Clec12a کولیٹوجینک کامنسل کی توسیع کو محدود کرتے ہوئے سوزش کو روکتا ہے۔

خلاصہ

مائیکرو بائیوٹا کا ضابطہ آنتوں کی صحت کے لیے بہت اہم ہے لیکن فطری قوت مدافعت کے ذریعے استعمال کیے جانے والے میکانزم ابھی تک واضح نہیں ہیں۔ یہاں ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ C-Type-lectin ریسیپٹر میں چوہوں کی کمی، Clec12a نے شدید کولائٹس تیار کیا، جو مائکرو بائیوٹا پر منحصر تھا۔ جراثیم سے پاک چوہوں میں فیکل مائیکرو بائیوٹا ٹرانسپلانٹیشن (FMT) کے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ Clec12a-/- چوہوں کے اندر تشکیل پانے والے کولیٹوجینک مائیکرو بائیوٹا جو گرام پازیٹو آرگنزم، فیکلیباکولم چوہوں کی توسیع سے نشان زد تھے۔ F. rodentium کے ساتھ علاج جنگلی قسم کے چوہوں میں کولائٹس کو خراب کرنے کے لیے کافی تھا۔ گٹ کے اندر میکروفیجز Clec12a کی بلند ترین سطح کا اظہار کرتے ہیں۔ Clec12a-/- macrophages میں سائٹوکائن اور ترتیب کے تجزیے سے سوزش میں اضافے کا انکشاف ہوا لیکن phagocytosis سے وابستہ جینز میں واضح کمی۔ درحقیقت، Clec12a-/- میکروفیجز F. rodentium کو اٹھانے کی صلاحیت میں کمزور ہیں۔ Purified Clec12a کی گرام پازیٹو جانداروں جیسا کہ F. rodentium سے زیادہ پابند تھا۔ اس طرح، ہمارا ڈیٹا Clec12a کو بغیر کسی سوزش کے ممکنہ طور پر نقصان دہ commensals کے پھیلاؤ کو کنٹرول کرنے کے لیے ایک پیدائشی مدافعتی نگرانی کے طریقہ کار کے طور پر شناخت کرتا ہے۔

مردوں کے لئے cistanche فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط

تعارف

مائیکرو بائیوٹا کی ساخت اور کام ممالیہ کی صحت اور بیماری پر گہرا اثر ڈال سکتا ہے (Fassarella et al.، 2021)۔ یہ سوزش والی آنتوں کی بیماری (IBD) کے لئے اچھی طرح سے دستاویزی کیا گیا ہے، جہاں IBD کے زیادہ تر ماؤس ماڈل مائکرو بائیوٹا ساخت میں تبدیلیوں کے لئے حساس ہیں (Gkouskou et al.، 2014)۔ ان عوامل کو سمجھنا جو مائیکرو بائیوٹا کے استحکام پر اثرانداز ہوتے ہیں اور ان کی ہدایات دیتے ہیں، کیونکہ مائکرو بائیوٹا پر مبنی علاج تیار کیے گئے ہیں (شرما ایٹ ال۔، 2020؛ سوربرا اور پامر، 2022)۔ مائکرو بائیوٹا متعدد پیرامیٹرز سے متاثر ہوتا ہے جس میں خوراک، ادویات اور مدافعتی نظام شامل ہیں۔ حالیہ برسوں میں، انکولی مدافعتی اجزاء، خاص طور پر IgA، کو مائیکرو بائیوٹا کی ساخت کو متاثر کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے (نکاجیما ایٹ ال۔، 2018؛ اوکائی ایٹ ال۔، 2016؛ یانگ اور پام، 2020)۔ تاہم، اس کے بارے میں کم معلوم ہے کہ مخصوص فطری قوت مدافعت کے رسیپٹرز ہومیوسٹیٹک مائیکرو بائیوٹا مرکب کو کس طرح متاثر کرتے ہیں۔

مائکروبیل کی شناخت اور میوکوسل استثنیٰ کو منظم کرنے والے جینوں میں جینیاتی پولیمورفزم IBD کے لیے اہم خطرے والے ایللیس ہیں، بشمول آٹوفجی پروٹین ATG16L1 (Cadwell et al.، 2008؛ Liu et al.، 2015؛ Rioux et al. )۔ اے ٹی جی 16 ایل 1 ٹی 300 اے پولیمورفزم والے افراد میں مائیلوڈ جین کے اظہار کی تبدیلیوں کی کھوج کرنے والے ایک حالیہ مطالعے میں، روکنے والے سی قسم کے لیکٹین ریسیپٹر (CLR)، Clec12a، کو ان خلیوں میں نمایاں طور پر دبانے کی نشاندہی کی گئی تھی (بیگن ایٹ ال۔، 2015)۔ اسی مطالعے نے یہ ظاہر کیا کہ Clec12a آٹوفجی پاتھ وے کے ساتھ وابستگی کے ذریعے روگجنک انفیکشن کے دفاع میں کام کرتا ہے۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ IBD والے افراد میں Clec12a کی کمی بیماری کی شدت اور/یا نشوونما کو متاثر کر سکتی ہے۔ اس ثبوت کے باوجود، کولائٹس کے دوران Clec12a کے ذریعے مدافعتی ضابطے کے طریقہ کار کے بارے میں بہت کم معلومات ہیں۔

C-type lectins گھلنشیل یا جھلی سے جڑے مالیکیولز کا ایک متنوع گروپ ہے جو میزبان- یا مائکروبیل سے ماخوذ، لپڈز، پروٹینز، اور کاربوہائیڈریٹ دونوں کو باندھنے کی صلاحیت رکھتا ہے (Brown et al.، 2018)۔ Mincle (Clec4e) اور Dectin-1 (Clec7a) دو CLRs ہیں جو آنتوں کے ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کے لیے مائکرو بائیوٹا کے مخصوص اراکین کو متاثر کرتے ہیں (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019)۔ تاہم، 1 سے زیادہ،000 مختلف سی قسم کے لیکٹینز کے ساتھ، اس پروٹین فیملی میں بہت کچھ دریافت کرنا باقی ہے۔ Clec12a کا تعلق قدرتی قاتل ریسیپٹر فیملی سے ہے اور یہ صرف دو سی قسم کے لیکٹینز میں سے ایک ہے جس میں ایک امیون ٹائروسین انحیبیٹری موٹف (ITIM) ہے جو سوزش کے سگنلنگ راستوں کو محدود کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004) . Clec12a یورک ایسڈ کو پہچانتا ہے جو سیلولر نقصان کا اشارہ ہے (Neumann et al.، 2014)۔ Clec12a کا سب سے زیادہ اظہار پیدائشی مدافعتی خلیوں میں ہوتا ہے، اور نیوٹروفیلز میں یہ یورک ایسڈ کی شناخت پر ایکٹیویشن کو کم کرنے اور سوزش والی سائٹوکائن کی پیداوار کو کم کرنے کے لیے کام کرتا ہے (نیومن ایٹ ال۔، 2014)۔ اس کے برعکس، Clec12a وائرل انفیکشن کے جواب میں ایک سے زیادہ سکلیروسیس اور پوٹینشیئٹنگ ٹائپ I انٹرفیرون سگنلنگ کے دوران خون کے دماغی رکاوٹ میں مونو نیوکلیئر فاگوسائٹس (MNPs) کی منتقلی کی اجازت دے کر سوزش کو فروغ دیتا ہے (Li et al. .، 2017)۔ Clec12a پلازموڈیل پروڈکٹ، ہیموزائن کو بھی پہچاننے کی صلاحیت رکھتا ہے، جو پلازموڈیم انفیکشن (Raulf et al.، 2019) کے بعد دماغ میں CD8+ T خلیات کو بڑھاتا دکھایا گیا ہے۔ اس طرح، Clec12a استثنیٰ اور انوکھی سگنلنگ کی صلاحیتوں میں مختلف کرداروں کے ساتھ ایک متضاد CLR کی نمائندگی کرتا ہے، پھر بھی آنت میں اس کا کردار نامعلوم ہے۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

ہم نے پہلے یہ ظاہر کیا ہے کہ مخصوص گٹ فنگس پیورین میٹابولائٹ، یورک ایسڈ (Chiaro et al.، 2017) کو شامل کرکے کولائٹس کو بڑھاتی ہے۔ مزید یہ کہ، purine میٹابولزم حال ہی میں انسانی آنتوں کی بیماری سے وابستہ تھا (Zhu et al.، 2019)۔ یہ اعداد و شمار اجتماعی طور پر تجویز کرتے ہیں کہ یورک ایسڈ کا پتہ لگانا IBD سے متعلقہ ہو سکتا ہے۔ اس کی بنیاد پر، ہم آنت میں Clec12a کے فنکشن کو دریافت کرنے نکلے۔ ہم نے پایا کہ Clec12a کی کمی والے جانور کولائٹس کے لیے انتہائی حساس ہوتے ہیں جو Clec12a کی غیر موجودگی میں بننے والی مائیکرو بائیوٹا مرکب پر منحصر ہے۔ Clec12a-/- مائکرو بائیوٹا کا WT جراثیم سے پاک جانوروں میں FMT کولائٹس کو بڑھانے کے لیے کافی تھا اور Clec12a-/- جانوروں میں کولیٹوجینک مائیکرو بائیوٹا کی تشکیل انکولی قوت مدافعت سے آزاد ہے۔ متعلقہ جرثوموں کی نشاندہی کرنے کے لیے جو کولائٹس کو بڑھا سکتے ہیں، Clec12a-/- جانوروں کا علاج مختلف اینٹی بائیوٹکس سے کیا گیا، اور وہ جو گرام پازیٹو بیکٹیریا کو نشانہ بناتے تھے بیماری کو بڑھاتے تھے۔ 16S rDNA کی ترتیب نے شناخت کیا کہ Faecalibaculum rodentium Clec12a-/- جانوروں میں نمایاں طور پر زیادہ پایا جاتا ہے اور F. rodentium کی زبانی گیج WT جانوروں میں بیماری کے پیتھالوجی کو بڑھانے کے لیے کافی تھی۔ Clec12a-/- جانوروں کی مدافعتی پروفائلنگ نے بڑی آنت میں ہومیوسٹیٹک مائیلوڈ خلیوں میں واضح کمی کا انکشاف کیا۔ F. rodentium-treated macrophages کی RNA ترتیب سے یہ بات سامنے آئی کہ Clec12a phagocytosis کو فروغ دیتا ہے۔ جیسا کہ Clec12a کو ایک سے زیادہ ligands کو باندھنے کے لیے دکھایا گیا ہے، ہم نے پوچھا کہ کیا Clec12a مائیکرو بائیوٹا کے متنوع ممبروں کا پابند ہوگا۔ Clec12a-Fc فیوژن پروٹین کا استعمال کرتے ہوئے ہم شناخت کرتے ہیں کہ Clec12a مائیکرو بائیوٹا کے گرام پازیٹو ممبران سے بہت زیادہ منسلک ہوتا ہے۔ اجتماعی طور پر یہ اعداد و شمار ایک ایسے ماڈل کی تجویز کرتے ہیں جس کے تحت Clec12a مائیکرو بائیوٹا کے کولیٹوجینک اراکین کو براہ راست بائنڈنگ اور phagocytosis کے ذریعے کنٹرول کرتا ہے جبکہ اشتعال انگیز ردعمل کو روکتا ہے۔ ایسے منظرناموں میں جہاں Clec12a اظہار کم ہو جاتا ہے، گرام پازیٹو پیتھوبیونٹس سوزش کو بڑھا اور فروغ دے سکتے ہیں۔ اس طرح، ہمارے مطالعے Clec12a کو ایک اہم سوزش کو دبانے والے کے طور پر شناخت کرتے ہیں تاکہ ہومیوسٹاسس اور صحت مند مائکرو بائیوٹا کی دیکھ بھال کو یقینی بنایا جا سکے۔

نتائج

Clec12a-/- جانور انکولی مدافعتی نظام سے آزاد کولائٹس کے لیے انتہائی حساس ہوتے ہیں

IBD والے افراد میں Clec12a اظہار میں کمی کی اطلاع دی گئی ہے اور ہم نے یہ ظاہر کیا ہے کہ Clec12a، یورک ایسڈ کے لیے ایک ligands کی پیداوار کو روکنا کولائٹس کو بہتر بنا سکتا ہے (Begun et al.، 2015؛ Chiaro et al.، 2017؛ Liu et al. .، 2015)۔ تاہم، Clec12a کا ابھی تک کولائٹس کے جانوروں کے ماڈلز میں مطالعہ نہیں کیا گیا ہے۔ اس مقصد کے لیے، WT اور Clec12a-/- C57BL/6 چوہوں کو شدید DSS کولائٹس کے ساتھ چیلنج کیا گیا۔ Clec12a-/- جانوروں نے نمایاں طور پر زیادہ وزن کم کیا، چھوٹی بڑی آنت کی نمائش کی، اور WT جانوروں کے مقابلے میں سوزش کے مارکر LCN2 میں نمایاں اضافہ ہوا، جو سوزش اور بیماری کی خرابی کی نشاندہی کرتا ہے (شکل 1A-C)۔ اس کی حمایت کرتے ہوئے، ہسٹولوجیکل تجزیہ نے WT (شکل 1D، E) کے مقابلے Clec12a-/- جانوروں میں اپکلا کو پہنچنے والے نقصان، کرپٹ نقصان، اور مدافعتی خلیوں کی آمد کا انکشاف کیا۔ DSS کولائٹس ماڈل کے نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، CD4+ CD45RBhi خلیوں کی TCRb-/- میں منتقلی؛ Clec12a-/- ڈبل ناک آؤٹ چوہوں نے TCRb-/- چوہوں (شکل 1F، G) میں منتقل ہونے والے T خلیوں کے مقابلے میں وقت کے ساتھ ساتھ کم وزن اور چھوٹی بڑی آنت کی قیادت کی۔ اجتماعی طور پر، یہ نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ Clec12a کا نقصان آنتوں کی بیماری کو خراب کرنے کا باعث بنتا ہے۔

Clec12a کا زیادہ تر اظہار پیدائشی مدافعتی خلیوں میں ہوتا ہے جس کا اظہار CD8+ T خلیوں میں بہت کم ہوتا ہے۔ لہذا، اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا Clec12a-/- جانوروں میں دیکھی جانے والی بگڑتی ہوئی بیماری میں انکولی قوت مدافعت شامل ہے، Clec12a-/- جانوروں کو Rag-/- جانوروں تک پہنچایا گیا تاکہ T اور B دونوں خلیوں کو ہٹایا جا سکے۔ ایک بار پھر، Clec12a-/- جانوروں میں WT جانوروں کے مقابلے میں بیماری بڑھ جاتی ہے کیونکہ ان کا وزن زیادہ ہوتا ہے اور ان کا وزن WT کنٹرولز سے چھوٹا ہوتا ہے (شکل 1H، I)۔ اسی طرح Clec12a-/-; Rag-/- کنٹرول کے مقابلے Rag-/- کی آنتوں کی بیماری خراب ہو گئی اور وزن کم ہو گیا اور WT اور Rag-/- سے Clec12a-/- (شکل 1H، I) کے مقابلے میں چھوٹی بڑی آنت تھی۔ ہم نے پہلے اطلاع دی ہے کہ S. cerevisiae کے ساتھ زبانی علاج کولائٹس کو خراب کرنے کے لیے یورک ایسڈ کی سطح کو بڑھاتا ہے۔ تاہم، WT بمقابلہ Clec12a-/- جانوروں میں سیرم یا پاخانے کے یورک ایسڈ کی سطح میں کوئی فرق نہیں دیکھا گیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ Clec12A-/- میں دیکھی گئی بڑھی ہوئی بیماری یورک ایسڈ میں اضافے کا نتیجہ نہیں ہے (تصویر S1)۔ اس طرح، Clec12a-/- جانوروں میں دیکھی جانے والی کولائٹس کی بگڑتی ہوئی نشوونما انکولی مدافعتی نظام سے آزاد ہے۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

Cistanche Enhance Immunity مصنوعات دیکھنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید پوچھیں】 ای میل:cindy.xue@wecistanche.com / واٹس ایپ: 0086 18599088692 / وی چیٹ: 18599088692

