جنین اور پیرینیٹل ہیومن ایمنیٹک فلوئڈ اسٹیم سیلز سے سیکریٹوم فارمولیشنز کی جامع پروفائلنگ

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

مزید برآں، جیسا کہ اعداد و شمار 5B اور 6B میں بار چارٹس سے، سیکریٹنگ سیل ہائپوکسک پیشگی شرط کے مطابق پروٹین کی مخصوص تقسیم قابل تعریف ہے۔ اس معاملے میں، مکمل معلومات کے لیے، ایسے پروٹین جو ڈی اے وی اور ڈی سی آئی سیٹ کی حد سے زیادہ نہیں ہوتے بھی رپورٹ کیے گئے۔ جنین کے ہائپوکسک فارمولیشن میں 60 kDa ہیٹ شاک پروٹین (HSPD1، فگر 5B، بائیں پینل) کے ساتھ افزودہ سیکروم نتائج ہوتے ہیں، جبکہ پیری نیٹل ہموار ہموار پٹھوں کے خلیے کے کانٹریکٹائل مائیوسین ریگولیٹری [52] لائٹ پولی پیپٹائڈ 9 (MYL9، Figure) 5B، دائیں پینل)۔ حمل کے مراحل کے درمیان فرق کا ایک اہم حصہ HAFS میں ہائپوکسک پیشگی شرط پر زیادہ انحصار کرتا ہے۔ ای وی ہائپوکسک سیل پرائمنگ سے حاصل کردہ f-have-EVs پرلیکن (HSPG2)، Agrin (AGRN)، Laminin Subunit -5، اور -1 (LAMA5 اور LAMB1)، Thrombospondin{17 سمیت عوامل سے افزودہ پائے گئے۔ }} (THBS1، شکل 6B، بائیں پینل)۔ ہائپوکسک p-hAFS-EVs میں فیریٹین ہیوی چین (FTH1)، سکیفولڈنگ پروٹین جیسے Flotillin-1(FLOT1)، Fascin (FSCN1)، Annexin A6 (ANXA6)، Rab GDP dissociation inhibitor beta (GDI2) شامل ہیں -1 جھلی گلائکوپروٹین (THY1)، Neuropilin-1(NRP1) اور میٹرکس Metalloprotein 14 (MMP14، Figure6B، دائیں پینل)۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

f-hAFS میں ہر جانچ شدہ حالت میں کم از کم 2 کی فریکوئنسی کے ساتھ پروٹین پائے گئے۔ EVs اور p-hAFS-EVs کا مزید موازنہ Vesciclepedia ڈیٹا بیس [53] سے کیا گیا۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، شناخت شدہ پروٹینوں کی اکثریت (96 فیصد) پہلے حوالہ ڈیٹا بیس (فگر S3A) میں EVs اور exosomes میں بیان کی گئی ہے۔cistanche فوائداس سلسلے میں، جین اونٹولوجی (GO) کی افزودگی کا تجزیہ FunRich [54] کے ذریعے کیا گیا۔ ڈیٹاسیٹ میں GO اصطلاحات کی کثرت کا موازنہ حوالہ ڈیٹا بیس میں ان کی قدرتی مقدار کے مقابلے میں کیا گیا تاکہ اعداد و شمار کے لحاظ سے پروٹین کے زیادہ نمائندگی والے گروپوں کو تلاش کیا جا سکے، حیاتیاتی عمل، مالیکیولر فنکشن، اور سیلولر اجزاء میں ان کی شمولیت کے مطابق (اس آخری پہلو کے لیے ڈیٹا نہیں ہے دکھایا گیا ہے، لیکن درخواست پر دستیاب ہے)۔ شناخت شدہ پروٹینوں سے وابستہ مالیکیولر افعال کے تجزیے کے بارے میں، hAFS-CM فریکشنز نے ایکسٹرا سیلولر میٹرکس اور cytoskeleton، cytoskeletal پروٹین بائنڈنگ، اور ساختی مالیکیول ایکٹیویٹی (Figure S2) میں افزودگی کا اشارہ کیا، جبکہ hAFS-EVs کو افزودہ کیا گیا تھا۔ سائٹوسکلٹن اور رائبوزوم کا جزو، ڈی این اے اور آر این اے بائنڈنگ اور جی ٹی پیس اور چیپیرون بائنڈنگ فیکٹرز (فگر S3C)۔

دونوں hAFS-CM اور have-EVs کے لیے حیاتیاتی عمل کی افزودگی کے تجزیے نے اشارہ کیا کہ جنین اور پیرینیٹل hAFS سیکروم فریکشن میں ماڈیول کردہ پروٹین کی اکثریت کا تعلق سیل کی نشوونما / دیکھ بھال اور پروٹین میٹابولزم (اعداد و شمار 5C اور 6C) سے ہے۔ hAFS-EVs کے اندر ہم نے دیکھا کہ "ایکسٹرا سیلولر میٹرکس ساختی اجزاء" کی اصطلاح خصوصی طور پر ہائپوکسک f-hAF-EVs کے ساتھ وابستہ تھی۔ اصطلاحات "کیلشیم آئن بائنڈنگ" اور "ساختی سالماتی سرگرمی" بنیادی طور پر ہائپوکسک f-hAFS اور p-hAFS نمونوں (شکل S3B) میں افزودہ تھیں۔

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I اور ایک DCI (تفرقی اظہار کا اعتماد) I5I سے زیادہ یا اس کے برابر فلٹرز کو پاس کیا اور انہیں امتیازی اظہار خیال کیا گیا۔ رپورٹ شدہ پروٹین کی مکمل فہرست اور تفصیلی پیرامیٹرز کے لیے ٹیبل S3 دیکھیں۔ (C) ہائپوکسک پیشگی شرط کے بعد f-hAFS-EVs (بائیں پینل) اور p-hAFS-EVs (دائیں پینل) میں کم از کم 2 کی فریکوئنسی کے ساتھ شناخت شدہ پروٹینوں کے حیاتیاتی عمل کی افزودگی کا تجزیہ۔ فن رِچ ٹول کی بنیاد پر، جین آنٹولوجی کی اصطلاحات بار چارٹس میں دکھائی جاتی ہیں جو ہر زمرے کے لیے افزودہ جینز کے فیصد کی اطلاع دیتے ہیں (f-hAFS-EVsnormo کے لیے گہرے پیلے رنگ کی سلاخیں، f-hAFS-EVShypo کے لیے سرخ سلاخیں، p-hAFS کے لیے ہلکے سبز رنگ کی سلاخیں p-hAFS-EVShypo کے لیے EVsnormo اور گہرے سبز رنگ کی سلاخیں)۔ بونفرونی کے ساتھ صرف جین آنٹولوجی کی اصطلاحات درست کی گئی*p<0.05 are="">

Cistanche مخالف عمر رسیدہ کر سکتے ہیں

2.6. جنین بمقابلہ پیرینیٹل کی سائٹوکائن اور کیموکائن پروفائلنگ ہے-CM اور ہے-EVs نے تقسیم کے مختلف نمونوں کو ظاہر کیا ہے۔

ہم نے پہلے پیراکرائن اثرات [34,35,49] کے ذریعے زخمی قلبی خلیوں پر f-hAFS-CMhypo کی دوبارہ تخلیقی صلاحیت کی توثیق کی ہے۔ یہاں ہم نے f-hAFS-CMHypo کے سائٹوکائن اور کیموکائن مواد کا موازنہ اسی p-hAFS ہم منصب (فگر 7A، فگر S4A، اور ٹیبل S4) سے کیا اور کچھ امتیازی عوامل پائے۔

ANGIOGENIN، Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN)، Interleukin 8 (IL-8)، اور Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) خصوصی طور پر افزودہ inf-hAFS-CMNypo پائے گئے تھے اور نہیں تھے۔ p-hAFS-CMhypo میں پتہ چلا۔ انسولین نما گروتھ فیکٹر بائنڈنگ پروٹین 2 (IGFBP2) اور Osteopontin (OPN) میں f-hAFS-CMhypo میں p-hAFS-CMHypo کے مقابلے میں 3 کا نمایاں اضافہ ہوا ہے۔{16}}اور 3۔{18}}گنا (" ص<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

جبکہ جنین بمقابلہ پیرینیٹل ہے-سی ایم نے اپنے سائٹوکائن اور کیموکائن پروفائل میں تفریق کا اظہار دکھایا، اسی برانن بمقابلہ پیرینیٹل ای وی ہم منصبوں کو زیادہ یکساں طور پر تقسیم کیا گیا تھا، حالانکہ کم اظہار والے پروفائلز کے ساتھ (شکل 7B، شکل S4B، اور ٹیبل S5)۔ بہر حال، کچھ فرقوں کی تعریف کی جا سکتی ہے: DiPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV)، نمو/تفرقی عنصر 15 (GDF-15)، اور IL-8 کا اظہار صرف f-hAFS-EVSHypo کے ذریعے کیا گیا، حالانکہ کم ہے۔ سطح ANGIOPOIETIN2، CD40 LIGAND اور وٹامن ڈی بائنڈنگ پروٹین (VDBP) صرف p-hAFS-EVShypo میں پائے گئے، اس کے باوجود ایک بار پھر کم مقدار میں پتہ چلا۔ دیگر سائٹوکائنز جیسے دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک فیکٹر (BDNF)ENDOGLIN، FGF-19، انسولین نما گروتھ فیکٹر بائنڈنگ پروٹین 3 (IGFBP3)، IL-17a، MIF OPN، PTX3، Stromal Dirived Factor-19 {23}} الفا (SDF-1a)، دونوں f-hAFS-EVShypo اور p-hAFS-EVSHvpo میں پائے گئے، PAI-1 اور EMMPRIN کے ساتھ زیادہ اظہار خیال کیا گیا ہے (شکل 7B)

