105 دوبارہ معطل شدہ خلیوں کو 1500 rpm پر 5 منٹ کے لئے سینٹرفیوج کیا گیا تھا اور سپرنٹنٹ کو ضائع کردیا گیا تھا۔ انیکسن V-FITC بائنڈنگ سلوشن کے پانچ مائیکرو لیٹرز سیل پیلٹ میں شامل کیے گئے تھے تاکہ خلیوں کو آہستہ سے بحال کیا جا سکے۔ مزید 5 µL Annexin V-FITC شامل کیا گیا اور اچھی طرح ملایا گیا۔ پروپیڈیم آئوڈائڈ محلول کے پانچ مائیکرو لیٹرز فلو سائٹومیٹری سے کچھ دیر پہلے کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کرکے سیل داغ لگانے کے لئے استعمال کیے گئے تھے۔

کے لیے ویسٹرن بلاٹ تجزیہوٹرو میں

خلیوں کو ایک عام گروپ، MPP + علاج گروپ، کم خوراک میں تقسیم کیا گیا تھا۔C. tubulosaعلاج گروپ، اعتدال پسند خوراک C. tubulosa علاج گروپ، اور زیادہ خوراک C. tubulosa علاج گروپ۔ Bcl2 اور Bax کا اظہار ہر ایک میں ماپا گیا۔ سیل کی کٹائی سے پہلے ہر گروپ میں ماڈلنگ اور علاج کے لیے 6-کنویں پلیٹ میں کل 1 × 10فی کنواں 5 سیل استعمال کیے گئے تھے۔ ایک مخلوط lysate، جس میں RIPA بفر، پروٹیز انہیبیٹر، اور فاسفیٹیس انحیبیٹر شامل ہیں، کو برف پر 30 منٹ تک سیلز کو لیس کرنے کے لیے شامل کیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن کے بعد، سپرنٹنٹ کو پروٹین کے تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا۔ BCA پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے کل پروٹین کی مقدار درست کی گئی تھی اور 10٪ SDS-PAGE سے الگ کیا گیا تھا۔ الگ کیے گئے پروٹین کو ایک جھلی میں منتقل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے 5% سکم دودھ بلاک کرنے والے بفر کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد جھلی کو پرائمری اینٹی باڈی (Bcl-2 0.34 mg/ml، Bax 0.11 mg/ml، 1:200 dilution) میں رات بھر 4◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ دھونے کے ایک قدم کے بعد، جھلی کو ثانوی اینٹی باڈی (0.5 mg/ml، 1:5000 dilution) میں 4◦C پر 1 گھنٹے کے لیے اور پھر روایتی نشوونما کے لیے 2 منٹ کے لیے ECL ڈویلپر میں لگایا گیا۔ کوانٹیٹی ون سافٹ ویئر پروٹین ایکسپریشن کے نیم مقداری تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

نیچرل سیسٹینچ ٹبلوسا برائے انسداد تھکاوٹ جگر کی حفاظت PHGS75% ECH 30% ایکٹ 12%

تجرباتی اینیمل ماڈلنگ اور ڈرگ ایڈمنسٹریشن

پچاس مخصوص روگزن سے پاک 8-ہفتہ پرانے نر چوہوں کو تصادفی طور پر پانچ گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: ایک نارمل گروپ، MPTP ٹریٹمنٹ گروپ (گاڑی)، کم خوراک والا C. tubulosa علاج گروپ، اعتدال پسند خوراک C. tubulosa علاج گروپ، اور اعلی خوراک C. tubulosa علاج گروپ. جانوروں کو خوراک اور پانی تک مفت رسائی کے ساتھ 20–22◦C پر رکھا گیا تھا۔ نارمل گروپ میں چوہوں کو لگاتار سات دن تک نارمل نمکین کی مساوی مقدار کے ساتھ انٹراپریٹونلی انجکشن لگایا گیا تھا۔ دوسرے علاج کے گروپوں میں چوہوں کو گاڑیاں قائم کرنے کے لیے لگاتار سات دنوں تک MPTP (30 mg/kg/d) کے ساتھ انٹراپریٹونلی انجکشن لگایا گیا تھا۔

PD ماڈلنگ کے دوران، کم خوراک، اعتدال پسند خوراک، اور زیادہ خوراک والے C. tubulosa کے علاج کے گروپوں میں چوہوں کو 4 g/kg/d، 8 g/kg/d، اور 16 g/ کے مساوی طبی حجم کا انتظام کیا گیا۔ کلوگرام/ڈیC. ٹیوبولوسا نینو پاؤڈربالترتیب، مسلسل 14 دنوں کے لیے۔ کنٹرول اور گاڑیوں کے گروپوں میں چوہوں کو مسلسل 14 دنوں تک نارمل نمکین کے مساوی مقدار میں انتظام کیا گیا۔ تمام تجرباتی طریقہ کار کو ٹی سی ایم کی فوجیان یونیورسٹی کی اخلاقی کمیٹی نے منظور کیا تھا اور لیبارٹری جانوروں کے استعمال اور دیکھ بھال کے لیے بین الاقوامی طور پر قبول شدہ اصولوں کے مطابق انجام دیا گیا تھا۔ اس تحقیق میں جانوروں کی تکلیف کو کم کرنے کے لیے تمام کوششیں کی گئیں۔