Clec12a-/- جانوروں میں خراب ہونے والی کولائٹس مائکرو بائیوٹا پر منحصر ہے

کولائٹس کو جزوی طور پر، مائکروبیوٹا کی ساخت میں تبدیلیوں کے ذریعے چلایا جاتا ہے (Kubinak et al.، 2015؛ Ray and Dittel، 2015)۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا Clec12a-/- جانور ایک مائکرو بائیوٹا رکھتے ہیں جو خراب ہونے والی کولائٹس کو فروغ دیتا ہے، FMTs کو WT یا Clec12a-/- چوہوں سے جراثیم سے پاک WT جانوروں میں انجام دیا گیا۔ ٹرانسپلانٹ کے چار ہفتوں بعد، آدھے جانوروں کو ایک ساتھ رکھا گیا، جبکہ باقی آدھے الگ الگ رکھے گئے۔ اس کے بعد ایکیوٹ ڈی ایس ایس کولائٹس کو ہر گروپ میں شامل کیا گیا تھا (شکل 2A)۔ جن جانوروں نے Clec12a-/- FMT حاصل کیا اور ساتھ رہنے والے جانور نمایاں طور پر زیادہ وزن (شکل 2B) کھو چکے ہیں اور ان جانوروں کے مقابلے میں نمایاں طور پر چھوٹی بڑی آنت (فگر 2C) تھی جنہوں نے WT چوہوں سے FMT حاصل کیا تھا۔ مزید برآں، ہسٹولوجیکل تجزیہ نے Clec12a-/- مائکرو بائیوٹا (شکل 2D، E) کے ساتھ ٹرانسپلانٹیشن کے بعد زیادہ اپکلا نقصان اور سوزش کی آمد کا انکشاف کیا۔ قائم شدہ مائکروبیل کمیونٹیز گروپوں میں الگ الگ تھیں جیسا کہ Bray-Curtis (PERMANOVA، p=0.0001)، غیر وزنی (PERMANOVA، p=0.0062)، اور وزنی- Unifrac فاصلے (PERMANOVA، p=0.0001)۔ گروپ کے اندر مائکروبیوٹا کی مماثلت ایک ہی میٹرکس کے ذریعہ شریک رہنے والے جانوروں میں سب سے زیادہ تھی جو ہر FMT جین ٹائپ (شکل 2 FH) سے جرثوموں کے حصول کی نشاندہی کرتی ہے۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ Clec12a-/- جانوروں کے اندر خراب ہونے والی کولائٹس Clec12a کی غیر موجودگی میں افزودہ مخصوص جرثوموں کے ذریعے چلتی ہے۔ اور یہ جرثومے ایک قائم شدہ ڈبلیو ٹی مائکرو بائیوٹا کی موجودگی میں بھی کولیٹوجینک فینوٹائپ کے غالب ڈرائیور بن گئے۔

Clec12a-/- جانوروں میں مائیکرو بائیوٹا کی تشکیل انکولی قوت مدافعت سے آزاد ہے

مائیکرو بائیوٹا کی ساخت کو ترتیب دینے کے لیے مدافعتی نظام اہم ہے۔ FMT تجربے نے اشارہ کیا کہ Clec12a-/- مائیکرو بائیوٹا کی ساخت میں تبدیلی کا باعث بنتا ہے جو کولائٹس کی بگڑتی ہوئی نشوونما کو فروغ دیتا ہے۔ ہم سب سے پہلے اس بات کا تعین کرنا چاہتے تھے کہ آیا Clec12a-/- مدافعتی کمپارٹمنٹ میں کمی گٹ مائکروبیوٹا کو نئی شکل دینے کے قابل تھی۔ اس مقصد کے لیے، مائکرو بائیوٹا کو معیاری بنانے کے لیے WT یا Clec12a-/- چوہوں سے بون میرو کو مہلک طور پر شعاع ریزی والے WT SPF وصول کنندہ چوہوں میں منتقل کیا گیا تھا جس کے بعد ایک 8- ہفتے کی مدافعتی بحالی کی مدت (شکل 3A)۔ اس وقت کے دوران، ٹرانسپلانٹ شدہ مدافعتی نظام کے پاس وصول کنندہ کے اندر نشوونما پانے کا وقت ہوتا ہے، جو مائیکرو بائیوٹا کی ساخت کو مختلف شکل دیتے ہیں۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا مائکرو بائیوٹا میں پروکولیٹوجنک تبدیلیاں اس مدافعتی مجسمہ سازی کے نتیجے میں ہوئیں، ہم نے FMTs کو WT یا Clec12a-/- chimeric چوہوں اور حوصلہ افزائی DSS کولائٹس (شکل 3A) سے مل کر استعمال کیا۔ اگرچہ وزن میں کمی (شکل 3B) میں کوئی خاص تبدیلیاں نہیں ہوئیں، Clec12a-/- chimeric چوہوں سے FMT حاصل کرنے والے جانوروں کے کالون WT چوہوں (شکل 3C) سے ایف ایم ٹی حاصل کرنے والے جانوروں کے مقابلے میں نمایاں طور پر چھوٹے تھے، جو کہ بیماری کی خرابی کی نشاندہی کرتے ہیں۔ مزید برآں، جب WT اور Clec12a-/- FMT وصول کنندگان کو ایک ساتھ رکھا گیا تھا، WT FMT (شکل 3C) حاصل کرنے والے جانوروں کے مقابلے میں کالون نمایاں طور پر چھوٹے تھے۔ اس طرح، Hematopoietic کمپارٹمنٹ کے اندر Clec12a-/- کی کمی غالب کولیٹوجینک مائکرو بائیوٹا کی تشکیل کا باعث بنتی ہے۔

اس بات کی مزید حمایت کرنے کے لیے کہ Clec12a-/- جانوروں میں کولیٹوجینک مائیکرو بائیوٹا کی تشکیل کے لیے انکولی مدافعتی نظام قابل عمل ہے، ہم نے Rag-/- یا Rag-/- سے مل کے استعمال سے FMT انجام دیا۔ Clec12a-/- - جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ وہ جانور جن کو چیتھڑا ملا ہے-/-؛ Clec12a-/- FMT نے زیادہ وزن کم کیا اور ان جانوروں کے مقابلے میں نمایاں طور پر چھوٹی بڑی آنتیں تھیں جنہوں نے Rag-/- جانوروں سے FMT حاصل کیا تھا، مزید یہ کہ ساتھ رہنے والے جانوروں میں بھی بیماری بڑھ گئی (شکل 3D، E)۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ پیدائشی مدافعتی نظام کے اندر Clec12a کی کمی ایک مائکرو بائیوٹا کی تشکیل کے لیے کافی ہے جو کولائٹس کو بڑھا سکتی ہے۔

Clec12a Faecalibaculum rodentium کی توسیع کو دباتا ہے۔

ہم نے متعلقہ جانداروں کی شناخت کے لیے مختلف اینٹی بائیوٹکس کا ایک سلسلہ استعمال کیا جو Clec12a-/- جانوروں کے اندر بیماری پھیلاتے ہیں۔ سب سے پہلے، وسیع اسپیکٹرم اینٹی بائیوٹکس کے ایک طاقتور کاک ٹیل کے ساتھ علاج جس میں erythromycin، ampicillin، neomycin، اور gentamycin شامل ہیں، Clec12a-/- اور WT دونوں جانوروں میں بیماری کی شدت کو نمایاں طور پر کم کر دیتے ہیں، یہ تجویز کرتا ہے کہ مائکرو بائیوٹا کی بیکٹیریا کی آبادی بیماری کے لیے متعلقہ تھی ( شکل 4A؛ شکل S2)۔ اگلا، ہم نے مزید تنگ کیا کہ کون سے بیکٹیریا کی آبادی منفرد بیکٹیریا ٹیکسا کو نشانہ بنانے والی مختلف اینٹی بائیوٹکس کا استعمال کرکے بیماری کے لیے سب سے زیادہ متعلقہ تھی۔ خاص طور پر، ہم نے gentamycin، گرام منفی بیکٹیریا کو نشانہ بنانے والا ایک امینوگلیکوسائیڈ، اور سیفالوتھین، ایک سیفالوسپورن کا انتخاب کیا جو بنیادی طور پر گرام مثبت بیکٹیریا کو نشانہ بناتا ہے۔ یہ دوائیں DSS کولائٹس کے دوران Clec12a-/- جانوروں کو دی گئیں۔ اگرچہ جینٹامائسن کے ساتھ علاج سے بیماری کی شدت میں کوئی فرق نہیں پڑا، لیکن جن جانوروں نے سیفالوتھین حاصل کیا ان کے وزن کو برقرار رکھا گیا اور وہ فرضی طور پر علاج کیے جانے والے جانوروں (شکل 4B، C) کے مقابلے میں بڑی بڑی بڑی آنت کے حامل تھے، جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ Clec12a-/- مائکروبیوٹا پلے کے اندر رہنے والے گرام پازیٹو جاندار بیماری کی پیتھالوجی کو بڑھانے میں ایک اہم کردار۔

اس کے بعد ہم نے مائکرو بائیوٹا میں ساختی تبدیلیوں کو پروفائل کرنے کے لیے SPF WT اور Clec12a-/- feces کی 16S rRNA جین کی ترتیب کی۔ WT اور Clec12a-/- جانور بالترتیب نان فائیلوجنیٹک اور فائیلوجنیٹک کثرت وزن والے میٹرکس، بری-کرٹس اور ویٹڈ-یونی فریک دونوں کے ذریعہ نمایاں طور پر مختلف ہیں (شکل S3A-C)۔ الفا ڈائیورسٹی میٹرکس نے امیریت (مشاہدہ خصوصیات) میں کوئی خاص فرق ظاہر نہیں کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ Clec12a-/- زیادہ پرجاتیوں کو محفوظ نہیں رکھتا ہے (شکل 4D)۔ تاہم، Clec12a کی عدم موجودگی میں یکسانیت اور شینن تنوع کے اشاریوں میں اضافہ کیا گیا جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ Clec12a-/- چوہوں میں بیکٹیریا کی متناسب تقسیم کو تبدیل کر دیا گیا تھا (شکل 4E، F) اور مزید اس بات کی حمایت کرتے ہوئے کہ Clec12a گٹ کے اندر مائکرو بائیوٹا ڈھانچے کو منظم کرنے کے لیے اہم ہے۔

مائکرو بایوم (ANCOM) کی تشکیل کے تجزیہ سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ، ASVs (ایمپلیکن سیکوینس ویریئنٹس) کے درمیان فرق بہت زیادہ ہے، ایک ASV کو Faecalibaculum genus (Erysipelotrichaceae family) میں درجہ بندی کیا گیا ہے، جو WT کے مقابلے Clec12a-/- feces کے اندر نمایاں طور پر پھیلا ہوا تھا۔ 4 جی، ایچ)۔ ہمارے تجزیے سے ASV نمائندہ ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے BLAST نے Faecalibaculum rodentium بیکٹیریا کے سلسلے کی 100% شناخت کی نشاندہی کی۔ یہ اعداد و شمار اس بات کا ثبوت فراہم کرتے ہیں کہ Clec12a-/- جانور میں گرام پازیٹو بیکٹیریا کولیٹوجینک فینوٹائپ کے لیے ذمہ دار ہیں، اور خاص طور پر گرام پازیٹو جاندار F. rodentium کو بگڑتی ہوئی بیماری میں ملوث کرتے ہیں۔

اس کی بنیاد پر، ہم نے اس مفروضے کا تجربہ کیا کہ F. rodentium کولائٹس کو بڑھا سکتا ہے۔ ہم نے WT SPF جانوروں کو 1 x 108 CFU کے ساتھ یا تو زندہ یا فکسڈ F. rodentium کے ساتھ اورل gavage کے ذریعے علاج کیا اور DSS کے شدید ماڈل کے دوران F. rodentium colonization کی اعلی سطح کو یقینی بنانے کے لیے ہر روز علاج جاری رکھا۔ زندہ اور فکسڈ F. rodentium حاصل کرنے والے جانوروں نے زیادہ وزن کم کیا اور گاڑیوں سے علاج کیے جانے والے جانوروں کے مقابلے میں ان کی بڑی آنت نمایاں طور پر چھوٹی تھی (شکل 4I, J)، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ F. rodentium کی بڑھتی ہوئی سطح بیماری کو مزید خراب کر سکتی ہے۔

Clec12a phagocytosis کو بڑھاتے ہوئے میکروفیج کی سوزش کے ردعمل کو محدود کرتا ہے

بیماری کی عدم موجودگی میں Clec12a سیلولر اظہار کی وضاحت کرنے کے لیے، ہم نے ملٹی کلر فلو سائٹوومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے لیمنا پروپریا (LP) میں فطری اور انکولی مدافعتی خلیوں کی پروفائلنگ کی۔ پچھلی رپورٹوں سے ہم آہنگ، Clec12a بنیادی طور پر myeloid نسب تک محدود ہے جس میں لیمفوسائٹس (شکل 5A) پر کوئی اظہار نہیں ہوتا ہے (Han et al.، 2004؛ Pyz et al.، 2008؛ Sobanov et al.، 2001)۔ آنتوں کے نیوٹروفیلز، میکروفیجز، اور ڈینڈرٹک سیلز Clec12a اظہار (تصویر S4A) کی یکساں سطح کو ظاہر کرتے ہیں، جب کہ میکروفیجز میں Clec12a (شکل 5A) کا اظہار کرنے والے گٹ ٹشو کے اندر خلیات کی سب سے زیادہ فیصد ہوتی ہے۔ کلاسیکی ایکٹیویشن کے ذریعے سوزش کو فروغ دینے بلکہ ٹشو کو پہنچنے والے نقصان کے جواب میں ازالہ کرنے والے میکانزم کو شروع کرنے کے لیے میکروفیجز کے دوہری کردار کو دیکھتے ہوئے، ہم نے پوچھا کہ Clec12a کولائٹس کے دوران اس اختلاف کو کیسے متاثر کر سکتا ہے۔ جبکہ میکروفیجز کافی متنوع ہیں، انہیں بالترتیب CD38 اور EGR2 کے اظہار کے ذریعے M1 سوزش اور M2 ریپریٹیو میکروفیجز میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔ ہم دکھاتے ہیں Clec12a-/- جانوروں نے کولائٹس کے دوران کالونک ایل پی میں M1 میکروفیجز میں اضافہ کیا ہے اور M2 میکروفیجز کو کم کیا ہے (شکل 5 B, C, Fig. S4B)۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ Clec12a آنت میں میکروفیج ردعمل کو منظم کرتا ہے۔

یہ بہتر طور پر سمجھنے کے لیے کہ Clec12a کس طرح مائکروبیل لیگنڈز کے جواب میں میکروفیج بائیولوجی کو متاثر کرتا ہے، WT یا Clec12a-/- سے الگ تھلگ بون میرو سے ماخوذ میکروفیجز (BMDMs) کو مختلف قسم کے عام مائکروبیل لیگنڈز بشمول LPS، Pam3CysK، اور Flagellin کے ساتھ علاج کیا گیا۔ ان تمام نمونوں پر سائٹوکائن کا تجزیہ کیا گیا۔ ان حالات کے تحت جانچ کی گئی بہت سی سائٹوکائنز کی حوصلہ افزائی نہیں کی گئی، تاہم، MCP-1، IL-27، IFN-b، TNF-a، اور IL-6 کا ان ثقافتوں میں مستقل طور پر پتہ چلا ( شکل 5D)۔ Clec12a-/- BMDMs میں بہت سے مائکروبیل لیگینڈز کے جواب میں ان سائٹوکائنز کا نمایاں طور پر زیادہ اظہار تھا اور TLR2 agonist Pam3CysK کے جواب میں سب سے زیادہ امتیازی ردعمل دیکھا گیا تھا۔ یہ ڈیٹا جراثیم سے پاک سوزش کے دوران اشتعال انگیز ردعمل کو تیز کرنے میں Clec12a کے معروف کردار سے مطابقت رکھتا ہے (نیومن ایٹ ال۔، 2014)۔

cistanche پلانٹ میں مدافعتی نظام میں اضافہ

RNA-seq کو WT یا Clec12a-/- سے BMDMs پر F. rodentium کے ساتھ علاج کیا گیا تاکہ اس بات کا تعین کیا جا سکے کہ Clec12a اس مخصوص بیکٹیریل جاندار کے لیے ان خلیوں کے ردعمل کو کس طرح منظم کرتا ہے۔ ہم نے F. rodentium کے سامنے آنے والے Clec12a-/- BMDMs کا WT BMDMs سے گاڑیوں کے کنٹرول سے موازنہ کرکے تفریق جواب کا اندازہ کیا۔ امتیازی طور پر ظاہر کیے گئے جینوں کی افزودگی کے تجزیے سے معلوم ہوا کہ Clec12a کی کمی والے میکروفیجز میں سیل سائیکل کنٹرول میں شامل جینز میں نمایاں اضافہ ہوا جب F. rodentium (Figure S5A) کے ساتھ چیلنج کیا گیا۔ سیل سائیکل اندرونی طور پر phagocytosis کے ساتھ جڑا ہوا ہے اور phagocytosis اور اشتعال انگیز ردعمل (Figure 5E) (Luo et al.، 2005) سے وابستہ جینوں میں بھی نمایاں کمی واقع ہوئی ہے۔ Clec12a اور Salmonella پر ایک حالیہ مطالعہ سے مطابقت رکھتے ہوئے، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ phagocytosis Clec12a کی غیر موجودگی میں عام گٹ کے رہائشی F. rodentium (Begun et al.، 2015) کے جواب میں عیب دار ہے۔ اس کی جانچ کرنے کے لیے، پیریٹونیل میکروفیجز WT اور Clec12a-/- جانوروں سے اکٹھے کیے گئے اور Sybr®-سبز لیبل والے F. rodentium کے ساتھ مل کر کلچر کیے گئے۔ Clec12a-/- میکروفیجز میں فی سیل میں نمایاں طور پر کم جرثومے ہوتے ہیں (شکل 5F, G؛ Figure S5B)، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ Clec12a کی کمی کم جانداروں کی افزائش کا باعث بنتی ہے اور RNA-seq ڈیٹاسیٹ میں کم فگوسیٹوسس کے ساتھ مطابقت رکھتی ہے۔ اجتماعی طور پر، یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ Clec12a میکروفیج بیکٹیریل اپٹیک کو فروغ دیتے ہوئے عام مائکروبیل لیگنڈس کے لیے ظاہری اشتعال انگیز ردعمل کو کم کرنے کا دوہرا کردار ادا کرتا ہے۔