BDNF، ENDOGLIN، IGFBP3، اور SDF-lo خصوصی طور پر تمام ہائپوکسک ہیو-ای وی میں اسی HAFS-CM کے مقابلے میں افزودہ تھے، قطع نظر حمل کے مرحلے سے۔ مزید برآں، جبکہ EMMPRIN کا پتہ p-hAFS-CMhypo کے اندر نہیں پایا گیا، یہ EV متعلقہ حصے میں افزودہ پایا گیا۔ اس کے برعکس، OPN f-have-EVShypo کے مقابلے f-have-CMhypo میں زیادہ پایا جاتا تھا، جبکہ اس کا موازنہ p-hAFS سیکروم فریکشن کے درمیان ہوتا تھا۔ FGF-19,MIF، اور PTX3 کا اظہار برانن اور پیرینیٹل has-CM اور متعلقہ hAFS-EVs دونوں میں اسی طرح کیا گیا تھا۔ PAI-1 ہائپوکسک سیکروم فریکشنز میں بہت زیادہ افزودہ تھا۔

تصویر 7. جنین- اور پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس سیکروم فارمولیشن کے اندر سائٹوکائن اور کیموکائن کی پروفائلنگ۔ (A) ہائپوکسک فیٹل بمقابلہ پیرینیٹل ہیو-سی ایم (f-hAFS-CMHypo بمقابلہ p-hAFS-CMHypo) کے اندر پائے جانے والے سائٹوکائنز اور کیموکائنز کا اظہار صوابدیدی یونٹ [AU] کے ذریعہ پکسل کثافت میں رپورٹ کیا جاتا ہے۔ اقدار کا اظہار آزاد تجربوں کے اوسط ±sem کے طور پر کیا جاتا ہے اور ٹیبل S4 میں رپورٹ کیا جاتا ہے؛*p=0.0485;**p=0.006. (B) ہائپوکسک جنین میں پایا جانے والا سائٹوکائن اور کیموکین مواد بمقابلہ پیرینیٹل hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo بمقابلہ p-hAFS-EVSHypo) اور صوابدیدی اکائیوں [AU] میں پکسل کثافت کے ذریعہ ظاہر کیا گیا ہے۔cistanche کولیسٹرولاقدار کو n=3 آزاد تجربوں کے اوسط ±سیم کے طور پر ظاہر کیا گیا ہے اور ٹیبل S5 میں رپورٹ کیا گیا ہے۔ CST3: Cystatin C;EMMPRIN:Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer;FCFF-19: Fibroblast Growth Factor-19;IGFBP2:انسولین نما گروتھ فیکٹر(IGF) بائنڈنگ پروٹین 2;IL{8}}:Interleukin -8;IL-17a:Interleukin-17a; MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1;MIF:Macrophage migration inhibitory factor; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Plasminogen Activator inhibitor-1; BDNF: دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک فیکٹر؛ DPPIV:Dipptidyl Peptidase IV؛ GDF-15:گروتھ تفریق کا عنصر-15;IGFBP3:انسولین نما گروتھ فیکٹر(IGF)بائنڈنگ پروٹین 3;SDF-1a: Stromal Derived Factor-1 الفا; VDBP: وٹامن ڈی بائنڈنگ پروٹین۔

2.7.Fetal-اور Perinatal have-EVs ان کے کارگو میں RNA کی معلومات سے بھرپور ہوتے ہیں

چونکہ چھوٹے نان کوڈنگ والے RNAs کو ٹارگٹ سیلز [4,55] پر EV پیراکرائن اثر و رسوخ کا ماسٹر ریگولیٹر سمجھا جاتا ہے، اس لیے ہم نے بنیادی طور پر f-hAFS-EVs اور p-hAFS-EVs کے اندر مائکرو آر این اے (miRNA) مواد پر RNA کی ترتیب کے تجزیہ پر توجہ مرکوز کی۔ چھوٹی RNA پروفائلنگ نے جنین- اور پیرینیٹل hAFS-EVs (تقریبا 35-36 فیصد) دونوں میں miRNA کی افزودگی ظاہر کی جب کل ​​چھوٹی RNA رقم (شکل 8A) کے مقابلے میں۔ miRNA جزو درحقیقت دونوں EV فارمولیشنوں میں سب سے زیادہ نمائندگی کرنے والی RNA پرجاتیوں میں سے تھا، ساتھ ساتھ rRNA(***p) p < 0.0001)۔="" درج="" ذیل="" mirnas="" کا="" تجزیہ="" کیا="" گیا="" ev="" نمونوں="" میں="" سب="" سے="" زیادہ="" افزودہ="" کیا="" گیا:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,let-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" اور="" mir-221-3p.="" قابل="" غور="" بات="" یہ="" ہے="" کہ="" جنین-="" اور="" پیدائشی="" طور="" پر="" ای="" وی="" نے="" اس="" طرح="" کے="" زیادہ="" تر="" mirnas="" کا="" اشتراک="" کیا="" (یعنی="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47}="" }}f-5p,="" let-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" اور="" mir-221-3p،="" figure7b)۔="" 15="" سب="" سے="" زیادہ="" افزودہ="" mirnas="" پرجاتیوں="" نے="" ہر="" نمونے="" میں="" کل="" mirna="" مواد="" کا="" 60="" فیصد="" سے="" زیادہ="" احاطہ="" کیا۔="" دوسری="" طرف،="" تقریباً="" 100="" mirnas="" باقی="" 30="" فیصد="" ویسکولر="" mirna="" مواد="" (شکل="" 8c)="" میں="" پائے="">

hAFS-EVs کے اندر miRNA مواد کو مزید نمایاں کرنے کے لیے، ہم نے تفتیش کی کہ آیا hAFS حملاتی مرحلے یا وٹرو ہائپوکسک سیل کی پیشگی شرط مخصوص miRNAs کی افزودگی کو متاثر کر سکتی ہے۔ سب سے مضبوط ماڈیولیشن حمل کے مراحل کے درمیان پائی گئی تھی، جہاں تقریباً تمام ماڈیولڈ miRNAs کو f-hAFS-EVs میں پیرینیٹل ہم منصب (شکل 9A اور جدول 1) کے مقابلے میں افزودہ کیا گیا تھا۔ ہائپوکسک پیشگی شرط کا miRNA کارگو پر ہلکا اثر پڑا، جبکہ اس مقابلے میں ماڈیولیشن دونوں سمتوں میں تھی، جس میں کچھ miRNA ہائپوکسک میں افزودہ تھا- اور دیگر نارموکسک کنٹرول کے حالات میں (شکل 9A)۔

ایک تکمیلی تجزیہ کے طور پر، ہم نے مختلف عطیہ دہندگان اور کلچر کی پیشگی شرط میں سب سے کم تغیر کے ساتھ تفتیش شدہ miRNAs کی شناخت پر توجہ مرکوز کی، دونوں تفتیشی حمل کے مراحل سے اخذ کردہ EVs کے لیے۔ اس تجزیہ کے نتیجے میں miRNAs اعلی سے کم اظہار کی سطح تک پھیلے ہوئے ہیں (شکل 9B)۔ hAFS-EVs کارگو کے انتہائی مستحکم miRNA کور کے اندر، f-hAFS-EVs اور p-hAFS-EVs کے درمیان کچھ مشترکہ miRNA کی نشاندہی کی گئی تھی (miR-21-5p، miR-29a-3 p، اعلی سطح پر miR-16-5p؛ miR-221-3p,miR-221-5p اور miR-22-3p مدھم سطح پر، ٹیبل 2)۔

شکل 9. جنین- اور پیرینیٹل hAFS-EVs میں miRNAs کی تفریق افزودگی کا تجزیہ۔ (A) حملاتی مرحلے (بائیں پینل) کے مطابق hAFS-EV miRNA کارگو کی تفریق افزودگی کے لئے آتش فشاں پلاٹ اور خفیہ خلیوں کی وٹرو ہائپوکسک پیشگی شرط (دائیں پینل)۔ miRNA کی تفصیلات کے لیے، براہ کرم ٹیبل 1 سے رجوع کریں۔ (B) اعلی (پیلے رنگ کے نقطوں) کے مطابق جنین hAFS-EVs (بائیں پینل) اور پیرینیٹل hAFS-EVs (دائیں پینل) کے اندر مستحکم miRNAs کے تغیر (X محور) اور افزودگی کی سطح (Y محور) کے درمیان ارتباط کا سکیٹر پلاٹ، مدھم (سبز نقطے) اور کم (گہرے جامنی رنگ کے نقطے) افزودگی۔ miRNA کی تفصیلات کے لیے، براہ کرم ٹیبل 2.RPM دیکھیں: ریڈز فی ملین۔