Clec12a ترجیحی طور پر گرام مثبت کامنسلز سے منسلک ہوتا ہے۔

چونکہ phagocytosis کا آغاز جرثوموں کے بائنڈنگ سے ہوتا ہے جس کے بعد انٹرنلائزیشن اور قتل ہوتا ہے، ہم نے قیاس کیا کہ Clec12a مائیکرو بائیوٹا کے مخصوص ممبران جیسا کہ F. rodentium سے منسلک ہونے کے قابل تھا۔ اس امکان کو حل کرنے کے لیے، ایک فیوژن پروٹین جس میں مورین Clec12a کے ایکسٹرا سیلولر بائنڈنگ ڈومین اور انسانی IgG1 (Clec12a-Fc) کا Fc حصہ بنایا گیا تھا (شکل 6A) (میگلیناو ایٹ ال۔، 2014؛ نیومن ایٹ ال۔، 2014؛ راول وغیرہ، 2019)۔ پروٹین کو مختلف گرام پازیٹو اور گرام منفی بیکٹیریا کے پینل سے منسلک کرنے کے لیے صاف کیا گیا تھا جو کہ ہومیوسٹیٹک گٹ کے اندر موجود ہونے کے لیے جانا جاتا ہے، بشمول F. rodentium، Roseburia spp.، Bifidobacteria animalis، Akkermansia muciniphila، Bacteriodes uniformis، اور فنگل کامنسل Candida albicans، بہاؤ cytometry کے ذریعے۔ سالمونیلا انٹریکا کو بھی شامل کیا گیا تھا کیونکہ پچھلے مطالعات نے اشارہ کیا تھا کہ Clec12a سیل میں S. enterica کے داخلے کے ساتھ منسلک ہوسکتا ہے (Begun et al., 2015)۔ Clec12a متعدد فائیلوجنیٹک طور پر الگ بیکٹیریا کے ساتھ مختلف ڈگریوں کا پابند ہے، بشمول F. rodentium، لیکن کوکی نہیں، C. albicans (شکل 6B)۔ Clec12a گرام پازیٹیو جانداروں F. rodentium اور Lachnospiraceae خاندان Roseburia sp. کے ساتھ سب سے زیادہ جڑا ہوا ہے، اور B. animalis، B. uniformis، اور S. enterica (شکل 6B) کے ساتھ سب سے کم بات چیت کرتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ Clec12a کر سکتے ہیں۔ گرام پازیٹو جانداروں کی ترجیح کے ساتھ مائکرو بائیوٹا کے مخصوص ممبران سے منسلک ہوں۔ ہمارے اعداد و شمار کو ایک ساتھ لے کر Clec12a کو مدافعتی نظام کے ذریعہ گٹ مائکروبیل کمیونٹی کا سروے کرنے اور مائکرو بائیوٹا کو براہ راست بائنڈنگ اور فگوسائٹوسس کے ذریعے کاٹنے کے طریقہ کار کے طور پر شناخت کرتا ہے جبکہ وافر گرام پازیٹو جرثوموں کے لئے واضح اشتعال انگیز ردعمل کو روکتا ہے جو آنتوں کی صحت کو برقرار رکھنے کے لئے اہم ہے۔

بحث

آنت کے اندر ہومیوسٹاسس کو نقصان دہ سوزش شروع کیے بغیر کامنسل جرثوموں کو محدود کرنے کے طریقہ کار کی ضرورت ہوتی ہے (Macpherson et al.، 2000)۔ IgA، حالیہ برسوں میں، ان اہم طریقوں میں سے ایک کے طور پر ابھرا ہے جس میں گٹ استثنیٰ مائیکرو بائیوٹا (Pabst and Slack، 2020) پر قابو پا سکتا ہے۔ درحقیقت، IgA جرثوموں اور/یا ان کی مصنوعات کو براہ راست باندھنے اور پروٹو ٹائپیکل سوزش کے شامل کیے بغیر انہیں آنتوں سے ختم کرنے کے قابل ہے۔ ان دوہری خصوصیات کے حامل دیگر مدافعتی مالیکیولز کا آج تک مطالعہ نہیں کیا گیا ہے۔ سی قسم کے لیکٹینز پروٹین کی ایک متنوع کلاس پر مشتمل ہوتے ہیں جو مائکروبیل اور میزبان مصنوعات سے مختلف قسم کے پروٹین، کاربوہائیڈریٹ اور لپڈ مالیکیولز کو پہچان سکتے ہیں (براؤن ایٹ ال۔، 2018؛ ڈروئن ایٹ ال۔، 2020)۔ تاہم، گٹ کے استثنیٰ اور مائیکرو بائیوٹا کے تناظر میں چند لوگوں کا مطالعہ کیا گیا ہے (Iliev et al.، 2012؛ Martinez-Lopez et al.، 2019)۔ اس طرح، ہمارے علم کے مطابق، یہ پہلا مظاہرہ ہے کہ Clec12a کی کمی مائکرو بائیوٹا کی ساخت کو تبدیل کرتی ہے جو بیماری کی شدت کو بڑھاتی ہے۔

cistanche فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط

Clec12a کا زیادہ تر مطالعہ مونوسوڈیم یوریٹ (MSU) یا یورک ایسڈ کی پہچان کے تناظر میں کیا گیا ہے، جو اکثر سیلولر موت کا اشارہ ہوتا ہے (کونو ایٹ ال۔، 2010؛ نیومن ایٹ ال۔، 2014)۔ یورک ایسڈ NLRP3 سوزش کے ذریعے اشتعال انگیز ردعمل کو چالو کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے، اس طرح، سیلولر موت کے دوران ٹشو کی تباہی کو روکنے کے لیے، اس سوزش کو کنٹرول کرنا ضروری ہے (مارٹینن ایٹ ال۔، 2006)۔ Clec12a کو سائک سگنلنگ (مارشل ایٹ ال۔ اس سے مطابقت رکھتے ہوئے، جراثیم سے پاک سوزش کے ماڈل میں Clec12a کو حذف کرنا اور گٹھیا کے خود بخود سوزش والے ماڈل نیوٹروفیل ایکٹیویشن میں اضافہ اور بیماری کو مزید خراب کرنے کا سبب بنتا ہے، جس سے Clec12a ایک اہم سوزشی بریک بنتا ہے (Redelinghuys et al.، 2016)۔ تاہم، حال ہی میں Clec12a کو وائرل انفیکشن کے جواب میں ٹائپ 1 انٹرفیرون سگنلنگ کو بڑھانے اور اینٹی بیکٹیریل آٹوفجی پاتھ وے (بیگن ایٹ ال۔، 2015؛ لی ایٹ ال۔، 2019) کے ذریعے سالمونیلا کے استعمال میں ثالثی کرنے کے لیے بھی دکھایا گیا تھا۔ یہ ظاہر کرتا ہے کہ Clec12a صرف سوزش کو محدود کرنے کے لیے کام نہیں کرتا، بلکہ سیاق و سباق کے لحاظ سے مختلف کردار ادا کر سکتا ہے۔ آنت اس لحاظ سے مختلف ہے کہ بیماری کی عدم موجودگی میں بھی بڑی تعداد میں مدافعتی خلیات موجود ہیں۔ یہ مائیکرو بائیوٹا کی موجودگی کی وجہ سے ہے، جو مدافعتی نشوونما کو ہدایت دینے اور روگجنک جانداروں کی نوآبادیات کو روکنے میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ مائکروبیوٹا میں سطح کے وہی نمونے ہوتے ہیں جو TLRs کے ذریعے پائے جاتے ہیں جو پیتھوجینز کو بھی پہچانتے ہیں، اور اس لیے آنتوں کے مدافعتی نظام میں ان غیر ملکی جانداروں کی سوزش کو روکنے کے لیے سخت ریگولیٹری میکانزم ہونا چاہیے (Blander et al.، 2017)۔

ہمیں اصل میں Clec12a میں دلچسپی ہوئی کیونکہ ہم نے شناخت کیا کہ گٹ فنگس، Saccharomyces cerevisiae یورک ایسڈ کو کولائٹس کو خراب کرنے پر اکساتا ہے (Chiaro et al.، 2017)۔ مزید برآں، دیگر مطالعات نے اس بات کی نشاندہی کی ہے کہ مائیکرو بائیوٹا پیورین میٹابولزم کی شمولیت کے ذریعے آنتوں کی بیماری کو متاثر کر سکتا ہے، جس میں سے ممالیہ جانوروں میں آخری پیداوار یورک ایسڈ ہے (Zhu et al.، 2019)۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ یورک ایسڈ کو محسوس کرنے کا طریقہ کار، جیسے Clec12a، آنتوں کے ہومیوسٹاسس کو متاثر کر سکتا ہے۔ تاہم، ہم نے سیرم یا پاخانہ میں یورک ایسڈ کی سطح میں کوئی تبدیلی نہیں دیکھی، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ Clec12a-/- جانور میں بیماری کی شدت میں اضافہ یورک ایسڈ کی وجہ سے نہیں ہوا تھا۔ تاہم، Clec12a-/- میں کولائٹس کی بڑھتی ہوئی شدت مائیکرو بائیوٹا کی ساخت سے ہوتی ہے۔ اس طرح، ہمارے ڈیٹا کی بنیاد پر Clec12a-/- کا کم اظہار IBD مریضوں میں مائکرو بائیوٹا کی ساخت کو متاثر کر سکتا ہے (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے پایا کہ گرام پازیٹو جانداروں کو نشانہ بنانے والی اینٹی بائیوٹکس Clec12a-/- جانوروں میں کولائٹس کی شدت کو کم کرنے کے قابل تھیں۔ یہ متعدد رپورٹس کے برعکس ہے جنہوں نے آنتوں کی سوزش کے دوران توسیع شدہ گرام-منفی Enterobacteriaceae کی نشاندہی کی ہے، اس طرح، یہ ان چند مطالعات میں سے ایک ہے جس میں گرام پازیٹو جانداروں میں توسیع کی نشاندہی کی گئی ہے جو کولائٹس کی نشوونما سے وابستہ ہیں۔ اگرچہ، ممکنہ طور پر اس ماڈل میں کولائٹس کی شدت کو متاثر کرنے والا واحد جاندار نہیں، Clec12a-/- جانوروں میں F. rodentium کی ڈرامائی توسیع دیکھی گئی۔ F. rodentium Firmicutes (Bacillota) phyla (Chang et al., 2015) کا ایک گرام پازیٹو، آکسیڈیز، اور catalase-negative رکن ہے۔ WT چوہوں میں روزانہ F. rodentium کا تعارف کولائٹس کو بڑھاتا ہے، اس بات کی حمایت کرتا ہے کہ گٹ کے اندر F. rodentium کی بڑھتی ہوئی سطح نقصان دہ ہے اور Clec12a-/- میں کولائٹس کی شدت کو بڑھا سکتی ہے۔ ایک حالیہ رپورٹ نے یہ ظاہر کیا ہے کہ F. rodentium اپیتھیلیل ٹرن اوور کو بڑھا سکتا ہے اور اپیتھیلیا کے اندر انزائمز کے اظہار کو دبا سکتا ہے جو سوزش کے ردعمل کو کم کرتے ہیں اور اس طرح اس بگڑتی ہوئی بیماری کے مطابق ہے جب ہم دیکھتے ہیں کہ F. rodentium کو گٹ میں پھیلایا جاتا ہے (Cao et al. 2022)۔ چونکہ انسانوں کو F. rodentium (Zagato et al., 2020) جیسے جاندار کے ساتھ نوآبادیاتی بنایا گیا ہے، مزید مطالعات کو کولائٹس سے متعلق انسانی فزیالوجی کے پہلوؤں پر ان F. rodentium جیسے بیکٹیریا کے اثر کو واضح کرنا چاہیے۔

پیدائشی مدافعتی خلیوں کے درمیان Clec12a کے لیے ایک کردار کی حمایت کرتے ہوئے، ہم نے مشاہدہ کیا کہ کولیٹوجینک مائکرو بائیوٹا اب بھی Clec12a-/- جانوروں میں بنتا ہے جن میں مدافعتی نظام کی کمی ہوتی ہے۔ گٹ کے اندر خلیات کی سب سے زیادہ فیصد جو Clec12a کا اظہار کرتی ہے وہ میکروفیجز تھے جس کی وجہ سے ہم ان خلیوں میں Clec12a فنکشن پر توجہ مرکوز کرتے ہیں۔ پچھلے مطالعات نے یہ ثابت کیا ہے کہ Clec12a وائرل انفیکشن (Li et al.، 2019) کے جواب میں قسم I انٹرفیرون کی پیداوار کا ایک اہم ثالث ہے۔ تاہم، کس طرح Clec12a بیکٹیریل لیگنڈس کے وسیع میدان عمل پر ردعمل کو متاثر کرتا ہے اس کا اندازہ نہیں لگایا گیا ہے۔ یہ آنت میں انتہائی متعلقہ ہے جہاں TLR ligands کی کثرت موجود ہے۔ یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ Clec12a گٹ میں میکروفیج کے رد عمل کو غصہ کرنے کا کام کرتا ہے اور مائیکرو بائیوٹا کے جواب میں ہومیوسٹاسس کو یقینی بنانے کے لیے ممکنہ کام کرتا ہے۔ F. rodentium کے ساتھ incubated macrophages کے RNA-seq نے روشنی ڈالی کہ Clec12a کی کمی ان کامنسل بیکٹیریا کے جواب میں سیل سائیکل اور phagocytosis کی خرابیوں کا باعث بنتی ہے۔ ایک حالیہ مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ Clec12a-/- macrophages نے سالمونیلا (Begun et al.، 2015) کے جواب میں آٹوفیجی کو کم کر دیا تھا۔ ہمارا ڈیٹا ان نتائج کی تعریف کرتا ہے اور اس میں توسیع کرتا ہے کہ Clec12a غیر حملہ آور کامنسل جانداروں کو کنٹرول کرنے کے لیے بھی کام کرتا ہے۔ F. rodentium کو دوسروں نے اپکلا حیاتیات پر اثر انداز ہونے کے لیے دکھایا ہے، جس سے پتہ چلتا ہے کہ F. rodentium میزبان کے قریب ہوتا ہے اور اس لیے اسے مدافعتی نظام کے ذریعے سختی سے کنٹرول کیا جانا چاہیے۔ ہمارا ڈیٹا اس بات کی تائید کرتا ہے کہ Clec12a F. rodentium کو phagocytosis کے ریگولیشن کے ذریعے کنٹرول کرتا ہے۔ Phagocytosis ایک ligand یا microbe کے جسمانی پابند ہونے سے شروع ہوتا ہے، اور C-type lectins ایک سے زیادہ ligands کے ساتھ منسلک ہو سکتے ہیں، جس کی وجہ سے ہمیں یہ جانچنا پڑتا ہے کہ آیا Clec12a گٹ میں رہنے والے بیکٹیریا کے ساتھ براہ راست منسلک ہو سکتا ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ Clec12a سب سے زیادہ گرام مثبت جانداروں F. rodentium اور Roseburia سے منسلک ہے اور اس سے بہت کم گرام-negative organisms A. muciniphila اور B. uniformis سے اور بالکل بھی C. albicans سے نہیں۔ اس اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ Clec12a میں مائکرو بائیوٹا کے مخصوص ممبروں کو پابند کرنے کا رجحان ہے۔ یہ ہمیں ایک ایسا ماڈل بنانے کی اجازت دیتا ہے جس میں Clec12a کی مشغولیت اور اس کے نتیجے میں ہونے والے phagocytosis مائیکرو بائیوٹا کے بعض ارکان کو کنٹرول کر سکیں اور ان کی توسیع کے ممکنہ طور پر نقصان دہ اثرات کو روک سکیں۔ یہ Clec12a کے دوہری فنکشن کو نمایاں کرتا ہے جو مائکروبیل لیگینڈز کے خلاف سوزش کو روک سکتا ہے جبکہ مائکرو بائیوٹا کے مخصوص ارکان کو پہچاننے اور کنٹرول کرنے کے ساتھ۔ اس طرح، Clec12a ایک منفرد طریقہ کی نمائندگی کرتا ہے جس کا پیدائشی مدافعتی نظام معدے کے اندر ہومیوسٹاسس کو یقینی بنانے کے لیے استعمال کرتا ہے۔