3. بحث

انسانی امینیٹک سیال کے بچ جانے والے ضائع شدہ نمونوں کی شناخت سٹرومل سیلز کے ایک قیمتی ذریعہ کے طور پر کی گئی ہے جن کی دوبارہ تخلیقی ادویات اور ٹشو انجینئرنگ میں امید افزا صلاحیت ہے۔ ان کی تنہائی سے وابستہ اخلاقی خدشات کم سے کم ہیں، کیونکہ وہ پیدائش سے پہلے کی معمول کی اسکریننگ ایمنیوسینٹیسیس کے بچ جانے والے نمونوں سے، حمل کے II سہ ماہی (جنین ایچ اے ایف ایس) کے دوران، یا III سہ ماہی کے شیڈول C-سیکشن میں طبی فضلہ کے طور پر ضائع کیے گئے امینیٹک سیال سے حاصل کیے جا سکتے ہیں۔ طریقہ کار (پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس)۔ حالیہ برسوں میں، تجرباتی بیماری کے ماڈلز سے حاصل کیے گئے حوصلہ افزا شواہد کے پیش نظر، ایچ اے ایف ایس کو انسانی بافتوں کی مرمت اور تخلیق نو کے لیے ممکنہ علاج کے طور پر تجویز کیا گیا ہے۔ مزے کی بات یہ ہے کہ ان کو جنین نوزائیدہ اعصابی امراض کی utero تھراپی میں بھی تجویز کیا گیا ہے۔ درحقیقت، طبی مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ایچ اے ایف ایس نے پیدائش سے پہلے انٹرا ایمنیٹک ڈلیوری کے ذریعے حمل کے دوران ریڑھ کی ہڈی کی حفاظت مائیلومیننگوسیل کے چوہے کے ماڈل میں پیراکرائن سرگرمی کے ذریعے کی، اور تجرباتی چوہا گیسٹروچیسس میں بے نقاب آنتوں کے نقصان کو کم کیا[59 ] ترجمہی نقطہ نظر سے، ایچ اے ایف ایس کی یوٹرو ٹرانسپلانٹیشن کو ان کے سیکروم (hAFS-CM یا hAFS-EVs) کی سب سے مناسب تیاری کی انتظامیہ کے ذریعہ تبدیل کیا جاسکتا ہے۔cistanche deserticola کے ضمنی اثراتیہ حکمت عملی حمل کے دوران کینونیکل سیل تھراپی کی حدود پر قابو پا کر فوری اور بروقت مداخلت کی اجازت دے گی (یعنی وٹرو سیل کی توسیع میں وقت کا استعمال) جبکہ آف دی شیلف اور استعمال کے لیے تیار فارماسیوٹیکل فارمولیشنز فراہم کرتی ہے۔

کم ناگوار قبل از پیدائش کی تشخیصی تکنیکوں کی حالیہ ترقی کے نتیجے میں مستقبل قریب میں ایمنیوسینٹیسیس کے طریقہ کار میں کمی واقع ہو سکتی ہے، اس طرح پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس کو زیادہ قابل رسائی آپشن کے طور پر آگے بڑھانا ہے۔ بہر حال، چونکہ جنین کے ایچ اے ایف ایس زیادہ نشوونما کے لحاظ سے ناپختہ ہوتے ہیں، اس لیے ان میں پیراکرائن کی زیادہ موثر صلاحیت ہو سکتی ہے۔ اس منظر نامے کے اندر، یہاں ہم نے fetal- اور perinatal c-KITt hAFS کا موازنہ کیا اور ہم نے ان کے خفیہ حصوں کی پروفائلنگ پر توجہ دی۔ ہم نے ان کی پیراکرین کی صلاحیت کے ممکنہ طبی ترجمہ کے لیے متعلقہ امتیازات پر روشنی ڈالی۔

پچھلے آزاد مطالعات کے ساتھ معاہدے میں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ حمل کے مرحلے نے متضاد HAFS مورفولوجی اور ان کے mesenchymal antigen پروفائل [25,26] کو متاثر نہیں کیا۔ اس کے بعد ہم نے پیرامیٹرز کا اندازہ کیا کہ سیل سکریٹری اور پیراکرائن سرگرمی کو کیننیکل اسٹروومل امیونو فینوٹائپ سے زیادہ متاثر کرنے کا امکان ہے۔ خاص طور پر بون میرو mesenchymal progenitors کے اندر CD146-مثبت، CD107a-اعلی ذیلی آبادی کی موجودگی کو حال ہی میں قابل ذکر ماڈیولیٹری اور علاج معالجے کی پیراکرین سرگرمی کے ساتھ تعلق ظاہر کیا گیا ہے [47]۔ یہاں ہم نے انکشاف کیا کہ جنین- اور پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس دونوں کی مضبوطی سے اس سالماتی دستخط کی خصوصیت ہے جو متعلقہ مترجم مضمرات کے ساتھ ان کی خفیہ طاقت کی حمایت کرتی ہے۔ مزید برآں، برانن کے ایچ اے ایف ایس میں غیر موثر ایروبک میٹابولزم کی خصوصیت تھی، جب کہ زیادہ بالغ پیرینٹل میں آکسیجن کی کھپت کی شرح اور اے ٹی پی کی ترکیب زیادہ دکھائی دیتی ہے۔ یہ II سہ ماہی ایچ اے ایف ایس کے ایک زیادہ ناپختہ میٹابولک پروفائل کا مشورہ دے سکتا ہے جو قبل از وقت نوزائیدہ بچوں کے نال کے اسٹروومل خلیوں سے ملتا جلتا ہے، جس نے ایک ہی رجحان دکھایا ہے [60]۔

پیراکرائن کی صلاحیت کو متحرک کرنے کے لیے، ایچ اے ایف ایس کو 24 گھنٹے سیرم فری ہائپوکسک پرائمنگ کا سامنا کرنا پڑا، یہ حکمت عملی ہم نے پہلے جنین کے خلیوں کے لیے [34,35,37] کامیابی کے ساتھ تیار کی ہے اور یہاں ہم نے پہلی بار ان کے پیرینیٹل ہم منصب پر تحقیق کی۔ ہائپوکسیا کے تحت جنین اور پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس کی پیشگی شرط کے نتیجے میں ان کے سیکروم کی حراستی میں اضافہ اور ای وی کی مقدار میں مثبت رجحان پیدا ہوا، جب کہ حمل کے مرحلے کا سیل سیکروم کی پیداوار پر کوئی اثر نہیں پڑا اور نہ ہی ای وی کی شکل اور سائز کی تقسیم پر۔

خاص طور پر، ایچ اے ایف ایس پیراکرائن کارگو کی خصوصیت نے کچھ مخصوص اختلافات کو ظاہر کیا، مختلف حالات کے مطابق جن کا ہم نے جائزہ لیا۔ جنین ایچ اے ایف ایس سیکروم کی پروٹومک پروفائلنگ نے حمل کے مرحلے اور سیل ہائپوکسک پیشگی شرط پر مبنی فیکٹر کی تقسیم کا انکشاف کیا۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ایچ اے ایف ایس پیراکرائن پوٹینشل Ⅱ سے Ⅲ حمل کے سہ ماہی کے دوران پختگی کے دوران ایک الگ شناخت حاصل کر سکتی ہے جس کے نتیجے میں وٹرو میں سیکریٹنگ سیلز کو متحرک کر کے ماڈیول کیا جا سکتا ہے۔ hAFS-CM اور hAFS-EVs کے حیاتیاتی عمل کی افزودگی کے تجزیے نے تجویز کیا کہ زیادہ تر ماڈیولڈ پروٹینز سیل کی نشوونما / دیکھ بھال اور پروٹین میٹابولزم سے متفق ہو سکتے ہیں، اس طرح سیل کے فائدہ مند پاراکرین اثرات کی حمایت کرتے ہیں۔ خاص طور پر، ہائپوکسک فیٹل ایچ اے ایف ایس کل سیکروم ہیٹ شاک پروٹین HSPD1 (HSP60) سے افزودہ پایا گیا تھا، جس کا مظاہرہ ذیابیطس کے ماؤس کی جلد کی چوٹ کے ماڈل میں زخم کی شفا یابی کی حمایت کرنے اور M2 فینوٹائپ [61] میں میکروفیج پرو ریزولونگ سکیونگ کو فروغ دینے کے لیے کیا گیا تھا۔ . اسی طرح، ہائپوکسک فیٹل hAFS-EVs کو نیوروجنسیس (HSPG2[62]، سیل کی خود کی تجدید، اور دماغ اور قلبی نشوونما (LAMA5[63]اور LAMB1[64]اور ہجرت (THBS1 [2])) کو فروغ دینے والے عوامل کے لیے افزودہ کیا گیا تھا۔ جنین ایچ اے ایف ایس کی ہائپوکسک پرائمنگ کے بعد ای وی میں AGRN بھی پایا گیا۔cistanche dosage redditہمارے نتائج سوزش اور ہائپوکسک تدریسی محرکات [65] کے تحت mesenchymal stromal خلیوں کے پروٹوم میں AGRN کو اپ گریڈ کیے جانے کے پچھلے شواہد کے مطابق ہیں۔ AGRN کو مدافعتی synapse سگنلنگ [66] اور نوزائیدہ ماؤس کے دل کی تخلیق نو کے ساتھ متفق ہونے کے لئے بھی دکھایا گیا ہے، اس طرح ترقی پذیر نوجوان جنین HAFS کے دوبارہ تخلیقی پیراکرائن اثرات کی طرف واضح رجحان کی حمایت کرتا ہے۔ مزید برآں، جنین کے ایچ اے ایف ایس کے ہائپوکسک پیشگی شرط کے لیے زیادہ ذمہ دار ہونے کی تصدیق کی گئی ہے جیسا کہ عروقی تجدید افادیت کے پیش گوئوں کی افزودگی سے دکھایا گیا ہے، جیسے اینجیوجینین، ای ایم ایم پی آر آئی ایم، آئی ایل-8، اور ایم سی پی-1 سائٹوکائن[68]، ان کا کنڈیشنڈ میڈیم۔ یہ مایوکارڈیل انفکشن، پچھلے اعضاء کی اسکیمیا، اور اسکیمک فاسیو کیوٹینیئس فلیپ [34،69-71]مزید برانن کے ایچ اے ایف ایس-سی ایم کی پیراکرین طاقت کے پچھلے ثبوت کی حمایت کرتا ہے جو کہ مایوکارڈیل انفکشن کے preclinical rodent ماڈلز میں endogenous neo-arteriogenesis کو بڑھاتا ہے۔ IGFBP2 اور OPN کے ساتھ کل سیکریٹوم نمایاں طور پر زیادہ افزودہ پایا گیا جب پیرینیٹل کے مقابلے میں، اس طرح ایک زیادہ واضح پرو ریزولونگ اور اینٹی ایجنگ ماڈیولیٹری پروفائل کی تجویز کرتا ہے[72-75]۔ پیرینیٹل ہیو-سی ایم، جب کہ پیراکرائن عوامل میں کم بڑھا ہوا تھا، اسی طرح نیوروٹروفک اور امیونوموڈولیٹری عوامل، جیسے CST3[76,77] اور MIF[78] کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا۔

کل hAFS-CM کے مقابلے میں، متعلقہ hypoxic fetal- اور perinatal-EV ہم منصبوں نے سائٹوکائنز اور کیموکینز کا کم اظہار دکھایا، ماسوائے ویسکولر ریموڈلنگ ثالث EMMPRIN [79]، جو زیادہ تر ویسیکل کمپارٹمنٹ میں افزودہ تھا۔ جنین کے HAFS-EVs[34,37] کے پہلے سے اطلاع دی گئی کارڈیو ایکٹیو اور پرو ریجنریٹیو پروفائل کی تصدیق یہاں ان کے کارڈیو پروٹیکٹو IL-8 [80] اور GDF-15 کے خصوصی اظہار کے ثبوت سے ہوئی ہے۔ ایک کلیدی پیراکرائن عنصر جو اینڈوجینس بالغ ہپپوکیمپل نیوروجنسیس [81,82] کو متحرک کرتا ہے، نیز اینتھرا سائکلائن سے متاثرہ کارڈیوٹوکسائٹی [78] کا مقابلہ کرتا ہے۔ جنین- اور پیدائشی HAFS-EVs دونوں نے پروجینیٹر/سٹیم سیل اسمگلنگ ریگولیٹر SDF-1 [83-85] کے لیے یکساں اظہار دکھایا۔ پروٹومک تجزیہ نے اینجیوجینیسیس سے متعلق پروٹین کے بڑھتے ہوئے اظہار کی اطلاع دی، جیسے NRP1 [86] اور MP14[87] hypoxic perinatal hAFS-EVs میں؛ اس طرح کی محرک پروفائل کنکال کے پٹھوں کی اسکیمک چوٹ [25] کے ایک preclinical ماؤس ماڈل میں Ⅲ سہ ماہی hAFS کی اینڈوتھیلیل ریجنریٹو خصوصیات پر پچھلے نتائج کی وضاحت کر سکتی ہے، ان کے hAFS-CM کے متعلقہ جنین کے مقابلے میں کم پرو انجیوجینک ہونے کے ثبوت کے باوجود۔ خاص طور پر، عصبی نمو کا عنصر BDNF برانن اور پیرینیٹل ای وی کارگو دونوں میں پایا گیا، حالانکہ کم مقدار میں، اس طرح نیورونل بقا اور نیورو ڈیولپمنٹل عملوں میں ایچ اے ایف ایس-ای وی کے لیے ایک پوٹیٹو نیوروٹروفک سرگرمی تجویز کرتا ہے، جیسا کہ انسانی ہڈیوں کے ذریعے خارج ہونے والے خلیوں کے لیے بھی مشاہدہ کیا جاتا ہے۔ میرو اور نال خون - MSC[8889]۔ ہائپوکسک محرک سے گزرنے والے جنین- اور پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس کے دونوں سیکروم فارمولیشنز PAI-1 کے ساتھ افزودہ ہوتے ہیں، جو اینڈوتھیلیل ایکٹیویشن [90] کا ایک سہولت کار ہے جو دل میں M2 میکروفیجز کے پولرائزیشن میں بھی شامل رہا ہے اور کارڈیو پروٹیکٹو سے نوازا گیا ہے۔ اور اینٹی فائبروٹک صلاحیت [91]۔

مائیکرو آر این اے (miRNAs) کو بڑے پیمانے پر سٹیم سیل- اور mesenchymal stromal cell-EV paracrine سرگرمی [92,93] کے اہم ریگولیٹرز کے طور پر خطاب کیا گیا ہے۔ یہاں ہم نے پایا کہ hAFS-EVs کے اندر 15 سب سے زیادہ افزودہ miRNA پرجاتیوں نے ہر نمونے میں کل miRNA مواد کا 60 فیصد سے زیادہ احاطہ کیا ہے۔ ان miRNAs کو mesenchymal stromal cell-EVs کے مالیکیولر کارگو کی خصوصیت کے لیے اطلاع دی گئی ہے (لیٹ-7a-5p [4,95])، عروقی تخلیق نو کو متاثر کرکے اور فبروسس کو روک کر مایوکارڈیل اسکیمیا کے خلاف تحفظ فراہم کرتے ہیں۔ -7b-5p, let-7f{-5p, miR-21-5p اور miR-155-5p [96,97]), فروغ دیں keratinocyte فنکشن (miR-16-5p [98]) کو ریگولیٹ کرکے زخم کا علاج اور forebrain ischemia (miR-29a-3p [99,100]) کے بعد نیورونل موت کا مقابلہ کرنا۔ دوسری طرف، تقریباً 1000 miRNAs باقی 30 فیصد ویسکولر miRNA مواد میں پائے گئے۔ اس طرح کی غیر متوازن تقسیم پچھلے مطالعات سے مطابقت رکھتی ہے [4] اور زیادہ تر افزودہ miRNAs کو hAFS-EVs کی اہم حیاتیاتی سرگرمی کے لیے قابل جوابدہ افراد کے طور پر نمایاں کرتی ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ جنین- اور پیرینیٹل hAFS-EVs نے 15 miRNAs کی اکثریت کا اشتراک کیا۔ قابل غور بات یہ ہے کہ ہم نے یہ بھی مشاہدہ کیا کہ جنین کے hAFS-EVs اور perinatal دونوں میں افزودگی کی مختلف سطحوں پر بہت مستحکم miRNAs کا ایک سیٹ موجود ہے۔ اس طرح کے شواہد HAFS-EVs پر qPCR تجربات میں "ہاؤس کیپنگ" امیدواروں کی ایک وسیع رینج کو اندرونی حوالہ کنٹرول کے طور پر استعمال کرنے کا مشورہ دے سکتے ہیں۔ مزید یہ کہ ایسے مستحکم miRNAs کا ایک مستقل ذیلی سیٹ (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) کو دو حملاتی مراحل کے درمیان اشتراک کیا جاتا ہے اور 15 زیادہ تر افزودہ مراحل کے ساتھ اوورلیپ ہوتا ہے، جو ایک اور بھی زیادہ مستقل رویے اور ایک قابل اعتماد پہلے سے حل کرنے والے مالیکیولر دستخط کی تجویز کرتا ہے ([96,{{45) }}])۔ قابل غور بات یہ ہے کہ اس طرح کے مخصوص کور کے اندر کچھ امیدواروں کو حال ہی میں II سہ ماہی کے امینیٹک فلوڈ سے حاصل کردہ mesenchymal stromal خلیات (miR-29a{-3p اور miR{{ سے حاصل کردہ نیورو پروٹیکٹو ای وی کے اندر حوالہ miRNAs کے طور پر رپورٹ کیا گیا ہے۔ 49}ص[95])۔ بہر حال، ہم نے یہ بھی دیکھا کہ حمل کی عمر miRNA کارگو کو ہائپوکسک پیشگی شرط سے زیادہ ماڈیول کر سکتی ہے۔ III سہ ماہی برانن HAFS سے حاصل کردہ ترقیاتی طور پر زیادہ نوعمر EVs کو miRNAs کے ساتھ افزودہ کیا گیا تھا جو پہلے ایمبریونک اسٹیم سیلز (miR-302-3p [101])، سیل کے پھیلاؤ، اور بون میرو اسٹروومل سیلز (miR) کے آسٹیوجینک تفریق کی عملداری کو سپورٹ کرنے کے لیے دکھایا گیا تھا۔ -217 [102])، جبکہ ٹیومر کو دبانے کی صلاحیت کو بھی پناہ دیتا ہے (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106])۔

ہمارے نتائج کی بنیاد پر، یہاں ہم تصدیق کرتے ہیں کہ جنین- اور پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس پرکشش پیراکرین ذرائع کی نمائندگی کر سکتے ہیں جن سے دوبارہ پیدا ہونے والی دوائیوں کا فائدہ اٹھایا جائے۔ جب کہ ان کی فینو قسم اور خفیہ سرگرمیاں ایک جیسی تھیں، ہم نے ان کے سیکروم فارمولیشنز میں کچھ خاص پہلوؤں کو ان کے مستقبل کے علاج معالجے کے لیے مفید بصیرت کے طور پر اجاگر کیا ہے۔