فگر لیجنڈز

شکل 1. Clec12a انکولی مدافعتی نظام سے آزاد آنتوں کی بیماری کو روکتا ہے

(A) کولائٹس کی شدت کا اندازہ لگانے کے لیے WT یا Clec12a-/- C57BL/6 مخصوص پیتھوجین فری (SPF) چوہوں کا علاج 2.5% ڈیکسٹران سوڈیم سلفیٹ (DSS) ایڈ لیبٹم کے ساتھ 7 دن تک پینے کے پانی میں کیا گیا۔ فی صد وزن میں کمی کا روزانہ جائزہ لیا گیا۔ مطلب +/- SEM، دو طرفہ ANOVA اور Śídák کے متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے تین آزاد تجربوں سے ڈیٹا جمع کیا جاتا ہے۔

(B) قربانی کے وقت اشارہ شدہ جانوروں کی بڑی آنت کی لمبائی (سینٹی میٹر) کی پیمائش کی گئی۔ ایک سکیٹر پلاٹ کا مطلب ہے +/- SEM، ڈیٹا کو تین آزاد تجربوں سے جمع کیا جاتا ہے جو بغیر جوڑ والے t-ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہیں۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

(C) اشارے شدہ جانوروں کے Fecal Lipocalin-2 (ng/mL) کو سوزش کے ریڈ آؤٹ کے طور پر ماپا گیا۔ بار گراف کا اوسط +/- SEM ہے، ڈیٹا کو دو آزاد تجربوں سے جمع کیا جاتا ہے جو ایک غیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ استعمال کرتے ہیں۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

(D) نمائندہ ایچ اینڈ ای نے ڈی ایس ایس سے متاثرہ کولائٹس کے بعد اشارے شدہ جانوروں سے بڑی آنت کے حصے داغے۔

(E) اشارے شدہ جانوروں کے لئے ہسٹولوجی کے اسکور بڑی آنت کے حصوں سے تیار کیے گئے تھے۔

(ڈی)۔ بار گراف کا اوسط +/- SEM ہے، اس کے مقابلے میں ایک غیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ کے استعمال سے۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

(F) کولائٹس کے ٹی سیل ٹرانسفر ماڈل کو دائمی کولائٹس کا اندازہ کرنے کے لئے انجام دیا گیا تھا۔ TCRb-/- اور Clec12a-/-؛ TCRb-/- جانوروں کا وزن ہفتہ وار ناپا جاتا تھا۔ گراف پورے تجربے میں اشارہ کردہ جانوروں کے وزن میں کمی کو ظاہر کرتا ہے۔ اوسط +/- SEM، 2-طریقہ ANOVA کے مقابلے میں۔

(G) قربانی کے وقت (I) سے اشارہ کردہ جانوروں کی کالونی کی لمبائی کی پیمائش کی گئی۔ بار گراف کا اوسط +/- SEM ہے، اس کے مقابلے میں ایک غیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ کے استعمال سے۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

(H) WT، Clec12a-/-، Rag-/- یا Rag-/-؛ Clec12a-/- C57BL/6 SPF چوہوں کا شدید کولائٹس کے لیے جائزہ لیا گیا۔ اشارے شدہ جانوروں کو 7 دنوں کے لیے 2.5% DSS ایڈ لیبٹم فراہم کیا گیا تھا۔ فی صد وزن میں کمی کا روزانہ جائزہ لیا گیا۔ اوسط +/- SEM، ڈیٹا دو آزاد تجربوں کا نمائندہ ہے۔ دو طرفہ ANOVA اور Śídák کا متعدد موازنہ ٹیسٹ۔

(I) قربانی کے وقت اشارہ کردہ جانوروں کی بڑی آنت کی لمبائی (سینٹی میٹر) کی پیمائش کی گئی۔ بار گراف کا اوسط +/- SEM ہے، ڈیٹا غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے دو آزاد تجربوں کا نمائندہ ہے۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے * p < 0۔{5}}5; ** p < 0۔{9}}1; *** p < 0.001; **** p <0.0001

شکل 2. Clec12a-/- جانوروں میں بننے والا مائیکرو بائیوٹا بگڑ جانے والی کولائٹس کا باعث بنتا ہے۔

A) فیکل مائکرو بائیوٹا ٹرانسپلانٹس (FMT) WT یا Clec12a جانوروں سے جراثیم سے پاک WT چوہوں میں فیکل سپرنٹنٹس کو منتقل کرکے انجام دیا گیا تھا۔ مائیکرو بایوٹاس کو چار ہفتوں کے لیے ہم آہنگ کرنے کی اجازت دی گئی، جس کے بعد، آدھے WTFMT چوہوں اور آدھے Clec12a-/-FMT چوہوں کو ایک ساتھ رکھا گیا اور مزید چار ہفتوں کے لیے اختلاط کی اجازت دی گئی۔ اس کے بعد تمام گروپوں کو اپنے پینے کے پانی میں 2.5% DSS ایڈ لیبٹم ملا اور ساتویں دن قربانی دی گئی۔

ب) اشارہ شدہ جانوروں کے وزن میں کمی کا روزانہ اندازہ کیا جاتا تھا۔ گراف کا مطلب دکھایا گیا ہے +/- SEM، ڈیٹا کو دو طرفہ ANOVA اور Śídák کے متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے دو آزاد تجربوں سے جمع کیا گیا ہے۔

ج) قربانی کے وقت اشارہ شدہ جانوروں سے بڑی آنت کی لمبائی (سینٹی میٹر) کی پیمائش کی گئی۔ ایک سکیٹر پلاٹ اوسط +/- SEM ہے، ڈنیٹ متعدد موازنہ ٹیسٹ کے ساتھ عام ون وے انووا کے استعمال کے مقابلے۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

D) نمائندہ ایچ اینڈ ای نے ایف ایم ٹی اور ڈی ایس ایس سے متاثرہ کولائٹس کے بعد اشارے شدہ جانوروں کے بڑی آنت کے حصے کو داغ دیا۔

E) ہسٹولوجی اسکور (D) میں بڑی آنت کے حصوں سے تیار کیے گئے تھے۔ بار گراف کا اوسط +/- SEM ہے، اس کے مقابلے میں ایک غیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ کے استعمال سے۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

F) WTFMT، Clec12a-/- FMT، یا ساتھ رہنے والے جانوروں کی 16S rRNA جین کی ترتیب سے ویٹڈ یونیفریک فاصلے۔ باکس اور وِسکر پلاٹ جو تمام پوائنٹس دکھاتے ہیں (جوڑے کے لحاظ سے فاصلے کا موازنہ) اور کرسکل والس ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے موازنہ کرتے ہیں۔

G) WTFMT، Clec12a-/- FMT، یا ساتھ رہنے والے جانوروں کی 16S rRNA جین کی ترتیب سے غیر وزنی یونیفریک فاصلے۔ باکس اور وِسکر پلاٹ جو تمام پوائنٹس دکھاتے ہیں (جوڑے کے لحاظ سے فاصلے کا موازنہ) اور کرسکل والس ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے موازنہ کرتے ہیں۔

H) Bray-Curtis WTFMT، Clec12a-/- FMT، یا ساتھ رہنے والے جانوروں کی 16S rRNA جین کی ترتیب سے دوری۔ باکس اور وِسکر پلاٹ جو تمام پوائنٹس دکھاتے ہیں (جوڑے کے لحاظ سے فاصلے کا موازنہ) اور کرسکل والس ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے موازنہ کرتے ہیں۔

شکل 3: Clec12a-/- جانوروں میں بننے والی مائیکرو بائیوٹا ساخت انکولی قوت مدافعت سے آزاد ہے۔

A) اسکیمیٹک خاکہ جس میں بعد کے FMT کے ساتھ بون میرو کی تشکیل نو دکھایا گیا ہے۔ C57Bl/6 WT چوہوں کو مہلک طور پر شعاع کیا گیا تھا اور WT یا Clec12a-/- بون میرو کے ساتھ دوبارہ تشکیل دیا گیا تھا۔ 8 ہفتوں کے بعد، ان چوہوں سے فضلہ لیا گیا اور WT جراثیم سے پاک چوہوں میں منتقل کیا گیا جیسا کہ (A) میں بیان کیا گیا ہے۔ اصل میں دوبارہ تشکیل پانے والے چائمرک جانوروں کو پھر ان کے پینے کے پانی میں 2.5% DSS ایڈ لیبٹم فراہم کیا گیا۔

B) (F) سے FMT چوہوں کے فی صد وزن میں کمی کا روزانہ اندازہ کیا گیا۔ مطلب +/- SEM، دو طرفہ ANOVA اور Tukey متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے۔

ج) قربانی کے وقت اشارہ شدہ جانوروں سے بڑی آنت کی لمبائی (سینٹی میٹر) کی پیمائش کی گئی۔ ایک سکیٹر پلاٹ اوسط +/- SEM ہے، بغیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

D) مائکروبیل کی تشکیل اور کولائٹس کی شدت پر انکولی مدافعتی نظام کے کردار کا جائزہ لینے کے لیے FMTs کو Rag-/- یا Rag-/- سے فیکل سپرنٹینٹس کی منتقلی کے ذریعے انجام دیا گیا تھا۔ Clec12a-/- SPF جانوروں کو WT جراثیم سے پاک چوہوں میں جیسا کہ (A) میں بیان کیا گیا ہے۔ چوہوں کا 7 دن تک 2.5٪ DSS کے ساتھ علاج کیا گیا۔ فی صد وزن میں کمی کا روزانہ جائزہ لیا گیا۔ گراف کا اوسط +/- SEM ہے، دو طرفہ ANOVA اور Tukey متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے۔

ای) قربانی کے وقت (F) میں اشارہ کردہ جانوروں سے بڑی آنت کی لمبائی (سینٹی میٹر) کی پیمائش کی گئی۔ اوسط +/-، عام ایک طرفہ ANOVA اور Dunnet متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے SEM کا موازنہ۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔ * p < 0۔{5}}5; ** p < 0۔{9}}1; *** p < 0.001; **** p <0.0001

شکل 4. Clec12a Faecalibaculum rodents کے پھیلاؤ کو محدود کرتا ہے، ایک جرثومہ جو کولائٹس کو خراب کرتا ہے۔

A) WT یا Clec12a-/- C57BL/6 SPF چوہوں کو ایک اینٹی بائیوٹک کاک ٹیل (A) (neomycin، gentamycin، ampicillin، erythromycin)، cephalothin، یا gentamycin (B, C) 0 کے ارتکاز پر دیا گیا تھا۔ چودہ دنوں کے لیے 5 گرام/L۔ سات دن کے بعد قربانی تک جانوروں کو پینے کے پانی میں 2.5% DSS دیا گیا۔ قربانی کے وقت اشارہ شدہ جانوروں سے بڑی آنت کی لمبائی (سینٹی میٹر) کی پیمائش کی گئی۔ ایک سکیٹر پلاٹ اوسط +/- SEM ہے، بغیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

ب) اشارہ شدہ جانوروں کے وزن میں کمی کا روزانہ اندازہ کیا جاتا تھا۔ گراف کا اوسط +/- SEM ہے، دو طرفہ ANOVA اور Tukey متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے

ج) قربانی کے وقت ناپنے والے اشارے شدہ جانوروں کی بڑی آنت کی لمبائی (سینٹی میٹر)۔ ایک سکیٹر پلاٹ اوسط +/- SEM ہے، بغیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

D) WT یا Clec12a-/- feces، 16S rRNA ترتیب الفا تنوع سے مشاہدہ کردہ خصوصیات۔ مین +/- SEM، مان-وائٹنی ٹیسٹ کے استعمال کے مقابلے۔

E) WT یا Clec12a-/- feces سے Pielou Evenness، 16S rRNA ترتیب الفا تنوع۔ مین +/- SEM، مان-وائٹنی ٹیسٹ کے استعمال کے مقابلے۔

F) Mann-Whitney ٹیسٹ کے استعمال کے مقابلے میں شینن اینٹروپی کا مطلب +/- SEM۔

G) WT اور Clec12a-/- feces سے ANCOM تجزیہ۔ جینوم ٹیکسونومی ڈیٹا بیس (GTDB) کا استعمال کرتے ہوئے ٹیکسونومک نام ASVs کی بہترین درجہ بندی ہیں۔

H) Faecalibaculum rodentium ASVs کی نسبتا کثرت۔ Mann Whitney * p < {{0}} کے استعمال کے مقابلے۔{4}}5; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p <0.0001

I) C57Bl/6 WT SPF چوہوں کا F. rodentium کے 1x108 CFU کے ساتھ تین دن تک زبانی گیویج کے ذریعے پہلے سے علاج کیا گیا۔ پھر جانوروں نے 7 دن تک اپنے پینے کے پانی میں 2.5% DSS حاصل کیا جبکہ F. rodentium روزانہ حاصل کرنا جاری رکھا۔ فی صد وزن میں کمی کا روزانہ جائزہ لیا گیا۔ اوسط +/- SEM، ڈیٹا کو دو طرفہ ANOVA اور Tukey ایک سے زیادہ موازنہ ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے چار الگ الگ تجربات سے جمع کیا گیا ہے۔

J) قربانی کے وقت اشارہ کردہ جانوروں کی بڑی آنت کی لمبائی (سینٹی میٹر) کی پیمائش کی گئی۔ بار گراف کا اوسط +/- SEM ہے، ڈنیٹ متعدد اصلاحی ٹیسٹ کے ساتھ عام ون وے انووا کے استعمال کے مقابلے میں ڈیٹا کو چار الگ الگ تجربات سے جمع کیا گیا ہے۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔ * p < 0۔{5}}5; ** p < 0۔{9}}1; *** p < 0.001; **** p <0.0001

شکل 5. Clec12a سوزش کو محدود کرتا ہے اور میکروفیجز میں phagocytosis کو فروغ دیتا ہے۔

A) امیونو فینوٹائپنگ WT اور Clec12a-/- جانوروں پر کالونک لیمنا پروپریا (cLP) سے الگ تھلگ خلیوں پر فلو سائٹوومیٹری کے ذریعے انجام دی گئی تھی۔ ہیٹ میپ پیدائشی اور انکولی مدافعتی خلیوں پر Clec12a اظہار کی تعدد کو ظاہر کرتا ہے۔

B) بار گراف اشارہ کردہ جانوروں کے cLP سے پری گیٹ، CD38+ سیلز (M1 میکروفیجز) کی فریکوئنسی دکھاتا ہے۔ اوسط +/- SEM، جوڑا نہ بنائے ہوئے t-ٹیسٹ کے استعمال کے مقابلے میں۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

C) بار گراف اشارہ کردہ جانوروں کے cLP سے پری گیٹ، EGR2+ سیلز (M2 macrophages) کی فریکوئنسی دکھاتا ہے۔ اوسط +/- SEM، جوڑا نہ بنائے ہوئے t-ٹیسٹ کے استعمال کے مقابلے میں۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

D) BMDMs کو WT اور Clec12a-/- لمبی ہڈیوں سے کاٹا گیا تھا اور M-CSF (20ng/mL) کی موجودگی میں 7 دن کے لئے کلچر کیا گیا تھا۔ 8ویں دن BMDMs کو LPS (100ng/mL)، MDP (10mg/mL)، Pam3cysk (1mg/mL)، یا Flagellin (1mg/mL) کے ساتھ 24 گھنٹے تک پلس کیا گیا۔ سائٹوکائن کی تیاری کے لیے میڈیا کو اکٹھا کیا گیا اور اس کی جانچ کی گئی۔ گرمی کا نقشہ WT پر Clec12a-/- سے اشارہ شدہ سائٹوکائنز کی لاگ 2 فولڈ تبدیلی کو ظاہر کرتا ہے۔