4. مواد اور طریقے

4.1.انسانی امینیٹک فلوئڈ اسٹیم سیل آئسولیشن اور ان وٹرو کلچر

انسانی امینیٹک فلوئڈ اسٹیم سیلز (ایچ اے ایف ایس) کو Ⅱ سہ ماہی امنیوسینٹیسس (جنین hAFS، f-hAFS) کے ذریعے معمول کے مطابق قبل از پیدائش کی اسکریننگ کے ذریعے جمع کیے گئے امینیٹک فلوئڈ (AF) کے بچ جانے والے نمونوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا، یا Ⅲ ٹرائیم کے دوران شیڈول سیزرین سیکشن ڈیلیوری کے دوران طبی فضلہ کے طور پر۔ (پیرینیٹل hAFS,p-hAFS) قبل از پیدائش کی تشخیص اور پیرینیٹل میڈیسن یونٹ، IRCCS سان مارٹینو ہسپتال، جنین- اور پیرینیٹل میڈیکل اینڈ سرجری یونٹ اور IRCCS Istituto Gaslini ہسپتال (Genova, Italy) میں انسانی جینیات کی لیبارٹری میں۔ تمام عطیہ دہندگان سے مقامی اخلاقی کمیٹی کی اجازت (پروٹوکول PR428REG2015) کے مطابق اور ہیلسنکی اعلامیہ کے رہنما خطوط کی تعمیل میں باخبر تحریری رضامندی حاصل کی گئی تھی۔ II سہ ماہی برانن AF کے نمونے خواتین عطیہ دہندگان سے حاصل کیے گئے جن کی اوسط عمر تقریباً 37.42±0.32 سال ہے (n=15 36-سے لے کر 41 سال کی عمر تک)؛ Ⅲ سہ ماہی پیرینیٹل AF کے نمونے خواتین عطیہ دہندگان جن کی اوسط عمر 34.25±1.31 سال ہے (n=10 26- سے لے کر 42 سال کی عمر تک)۔ جنین- اور پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس کو عام کیریٹائپ کے لیے توثیق شدہ نمونوں سے حاصل کیا گیا تھا اور سی-KIT اظہار کے لیے امیونو میگنیٹک چھانٹی کے ذریعے الگ تھلگ کیا گیا تھا (CD117 مائیکرو بیڈ کٹ، ملٹینی بائیوٹیکنالوجی، بولوگنا، اٹلی) پیروی کرنے والے AF mesenchymal stromal خلیات[16] سے۔cistanche اقتباس کے فوائدc-KIT* hAFS کو Minimal Essential Medium (MEM) الفا میں 15 فیصد FBS (Fetal Bovine Serum، Gibco-Thermo Fisher Scientific، Monza, Italy)، 18 فیصد Chang B، اور 2 فیصد Chang C میڈیم (Irvine Scientific) میں کلچر کیا گیا تھا۔ , Santa Ana, CA, USA) 1 فیصد L-glutamine اور 1 فیصد penicillin/streptomycin (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) کے ساتھ ایک انکیوبیٹر میں 37 ڈگری پر 5 فیصد CO2 اور 20 فیصد اوز ماحول اور ثقافتی وٹرو میں 5 حصئوں تک ان کے سیکروم کو الگ کرنے کے لئے استعمال کرنے سے پہلے۔

4.2. ایچ اے ایف ایس میٹابولزم کی بائیو کیمیکل تشخیص

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) سیل ہر تجربے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ بنیادی تنفس کا اندازہ کرنے کے لیے، hAFS کو 10 منٹ کے لیے 0.03 mg/mL digitonin کے ساتھ پارمیبلائز کیا گیا اور فاسفیٹ بفر سیلائن (PBS) میں معطل کر دیا گیا۔ 10 mM پائروویٹ پلس 5 mM malate یا 20 mM succinate کو stimulized میں شامل کیا گیا۔ کمپلیکسز I، II، اور IV یا کمپلیکسز Ⅱ اور IV، بالترتیب [60] کے بنائے ہوئے طریقے۔

گلوٹامین، لانگ چین فیٹی ایسڈ آکسیکرن، اور گلوکوز کے تنفس میں متعلقہ شراکت کا جائزہ لینے کے لیے، ڈیجیٹونن پارمیبلائزیشن کے بعد، خلیات کو گروتھ میڈیم اور BPTES کے 4 uM، 4 uM Etomoxir، اور 4 uM UK5 میں معطل کر دیا گیا تھا{{22} 99 کو بالترتیب glutaminase، carnitine palmitoyl-transferase 1A(CPT1A)، یا mitochondrial pyruvate carrier (MPC) کو روکنے کے لیے شامل کیا گیا تھا۔ Fi-F.ATP synthase(ATP synthase) سرگرمی کا پتہ ATP کی پیداوار کو انتہائی حساس luciferin/luciferase طریقہ سے ناپ کر لگایا گیا۔ اسیسز 37 ڈگری پر 2 منٹ کے لیے کیے گئے، اور ڈیٹا ہر 30 سیکنڈ میں جمع کیا گیا۔ تجربات کے پہلے سیٹ میں، 10 ڈگری سیلز کو درمیانے درجے میں 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا جس میں 50mM KCl, 1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6mMouabain,1mM P1Pi5- (اڈینوسین-5')پینٹا فاسفیٹ، 0.040 mg/mL ampicillin، اور 10mM Tris-HCl pH7.4۔ اس کے بعد، ATP ترکیب تنفس کے ذیلی ذخیرے (10mM پائروویٹ پلس 5 mM malate یا 20 mM succinate) اور 0.1 mM ADP کے اضافے سے پیدا ہوئی۔ رد عمل کی پیمائش luciferin/luciferase ATP bioluminescence assay kit CLSII (Roche, Basel, Switzerland) ایک Luminometer (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milan, Italy) ATP معیاری حل (Roche, Basel, Switzerland) میں کی گئی تھی۔ 42}}/M انشانکن کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ تجربات کے دوسرے سیٹ میں، اے ٹی پی کی ترکیب کا اندازہ 4 uM BPTES، 4 uM Etomoxir، یا 4 uM UK5099 کی موجودگی میں کیا گیا تھا۔ اس صورت میں، 10 خلیات کو 10 منٹ کے لیے گروتھ میڈیم میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ میٹابولزم روکنے والا، اور اے ٹی پی کی ترکیب کو 0.1 ایم ایم اے ڈی پی کے ساتھ شامل کیا گیا تھا۔ OxPhos (آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن) کی کارکردگی (P/O تناسب) کا شمار پیدا شدہ ATP کے ارتکاز اور سانس کی سبسٹریٹ اور ADP کی موجودگی میں استعمال شدہ آکسیجن کی مقدار کے درمیان تناسب کے طور پر کیا گیا۔ جب آکسیجن کی کھپت پوری طرح سے توانائی کی پیداوار کے لیے وقف ہوتی ہے، تو P/O تناسب تقریباً 2.5 اور 1.5 ہونا چاہیے pyruvate Plus malate یا succinate کے اضافے کے بعد، بالترتیب [48] anaerobic glycolysis کے hAFS میٹابولزم اور laclucteducent contribution کا جائزہ لینے کے لیے ترقی کے وسط میں. گلوکوز کی کھپت کا اندازہ ہیکسوکینیز (HK) اور گلوکوز-6-فاسفیٹ ڈیہائیڈروجنیز(G6PD) کے کپلنگ سسٹم کے ذریعے کیا گیا، NADP کی 340 nm میں کمی کے بعد۔ پرکھ کے میڈیم میں 100mM Tris-HCl، pH7.4,2mM ATP، 10mMNADP، 2mMMgC12,2IU ہیکسوکینیز، اور 2 IU گلوکوز-6-فاسفیٹ ڈیہائیڈروجنیز تھا۔ NAD پلس میں 340 nm میں کمی کے بعد لییکٹیٹ کی رہائی کی جانچ کی گئی۔ پرکھ کے میڈیم میں 100 mM Tris-HCl (pH8)، 5 mM NAD پلس، اور 1 IU/mL lactate dehydrogenase پر مشتمل ہے۔ پیوریفائیڈ لییکٹیٹ ڈیہائیڈروجنیز کے 4 ug کے اضافے سے پہلے اور بعد میں نمونوں کا تجزیہ کیا گیا۔ دونوں صورتوں میں، ڈیٹا کو سیل نمبر پر معمول بنایا گیا تھا اور بالترتیب mM گلوکوز/10 ڈگری سیلز یا mM لییکٹیٹ ریلیز/10 ڈگری سیلز کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا[107]۔

4.3.HAFS کی فلو سائٹومیٹری کی خصوصیت

ایک لاکھ (105) جنین-اور p-hAFS خلیات کو ماؤس اینٹی ہیومن-CD107a-Alexa Fluor 647-اور اینٹی ہیومن CD146-FITC- کے ساتھ الگ کر کے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ کنججٹیڈ اینٹی باڈیز (ای بائیو سائنس، تھرمو فشر سائنٹیفک، مونزا، اٹلی)۔ سیل اپوپٹوس کا اندازہ کارخانہ دار کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen، Becton Dickinson، Mi-lan، Italy) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ ایونٹس کو BD بایوسائنس FACS Aria II سارٹر اور تجزیہ کار پر حاصل کیا گیا تھا، جو FACS Diva سافٹ ویئر سے لیس تھا (BD Bioscience، Bec-ton Dickinson, Milan, Italy)۔ FlowJo V9.0 سافٹ ویئر (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milan) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا تھا۔ ، اٹلی). 4.4.سینیسینس سٹیننگ

ایچ اے ایف ایس کے سنسنی فینوٹائپ کو وٹرو کی حالتوں میں پیسیج 5 تک کلچرڈ کیا گیا سینیسنس -گلیکٹوسیڈیس سٹیننگ کٹ (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، ایم اے، یو ایس اے): f-hand p-hAFS کو 70 فیصد پر 1x Fixative محلول کے ساتھ طے کیا گیا تھا۔ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق، SA- -گیل کے لیے راتوں رات 37 ڈگری پر سنگم اور داغ۔ سینسنٹ ایونٹس کو Leica DMil مائکروسکوپ پر حاصل کیا گیا تھا (Leica Acquire سافٹ ویئر V3.4.4، Leica Microsystems, Milan, Italy سے لیس) اور فی فیلڈ کل سیلز پر SA- -گیل پازیٹو سیلز کے فیصد کے طور پر جانچا گیا۔

4.5 ایچ اے ایف ایس سیکریٹوم فریکشنز کی علیحدگی اور ارتکاز

f-hAFS اور p-hAFS کو 1 فیصد O2 ہائپوکسیا بمقابلہ 20 فیصد O2 نورموکسیا (کنٹرول) میں سیرم فری میڈیم (SF) میں 24 گھنٹے کے لئے کلچر کیا گیا تھا ، جس کا مؤخر الذکر بنیادی حوالہ کے طور پر استعمال ہوتا تھا۔ اس پیشگی شرط کی حکمت عملی کا استعمال بائیو ایکٹو پیراکرین عوامل کی رہائی کو بڑھانے کے لیے کیا گیا تھا، جیسا کہ ہم نے پہلے رپورٹ کیا تھا [34,35,37,49]۔ hAFS کو 24 گھنٹے کے لیے سیرم فری (SF) میڈیم (ہائی گلوکوز Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM، 1 فیصد L-glutamine اور 1 فیصد penicillin/streptomycin، تمام Gibco-Thermo Fisher Scientific سے)، مونزا، اطالوی، اٹامکس کے تحت کلچر کیا گیا تھا۔ (20 فیصد O2 اور 5 فیصد CO2 37 ڈگری پر) یا ہائپوکسک (1 فیصد O2 اور 5 فیصد CO2 CellXpert C170i میں 37 ڈگری پر اور Galaxy 48R CO2 انکیوبیٹرز، ایپنڈورف، میلان، اٹلی سے) حالات۔

سیل کے ملبے کو ہٹانے کے لیے f-hAFS-CM اور p-hAFS-CM کو جمع کیا گیا اور 4 ڈگری پر 300x g 10 منٹ اور 2000× g 20 منٹ پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ hAFS-CM کو 3kDa سلیکٹیو کٹ آف (Amicon Ultra-15, Merck Millipor Darmstadt, Germany) کے ساتھ الٹرا فلٹریشن جھلیوں کا استعمال کرتے ہوئے 4 ڈگری پر 3000×g پر 90 منٹ کے لیے مرتکز کیا گیا اور پھر مزید 4 پر مرتکز کیا گیا۔ ڈگری 3000× g پر 30 منٹ کے لیے۔ hAFS-EVs کو hAFS-CM سے سیریل الٹرا سینٹرفیوگریشن کے ذریعہ الگ اور مرتکز کیا گیا تھا۔ مختصراً، hAFS-CM کو اکٹھا کیا گیا اور سیل کے ملبے کو ہٹانے کے لیے 4 ڈگری پر 300×g پر 10 منٹ اور 2000x g 20 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ اس کے بعد سپرنٹنٹ پر 40 منٹ کے لیے 10,000 × g پر کارروائی کی گئی۔ گولی کو ضائع کر دیا گیا اور بیک مین کولٹر کی جھولنے والی بالٹی SW55Tiors کا استعمال کرتے ہوئے 10,000×g پر ایک Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milan, Italy) میں الٹرا سینٹرفیوگیشن کے ذریعے سپرنٹنٹ پر مزید کارروائی کی گئی۔ متضاد hAFS-EVs پر مشتمل گولی کو PBS میں 100,000×g پر 120 منٹ کے لیے حتمی سینٹرفیوگریشن کے ساتھ دھویا گیا اور پھر PBS میں 0,22 um pore فلٹر جھلی کے ساتھ فلٹر کیا گیا۔ HAFS-CM میں اور hAFS-EVs کی سطح پر پروٹین کی تعداد کو BiCinchonic Acid (BCA) پرکھ (تھرمو فشر سائنٹیفک، مونزا، اٹلی) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ HAFS-CM اور hAFS-EVs کی پیداوار کا اندازہ کرنے کے لیے Gen5 Microplate Reader پر 570 nm پر نمونے حاصل کیے گئے تھے تاکہ ug آف سلوشن/10 ڈگری پیدا کرنے والے سیلز کے لحاظ سے۔

4.6 ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی اور نینو پارٹیکل ٹریکنگ تجزیہ کے ذریعہ hAFS-EVs کی خصوصیات

ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM) تجزیہ ہٹاچی TEM مائکروسکوپ (HT7800 سیریز، ہٹاچی ہائی ٹیکنالوجیز، مونزا، اٹلی) پر کیا گیا تھا۔ ڈیجیٹل تصاویر میگا ویو 3 کیمرہ اور ریڈیئس سافٹ ویئر (EMSIS، Muenster، Germany) کے ساتھ لی گئی تھیں۔ f-hAFS اور p-hAFS کو 3.7 فیصد paraformaldehyde (PA) حل میں 1:1 کو hAFS مکمل میڈیم کے ساتھ ملایا گیا، 0.1 M cacodylate بفر میں دھویا گیا، اور پھر فوری طور پر کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ 0.1 ایم کیکوڈیلیٹ بفر جس میں 2.5 فیصد گلوٹرالڈہائڈ (الیکٹران مائکروسکوپی سائنس، ہیٹ فیلڈ، PA، USA) شامل ہیں۔ خلیات کے چھرے lh کے لیے osmium tetroxide میں اور 1h کے لیے 1 فیصد uranyl acetate محلول میں پوسٹ فکس کیے گئے تھے۔ درجہ بندی شدہ ایتھنول سیریز کے ذریعے نمونوں کو 24 گھنٹے 42 ڈگری پر اور 48 گھنٹے پر 60 ڈگری پر پانی کی کمی کی گئی اور ایپوکسی رال (پولی بیڈ؛ پولی سائنسز یورپ جی ایم بی ایچ، منیپولس، جرمنی) میں سرایت کر دی گئی۔ الٹراتھن حصوں (50 nm) کو Leica Ultracut microtome (Leica Microsystems, Milan, Italy) کے ساتھ کاٹا گیا اور 50 فیصد ایتھنول محلول میں 5 فیصد یورینیل ایسیٹیٹ کے ساتھ داغ دیا گیا۔ f-hAFS-EVs اور p-hAFS-EVs کو 20 uL PBS محلول میں دوبارہ معطل کیا گیا تھا اور 0.1 M فاسفیٹ بفر سلوشن (pH7.4) میں 2 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ کے مساوی حجم کو شامل کرکے طے کیا گیا تھا۔ اس کے بعد EVs کو پیرافیلم پر 5 μL قطروں پر گرڈ کو تیرتے ہوئے فارمور کاربن لیپت تانبے کے گرڈز پر 10 منٹ تک جذب کیا گیا۔ اس کے بعد، پی بی ایس میں ای وی کے ساتھ گرڈ کو دھویا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے 2 فیصد یورینیل ایسیٹیٹ محلول سے منفی طور پر داغ دیا گیا۔ داغ دار گرڈز کو بہتر تحفظ کے لیے 2.5 فیصد میتھائل سیلولوز میں سرایت کیا گیا تھا اور امتحان سے پہلے ہوا میں خشک کیا گیا تھا۔ hAFS-EVs کا مورفومیٹری تجزیہ 10 تصادفی طور پر لیے گئے مائیکرو گرافس پر 40000× g میگنیفیکیشن پر ناپا گیا۔ Radius سافٹ ویئر (EMSIS، Muenster Germany) کے پیمائش ڈائیلاگ باکس میں سرایت شدہ صوابدیدی لائن فنکشن کا استعمال کرتے ہوئے سائز کا حساب لگایا گیا۔ HAFS-EVs سائز کی تقسیم کو دیکھنے کے لیے، نتائج کو سکیٹر ڈاٹ پلاٹ کے طور پر اور فریکوئنسی ڈسٹری بیوشن کے طور پر تیار کیا گیا تھا جس میں ہر سائز کو درمیانی قدر اور رینج کے لیے لائنوں کے ساتھ ایک نقطہ کے طور پر دکھایا جاتا ہے۔

f-hAFS-EVs اور p-hAFS-EVs کا بھی نینو پارٹیکل ٹریکنگ اینالیسس (NTA) کے ذریعے تجزیہ کیا گیا تاکہ 10 ڈگری سیلز کے ذریعے جاری ہونے والے ذرات کا اندازہ لگایا جا سکے۔ hAFS-EVs کو PBS سلوشن میں 1:100 پر گھٹا دیا گیا اور ایک NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, UK) پر حاصل کیا گیا جس میں 60 سیکنڈ کے کم از کم 3 مختلف فریم ریکارڈ کیے گئے۔ سافٹ ویئر میں بیچ پروسیس آپشن کا استعمال کرتے ہوئے ہر نمونے کے تین مختلف حصول کا تجزیہ کیا گیا۔ 4.7.LC-MS/MS hAFS-CM اور hAFS-EVs کا تجزیہ 4.7.1.ان حل ہضم