E) WT اور Clec12a-/- چوہوں کے BMDMs کو الگ تھلگ اور کلچر کیا گیا جیسا کہ (A) میں ہے اور پھر F. rodentium کے ساتھ 10 کے MOI پر 24 گھنٹے کے لیے کلچر کیا گیا۔ BMDMs کو دھونے کے بعد، RNA کو اکٹھا کیا گیا اور RNA کی ترتیب کے لیے تیار کیا گیا۔ اوپر 10 آسان GO ٹرم (حیاتیاتی عمل) زمرے جو Clec12a-/- کے درمیان افزودہ ہیں

F) Peritoneal macrophages کو WT اور Clec12a-/- چوہوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا اور پھر phagocytosis کا اندازہ لگانے کے لیے Sybr کے سبز رنگ کے F. rodentium کے ساتھ cocultured کیا گیا تھا۔ بائیں: ڈبلیو ٹی میکروفیجز۔ دائیں: Clec12a-/- میکروفیجز۔ برائٹ فیلڈ (بائیں کالم)، فلوروسینس (درمیانی کالم)، اور ضم شدہ (دائیں کالم) کی نمائندہ تصاویر کو دکھایا گیا ہے۔ پیلے تیر کے نشانات F. rodentium خلیات کی مثالوں کو ظاہر کرتے ہیں جو میکروفیجز میں گھرے ہوئے ہیں۔ اسکیل بار=20 µm۔ تصاویر دو الگ الگ تجربات کی نمائندہ ہیں۔

جی) بار گراف فی خلیہ حیاتیات کو دکھاتا ہے، جیسا کہ (F) میں دیکھا گیا ہے۔ 250 WT خلیات اور 269 Clec12a-/- خلیات کو F. rodentium فی سیل کی مقدار کا تعین کرنے کے لیے شمار کیا گیا۔

شکل 6: Clec12a براہ راست مائیکرو بائیوٹا کے مخصوص اراکین سے منسلک ہوتا ہے۔

A) اسکیمیٹک ڈایاگرام جس میں Clec12a-human IgG1-Fc فیوژن پروٹین یا خالی ویکٹر (صرف Fc حصہ) دکھایا گیا ہے B) Clec12a-Fc کے مختلف بیکٹیریا یا C. albicans کے امتیازی بائنڈنگ کی نمائندگی کرنے والے بہاؤ سائٹومیٹرک تجزیہ کے ہسٹوگرام۔

سپلیمینٹل فگر لیجنڈز

ضمنی شکل 1۔ Clec12a کی عدم موجودگی یورک ایسڈ کی سطح کو متاثر نہیں کرتی ہے۔

A) اشارہ شدہ جانوروں کے سیرم یورک ایسڈ (µM) کی پیمائش WT اور Clec12a-/- C57Bl/6 چوہوں کے درمیان پیورین میٹابولزم کا جائزہ لینے کے لیے کی گئی۔ سکیٹر پلاٹ کا اوسط +/- SEM ہے، ڈیٹا کو تین آزاد تجربوں سے جوڑا بنا ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے جمع کیا جاتا ہے۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

B) WT اور Clec12a-/- C57Bl/6 چوہوں کے درمیان یورک ایسڈ کے گٹ کے اخراج کا اندازہ کرنے کے لیے اشارہ شدہ جانوروں کے فیکل یورک ایسڈ (µM) کی پیمائش کی گئی۔ سکیٹر پلاٹ کا اوسط +/- SEM ہے، ڈیٹا کو تین آزاد تجربوں سے جوڑا بنا ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے جمع کیا جاتا ہے۔ ہر نقطہ ایک ماؤس کی نمائندگی کرتا ہے۔

ضمنی شکل 2. WT اور Clec12a-/- مائیکرو بایوٹاس فرق کی بیماری کو چلاتے ہیں

WT اور Clec12a-/- جانوروں کے وزن میں فیصد کمی جس کا علاج ایک اینٹی بائیوٹک کاک ٹیل کے ساتھ کیا جاتا ہے جس میں نیومائسن، جینٹامائسن، امپیسلن، اور اریتھرومائسن شامل ہوتے ہیں۔

ضمنی شکل 3۔ مائیکرو بائیوٹا کی ساخت Clec12a سے متاثر ہے۔

A) Bray-Curtis کے فاصلوں پر مبنی پہلے 3 محوروں کے PCoA پلاٹ جو مجموعی طور پر مائیکرو بائیوٹا تعلقات کو ظاہر کرتے ہیں اور متعلقہ باکس اور وِسکر پلاٹ ہر گروپ کے اندر تفاوت کی مقدار ظاہر کرتے ہیں اور مان-وٹنی ٹیسٹ کے ساتھ موازنہ کرتے ہیں۔

B) پی سی او اے پلاٹ وزنی یونیفریک فاصلوں پر مبنی اور متعلقہ باکس اور وِسکر پلاٹس جو کہ غیر جوڑی والے مان-وٹنی ٹیسٹ کے استعمال کے مقابلے میں گروپ کے اندر فرق کو درست کرتے ہیں۔

C) ٹیبل WT بمقابلہ Clec12a-/- فیکل مائکرو بائیوٹا کے لیے Bray-Curtis اور وزنی Unifrac فاصلے کے لیے PERMANOVA ٹیسٹ کے نتائج دکھا رہا ہے۔

ضمنی شکل 4: میکروفیجز میں Clec12a سوزش کو روکتا ہے۔

A) وائلن پلاٹ (A) میں دکھائے گئے مدافعتی خلیوں کی جیومیٹرک اوسط فلوروسینٹ شدت (MFI) کو ظاہر کرتے ہیں۔ مطلب +/- SEM، ایک سے زیادہ موازنہ کے لیے ڈن کی تصحیح کے ساتھ Kruskal-Wallis ٹیسٹ۔ خطوط ان گروہوں کی نشاندہی کرتے ہیں جو نمایاں طور پر مختلف ہیں۔

B) DSS کولائٹس کے بعد WT کے cLP یا Clec12a-/- چوہوں سے M1 اور M2 میکروفیجز کے نمائندہ بہاؤ سائٹوومیٹری پلاٹ۔ سیلز لائیو، CD45+، Ly6C-، CD11b+، MHCII+، اور CD64+ پر پہلے سے بند ہیں۔ شکل 5A سے

ضمنی شکل 5۔ Clec12a سیل سائیکل کنٹرول کو مستحکم کرتا ہے اور میکروفیجز میں phagocytosis کو منظم کرتا ہے۔

A) F. rodentium کے جواب میں WT کے مقابلے Clec12a-/- اپ ریگولیٹڈ جینز کے درمیان اعلیٰ 10 آسان جی او ٹرم (حیاتیاتی عمل) کے زمرے۔ WT سے BMDMs اور Clec12a-/- چوہوں کو F. rodentium کے ساتھ مل کر الگ تھلگ اور تجزیہ کیا گیا جیسا کہ شکل 7A میں ہے۔

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200 میکروفیجز کی گنتی کی گئی۔ بار گراف 4 انفرادی کنوؤں سے F. rodentium کی اوسط تعداد کو ظاہر کرتا ہے تاکہ کنوؤں میں گنتی اور اثر کی مستقل مزاجی کو ظاہر کیا جا سکے۔ اوسط +/- SEM کے مقابلے میں غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ استعمال کرتے ہوئے۔

اعترافات

ہم اس پروجیکٹ کے لیے Clec12a-/- جانور فراہم کرنے کے لیے گورڈن براؤن کا شکریہ ادا کرنا چاہیں گے۔ اس کام کو ہیلن ہی وٹنی فاؤنڈیشن (KSO)، یونیورسٹی آف یوٹاہ NRSA مائکروبیل پیتھوجینیسیس T32 ٹریننگ گرانٹ (KSO)، ایک CCFA سینئر ریسرچ ایوارڈ (JLR)، NIDDK R01DK124336، NIDDK R01124317 اور NCCAM124317 اور NCCAM124317، Mald0124317 جونیئر فاؤنڈیشن (JLR)، NSF CAREER ایوارڈ (IOS-1253278) (JLR)، پیکارڈ فیلوشپ ان سائنس اینڈ انجینئرنگ (JLR)، Burroughs Welcome Investigator in Pathogenesis Award (JLR)، American Asthma Foundation (JLR)، Margolis فاؤنڈیشن (JLR)، ایک MS سوسائٹی سینٹر گرانٹ (JLR)، اور WM Keck Foundation (JLR) NIH نیو انوویٹر ایوارڈ DP2GM111099-01 (RMO)، NHLBI R00HL102228-05 ( RMO)، ایک امریکن کینسر سوسائٹی ریسرچ گرانٹ (RMO)، ایک Kimmel Scholar Award (RMO)، R01AG047956 (RMO)، اور NIAID R01AI141202 (ASI)۔ اس کام کو ایوارڈ نمبر 5P30CA042014-24 کے ذریعے نیشنل کینسر انسٹی ٹیوٹ کے علاوہ یونیورسٹی آف یوٹاہ فلو سائٹومیٹری سہولت کے ذریعے تعاون حاصل تھا۔ یوٹاہ یونیورسٹی میں سنٹر فار ہائی پرفارمنس کمپیوٹنگ کی طرف سے تعاون اور وسائل کا شکرگزار اعتراف کیا جاتا ہے۔

مصنف کی شراکتیں۔

TRC نے مطالعہ کو تصور کرنے میں مدد کی، زیادہ تر ماؤس اور امیونولوجی کے تجربات کیے، اعداد و شمار کو ایک ساتھ اعداد و شمار میں ڈالا، اور مخطوطہ لکھنے میں مدد کی۔ RB نے جراثیم سے پاک تجربات مرتب کیے اور تمام جراثیم سے پاک جانوروں کو برقرار رکھا۔ ESV نے امیونولوجی گٹ لامینا پروپریا تجربات میں مدد کی۔ KSO نے ماؤس کی کٹائی میں مدد کی اور بصیرت اور سمت فراہم کی۔ KMB نے ماؤس کی کٹائی اور فلو سائٹومیٹری میں مدد کی۔ MCN نے ماؤس کی کٹائی میں مدد کی۔ ڈبلیو وی نے فیوژن پروٹین اور پیوریفیکیشن کی تعمیر میں مدد فراہم کی۔ TJ نے phagocytosis assays کے ساتھ مدد فراہم کی۔ جے ایچ نے فگوسائٹوسس مائکروسکوپی سلائیڈز کا تجزیہ کیا۔ MH نے فیوژن پروٹین کو صاف کرنے اور استعمال کرنے میں مدد فراہم کی۔ KAK بیکٹیریل الگ تھلگ فراہم کرتا ہے۔ ROC نے امیونولوجی کی مہارت اور بصیرت فراہم کی۔ ڈبلیو زیڈ ایس نے بائیو انفارمیٹکس کے تجزیے کیے گئے مطالعہ کو تصور کرنے میں مدد کی، اعداد و شمار کی تیاری اور شماریات میں مدد کی، اور مخطوطہ لکھنے میں مدد کی۔ JLR نے مطالعہ کو تصور کرنے اور اس کی ہدایت کرنے میں مدد کی، تجرباتی ڈیزائن اور نتائج کی نگرانی کی، ساتھیوں اور ری ایجنٹس کو منظم کیا، مطالعہ کے لیے فنڈ حاصل کیا، اور مخطوطہ لکھنے میں مدد کی۔

طریقے

ماؤس کے تناؤ

یہاں استعمال ہونے والی تمام ماؤس لائنیں C57BL/6 پس منظر پر تھیں۔ Clec12a-/- چوہوں کو گورڈن براؤن (میڈیکل ریسرچ کونسل سینٹر فار میڈیکل مائکولوجی، یونیورسٹی آف ایکسیٹر) نے مہربانی کرکے فراہم کیا تھا اور ان کے پہلے بیان کردہ پروٹوکول (Redelinghuys, et al. 2016) کے مطابق جین ٹائپ تھے۔ Rag2-/- اور TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) جیکسن لیبارٹریز سے حاصل کیے گئے تھے اور کئی نسلوں تک ہماری ماؤس کالونی میں برقرار رکھے گئے تھے۔ تمام ویوو کولائٹس کے تجربات کے لیے 8 سے 12- ہفتہ پرانے جنسی مماثل چوہوں کا استعمال کیا گیا۔ نر اور مادہ دونوں چوہے استعمال کیے گئے۔ چوہوں کو مخصوص روگزن سے پاک حالات میں برقرار رکھا گیا تھا۔

بیکٹیریل اور فنگل تناؤ

درج ذیل جاندار DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH سے حاصل کیے گئے تھے: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127)؛ Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074)۔ Bacteroides uniformis American Type Culture Collection (ATCC® 8492™) سے حاصل کیا گیا تھا۔ ایک روزبوریا ایس پی (تناؤ کا عہدہ JLR.KK002) شیڈلر کے آگر پر C57BL/6 چوہوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا جو ایک بیضہ سابقہ ​​افزودہ مائکرو بائیوٹا کو پناہ دیتا ہے۔ بیضہ کی سابقہ ​​افزودگی انجام دی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا اور JLR.KK002 کو میل سے الگ تھلگ کرنے سے پہلے اس مائکرو بائیوٹا کے ساتھ چوہوں کو کئی نسلوں تک برقرار رکھا گیا تھا (Browne et al.، 2016)۔ ہم نے پی سی آر ایمپلیفائیڈ اور سنجر نے 16 ایس آر آر این اے جین کو ترتیب دیا اور پھر اسے سلوا ایکٹ سروس اور سلوا ڈیٹا بیس (پروسی ایٹ ال۔، 2012) کے ساتھ درجہ بندی کیا۔ سالمونیلا ٹائیفیموریمم ST2 تناؤ استعمال کیا گیا تھا۔ Candida albicans strain sc5314 استعمال کیا گیا تھا۔ PhyLo11b مصنوعی برادری میں استعمال ہونے والے بیکٹیریل تناؤ ذیل میں بیان کیے گئے ہیں۔

DSS کی حوصلہ افزائی تجرباتی کولائٹس

کولائٹس کو پینے کے پانی میں 2.5% یا 3% (w/v) 36,000-50,000MW Dextran sodium سلفیٹ (DSS) (MP بایومیڈیکلز) 7 دنوں کے لیے شامل کرنے کے ساتھ پیدا کیا گیا تھا۔ جسم کے وزن، پاخانے کی مستقل مزاجی، اور آنتوں کے خون میں تبدیلیوں کے ذریعے کولائٹس کی شدت کی روزانہ نگرانی کی جاتی تھی۔ مونوسائٹ ریسکیو کے تجربے کے لیے تمام چوہوں کو 5 دن کے لیے 2.5% DSS ملا، جس کے بعد باقاعدہ پانی دیا گیا۔ وزن کی نگرانی دن 10 تک جاری رہی جب جانوروں کی کٹائی کی گئی۔ 20% سے زیادہ وزن میں کمی کی شدت کی حد کو شدت کی حد کے طور پر نافذ کیا گیا تھا۔ تجرباتی اختتامی مقامات پر، MLNs اور بڑی آنت کو ہٹا دیا گیا۔ لمبائی کا تعین کرنے کے لیے بڑی آنت کو سیکم سے ملاشی تک ناپا گیا۔ اس کے بعد ہسٹولوجی، آر این اے نکالنے، یا فلو سائٹومیٹرک تجزیہ کے لیے ٹشوز پر کارروائی کی گئی۔

کولون ہسٹولوجی اور اسکورنگ

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Lipocalin-2 (LCN-2) ELISA

پروٹوکول مینوفیکچرر کے پروٹوکول (فشر سائنٹیفک DY1857-05) کے مطابق انجام دیا گیا تھا۔ مختصراً، HBSS 1X میں 100mg/mL کے ارتکاز میں ملا کو جمع کیا گیا، وزن کیا گیا اور میش کیا گیا۔ اس کے بعد بڑے ملبے کو ہٹانے کے لیے نمونوں کو 5 منٹ کے لیے 50 xg پر کاتا گیا۔ اس کے بعد سپرنیٹنٹ کو ہٹا کر ایک نئی ٹیوب میں رکھا گیا اور 8000 xg پر 5 منٹ تک گھمایا گیا تاکہ بیکٹیریا کو گولی مار سکے۔ اس سپرنیٹنٹ کو پھر جانوروں کی بیماری کے مطابق پتلا کیا گیا لیکن عام طور پر 1:100- 500 (صحت مند) – 1:500-1000 (DSS-علاج) سے ہوتا ہے۔ یورک ایسڈ کی پیمائش یورک ایسڈ کا ارتکاز کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کیا گیا تھا (Invitrogen™ Amplex™ Red Uric/Uricase ایکٹیویٹی پرکھ کٹ، cat# A22181)۔ مختصراً، خون WT یا Clec12a-/- چوہوں سے کارڈیک پنکچر کے ذریعے گولڈ ٹاپ سیرم سیپریٹر ٹیوبوں میں جمع کیا گیا۔ ٹیوبوں کو 30 منٹ تک جمنے کی اجازت دی گئی اور پھر 10 منٹ کے لیے 1300 xg پر کاتا گیا۔ سیرم کو ہٹا کر 1.5ml Eppendorf ٹیوبوں میں رکھا گیا، فلیش کو منجمد کر دیا گیا، اور جانچ تک -80 ڈگری سیلسیس پر محفوظ کر دیا گیا۔ فیکل یورک ایسڈ WT اور Clec12-/- چوہوں سے تازہ فیکل گولیاں حاصل کرکے انجام دیا گیا۔ چھروں کا وزن اور ریکارڈ کیا گیا اور پھر 1x ردعمل بفر کے 1mL میں میش کیا گیا۔ جسمانی میشنگ کے بعد، بڑے ملبے کو ہٹانے کے لیے ٹیوبوں کو 5 منٹ کے لیے 50 xg پر گھمایا گیا۔ باقی فیکل سلوری کو یورک ایسڈ کے لیے پرکھا گیا۔

ٹی سیل ٹرانسفر تجرباتی کولائٹس

ڈبلیو ٹی تلیوں کو RPMI میں الگ تھلگ اور میش کیا گیا تھا جس میں 10٪ برانن بوائین سیرم، پینسلن، اور اسٹریپٹومائسن شامل تھے۔ خلیات کو الگ تھلگ کرنے کے لیے خلیات کو 367 xg پر کاتا گیا تھا۔ نتیجے میں گولی پھر کمرے کے درجہ حرارت پر، اندھیرے میں، 5 منٹ کے لیے 1x RBC lysis بفر میں معطل کر دی گئی۔ اس کے بعد خون کے سفید خلیوں کو ملٹینی CD4+ MACS کالم سے CD4+ T-خلیوں کو الگ تھلگ کرنے کے لیے منتقل کیا گیا۔ اس کے بعد ٹی سیلز کو CD4 اور CDRB سے داغ دیا گیا اور FACS Aria Fusion (BD Biosciences) پر ترتیب دیا گیا۔ CD4+ CDRBhi سیلز کو جمع کیا گیا اور TCRb-/- یا TCRb-/- کو دیا گیا؛ Clec12a-/- چوہوں انٹراپریٹونیلی (IP)۔ ہر ماؤس کو 5 x 105 سیل ملے۔ وزن میں کمی کا اندازہ لگا کر کولائٹس کی شدت اور نشوونما کی ہفتہ وار نگرانی کی گئی۔ تجرباتی اختتامی نقطہ پر، MLNs اور بڑی آنت کو ہٹا دیا گیا اور بیماری کی شدت کا اندازہ لگانے کے لیے cecum سے rectum تک بڑی آنت کی پیمائش کی گئی۔

کالونی لیمنا پروپریا سے لیوکوائٹس کا الگ تھلگ

منسلک سیکا کے ساتھ مورین کالون کاٹ کر 1X PBS میں 6-برف پر کنویں پلیٹوں میں رکھا گیا تھا۔ کوئی بھی بقیہ چربی اور جوڑنے والے ٹشو کو ہٹا دیا گیا اور سیکم کو بڑی آنت سے کاٹ دیا گیا۔ بڑی آنت کو کھول کر پھینکا جاتا تھا اور بلغم اور پاخانہ کو بڑی آنت سے احتیاط سے نکالا جاتا تھا اور اسے واپس 6-کنویں کی پلیٹ میں رکھا جاتا تھا۔ ایک بار جب تمام بڑی آنت کو چھڑک دیا گیا اور کھرچ دیا گیا تو، ہر بڑی آنت کو استرا بلیڈ کا استعمال کرتے ہوئے پیٹری ڈش کے ڈھکن پر کاٹ کر علیحدہ 50 mL ٹیوب میں رکھا گیا۔ 10 ملی لیٹر پری وارمڈ ڈسوسی ایشن سلوشن (1X HBSS w/o Ca+ اور Mg+، 1.5 mM DTT، 10 mM HEPES، اور 30 ​​mM EDTA) شامل کیا گیا اور ٹیوبیں مختصر طور پر گھوم گئیں۔ بڑی آنت کو تقریباً 25 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ 150 rpm پر ہلچل کے ساتھ 37 ڈگری پر جب تک کہ حل IEC علیحدگی سے ابر آلود نہ ہوں۔ نمونوں کو 3X ہلایا گیا اور 15 سیکنڈ تک گھمایا گیا پھر 50 ملی لیٹر مخروط پر 100 ایم ایم فلٹر ڈالا گیا تاکہ IECs جیسے غیر مدافعتی خلیات کو ہٹایا جا سکے، اور فلٹرز کو 2 ملی لیٹر آئس کولڈ 1X پی بی ایس کے ساتھ مختصر طور پر دھویا گیا۔ باقی ٹشو کو فورپس کے ساتھ فلٹر پر جمع کیا گیا اور ایک نئے 50 ملی لیٹر مخروط میں منتقل کیا گیا۔ 15 ملی لیٹر پہلے سے گرم ہاضمہ حل (1X HBSS ساتھ Ca+ اور Mg، 5% FBS، 50 U/ml Dispase II [Millipor-Sigma, cat # 4942078001], 0.5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, cat # LS12]000 اور 0.5 mg/mL Collagenase D [Millipor-Sigma, cat # 11088866001]) شامل کیا گیا، نمونوں کو مختصر طور پر گھماؤ، اور اس کے بعد 45 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ 150 rpm پر ہلنے کے ساتھ 37 ڈگری پر، یا جب تک محلول ابر آلود نہ ہو جائے۔ اس کے بعد نمونوں کو 3X ہلایا گیا اور 15 سیکنڈ تک گھمایا گیا۔ باقی مدافعتی سی ایل پی خلیوں کو جمع کرنے کے لیے، ہضم شدہ ٹشو کو پھر 40 ایم ایم فلٹر پر 50 ملی لیٹر مخروطی ٹیوب پر ڈالا گیا جس میں 10 ایم ایل 1 ایکس پی بی ایس تھا۔ اس کے بعد نمونوں کو 2 ملی لیٹر آئس کولڈ 1X پی بی ایس کے ساتھ کللا اور فلٹر کیا جاتا ہے اور 4 ڈگری پر 10 منٹ کے لئے 800 xg پر کاتا جاتا ہے۔ اس کے بعد، سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا اور ویکیوم کے ساتھ ضائع کر دیا گیا۔ اس کے بعد خلیوں کو مکمل RPMI کے 500 ملی لیٹر میں دوبارہ معطل کیا گیا تھا، اور ٹرپین بلیو خارج ہونے والے داغ کے ساتھ شمار کیا گیا تھا۔

بہاؤ سائٹوومیٹری

سی ایل پی سے الگ تھلگ لیوکوائٹس کو اندھیرے میں RT پر 10 منٹ کے لیے زومبی ڈائی 510 (AmCyan) کا استعمال کرتے ہوئے قابل عمل ہونے کے لیے داغ دیا گیا تھا۔ اس کے بعد اندھیرے میں 4 ڈگری پر 20 منٹ کے لیے Fc ریسیپٹر کو CD-16/32 کے ساتھ بلاک کر دیا گیا۔ 5 منٹ تک 367 xg پر نیچے گھومنے کے بعد 4 ڈگری پر اندھیرے میں 30 منٹ تک صاف کیے گئے خلیوں کو داغ دیا گیا۔ تمام اینٹی باڈیز 1:250 کی کمی پر استعمال کی گئیں جب تک کہ دوسری صورت میں نوٹ نہ کیا جائے۔ Myleloid پینل پر مشتمل ہے CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (انٹرا سیلولر، 1:50)۔ T خلیات کو اس سے ممتاز کیا گیا: زومبی ڈائی 510 (AmCyan)، CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (intracellular 1:50), IL{{ 50}PE (انٹرا سیلولر 1:50)، IFN-g (BV605) (انٹرا سیلولر 1:50)، RORgt-PE610 (انٹرا سیلولر 1:50)، IL-17A-BV785 (انٹرا سیلولر 1:50)۔ داغ لگنے کے بعد، سیلز کو کالم بفر (1X HBSS w/o Ca2+, Mg2+ اور HEPES, EDTA, FBS) کے ساتھ 5 منٹ کے لیے 2 بار دھویا گیا۔ خلیوں کو 2٪ PFA کے ساتھ O/N طے کیا گیا تھا اگر کسی انٹرا سیلولر سٹیننگ کی ضرورت نہ ہو اور پھر فلو سائٹو میٹر پر چلنے سے پہلے کالم بفر 2X میں دھویا جائے۔ اگر انٹرا سیلولر سٹیننگ ضروری تھا تو، FoxP3 / ٹرانسکرپشن فیکٹر سٹیننگ بفر کٹ (Tonbo Biosciences) اور پروٹوکول کی پیروی کی گئی۔ اس کے بعد تمام نمونوں کو 300 ul کالم بفر میں دوبارہ معطل کر دیا گیا اور الٹراکمپ ای بیڈس (تھرمو فشر سائنٹیفک) کے ساتھ معاوضہ لینے اور سنگل اسٹین کنٹرول استعمال کرنے کے بعد BD LSR فورٹیسا پر چلایا گیا۔

آئی جی اے داغدار بیکٹیریا

بیکٹیریا کو HBSS w/ Ca2+ اور Mg2+ میں 100 mg feces فی mL HBSS کے ارتکاز میں میش کرکے آنتوں کے چھروں سے الگ کیا گیا تھا۔ پھر بڑے ملبے کو ہٹانے کے لیے میشڈ مل کو 5 منٹ کے لیے 50 xg پر کاتا گیا۔ سپرنٹنٹ کو ہٹا کر ایک نئی ٹیوب میں رکھا گیا۔ اس کے بعد اسے 8000 xg پر 5 منٹ کے لیے پیلٹ بیکٹیریا کے لیے کاتا گیا۔ سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا تھا اور چھرروں کو HBSS w/ Ca2+ اور Mg2+ میں دھویا گیا تھا۔ آخر میں، چھرروں کو HBSS میں 100mg/mL کے ارتکاز پر دوبارہ معطل کیا گیا، اور اس میں سے 10uL کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں رکھا گیا اور HBSS w/ Ca2+ اور Mg2+ کے ساتھ بلاک کر دیا گیا۔ RT پر 20 منٹ کے لیے 10% FBS۔ اس کے بعد 100uL اینٹی آئی جی اے (PE) کو براہ راست نمونے میں شامل کیا گیا اور اندھیرے میں 4 C پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد سیلز کو HBSS+FBS سلوشن 2x میں دھویا گیا اور آخر میں HBSS+1x Sybr®-گرین میں دوبارہ معطل کیا گیا اور RT پر اندھیرے میں 20 منٹ تک انکیوبیٹ ہونے دیا گیا۔ اس کے بعد نمونے براہ راست فلو سائٹو میٹر پر پڑھے گئے۔

بون میرو کی تنہائی

بون میرو الگ تھلگ تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ مختصراً، C57Bl/6 وائلڈ ٹائپ یا Clec12a-/- جانوروں سے لمبی ہڈیاں نکال کر کاغذ کے تولیے سے آہستہ سے رگڑ کر صاف کی گئیں۔ صاف ہڈیوں کو برف پر رکھا گیا جبکہ جانوروں پر کارروائی کی گئی۔ میرو کو بے نقاب کرنے کے لیے ہڈیوں کے سروں کو تھوڑا سا کاٹا گیا تھا۔ ہڈی کو ایک 0.5mL ایپنڈورف ٹیوب میں داخل کیا گیا تھا (نیچے کی طرف بے نقاب کیا گیا تھا) جسے 18 گرام کی سوئی سے چھیدا گیا تھا۔ اس 0.5mL Eppendorf ٹیوب کو پھر 1.5mL Eppendorf ٹیوب کے اندر رکھا گیا اور 13,000 x g پر 1 منٹ کے لیے گھمایا گیا۔ مینوفیکچرر کی سفارشات کے مطابق RBC-lysis بفر (Biolegend) کا استعمال کرتے ہوئے بون میرو کے ذریعے کاتا پھر RBC-lysed تھا۔ RBC lysis کے بعد، خلیات کو مکمل Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) میں دوبارہ معطل کیا گیا جس میں: 10% FBS، 1mg/mL Pen/Strep، HEPES 10mM، 1x غیر ضروری امینو ایسڈ، سوڈیم پائروویٹ 1mM۔ اس کے بعد خلیات کو 367 xg پر پانچ منٹ کے لیے گولیوں کے خلیات کے لیے گھمایا گیا۔ اس کے بعد الگ تھلگ خلیات کا استعمال BMDMs کو تیار کرنے کے لیے، یا monocytes کو مزید الگ کرنے کے لیے کیا جاتا تھا۔

بون میرو سے ماخوذ میکروفیجز

لیوکوائٹس کو بون میرو آئسولیشن سے الگ تھلگ کیا گیا تھا، مکمل ڈی ایم ای ایم میں معطل کر دیا گیا تھا، اور ہیمو سائیٹومیٹر پر ٹرپین بلیو خارج ہونے والے داغ کے ذریعے شمار کیا گیا تھا۔ سیلز کو ٹشو کلچر سے علاج شدہ 10 سینٹی میٹر ڈشز پر 5-8 x 106 سیلز/پلیٹ کے 10 ملی لیٹر مکمل میڈیا + M-CSF (20ng/mL) میں چڑھایا گیا تھا۔ تازہ میڈیا، بشمول M-CSF، موجودہ میڈیا میں 4 اور دن 7 کو شامل کیا گیا تھا۔ مکمل طور پر مختلف BMDMs کو دنوں 7-9 کے درمیان تجرباتی استعمال کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

مونوسائٹ تنہائی

بون میرو WT اور Clec12a-/- جانوروں سے کاٹا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق مونوسائٹس کو Monocyte Isolation Kit (BM)، ایک ماؤس (Miltenyi Biotec)، اور LS MACS کالم کے ساتھ الگ تھلگ کیا گیا تھا۔

F. rodentium BMDM کو کلچر اور RNAseq

F. rodentium ثقافتوں کی مقدار OD 600nm (1 OD 600nm=1 x 10^8 خلیات/mL استعمال کرتے ہوئے)، جراثیم سے پاک PBS میں 2x دھوئے گئے، اور 1 x 106 سیل/mL مکمل طور پر مختلف BMDMs کے ساتھ ہم آہنگ کنویں کے ٹشو کلچر پلیٹوں میں 6-10 کا MOI۔ 24 گھنٹوں کے تعاون کے بعد، میڈیا کو جمع کیا گیا اور مزید استعمال تک -20 C پر ذخیرہ کیا گیا۔ BMDMs کو ٹھنڈے، جراثیم سے پاک PBS، 2x سے دھویا گیا۔ Qiazol (Qiagen cat# 79306) RNA-stabilization reagent، پھر براہ راست ہر کنویں میں شامل کیا گیا۔ کنویں کو سیل سکریپر کے ساتھ 1.5 ایپنڈورف ٹیوبوں میں جمع کیا گیا اور RNA نکالنے تک -20 ڈگری پر منجمد کیا گیا۔ RNA نکالنے کا کام ایک Direct-zol RNA miniprep کٹ (Zymo Research cat# R2070) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق اور ترتیب دینے والی لائبریریوں کو ہنٹس مین کینسر انسٹی ٹیوٹ ہائی تھرو پٹ جینومکس بنیادی سہولت نے تیار کیا تھا۔ کل RNA کو پہلے NEBNext rRNA Depletion kit v2 (NEB، cat# E7400) کے ساتھ ہائبرڈائز کیا گیا تھا تاکہ نمونوں سے rRNA کو کم کیا جا سکے۔ پھنسے ہوئے RNA سیکوینسنگ لائبریریوں کو NEBNext Ultra II ڈائریکشنل RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, cat# E7760L) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ Purified لائبریریوں کو D1000 ScreenTape پرکھ (Agilent، cat# 5067-5582 اور 5067-5583) کا استعمال کرتے ہوئے Agilent Technologies 4150 TapeStation پر کوالیفائی کیا گیا تھا۔ کاپا بایو سسٹم کاپا لائبریری کوانٹ کٹ (روچے، بلی # 07960140001) کا استعمال کرتے ہوئے اڈاپٹر میں ترمیم شدہ مالیکیولز کی مقداری پی سی آر کی طرف سے وضاحت کی گئی تھی۔ انفرادی لائبریریوں کو Illumina تسلسل کے تجزیہ کی تیاری میں 5 nM پر معمول بنایا گیا تھا اور NovaSeq 6000 پر پیئر اینڈ 150-سائیکل سیکوینسنگ رن کے ساتھ ترتیب دیا گیا تھا۔

سائٹوکائن تجزیہ

BMDM الگ تھلگ اور بڑھے ہوئے تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ مکمل طور پر تفریق شدہ BMDMs کو 1 x 105 سیل/کنویں میں 12-کنویں ٹشو کلچر پلیٹوں میں چڑھایا گیا تھا۔ BMDMs کو 100ng/mL LPS کے ساتھ متحرک کیا گیا تھا۔ 1 ug/mL Pam3Cysk؛ یا 1ug/mL flagellin۔ خلیات کو 24 گھنٹے کے لیے متحرک کیا گیا، میڈیا کو اکٹھا کیا گیا اور تجزیہ کے لیے -20 C پر محفوظ کیا گیا۔ سائٹوکائنز کا تجزیہ LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, cat# 740150) کے ساتھ کیا گیا۔ ڈیٹا کا تجزیہ LEGENDplex™ ڈیٹا تجزیہ سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

16s rRNA جین کی ترتیب

فیکل پیلٹس یا ileal مواد کو انفرادی چوہوں سے اکٹھا کیا گیا اور 2mL اسکرو کیپ ٹیوبوں میں فوری طور پر {{{0}} ڈگری پر منجمد کر دیا گیا جس میں 250 ملی گرام 0.15 ملی میٹر گارنیٹ موتیوں کی مالا (MoBio، cat# {{5) }})۔ ڈی این اے کو پاور فیکل ڈی این اے آئسولیشن کٹ (MoBio یا QIAGEN) کا استعمال کرتے ہوئے، فی کٹ ہدایات کے ذریعے نکالا گیا تھا، اور ایک Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products) پر 4 ڈگری پر 1 منٹ کی مالا کی دھڑکن کے 2 سائیکل شامل تھے۔ 16S rRNA جین کے V3 اور V4 خطوں کو PCR کے واحد راؤنڈ کے ساتھ پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے بڑھا دیا گیا تھا جس میں V3/4 ریجن 16S rRNA جین کو نشانہ بنانے کی ترتیب (3' سے 5' بیان کی گئی تھی)، اس کے بعد ایک 2-نیوکلیوٹائڈ پیڈ تھا۔ Illumina پرائمر کی ترتیب کے ذریعے، ایک 8- نیوکلیوٹائڈ انڈیکس کی ترتیب اور باقی Illumina اڈاپٹر کی ترتیب۔ V3/4 16S-ہدف بندی کے سلسلے تاکاہاشی (Takahashi et al., 2014) سے لیے گئے تھے، اور اشاریے Kozich (Kozich et al., 2013) سے لیے گئے تھے۔ استعمال شدہ مکمل oligonucleotide کے سلسلے تھے (اشارہ جات Xs کے ذریعے ظاہر کیے گئے ہیں): Prok16SV34_کے لیے: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXACACTCTTTCCCTACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGNBGCASCAG; Prok16SV34_ Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC۔ PCR سائیکلنگ کے حالات حسب ذیل تھے: 2 منٹ کے لیے 98 ڈگری ابتدائی ڈینیچریشن؛ 20 سیکنڈ 98 ڈگری ڈینیچریشن کے 26 سائیکل، 20 سیکنڈ 51.5 ڈگری اینیل، 20 سیکنڈ 72 ڈگری ایکسٹینشن؛ اور 2 منٹ کے لیے ایک آخری 72 ڈگری ایکسٹینشن۔ ہر PCR (ہر نمونے کے لیے سہ رخی میں انجام دیا گیا) Q5 High-Fidelity 2X ماسٹر مکس (NEB، cat# M0492L)، ہر پرائمر کے 5 pmol اور 50 ng ٹیمپلیٹ DNA کا استعمال کرتے ہوئے 25 ul والیوم میں کیا گیا۔ ایمپلیفیکیشن کے بعد، ہر نمونے سے ٹرپلیکیٹ پی سی آر جمع کیے گئے، ایمپلیفیکیشن کی تصدیق کے لیے 5 ul کو ایگرز جیل پر چلایا گیا، اور باقی حجم کو Axygen AxyPrep MAG PCR کلین اپ بیڈز (کارننگ، بلی # MAG-PCR-CL{53) کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا گیا۔ }}) کسی بھی پرائمر ڈائمر کو مؤثر طریقے سے ہٹانے کے لیے پانی میں 62.5% تک پتلا کر دیا گیا جو ترجیحی طور پر ترتیب دیا جائے گا۔ پتلی موتیوں کو پی سی آر کے رد عمل کے 1.8X والیوم میں شامل کیا گیا، فی مینوفیکچرر کے رہنما خطوط پر صاف کیا گیا اور 25 ul 10 mM Tris-Cl، pH 8.0 کے ساتھ صاف کیے گئے ایمپلیونز کو صاف کیا گیا۔ اس کے بعد امپلیکنز کو ایک مائکروپلیٹ ریڈر پر پیکو گرین ڈی ایس ڈی این اے پرکھ (تھرمو فشر، بلی #P11495) کے ساتھ مقدار کا تعین کیا گیا، اور پھر صاف اور انڈیکس شدہ انفرادی ترتیب والی لائبریریوں کو یکساں طور پر ملٹی پلیکس کیا گیا (این جی ڈی این اے کے ذریعہ) اور ایک ایلومینا MiSeq انسٹرومنٹ پر ترتیب دیا گیا۔ ہنٹس مین کینسر انسٹی ٹیوٹ کے ہائی تھرو پٹ جینومکس مشترکہ وسائل کی سہولت میں 300 سائیکل موڈ۔

ترتیب ڈیٹا کی بایو انفارمیٹکس پروسیسنگ

16S rRNA جین خام ریڈز کو ڈیملٹی پلیکس کیا گیا تھا جس کی وجہ سے انڈیکس میں 0 مماثلت نہیں ہوتی تھی پھر QIIME2 فریم ورک (بولین ایٹ ال۔، 2019) کے اندر پروسیس اور تجزیہ کیا جاتا تھا جیسا کہ ہم نے پہلے بیان کیا ہے (سٹیفنز ایٹ ال۔، 2021)۔ مختصراً، ڈیملٹی پلیکسڈ اور کوالٹی فلٹرڈ سیکوینسز کو پہلے کٹاڈیپٹ پلگ ان کے ساتھ پرائمر اور لنکر سیکوینسز کو تراش دیا گیا، پھر DADA2 (Callahan et al.، 2016؛ Martin، 2011) کے ساتھ انکار کیا گیا۔ اس کے بعد ASVs کو ASVs کو فیچر کلاسیفائر پلگ ان میں کلاسیفائیسکلیرن طریقہ کے ساتھ تفویض کیا گیا، جی ٹی ڈی بی ریفرنس سیٹ (ریلیز 89) کے خلاف جس کو ایمپلیفائیڈ V3/4 ریجن میں تراشا گیا اور فٹ-کلاسیفائر-نائیو-بیز طریقہ (Bokulich et al. ، 2018؛ پارکس وغیرہ۔، 2018؛ پیڈریگوسا ایٹ ال۔، 2011)۔ تنوع میٹرکس، فاصلے، اور پرمانوا کے ذریعہ بیٹا تنوع گروپ بندی کی شماریاتی اہمیت کا حساب QIIME2 (اینڈرسن، 2001) کے اندر لگایا گیا تھا۔

BMDMs کے RNA-seq کے لیے، خام ریڈز پہلے کوالٹی اور اڈاپٹر سے ٹرم گیلور کا استعمال کرتے ہوئے تراشے گئے تھے پھر GRCm38 (mm10) (Patro et al.، 2{{ 16} 17)۔ ٹرانسکرپٹ لیول کی مقدار کو ٹائم پیکج کا استعمال کرتے ہوئے R میں پڑھا گیا اور DESeq2 کے ساتھ ڈیزائین فارمولہ '~ جینوٹائپ + ٹریٹمنٹ + جینوٹائپ: ٹریٹمنٹ' (Love et al., 2014; Love et al., 2020)۔ F. rodentium کے لیے مختلف ردعمل گاڑیوں پر قابو پانے والے خلیوں پر زندہ F. rodentium کے علاج کے لیے ہر جین ٹائپ کے ردعمل کے درمیان فرق کو ظاہر کرتے ہیں۔ نمایاں طور پر امتیازی طور پر ظاہر کیے گئے جینز کی وضاحت کی گئی تھی جو کہ ایڈجسٹ شدہ p-value <0.05 اور log2 fold-change > |0.58| (1.5 گنا تبدیلی)۔ اس کے بعد نمایاں طور پر ڈاون ریگولیٹڈ اور اپ ریگولیٹڈ جین کی فہرستوں کو کلسٹر پروفائلر پیکج کا استعمال کرتے ہوئے جین آنٹولوجی (GO) کی اصطلاحات میں افزودگی کی جانچ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا جس میں GO ٹرم کی فالتو پن کو کم کرنے اور کلیدی حیاتیاتی عمل کی نشاندہی کرنے کے لیے فنکشن کو آسان بنانا (S, 2020؛ Wu et al) ، 2021)۔

F. rodentium DSS چیلنج

F. rodentium جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا اور اسے جراثیم سے پاک PBS میں 1 x 109 CFU/mL تک بڑھایا گیا تھا۔ F. rodentium پہلے جراثیم سے پاک PBS میں 2x دھو کر اور پھر 1mL 10% Fomalin-PBS میں 10 منٹ کے لیے دوبارہ لگا کر ٹھیک کیا گیا۔ اس کے بعد سیلوں کو 10 ملی لیٹر جراثیم سے پاک پی بی ایس میں مزید دو بار دھویا گیا تاکہ زبانی نالی کی تیاری کی جا سکے۔ غیر فکسڈ کو مقررہ خلیوں کی طرح دھویا جاتا تھا اور گیویج تک برف پر رکھا جاتا تھا۔ WT C57BL/6 SPF چوہوں کو زبانی طور پر 100uL محلول کے ساتھ گیج کیا گیا تھا جس میں یا تو اکیلے PBS (گاڑی)، F. rodentium (لائیو) یا F. rodentium (فکسڈ) دنوں -3 سے 10 تک تھے۔ جانوروں کو 3.0% دیا گیا تھا۔ DSS دن 0-7؛ تازہ DSS پانی ہر دوسرے دن تبدیل کیا گیا تھا. 20% سے زیادہ وزن میں کمی کی شدت کی حد کو شدت کی حد کے طور پر نافذ کیا گیا تھا۔ تجرباتی اختتامی مقامات پر، MLNs اور بڑی آنت کو ہٹا دیا گیا۔ لمبائی کا تعین کرنے کے لیے بڑی آنت کو سیکم سے ملاشی تک ناپا گیا۔ اس کے بعد ہسٹولوجی، آر این اے نکالنے، یا فلو سائٹومیٹرک تجزیہ کے لیے ٹشوز پر کارروائی کی گئی۔

Phagocytosis پرکھ

پیریٹونیل میکروفیجز کو پیریٹونیل گہا میں 5 ملی لیٹر جراثیم سے پاک پی بی ایس کا انجیکشن لگا کر الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ پی بی ایس ہر چند سیکنڈ میں گہا میں رہتے ہوئے آہستہ سے مشتعل تھا۔ 2 منٹ کے بعد، پی بی ایس کو 28 گیج کی سوئی کا استعمال کرتے ہوئے واپس لے لیا گیا اور سرد مکمل DMEM میں تقسیم کر دیا گیا۔ خلیوں کو 367 xg پر گھمایا گیا اور مکمل میڈیا میں دھویا گیا۔ اس کے بعد سیلوں کو ہیمو سائیٹومیٹر کے ساتھ شمار کیا گیا اور 2.5 x 105 سیل/mL کے ارتکاز پر 12-وییل ٹشو کلچر پلیٹوں میں چڑھایا گیا۔ سیلوں کو راتوں رات قائم رہنے کی اجازت تھی۔ اگلے دن، کنوئیں ہلکے ہلکے گھل مل گئے اور میڈیا کی خواہش کی گئی۔ اس کے بعد منسلک خلیوں کو 500uL سرد، جراثیم سے پاک، پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ 10 کے MOI پر F. rodentium پر مشتمل پہلے سے گرم مکمل DMEM کو پھر adherent (macrophages) میں شامل کیا گیا۔ اس کے بعد پلیٹوں کو آہستہ سے 200 xg پر، کمرے کے درجہ حرارت پر تین منٹ کے لیے گھمایا گیا اور پھر معیاری سیل کلچر حالات (37 C، 5% CO2) کے تحت 90 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ F. rodentium تیار کیا گیا تھا جیسا کہ BMDMs کی کو-کلچر کے لیے صرف RNA کی ترتیب کے لیے بیان کیا گیا تھا، دھونے کے بعد سیلز کو 1x Sybr® گرین (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) میں 20 منٹ کے لیے RT پر دوبارہ معطل کر دیا گیا تھا۔ اس کے بعد بیکٹیریل خلیوں کو 4000 rpm پر 5 منٹ تک مکمل ڈی ایم ای ایم کے ساتھ دوبارہ معطل کیا گیا اور پیریٹونیل میکروفیجز کے لیے پہلے سے گرم کیا گیا۔ 90 منٹ کی شریک ثقافت کے بعد، میڈیا کی خواہش کی گئی، اور خلیات کو سرد، جراثیم سے پاک، پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ Sybr® سبز داغ والے F. rodentium پر مشتمل اُس خلیات کو 10 منٹ کے لیے 2% paraformaldehyde (PFA) کے ساتھ طے کیا گیا تھا۔ پی ایف اے کی خواہش کی گئی تھی اور جراثیم سے پاک پی بی ایس کو خلیوں پر رکھا گیا تھا۔ اس کے بعد خلیوں کو F. rodentium کے phagocytosis کے لیے امیج کیا گیا۔

میکروفیج تصویری تجزیہ

F. rodentium-treated macrophage ثقافتوں کی Brightfield اور fluorescence images EVOS m7000 امیجنگ سسٹم (تھرمو فشر سائنٹیفک، والتھم، MA) کا استعمال کرتے ہوئے لی گئی تھیں۔ ہر ثقافت کے لیے تین سے پانچ الگ الگ بے ترتیب تصاویر لی گئی تھیں، جو کہ سہ رخی میں کی گئیں۔

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

CLEC12A-Fc فیوژن پروٹین کی تعمیر and purificatiپر

C57Bl/6 WT SPF بون میرو سے الگ تھلگ سفید خون کے خلیات سے PCR کے ذریعے ماؤس Clec12a کے ایکسٹرا سیلولر ڈومینز کو انکوڈنگ کرنے والے cDNAs کو بڑھایا گیا اور ترتیب سے تصدیق کی گئی۔ cDNAs کو انسانی IgG1-Fc اظہار ویکٹر pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen) میں C ٹرمینس میں ملایا گیا تھا۔ Clec12a یا خالی ویکٹر پر مشتمل تعمیرات DMEM +10% FBS اور Pen/strep (1mg/mL) کے ساتھ ثقافتی Lx293 سیلز میں تبدیل کی گئیں۔ منتقلی کے بعد خفیہ فیوژن پروٹین میڈیا 24-48 سے حاصل کیے گئے تھے۔ ملبہ/مردہ خلیات کو ہٹانے کے لیے میڈیا کو 5 منٹ کے لیے 367 xg پر گھمایا گیا تھا، اور سپرنیٹنٹ کو استعمال تک -20 C پر منجمد کر دیا گیا تھا۔ Clec12a-Fc یا Fc-only فیوژن پروٹینز کو Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kit (تھرمو فشر سائنٹیفک، کیٹلاگ نمبر: 88804) کے ساتھ الگ تھلگ کیا گیا، Pierce™ BCA پروٹین آسے کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک کیٹلاگ نمبر2327) کے ساتھ مقدار درست کی گئی۔ اور مغربی دھبے کے ذریعے اینٹی کلیک 12 اے اینٹی باڈی (نووس بائیولوجیکل NBP2-27346SS) کا استعمال کرتے ہوئے تصدیق کی گئی ہے۔

Clec12a-Fc-بائنڈنگ پرکھ

پیوریفائیڈ کنسٹرکٹس کو HBSS w/ Ca2+ اور Mg2+ میں 0.4 mg/mL تک پتلا کر دیا گیا تھا۔ بیکٹیریا ان کے متعلقہ میڈیا اور ایروبک حالات میں اگائے گئے تھے اور OD 600nm کے ذریعہ معمول پر لائے گئے تھے۔ بیکٹیریا کو HBSS w/ Ca2+ اور Mg2+ سے دھویا گیا اور RT پر 20 منٹ کے لئے HBSS w/ Ca2+ اور Mg2+ +10% FBS کے ساتھ بلاک کر دیا گیا۔ تمام داغدار طریقہ کار ماحولیاتی حالات کے تحت ہوئے تھے۔ 1 x 107 بیکٹیریا کے خلیوں کو ایک گول نیچے 96-کنویں پلیٹ میں رکھا گیا تھا، 3،000 xg پر کاتا گیا تھا، اور صاف کیا گیا تھا۔ 50uL تعمیرات کو بیکٹیریا کے خلیوں پر رکھا گیا تھا، آہستہ سے ملایا گیا تھا، اور 1 گھنٹے کے لیے 4 C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ بیکٹیریا کے خلیات کو HBSS w/ Ca2+ اور Mg2+ + 10% FBS، 2x سے دھویا گیا۔ 50uL بکری اینٹی ہیومن Fc (PE) (ebioscience Catalog # 12-4998-82) کو خلیات میں شامل کیا گیا اور اندھیرے میں 1 گھنٹے کے لیے 4 C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ پھر سیل کو پہلے کی طرح دھویا گیا اور HBSS w/ Ca2+ اور Mg2+ میں رکھا گیا جس میں 1x Sybr® گرین (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3)۔ خلیوں کو اندھیرے میں 20 منٹ کے لئے RT پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا اور BD LSR فورٹیسا فلو سائٹو میٹر پر فوری طور پر پڑھا گیا تھا۔

شعاع ریزی اور بون میرو کی تشکیل نو

بون میرو WT اور Clec12a-/- جانوروں سے کاٹا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ وصول کنندہ چوہوں کو 50دن پر 0 ریڈی ایشن کے ساتھ مہلک طور پر شعاع ریزی کی گئی تھی، اس کے بعد 0 دن کو 400 ریڈیائی گئی تھیں۔ آخری شعاع ریزی کے چار گھنٹے بعد، وصول کنندہ چوہوں کو آئسو فلورین اینستھیٹائزیشن کے تحت رکھا گیا تھا، اور 100uL الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ جراثیم سے پاک PBS (1 x 108 سیل/mL) میں معطل بون میرو سیلز 28.5 گیج کی سوئی کے ذریعے ریٹرو مداری جگہ پر پہنچائے گئے۔ ہمیں مائیکرو بائیوٹا میں دلچسپی تھی اس لیے جانوروں کو اینٹی بائیوٹکس پر نہیں رکھا گیا تھا، اور 8 ہفتوں کے بعد GF جانوروں میں مائیکرو بائیوٹا کی منتقلی کے لیے آنتوں کے چھرے اکٹھے کیے گئے تھے۔

حوالہ جات

اینڈرسن، ایم جے (2001)۔ تغیر کے غیر پیرامیٹرک ملٹی ویریٹیٹ تجزیہ کے لیے ایک نیا طریقہ۔ آسٹرل ایکول۔ 26، 32-46۔ DOI 10.1111/j۔{6}}.2001.01070.pp.x

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ, et al. (2015)۔ کروہن کی بیماری کے خطرے کے مختلف قسم کے مربوط جینومکس

اینٹی بیکٹیریل آٹوفجی میں CLEC12A کے کردار کی نشاندہی کرتا ہے۔ سیل ریپ. 11، 1905-1918۔ 10.1016/j.celrep.2015.05.045

Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF, and Artis, D. (2017). میزبان کے ساتھ مائکرو بائیوٹا تعاملات کے ذریعہ سوزش کا ضابطہ۔ نیٹ امیونول۔ 18، 851-860۔ 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA, and Caporaso, JG (2018)۔ QIIME 2''sq2-فیچر کلاسیفائر پلگ ان کے ساتھ مارکر-جین ایمپلی کون سیکوینسز کی درجہ بندی کو بہتر بنانا۔ مائکرو بایوم 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

بولین، ای، رائڈ آؤٹ، جے آر، ڈیلن، ایم آر، بوکولیچ، این، ابنیٹ، سی سی، الغالیتھ، جی اے، الیگزینڈر، ایچ، الم، ای جے، ارموگم، ایم، اسنیکار، ایف، وغیرہ۔ (2019)۔ QIIME 2 کا استعمال کرتے ہوئے قابل تولید، انٹرایکٹو، توسیع پذیر، اور قابل توسیع مائکرو بایوم ڈیٹا سائنس۔ بائیو ٹیکنالوجی 37، 852-857۔ 10.1038/s41587-019-0209-9۔

براؤن، جی ڈی، ولمنٹ، جے اے، اور وائٹ ہیڈ، ایل (2018)۔ استثنیٰ اور ہومیوسٹاسس میں سی قسم کے لیکٹینز۔ نیٹ Rev. Immunol. 18، 374-389۔ 10.1038/s41577-018-0004-8۔

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., and Lawley, TD (2016)۔ 'غیر ثقافتی' انسانی مائیکرو بائیوٹا کی ثقافت نوول ٹیکسا اور وسیع اسپورولیشن کو ظاہر کرتی ہے۔ فطرت 533، 543-+۔ 10.1038/Nature17645۔

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., et al. (2008)۔ ماؤس اور انسانی آنتوں کے پینتھ خلیوں میں آٹوفجی اور آٹوفجی جین Atg16l1 کے لیے کلیدی کردار۔ فطرت 456، 259-263۔ 10.1038/Nature07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA, and Holmes, SP (2016)۔ DADA2: Illumina amplicon ڈیٹا سے اعلی ریزولوشن نمونہ کا اندازہ۔ نیٹ طریقے 13، 581-+۔ 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., and Garrett, WS (2022)۔ Faecalibaculum rodentium eosinophil پر منحصر آنتوں کے اپکلا ہومیوسٹاسس کو کنٹرول کرنے کے لیے ریٹینوک ایسڈ سگنلنگ کو دوبارہ تیار کرتا ہے۔ سیل ہوسٹ اور مائکروب 30، 1295- 1310 e1298۔ 10.1016/j.chom.2022.07.015

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK, and Kim, BC (2015)۔ فیکلیباکولم روڈینٹیم جین۔ نومبر، ایس پی nov.، لیبارٹری ماؤس کے پاخانے سے الگ تھلگ۔ Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318۔ 10.1007/s10482-015-0583-3۔

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., et al. (2017)۔ گٹ مائکوبیوٹا کا ایک رکن میزبان پیورین میٹابولزم کو ماڈیول کرتا ہے جو چوہوں میں کولائٹس کو بڑھاتا ہے۔ سائنس ترجمہ میڈ. 9،

Drouin, M., Saenz, J., and Chiffoleau, E. (2020)۔ سی ٹائپ لیکٹین نما رسیپٹرز: سیل ڈیتھ امیونٹی میں سر یا دم۔ سامنے والا۔ امیونول۔ 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

فاسریلا، ایم، بلیک، ای ای، پینڈرز، جے، نوٹا، اے، سمڈٹ، ایچ، اور زوٹینڈل، ای جی (2021)۔ گٹ مائکرو بایوم استحکام اور لچک: گٹ کی صحت کو ماڈیول کرنے کے لئے گڑبڑ کے ردعمل کو واضح کرنا۔ گٹ 70، 595-605۔ 10.1136/gutjnl-2020-321747۔

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C., and Eliopoulos, AG (2014)۔ آنتوں کی سوزش کی بیماری کے ماؤس ماڈلز میں گٹ مائکرو بائیوٹا۔ سیلولر اور انفیکشن مائکرو بایولوجی میں فرنٹیئرز 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T., and Cao, XT (2004)۔ KLRL1، ایک ناول قاتل سیل لیکٹین نما رسیپٹر، قدرتی قاتل سیل کی سائٹوٹوکسٹی کو روکتا ہے۔ خون 104، 2858-2866۔ DOI 10.1182/خون-2004-03-0878۔

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., et al. (2012)۔ کامنسل فنگس اور سی قسم کے لیکٹین ریسیپٹر ڈیکٹن-1 کے درمیان تعامل کولائٹس کو متاثر کرتے ہیں۔ سائنس 336، 1314-1317۔ 10.1126/science.1221789.

Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Pots, Peter E. Jensen, Ryan M. O' کونیل اور جون ایل راؤنڈ (2015)۔ MHC تغیرات انفرادی مائکروبیل کمیونٹیز کا مجسمہ بناتے ہیں جو آنتوں کے انفیکشن کی حساسیت کو کنٹرول کرتے ہیں۔ نیچر کمیونیکیشن۔ 0.1038/ncomms9642۔

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F., and Rock, KL (2010)۔ یورک ایسڈ چوہوں میں جراثیم سے پاک خلیوں کی موت پر شدید اشتعال انگیز ردعمل کو فروغ دیتا ہے۔ جے کلین سرمایہ کاری کریں۔ 120، 1939-1949۔ 10.1172/Jci40124۔

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK, and Schloss, PD (2013)۔ MiSeq Illumina Sequencing پلیٹ فارم پر ایمپلی کون سیکوینس ڈیٹا کا تجزیہ کرنے کے لیے ڈوئل انڈیکس کی ترتیب کی حکمت عملی اور کیوریشن پائپ لائن کی ترقی۔ اطلاقی اور ماحولیاتی مائکرو بایولوجی 79، 5112-5120۔ 10.1128/Aem۔{6}}۔

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM, and Round, JL (2015). ٹی سیلز میں MyD88 سگنلنگ صحت کو فروغ دینے کے لیے مائکرو بائیوٹا کے IgA ثالثی کنٹرول کی ہدایت کرتا ہے۔ سیل ہوسٹ مائکروب 17، 153-163۔ 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS, and Ruland, J. (2019)۔ یورک ایسڈ کرسٹل ریسیپٹر Clec12A قسم I انٹرفیرون کے ردعمل کو ممکن بناتا ہے۔ Proc Natl Acad Sci USA 116، 18544-18549۔ 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T., et al . (2015)۔ ایسوسی ایشن کے تجزیے سوزش والی آنتوں کی بیماری کے لیے 38 حساسیت والے مقام کی نشاندہی کرتے ہیں اور آبادی میں مشترکہ جینیاتی خطرے کو نمایاں کرتے ہیں۔ نیٹ جینیٹ 47، 979-986۔ 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W., and Anders, S. (2014)۔ DESeq2 کے ساتھ RNA-seq ڈیٹا کے لیے فولڈ تبدیلی اور بازی کا معتدل تخمینہ۔ جینوم بائیول۔ 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8۔

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M., and Patro, R. (2020)۔ Tximeta: RNA-seq میں پرووینس شناخت کے لیے حوالہ ترتیب چیکسم۔ پلس کمپیوٹیشنل بائیولوجی 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC, and Casadevall, A. (2005). Fc- اور complement-receptor ایکٹیویشن G1 سے SJ Immunol تک میکروفیج سیلز کے سیل سائیکل بڑھنے کو متحرک کرتا ہے۔ 174، 7226- 7233۔ 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H., and Zinkernagel, RM (2000). کامنسل بیکٹیریا پر آنتوں کے میوکوسل IgA ردعمل کا ایک قدیم T سیل سے آزاد میکانزم۔ سائنس 288، 2222-+۔ DOI 10.1126/science.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH, and Lepenies, B. (2014)۔ سی قسم کے لیکٹین ریسیپٹر بائنڈنگ کاربوہائیڈریٹس اور سیل کے لیے مخصوص ہدف اور مدافعتی ماڈیولیشن کے لیے ان کی صلاحیت کو اسکرین کرنے کے لیے ایک پلیٹ فارم۔ جرنل آف کنٹرولڈ ریلیز 175، 36-42۔ 10.1016/j.jconrel.2013.12.011۔

Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S., and Brown, GD (2004). ایک ناول ہیومن مائیلائڈ انحیبیٹری سی ٹائپ لیکٹین نما رسیپٹر (MICL) کی شناخت اور خصوصیت جو بنیادی طور پر گرینولوسائٹس اور مونوکیٹس پر ظاہر ہوتی ہے۔ J. Biol کیم 279، 14792-14802۔ 10.1074/jbc.M313127200۔

مارٹن، ایم (2011)۔ Cutadapt اعلی تھرو پٹ سیکوینسنگ ریڈز سے اڈاپٹر کی ترتیب کو ہٹاتا ہے۔ EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Man, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro ، ایم، لورینزو، ایم پی، وغیرہ۔ (2019)۔ ڈینڈریٹک سیلز میں منکل سائک ایکسس کے ذریعے مائیکرو بائیوٹا سینسنگ انٹرلییوکن-17 اور -22 کی پیداوار کو منظم کرتی ہے اور آنتوں کی رکاوٹ کی سالمیت کو فروغ دیتی ہے۔ استثنیٰ 50، 446-461 e449۔ 10.1016/j.immuni.2018.12.020

مارٹنن، ایف، پیٹریلی، وی.، میئر، اے.، ٹارڈیول، اے.، اور سکوپ، جے. (2006)۔ گاؤٹ سے وابستہ یورک ایسڈ کرسٹل NALP3 سوزش کو چالو کرتے ہیں۔ فطرت 440، 237-241۔ 10.1038/Nature04516.

Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., ET رحمہ اللہ تعالی. (2018)۔ IgA بیکٹیریا کے درمیان سمبیوسس کو فروغ دے کر گٹ مائکروبیٹا کی ساخت اور میٹابولک فنکشن کو منظم کرتا ہے۔ J. Exp. میڈ. 215، 2019-2034۔ 10.1084/jem.20180427۔

نیومن، K.، Castineiras-Vilarino، M. Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. ، ET رحمہ اللہ تعالی. (2014)۔ Clec12a یورک ایسڈ کرسٹل کے لئے ایک روک تھام کرنے والا ریسیپٹر ہے جو سیل کی موت کے جواب میں سوزش کو کنٹرول کرتا ہے۔ استثنیٰ 40، 389-399۔ 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S. Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., et al (2016)۔ ہائی فینیٹی مونوکلونل آئی جی اے گٹ مائکرو بائیوٹا کو منظم کرتا ہے اور چوہوں میں کولائٹس کو روکتا ہے۔ Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Pabst, O., and Slack, E. (2020)۔ آئی جی اے اور آنتوں کا مائکرو بائیوٹا: مخصوص ہونے کی اہمیت۔ میوکوسل امیونول۔ 13، 12-21۔ 10.1038/s41385-019-0227-4۔

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA, and Hugenholtz, P. (2018)۔ جینوم فائیلوجنی پر مبنی ایک معیاری بیکٹیریل درجہ بندی زندگی کے درخت پر کافی حد تک نظر ثانی کرتی ہے۔ نیٹ بائیو ٹیکنالوجی 36، 996-+۔ 10.1038/nbt.4229۔

Patro, R. Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, and Kingsford, C. (2017)۔ سالمن ٹرانسکرپٹ اظہار کی تیز رفتار اور تعصب سے آگاہ مقدار فراہم کرتا ہے۔ نیٹ طریقے 14، 417-+۔ 10.1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., ET رحمہ اللہ تعالی. (2011)۔ Scikit-learn: Python میں مشین لرننگ۔ J Mach Learn Res 12، 2825-2830۔

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR, and Brown, GD (2008). مورین MICL (CLEC12A) کی خصوصیت اور اینڈوجینس لیگنڈ کے ثبوت۔ یور J. Immunol. 38، 1157-1163۔ 10.1002/eji.200738057۔

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., ET رحمہ اللہ تعالی. (2019)۔ سی قسم کا لیکٹین ریسیپٹر CLEC12A پلازموڈیل ہیموزائن کو تسلیم کرتا ہے اور دماغی ملیریا کی نشوونما میں معاون ہے۔ سیل ریپ. 28، 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015

Ray, A., and Dittel, BN (2015)۔ امیونو کی کمی اور کولائٹس کی بیماری کے دخول کی وجہ سے گٹ مائکرو بائیوٹا میں dysbiosis کے درمیان باہمی تعلق۔ امیونولوجی 146، 359-368۔ 10.1111/imm.12511۔

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA, et al. (2016)۔ MICL رمیٹی سندشوت میں سوزش کو کنٹرول کرتا ہے۔ این۔ ریم ڈس 75، 1386-1391۔ 10.1136/annrheumdis-2014-206644.