پروٹومک تجزیہ hAFS-CM اور hAFS کی 3 حیاتیاتی نقلوں پر کیا گیا تھا۔ نارموکسک یا ہائپوکسک پیشگی شرط کے بعد f-hAFS اور p-hAFS سے EVs (n=24 مختلف حالات)۔hAFS-CM اور hAFS-EVs کے نمونے 0.1M NHCO3 pH 7.9 میں معطل کیے گئے تھے اور RapigestIM کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ SF ریجنٹ (Waters Co, Milford, MA, USA) 0.25 فیصد (w/v) کے آخری ارتکاز پر۔ 100 ڈگری پر 2{{40}} منٹ تک ہلچل کے دوران نتیجے میں آنے والے معطلی کو انکیوبیٹ کیا گیا۔ عمل انہضام ہر ایک نمونے پر 0.1 M NH4HCO3 pH7.9 میں 37 ڈگری پر راتوں رات 1:50 (w/w) کے انزائم/سبسٹریٹ تناسب پر سیکوینسنگ گریڈ موڈیفائیڈ ٹرپسن (پرومیگا انک، میڈیسن، WI، USA) کو شامل کرکے انجام دیا گیا۔ 10 فیصد CHSCN کے ساتھ بفر۔ ٹرپسن کا ایک اضافی ایلی کوٹ (1:100 w/w) صبح میں شامل کیا گیا، اور عمل انہضام 4 گھنٹے تک جاری رہا۔ مزید برآں، 0.5 فیصد Trifluoroacetic acid (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) کے اضافے نے انزیمیٹک رد عمل کو روک دیا، اور اس کے بعد 45 منٹ کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیشن نے RapiGest ایسڈ ہائیڈولیسس مکمل کیا[108]۔ پانی میں ناقابلِ تحلیل انحطاط کی مصنوعات کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 13000 rpm پر 10 منٹ کے لیے ہٹا دیا گیا۔ آخر کار، مینوفیکچرر پروٹوکول کے مطابق PierceTM C-18 اسپن کالم (تھرمو فشر سائنٹیفک، مونزا، اٹلی) کا استعمال کرتے ہوئے ٹرپٹک ڈائجسٹ کے مرکب کو صاف کیا گیا، اور 0.1 فیصد فارمک ایسڈ (Sigma-Aldrich Inc.، St) میں دوبارہ معطل کر دیا گیا۔ Louis, MO, USA) پانی میں (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, USA) 0.1 ug/μL کے ارتکاز میں۔

4.7.2.لیکوئڈ کرومیٹوگرافی۔

ٹرپسن ہضم شدہ مرکب کا تجزیہ ایک پلیٹ فارم کے ذریعے کیا گیا جس میں ایک نینو مائع کرومیٹوگرافک سسٹم، ایکسیجنٹ نانو ایل سی-الٹرا[2]2D سسٹم (ایکسیجنٹ، AB SCIEX ڈبلن کا حصہ، ڈبلن، CA، USA) ٹریپ-ایلوٹ موڈ میں ترتیب دیا گیا، ایک اعلی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹر کے ساتھ مل کر۔ مختصراً، نمونے (0.8 ug انجیکشن) پہلے پیپٹائڈ ٹریپ پر لوڈ کیے گئے تھے (200 um × 500 um ChromXP C18- CL,3 um,120 A) اور 3 μL/منٹ کے بہاؤ پر 10 منٹ تک پانی میں 0.1 فیصد فارمک ایسڈ کے ساتھ isocratic موڈ میں چلنے والے لوڈنگ پمپ سے دھویا جاتا ہے۔ دس بندرگاہ والے والو کی خودکار سوئچنگ نے پھر پھنسے ہوئے مرکب کو نینو ریورسڈ فیز کالم (75 um × 15 سینٹی میٹر ChromXP C18-CL,3 um,120 A) پر ایلیونٹ B کے 150 منٹ گریڈینٹ کے ذریعے نکال دیا۔ 300 nL/منٹ کی بہاؤ کی شرح پر (Eluent A, 0.1 فیصد فارمک ایسڈ پانی میں؛ eluent B, 0.1 فیصد formic acid in acetonitrile) گہرائی میں، گریڈینٹ یہ تھا: 5-10 فیصد بن 3 منٹ،10-40 فیصد بن 130 منٹ،40-95 فیصد بن 10 منٹ اور 7 منٹ کے لیے 95 فیصد B پر ہولڈنگ۔ 4.7.3.ماس سپیکٹرو میٹری

MS/MS کے تجزیے LTQ-OrbitrapXL ماس اسپیکٹومیٹر (تھرمو فشر سائنٹیفک، مونزا، اٹلی) پر کیے گئے جو ایک نینو سپرے آئن سورس سے لیس تھا۔ سپرے کیپلیری وولٹیج 1.7 kV پر سیٹ کیا گیا تھا اور آئن ٹرانسفر کیپلیری کا درجہ حرارت 220 ڈگری پر رکھا گیا تھا۔ مکمل MS سپیکٹرا کو مثبت آئن موڈ میں ایک 400-1600 m/z رینج پر ریکارڈ کیا گیا، جس کی ریزولونگ پاور 60000 (مکمل چوڑائی نصف زیادہ سے زیادہ) اور اسکین ریٹ 2 سپیکٹرا/s ہے۔ اس قدم کے بعد پانچ کم ریزولوشن MS/MS واقعات ہوئے جو کہ ترتیب وار طور پر مکمل MS سپیکٹرم (35 فیصد تصادم کی توانائی پر) سے منتخب کردہ ٹاپ پانچ آئنوں پر ڈیٹا پر منحصر انداز میں 0.5 منٹ کے متحرک اخراج کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے۔ MS/MS تجزیہ۔ ماس اسپیکٹومیٹر اسکین کے افعال اور اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی سالوینٹ گریڈینٹ کو Xcalibur ڈیٹا سسٹم ورژن 1.4 (تھرمو فشر سائنٹیفک، مونزا، اٹلی) کے ذریعے کنٹرول کیا گیا تھا۔

4.7.4. پروٹومک ڈیٹا پروسیسنگ اور ڈیٹا مائننگ

Thermo Scientific Proteome Discoverer سافٹ ویئر ورژن 2.1 میں موجود Sequest HT سرچ انجن کا استعمال کرتے ہوئے تمام تیار کردہ ڈیٹا کو تلاش کیا گیا۔ تجرباتی MS/MS سپیکٹرا کو ٹرپٹک پیپٹائڈ کی ترتیب سے منسلک کیا گیا تھا جو کہ 2 جنوری میں ڈاؤن لوڈ کیے گئے Uniprot Homo Sapiens proteome ڈیٹا بیس (74600 اندراجات) کے سلیکو ڈائجشن میں حاصل کردہ نظریاتی ماس سپیکٹرا کے ساتھ موازنہ کیا گیا تھا۔ 020 (www.uniprot.org، 10 مارچ 2021 کو رسائی ہوئی)۔ پیپٹائڈ کی ترتیب اور متعلقہ پروٹین کی شناخت کے لیے درج ذیل معیارات استعمال کیے گئے تھے: ٹرپسن بطور انزائم، تین مسڈ کلیویجز فی پیپٹائڈ، پیشگی آئنوں کے لیے ±50 پی پی ایم کی بڑے پیمانے پر رواداری، اور ±0.8 Da فار فریگمنٹ آئنوں۔ پرکولیٹر نوڈ کو ٹارگٹ ڈیکوئی حکمت عملی کے ساتھ پیپٹائڈ اسپیکٹرم میچ (PSM) کی سطح 0.01 (سخت) پر 0.05 کی زیادہ سے زیادہ ڈیلٹا سی این کو مدنظر رکھتے ہوئے حتمی غلط دریافت کی شرح (FDR) دینے کے لیے استعمال کیا گیا تھا [109]۔ چھ امینو ایسڈ اور درجہ 1 کی کم از کم پیپٹائڈ لمبائی کے ساتھ صرف پیپٹائڈس پر غور کیا گیا۔ پروٹین کی گروپ بندی اور سختی کے اصولوں کا اطلاق کیا گیا۔ MS ڈیٹا کو PRIDE [10]پارٹنر ریپوزٹری (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/، 10 مارچ 2021 کو حاصل کیا گیا) کے ذریعے ProteomeXchange کنسورشیم میں جمع کر دیا گیا ہے ، اور لیبل فری مقابلے میں۔ ایک اندرون خانہ الگورتھم، یعنی کثیر جہتی الگورتھم پروٹین میپ (MAProMa) اس مقصد کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اوسط پیپٹائڈ سپیکٹرم میچز (aPSM) [111,112] کا استعمال کرتے ہوئے جو ایک پروٹین کے لیے شناخت کیے گئے تمام سپیکٹرا کی اوسط سے مطابقت رکھتا ہے اور اس کے نتیجے میں ہر تجزیہ شدہ حالت میں، اس کی نسبتا کثرت کے مطابق۔ گہرائی میں، تفریق ظاہر کیے گئے پروٹینز کو منتخب کرنے کے لیے، ذیلی گروپس (دونوں جنین بمقابلہ پیرینیٹل-ایچ اے ایف ایس-سی ایم اور ایچ اے ایف ایس-ای وی کے لیے، ہائپوکسک سیل پری کنڈیشننگ محرک پر بھی غور کرتے ہوئے)، دو MAProMa پر 0.4 اور 5 کی حد کا اطلاق کرتے ہوئے جوڑے کے مقابلے کیے گئے تھے۔ اشاریہ جات بالترتیب DAve (Deferential Average) اور DCI (Differential Confidence Index)۔ DAve، جو پروٹین کے اظہار میں تبدیلیوں کا جائزہ لیتا ہے، اس کی تعریف (XY)/(X＋Y)/0.5 کے طور پر کی گئی تھی، جبکہ DCI جو تفریق اظہار کے اعتماد کا اندازہ کرتا ہے، کی تعریف (X پلس Y)×(XY)/2 The X اور Y کے طور پر کی گئی تھی۔ شرائط دو موازنہ نمونوں میں دیئے گئے پروٹین کے PSM کی نمائندگی کرتی ہیں۔ اس کے علاوہ، ہر جانچ شدہ حالت سے حاصل کی گئی اوسط پروٹین کی فہرستوں کو لکیری امتیازی تجزیہ (LDA) کا نشانہ بنایا گیا، اور سب سے بڑا F تناسب (4.5 سے زیادہ یا اس کے برابر) اور سب سے چھوٹی p-value (سے کم یا اس کے برابر) کے ساتھ پروٹین 0.001) کو درجہ بندی کے جھرمٹ کے ذریعے برقرار رکھا گیا اور اس پر کارروائی کی گئی، وارڈ کا طریقہ کار اور JMP 15.2 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے Euclidean کے فاصلاتی میٹرک کو لاگو کیا گیا۔ خاص طور پر، F کا تناسب ماڈل کی اوسط مربع کی نمائندگی کرتا ہے جسے غلطی کے اوسط مربع سے تقسیم کیا جاتا ہے، جب کہ p-value اس حساب سے زیادہ F قدر حاصل کرنے کے امکان کی نشاندہی کرتی ہے اگر، حقیقت میں، آبادی کے گروپ کے ذرائع کے درمیان کوئی فرق نہیں تھا۔ 4.8 hAFS-CM اور have-EVs کی سائٹوکائن اور کیموکائن پروفائلنگ

ہائپوکسک پیشگی شرط کے بعد f-hAFS اور p-hAFS کے ذریعہ حاصل کردہ hAFS-CM اور have-EVs کی سائٹوکائن اور کیموکائن پروفائلنگ کا اندازہ Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array kit (R&D System, Minneapolis, MN, USA) کے ذریعے کیا گیا۔ کارخانہ دار کی ہدایات. hAFS-CM اور hAFS-EVs کے 20 ug نمونے استعمال کیے گئے تھے۔ جھلیوں کی تصاویر ایک Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec کیمبرج، UK) کے ذریعہ حاصل کی گئی تھیں مخصوص سائٹوکائن/کیموکائن مواد کا اندازہ امیج جے سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے ہر قابل شناخت سائٹوکائن کے لیے مثبت پکسل کی شدت (من مانی یونٹ کے ذریعے) کی مقدار کے ذریعے کیا گیا تھا (https پر دستیاب ہے: //imagej.nih.gov/ij/، 10 مارچ 2021 کو حاصل کیا گیا [13])۔ hAFS-EVs اور Next سے 4.9.RNA نکالنا

نسل کی ترتیب

کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق RNA کو miRNeasy مائیکرو کٹ (کیجین، میلان، اٹلی) کے ساتھ f-hAFS-EVs اور p-have-EVs سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ RNA کی سالمیت اور سائز کی تقسیم کا اندازہ Agilent Small RNA Kit کا استعمال کرتے ہوئے چھوٹے نان کوڈنگ RNA چپ کے ساتھ کیا گیا تاکہ 6 سے 150 نیوکلیوٹائڈس (nt) تک کے چھوٹے RNAs کے مواد کا اندازہ لگایا جا سکے۔ کیوبٹ مائیکرو آر این اے اسے کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک، مونزا، اٹلی) کو کارخانہ دار کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے، مائیکرو آر این اے (miRNAs) مواد کی مقدار درست کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ miRNA ترتیب دینے والی لائبریریوں کو QIAseq miRNA لائبریری کٹ (Qiagen، Milan، Italy) کا استعمال کرتے ہوئے 18.5ng الگ تھلگ miRNAs کو بطور ان پٹ استعمال کرتے ہوئے اور مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے تیار اور بڑھا دیا گیا۔ ٹیپ سٹیشن (ایجیلنٹ ٹیکنالوجیز، فوسٹر سٹی، CA، USA) کی طرف سے کوالٹی چیک اور کوانٹیفیکیشن کے بعد لائبریریوں کو پول کیا گیا تھا جس میں Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape کا استعمال کیا گیا تھا۔ کوالٹی کنٹرول کے لیے پول شدہ لائبریریوں کا اندازہ ریئل ٹائم کیو پی سی آر کے ذریعے "سیکوینسنگ لائبریری qPCR کوانٹیفیکیشن" گائیڈ (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) کے بعد کیا گیا تھا اور Illumina NextSeq پلیٹ فارم کے ذریعے ہائی آؤٹ پٹ ہٹ v2.5 (75 سائیکلوں) کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا گیا تھا۔ Illumina Inc, San Diego, CA, USA)۔ بیس کالنگ ڈیفالٹ Illumina NextSeq500 ورک فلو کے ساتھ کی گئی تھی۔

4.10. miRNA کی ترتیب کا بائیو انفارمیٹک ڈیٹا تجزیہ

Fastq فائلوں پر سب سے پہلے کٹاڈیپٹ [114] کا استعمال کرتے ہوئے 3' اڈاپٹر اور کم معیار کے اڈوں کو تراش کر کارروائی کی گئی۔ تراشنے کے بعد، داخل کی ترتیب اور UMI ترتیب کی نشاندہی کی گئی۔ بغیر اڈاپٹر سیکوینس کے پڑھا جاتا ہے، 16 bp سے کم انسرٹ سیکوینسز کے ساتھ پڑھتا ہے، اور 10 bp سے کم UMI سیکوینسز کے ساتھ پڑھا جاتا ہے۔ داخل کرنے کے سلسلے کی تشریح کرنے کے لیے، Bowtie کا استعمال کرتے ہوئے ریڈز کو GRCh38 انسانی جینوم اسمبلی کے ساتھ منسلک کیا گیا تھا [15]ہر نمونے کے لیے ایک مخصوص miRNA کو تفویض کردہ تمام ریڈز کو شمار کیا گیا تھا، اور متعلقہ UMIs کو منفرد مالیکیولز کی گنتی کے لیے جمع کیا گیا تھا۔ ثانوی تجزیہ معقول درخواست پر دستیاب حسب ضرورت R اسکرپٹس کے ذریعے انجام دیا گیا۔ لیما [116] اور EdgeR بائیو کنڈکٹر پیکیجز [117] کا استعمال کرتے ہوئے تفریق افزودگی کا تجزیہ کیا گیا۔

4.11۔ شماریاتی تجزیہ

نتائج کم از کم تین (n{{0}}) آزاد تجربوں کے اوسط ±sem کے طور پر پیش کیے جاتے ہیں۔ موازنہ یک طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا گیا تھا جس کے بعد پوسٹ ہاک ٹوکی کے متعدد موازنہ ٹیسٹ یا طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے۔ تجزیہ گراف پیڈ پرزم ورژن 8.0.2 (گراف پیڈ سافٹ ویئر، https://www.graphpad.com، 10 مارچ 2021 کو حاصل کیا گیا) کا استعمال کرتے ہوئے اعدادوشمار کی اہمیت کے ساتھ کیا گیا تھا<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

آخر میں، fetal- اور perinatal hAFS فینوٹائپیکل طور پر مساوی پائے گئے جو کہ سائز اور تقسیم میں EV کی افزودگی اور EV کی افزودگی کے ساتھ مماثلت رکھتے ہیں۔ پھر بھی ان کے خفیہ پروفائل میں کچھ امتیازات کو سراہا جا سکتا ہے۔ خاص طور پر، جنین ایچ اے ایف ایس کی نشوونما کے لحاظ سے ناپختہ پروفائل کو ان کے سیکروم فارمولیشنز کے ذریعے دوبارہ بیان کیا جا سکتا ہے جو کہ ایک زیادہ واضح پرو ویسکولوجینک، پرو ریجنریٹیو اور دوبارہ جوان ہونے والے سیکروم کے ساتھ عطا کیا گیا ہے۔ تاہم، پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس اب بھی انڈوتھیلیل سیل ہجرت، مدافعتی ماڈیولیٹری، اینٹی انفلامیٹری، اور جنین ایچ اے ایف ایس کی طرح نیوروٹروفک صلاحیت سے متعلق عوامل کے اظہار کے ذریعے ایک متعلقہ پیراکرائن پروفائل کو برقرار رکھتا ہے۔ یہ نتائج چوٹ سے متعلق اور سوزش/اسکیمک پر مبنی بیماری کے مستقبل میں پیراکرین تھراپی کی حمایت کرنے کے لیے مفید بصیرت فراہم کر سکتے ہیں۔ لہذا، جنین یا پیرینیٹل ایچ اے ایف ایس کے انتخاب کا سب سے زیادہ مثالی سیل ماخذ کے طور پر مخصوص طبی منظر نامے پر غور کیا جانا چاہیے۔

یہ مضمون Int سے ماخوذ ہے۔ جے مول سائنس 2021، 22، 3713۔ https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms