ڈی این اے پر منحصر پروٹین کناز کیٹلیٹک سبونائٹ (DNA-PKcs) نر چوہوں میں گردے کی دائمی بیماری کی ترقی کو آگے بڑھاتا ہے Ⅱ

TAF7 کا DNA-PKcs ثالثی فاسفوریلیشن رینل فبروسس کو بڑھاتا ہے۔

ممکنہ مالیکیولر میکانزم کو مزید جدا کرنے کے لیے جس کے ذریعے ڈی این اے پی کے سی ایس کو ریگولیٹ کرتا ہے۔CKD کی ترقیDNA-PKcs کے ممکنہ ذیلی ذخائر کو ظاہر کرنے کے لیے فاسفوپوٹومکس کی گئی تھی۔ جیسا کہ تصویر 5a میں دکھایا گیا ہے، زیادہ تر فاسفوریلیٹڈ پروٹین جوہری پروٹین تھے۔ دیفاسفوریلیشن کی سطحان پروٹینوں میں سے صرف 6 پروٹین تھے۔گردے کے ؤتکوں میں نمایاں طور پر کمیWT چوہوں کے مقابلے DNA-PKcs−/− چوہوں کا، جیسا کہ آتش فشاں پلاٹوں سے دکھایا گیا ہے (تصویر 5a)۔ DNA-PKcs−/− چوہوں اور WT کنٹرولز کے درمیان فاسفوریلیڈ پروٹین کے ہیٹ میپ کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ Slc4a1، Ampd2، Hbb-b1، Gas2، Ank1 اور TAF7 کی نشاندہی شدہ سائٹس کی فاسفوریلیشن کی سطح DNA-PKkout کے بعد نمایاں طور پر کم ہوئی تھی۔ 5a)۔ سب سیلولر لوکلائزیشن کے تجزیہ اور ان پروٹینوں کے دستک ڈاؤن کے ذریعے، ہم نے پایا کہ DNA-PKcs رینل فبروسس میں ثالثی کرتا ہے، شاید TAF7 کے فاسفوریلیشن کے ذریعے، جو TFIID کا ایک ذیلی یونٹ ہے۔ Coimmunoprecipitation مطالعہ نے DNA-PKcs اور TAF7 (تصویر 5b) کے درمیان ممکنہ براہ راست تعامل کا انکشاف کیا۔ DNA-PKcs اور TAF7 کے درمیان پروٹین-پروٹین ڈاکنگ کا تجزیہ ایک آن لائن ڈیٹا بیس ClusPro39,40 کے ذریعے کیا گیا۔ ڈاکنگ کے نتائج نے DNA-PKcs اور TAF7 کے درمیان ممکنہ براہ راست تعامل ظاہر کیا، اور TAF7 کی 213-سائٹ سیرین قریب ترین سائٹس میں سے ایک ہے جو شاید DNA-PKcs (ضمیمہ تصویر 6a) سے منسلک ہے۔ ان وٹرو کناز پرکھ کا تجزیہ کرنے کے لئے کیا گیا تھا کہ آیا TAF7 کو براہ راست DNA-PKcs کے ذریعہ فاس فوریلیٹ کیا گیا تھا۔ کناز پرکھ کی مصنوعات کا ماس اسپیکٹومیٹری کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ نتائج سے ظاہر ہوا کہ انسانی TAF7 کی S213، T137، Y24، اور S171 سائٹس DNA-PKcs (ضمیمہ تصویر 6b) کے ذریعے فاسفوریلیٹڈ تھیں۔ مزید برآں، ہمارے نتائج نے انسانوں میں p-DNA-PKcs اور TAF7 کی پروٹین کی سطح کے درمیان ایک مثبت تعلق کا انکشاف کیا۔CKD گردہTAF7 (تصویر 5c) کے ساتھ p DNA-PKcs کے امیونو فلوروسینس کو-سٹیننگ کے ذریعے ٹشوز۔

گردے کے لیے جڑی بوٹیوں کی فارمولیشن سیسٹانچ جاننے کے لیے یہاں کلک کریں

پچھلی تحقیق میں معلوم ہوا کہ TAF7 کا مالیکیولر وزن تقریباً 40 kDa ہے، لیکن فاسفوریلیٹڈ TAF7 تقریباً 55 kDa41 ہے۔ ویسٹرن بلاٹ اور امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ TAF7 کی سطح WT کنٹرولز کے گردے کے ٹشوز (تصویر 5d اور سپلیمنٹری تصویر 6d) میں UUO کے ذریعے بہت زیادہ متاثر ہوئی تھی۔ DNA-PKcs ناک آؤٹ نے WT کنٹرولز (تصویر 5d) کے مقابلے بیس لائن اور UUO دونوں ماڈلز میں TAF7 کے فاسفوریلیشن کو روک دیا۔ UUO چوہوں میں TAF7 کے فاسفوریلیشن کی تصدیق Phos-tag SDS-PAGE42 (ضمنی شکل 6c) سے بھی ہوئی۔ اسی طرح کے نتائج UIR ماڈل (تصویر 5e) میں بھی دیکھے گئے۔ DNA-PKcs inhibitor NU7441 کے ساتھ علاج نے چوہوں میں UIR کے ذریعہ TAF7 کے اپریگولیٹڈ فاسفوریلیشن کو بھی روکا (تصویر 5f)۔ مزید برآں، ویسٹرن بلاٹ کے ذریعے تجزیہ کردہ TAF7 کے پروٹین کی سطحوں سے پتہ چلتا ہے کہ HK-2 خلیات (تصویر 5g) میں DNA-PKcs ناک آؤٹ اور HK2 (تصویر 5h) یا NRF-49F خلیات میں NU7441 کے ساتھ علاج (تصویر 5i) نے وٹرو میں TGF 1 کی طرف سے حوصلہ افزائی TAF7 کے اپریگولیٹڈ فاسفوریلیشن کو روکا۔

چونکہ DNA-PKcs رینل فبروسس میں TAF7 کے فاسفوریلیشن میں ملوث ہے، اس لیے ہم نے جانچا کہ آیا TAF7 کی کمی گردوں کے اپکلا خلیوں کی تفریق کو متاثر کر سکتی ہے یا TGF 1 کی وجہ سے انٹرسٹیشل فبرو بلاسٹس کے فعال ہونے اور پھیلاؤ کو متاثر کر سکتی ہے۔ TAF7 ناک آؤٹ ایم پی ٹی سی{اور }} F سیل CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے، اور TAF7 ناک آؤٹ سیلز کی کامیاب تعمیر کی تصدیق مغربی دھبے (ضمنی شکل 6e) سے ہوئی۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ TAF7 ناک آؤٹ نے گردوں کے اپکلا خلیوں کی تفریق کو بہتر بنایا، جیسا کہ TGF 1 (تصویر 5j، l) کی نمائش کے بعد FN اور کولیجن I کی پیداوار کی کم سطح سے ظاہر ہوتا ہے۔ اسی طرح، TAF7 ناک آؤٹ نے NRF-49F خلیات کے منافع بخش فینوٹائپ کو ختم کر دیا جو TGF 1 کی طرف سے حوصلہ افزائی کرتا ہے، جیسا کہ FN پیداوار کی کم سطح (تصویر 5k)، کولیجن I (تصویر 5m)، -SMA (تصویر 5n) سے ظاہر ہوتا ہے۔ ) نیز TAF7−/− خلیوں میں EDU سٹیننگ (تصویر 5o) کی کم سطح۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا گردوں کے اپکلا خلیوں میں TAF7 کا زیادہ اظہار ایک منافع بخش فینوٹائپ چلانے کے لیے کافی ہے، HK-2 خلیات یا NRK49F خلیات کو انسانی TAF7 یا اس کے اتپریورتی کے اوور ایکسپریشن پلازمیڈ سے منتقل کیا گیا تھا۔ مغربی دھبے کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ HK-2 یا NRF49F خلیات کی منافع بخش فینوٹائپ کو درحقیقت TAF7 یا اس کے اتپریورتیوں (ضمنی شکل 6h,j) کی حد سے زیادہ اظہار سے بڑھایا گیا تھا۔ تاہم، HK-2 خلیوں میں DNA-PKcs ناک آؤٹ کے ذریعے TAF7 کے منافع بخش اثرات تقریباً مکمل طور پر مسدود ہو گئے تھے (ضمیمہ تصویر 6i)۔ مزید برآں، ہم نے جانچ کی کہ آیا TAF7 کی کمی DNA-PKcs کے منافع بخش اثرات کو متاثر کر سکتی ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ TAF7 کی کمی نے DNA-PKcs اوور ایکسپریشن (ضمنی شکل 6f) کے منافع بخش اثرات کو روکا اور mPTC خلیات (ضمنی شکل 6g) میں NU7441 کے اینٹی پروفبروٹک اثرات کو روک دیا۔ حال ہی میں، وانگ ایس، وغیرہ۔ پایا گیا کہ سائٹوپلاسمک DNA-PKcs کو بڑھایا گیا اور Fis1 کے ساتھ بات چیت کی گئی اور اسے Thr34 پر اس کے TQ شکل میں فاسفوریلیٹ کیا، جس نے Drp1 کے لیے Fis1 کی وابستگی کو بڑھایا اور AKI43 میں مائٹوکونڈریل فریگمنٹیشن کی حوصلہ افزائی کی۔ ہمارے مطالعے میں، جوہری نکالنے والے پروٹین کے تجزیے کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DNA-PKcs بنیادی طور پر UUO چوہوں کے گردوں کے نیوکلئس میں مقامی اور بڑھ گیا تھا جو AKI ماڈل سے مختلف تھا (ضمنی شکل 6k)۔ اور Fis1 کو دستک دینے سے TGF 1 کے ساتھ چیلنج شدہ گردوں کے نلی نما اپکلا خلیوں میں منافع بخش ردعمل کو فروغ دیا گیا، یہ تجویز کیا گیا کہ Fis1 نے CKD میں DNA-PKcs کے منافع بخش کردار میں ثالثی نہیں کی (ضمیمہ تصویر 6l)۔ ایک ساتھ مل کر، ان اعداد و شمار نے اشارہ کیا کہ TAF7 کا DNA-PK ثالثی فاسفوریلیشن رینل فبروسس کو بڑھاتا ہے۔

TAF7 RAPTOR کے اظہار کو بہتر بنا کر mTORC1 ایکٹیویشن کو فروغ دیتا ہے۔

TAF7 کے منافع بخش اثرات کے طریقہ کار کی چھان بین کرنے کے لیے، RNA-Seq کو TGF 1 کے ساتھ یا اس کے بغیر علاج کیے جانے والے NC اور TAF−/- mPTC خلیوں میں ٹرانسکرومیٹک تبدیلیوں کا تجزیہ کرنے کے لیے انجام دیا گیا۔ } ایم پی ٹی سی میں فبروسس سے وابستہ جین کا اظہار (ضمنی شکل 7a، b)۔ KEGG پاتھ وے کی افزودگی کے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ MTOR سگنلنگ پاتھ وے TGF 1 ٹریٹمنٹ کے بغیر TAF−/− اور NC mPTC سیلوں کے درمیان سب سے اوپر کا راستہ تھا (تصویر 6a)۔ جین سیٹ کی افزودگی تجزیہ (GSEA) نے TGF 1 کے ساتھ علاج کے بعد mTOR سگنلنگ پاتھ وے کی ایک اہم اپ گریجولیشن کا انکشاف کیا، جس میں NC کنٹرول سیلز (تصویر 6a) کے مقابلے mPTC سیلز میں TAF7 ناک آؤٹ کے بعد نمایاں طور پر کمی واقع ہوئی تھی۔ ایم ٹی او آر سگنلنگ کے ہیٹ میپ کے تجزیے نے یہ ظاہر کیا کہ RPTOR (RAPTOR)، mTORC144,45 کا ایک مثبت ریگولیٹر، TGF 1 کے ساتھ علاج کے ذریعے بڑھایا گیا تھا، جو mPTC خلیات میں TAF7 کے ناک آؤٹ سے روکا گیا تھا (تصویر 6b)۔

ایم پی ٹی سی خلیوں میں ٹی جی ایف 1 کے ساتھ علاج کے بعد آر پی ٹی او آر کی پروٹین کی سطح اور ایم ٹی او آر کی فاسفوریلیشن دونوں میں نمایاں اضافہ ہوا جیسا کہ مغربی بلاٹ کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا ہے۔ تاہم، TAF7 کی کمی نے NC کنٹرول (تصویر 6c) کے مقابلے میں ایم پی ٹی سی سیلوں میں ٹی جی ایف 1 کے ذریعہ آر پی ٹی او آر کی پروٹین کی سطح اور ایم ٹی او آر کی فاسفوریلیشن کو کم کیا۔ ایم ٹی او آر اور اس کے پروٹین پارٹنرز کی ایم آر این اے لیولز، بشمول ریپٹر، ریکٹر، اور ایم ایل ایس ٹی 8، کا تجزیہ qRT-PCR کے ذریعے کیا گیا، اور نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ TGF 1 علاج نے Rptor، Rictor، اور Mlst8 کے mRNA کی سطح کو بڑھا دیا لیکن mTOR نہیں۔ ٹی اے ایف 7 کی کمی نے ایم پی ٹی سی خلیوں میں ٹی جی ایف 1 کے علاج کے ساتھ اور اس کے بغیر ریپٹر کے ایم آر این اے کی سطح کو NC کنٹرول سیلز کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم کیا لیکن ریکٹر، ایم ایل ایس ٹی 8، یا ایم ٹی او آر (ضمیمہ تصویر 7 سی) میں نہیں۔ اسی طرح، DNA-PKcs کی کمی یا روکنا نے mRNA کی سطح کو نمایاں طور پر کم کیا۔Raptorin گردے کے ؤتکوںUUO چوہوں اور UIR چوہوں کی (ضمنی شکل 7d، e)۔ مزید برآں، ہم نے TAF7، TAF7- S213D، اور TAF7-S213A کے دو مختلف اوشیشوں 213 سیرین سائٹ میوٹینٹس بنائے تاکہ TGF میں انسانی Raptor کے ٹرانسکریشنل ایکٹیویشن پر TAF7 کے سیرین 213 کے فاسفوریلیشن کا تجزیہ کیا جا سکے۔ HK-2 سیل۔ لوسیفریز پرکھ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ان تمام TAF7 اتپریورتیوں کے زیادہ اظہار نے انسانی Raptor کی نقلی ایکٹیویشن میں اضافہ کیا، حالانکہ TAF7- S213A گروپ کی نسبتہ luciferase سرگرمی TAF7-WT اور TAF{ سے کم تھی۔ {15}S213D گروپس (تصویر 6d)۔ مزید برآں، ChIP پرکھ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ TAF7 براہ راست Rptor پروموٹر سے منسلک ہو سکتا ہے (تصویر 6e)۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ TAF7 TGF 1 کے ذریعہ RPTOR کی ٹرانسکرپشنی ایکٹیویشن میں ثالثی کرتا ہے، شاید نہ صرف باقیات 213 کے فاسفوریلیشن کے ذریعے۔ مزید برآں، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ RPTOR کی پروٹین کی سطح اور mTOR کی فاسفوریلیشن دونوں تھے۔گردے کے ؤتکوں میں اضافہUUO اور UIR چوہوں کی اور DNA-PKcs ناک آؤٹ کے بعد بیس لائن اور ماڈل دونوں چوہوں (تصویر 6f–i) میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ اسی طرح کے نتائج DNA-PKcs ناک آؤٹ HK-2 خلیات اور NRF-49F خلیات (تصویر 6j, k) میں NU7441 کے علاج کے جواب میں بھی دیکھے گئے۔ مزید برآں، مغربی دھبے کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ RPTOR کی پروٹین کی سطح اور mTOR کی فاسفوریلیشن DNA-PKcs یا TAF7 (ضمنی شکل 7f,g) کی حد سے زیادہ کارکردگی کے بعد بڑھ گئی تھی۔ مزید برآں، RPTOR کے دستک ڈاؤن نے واضح طور پر TGF 1 (ضمنی شکل 7h) کے ذریعے حوصلہ افزائی ایم ٹی او آر کے فاسفوریلیشن کو روک دیا۔ ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ TAF7 کا DNA-PKcs-ثالثی فاسفوریلیشن RPTOR کے اظہار کو اپ گریڈ کرکے mTORC1 ایکٹیویشن کو فروغ دیتا ہے۔

تصویر 6|TAF7 کا DNA-PKcs ثالثی فاسفوریلیشن RPTOR اظہار کو اپ گریڈ کرکے mTORC1 ایکٹیویشن کو فروغ دیتا ہے۔ ایک RNA-seq یہ ظاہر کرتا ہے کہ MTOR سگنلنگ (سرخ فونٹ کے ذریعہ اشارہ کیا گیا) TAF7-/- اور NC گروپوں کے درمیان سب سے اوپر فرق ظاہر کرنے والا سگنلنگ عنصر تھا۔ GSEA نے ظاہر کیا کہ NC + TGF 1 گروپ میں mTOR سگنلنگ کو اپ گریڈ کیا گیا تھا اور TAF7−/− + TGF 1 گروپ (n=2)، TGF 1 (5 ng/ml) علاج میں 24 گھنٹے تک دبا دیا گیا تھا۔ b ہیٹ میپ امیج جس میں دکھایا گیا ہے کہ Rptor (سرخ فونٹ کے ذریعہ اشارہ کیا گیا ہے) TF7−/− گروپوں میں NC گروپوں کے مقابلے میں TGF 1 (5 ng/ml) علاج کے ساتھ یا اس کے بغیر ہر ایک کے 24 گھنٹے (n=2) میں کمی واقع ہوئی ہے۔ گروپ)۔ RPTOR، mTOR، اور فاسفوریلیٹڈ mTOR کی پروٹین کی سطحوں کا تجزیہ TAF7-/- میں مغربی بلاٹ اور NC mPTCs میں TGF 1 (5 ng/ml) کے ساتھ 24 گھنٹے تک کیا گیا۔ بارز مقدار کے نتائج کی نمائندگی کرتے ہیں (مطلب ± SD، n=3 آزاد تجربات)۔ d Luciferase رپورٹر پرکھ HK-2 خلیوں میں TGF 1 (5 ng/ml) کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے۔ سلاخیں 3 آزاد تجربوں کے نتائج کی نمائندگی کرتی ہیں (مطلب ± SD)۔ E ChIP پرکھ TAF7 کا تجزیہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا جو Raptor کے پروموٹر سے منسلک ہے۔ بارز مقدار کے نتائج کی نمائندگی کرتے ہیں (مطلب ± SD، n=3 آزاد تجربات)۔ f RPTOR، mTOR اور phosphorylated-mTOR کی پروٹین کی سطح کا تجزیہ مغربی دھبے کے ذریعے کیا گیا۔گردے کے ؤتکوںDNA PKcs−/− اور WT کنٹرول چوہوں کو UUO (دن 7) یا UIR (دن 21) (g)، NU7441 (40 mg/kg) اور گاڑیوں کے علاج والے چوہوں کو UUO (h) یا UIR (i)، DNA PKcs−/− یا NC HK-2 خلیات (j) میں، NU7441 (0.1 μM) یا گاڑیوں کے علاج NRK-49F خلیات (k) میں TGF 1 (5 ng) کے ساتھ علاج کیا گیا /ml) 24 گھنٹے کے لیے۔ بارز مقدار کے نتائج کی نمائندگی کرتے ہیں (مطلب ± SD، ہر گروپ کے n=6 چوہے اور سیل ماڈلز کے لیے n=3 آزاد تجربات)۔ ایک طرفہ ANOVA جس کے بعد Tukey کے متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال d، e کے لیے p-values ​​کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ دو طرفہ ANOVAs کے بعد Šídák کے متعدد موازنہ ٹیسٹ کا استعمال c, f–k کے لیے p-values ​​کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ ماخذ ڈیٹا کو ماخذ ڈیٹا فائل کے طور پر فراہم کیا جاتا ہے۔

DNA-PK کی روک تھام Vivo اور in Vitro میں میٹابولک ری پروگرامنگ کو درست کرتی ہے۔

کئی پچھلے مطالعات کے مطابق 9,46، ایم ٹی او آر سی 1 کا غیر فعال ہونا میٹابولک ری پروگرامنگ میں ثالثی کرکے رینل فبروسس کے بڑھنے کو فروغ دیتا ہے۔fibrotic گردے. اس طرح، ہم نے جانچ کی کہ آیا DNA-PK یا TAF7 کی روک تھام فائبروٹک گردوں میں میٹابولک ری پروگرامنگ کو درست کرتی ہے۔ TGF 1-علاج شدہ NC اور TAF−/− mPTC خلیات میں ٹرانسکرپٹومک تبدیلیوں کے RNA-Seq تجزیہ کی بنیاد پر، KEGG پاتھ وے کی افزودگی کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ میٹابولک سگنلنگ پاتھ وے TGF {{4} کے درمیان سب سے زیادہ امتیازی طور پر اظہار کردہ راستوں میں سے ایک تھا۔ }علاج شدہ TAF−/− اور NC mPTC خلیات (تصویر 7a)۔ مزید برآں، GSEA نے NC کنٹرول سیلز (تصویر 7a) کے مقابلے TAF7 ناک آؤٹ ایم پی ٹی سی سیلز میں TGF 1 کے ساتھ علاج کے بعد آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن اور فیٹی ایسڈ آکسیڈیشن (FAO) کے راستے کی نمایاں اپ گریجشن کا انکشاف کیا۔ NC کنٹرول (تصویر 7a) کے مقابلے ایم پی ٹی سیز میں ٹی اے ایف 7 کو ناک آؤٹ کرنے پر گلائکولائسز کے راستے میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ TAF7 کی کمی PTC خلیوں میں TGF 1-حوصلہ افزائی شدہ میٹابولک ری پروگرامنگ کو درست کرتی ہے۔

فائبروٹک گردوں میں میٹابولک ری پروگرامنگ کو منظم کرنے میں DNA-PKcs کے کردار کو سمجھنا۔ سب سے پہلے، فیٹی ایسڈ آکسیڈیشن (CPT1، CPT2، ACOX1، اور ACOX2) میں شامل کلیدی خامروں کی پروٹین اور mRNA کی سطح کا مغربی بلاٹ اور qRT-PCR کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ نتائج سے ظاہر ہوا کہ UUO یا UIR حالات کے تحت WT چوہوں کے گردوں میں ان انزائمز کے اظہار کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا، لیکن DNA-PKcs ناک آؤٹ چوہوں (تصویر 7b، c اور ضمنی شکل 8) میں ان کا اظہار نمایاں طور پر بحال ہوا تھا۔ دوسرا، آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن کے لیے مائٹوکونڈریل مورفولوجی اور فنکشن ضروری ہیں، اور الیکٹران مائیکروسکوپی نے UUO کی طرف سے حوصلہ افزائی WT چوہوں کے گردے کے نلی خلیوں میں مائٹوکونڈریا کے واضح ٹکڑے ہونے کا انکشاف کیا، جس میں DNA-PKcs−/mice کے گردے کے نلی خلیوں میں نمایاں طور پر بہتری آئی تھی۔ 7f)۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ WT چوہوں میں UUO کی طرف سے غیر معمولی آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن اور فیٹی ایسڈ میٹابولزم DNA-PKcs ناک آؤٹ کے ذریعے بہتر ہوتا ہے۔

گلائکولیسس رینل فبروسس کی ایک خصوصیت ہے اور رینل فبروسس کی نشوونما کو فروغ دیتی ہے۔ Hexokinase 2 (HK2) اور lactate dehydrogenase A (LDHA) کی پروٹین کی سطح، جو کہ گلائکولائسز کے لیے شرح کو محدود کرنے والے انزائمز ہیں، کا مغربی بلاٹ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ UUO چوہوں اور UIR چوہوں کے گردے کے ؤتکوں میں HK2 اور LDHA کی سطح کو نمایاں طور پر بڑھا دیا گیا تھا، جو فائبروٹک گردوں میں گلائکولٹک سرگرمی میں اضافہ کی نشاندہی کرتا ہے۔ اس کے برعکس، UUO اور UIR دونوں ماڈلز میں WT چوہوں کے مقابلے DNA-PKcs کی کمی والے چوہوں کے گردے کے ٹشوز میں گلائکولائسز کو نمایاں طور پر روکا گیا، جیسا کہ HK2 اور LDHA (تصویر 7d، e) کی نچلی سطح سے ظاہر ہوتا ہے۔ TGF 1-علاج شدہ DNA-PKcs−/− HK-2 خلیات اور NU7441-علاج شدہ NRK-49F خلیات میں گلائکولٹک سرگرمی کا تجزیہ کرنے کے لیے ایکسٹرا سیلولر ایسڈیفیکیشن ریٹ (ECAR) اسسز کیے گئے تھے۔ وٹرو میں. DNA-PKcs کے ناک آؤٹ اور NU7441 کے ساتھ علاج دونوں نے ECAR میں نمایاں کمی کی، جسے TGF 1-علاج شدہ خلیوں میں کنٹرول سیلز (تصویر 7g–h) کے مقابلے اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ TF7-/- کے ناک آؤٹ نے بھی TGF 1 (تصویر 7i) کے ذریعہ ایم پی ٹی سی میں ECAR کی اپ گریجشن میں نمایاں کمی کی۔ مزید برآں، DNA-PKcs−/− اور NU7441-علاج شدہ خلیوں کے کلچر میڈیم میں ایکسٹرا سیلولر لییکٹیٹ کی سطح بھی کم ہو گئی تھی (تصویر 7j، k)۔

یہ سمجھنے کے لیے کہ DNA-PKcs−/− چوہوں میں میٹابولک ری پروگرامنگ کیسے بہتر ہوئی، ہم نے UUO سرجری (تصویر 8a) کے بعد میٹابولائٹ تبدیلیوں کا تجزیہ کرنے کے لیے میٹابولومکس پروفائلنگ کا استعمال کیا۔ UUO نے WT چوہوں کے گردوں میں خراب گلوکوز میٹابولزم کی حوصلہ افزائی کی، جیسا کہ WT UUO گردوں میں گلوکوز میٹابولائٹس، جیسے پائروویٹ، کی کمی سے ظاہر ہوتا ہے، جو DNA-PKcs (تصویر 8a) کے ناک آؤٹ سے بحال ہوا تھا۔ مزید برآں، UUO کا نشانہ بننے والے WT چوہوں کے گردوں میں لییکٹیٹ کے بڑھتے ہوئے جمع کو بھی دیکھا گیا، جو گردے کے خلیوں میں آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن سے بڑھے ہوئے گلائکولائسز میں میٹابولک تبدیلی کی نشاندہی کرتا ہے۔ تاہم، DNA-PKcs−/− چوہوں کے زخمی گردوں میں، glycolysis کو نمایاں طور پر روکا گیا تھا (تصویر 8a)۔ مزید برآں، کارنیٹائن کنجوگیٹڈ لانگ چین فیٹی ایسڈز کا جمع ہونا، بشمول لوروائل کارنیٹائن (تصویر 8a) اور مائرسٹائل کارنیٹائن (تصویر 8a)، WT UUO چوہوں کے گردوں میں دیکھا گیا، جو کہ فیٹی ایسڈ میٹابولزم میں نقائص کی نشاندہی کرتا ہے۔ اس کے برعکس، DNA-PKcs ناک آؤٹ نے بڑی حد تک ان تمام اسامانیتاوں کو درست کیا جو UUO کی طرف سے پیدا کی گئی تھیں۔ ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ڈی این اے پی کے یا ٹی اے ایف 7 کی روک تھام Vivo اور وٹرو میں چوٹ یا TGF 1 کی وجہ سے میٹابولک ری پروگرامنگ کو درست کرتی ہے۔

بحث

اپیتھیلیل ڈیفرینٹی ایشن اور میوفائبروبلاسٹ ایکٹیویشن اور پھیلاؤ، یہ سب سیلولر چوٹ سے شروع ہوتے ہیں، CKD2 کی ترقی کو فروغ دیتے ہیں۔ اگرچہ ڈی این اے ڈیمیج رسپانس (DDR) اکثر گردوں کے اپکلا کی چوٹ47 کے ساتھ منسلک ہوتا ہے، لیکن ترقی پسند CKD میں اپیتھیلیل ڈیفرینٹی ایشن اور میوفائبروبلاسٹ ایکٹیویشن میں اس کے ممکنہ کردار کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔ اس مطالعے میں، ہمارے نتائج نے انکشاف کیا کہ ڈی این اے پی کے سی ایس کا اظہار، ڈی این اے پر منحصر پروٹین کناز کیٹلیٹک سبونائٹ، فائبروٹک گردوں میں بڑھتا ہے اور سی کے ڈی کی نشوونما کو فروغ دیتا ہے۔ اگرچہ DNA-PKcs DNA ڈبل سٹرینڈڈ بریکس (DSBs)24,25 یا ROS26 کے ذریعے چالو ہوتا ہے، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DNA-PKcs اظہار بھی TGF 1-SMAD سگنلنگ کے ذریعے چالو کیا گیا تھا، جبکہ DNA-PKcs ناک آؤٹ نے SMAD2/ SMAD3 کو روکا تھا۔ . یہ نتائج فبروسس میں TGF 1-SMAD سگنلنگ ایکٹیویشن میں ثالثی کرنے والے ایک نئے ممکنہ راستے کی تجویز کرتے ہیں۔

اگلا، ہم نے عالمی prkdc جین ناک آؤٹ چوہوں کو تیار کیا۔ ہمارے نتائج سے انکشاف ہوا ہے کہ DNA-PKcs کو حذف کرنے سے گردوں کی نلی نما چوٹ کو کم کیا گیا ہے اور UUO اور UIR ماؤس ماڈل دونوں میں رینل انٹرسٹیشل فبروسس کی ترقی ہے۔ ہم یہ نتیجہ اخذ نہیں کر سکتے کہ DNA-PK لیمفوسائٹس سے آزاد رینل فبروسس کو فروغ دیتا ہے، کیونکہ DNA-PKcs-/- چوہوں کی سب سے نمایاں فینوٹائپ لیمفوسائٹ کی کمی 27,48 ہے۔ لیمفوسائٹ کی کمی کے ممکنہ اثر کو خارج کرنے کے لیے، ہم نے CRISPR/cas9 ناک ان چوہوں کا استعمال کرتے ہوئے Vivo میں مخصوص DNA-PKcs ناک آؤٹ کے ساتھ قربت والے رینل ٹیوبلر اپیٹیلیل سیل بنایا۔ ہمارے نتائج سے انکشاف ہوا ہے کہ DNA-PKcs کے گردوں کے نلی نما مخصوص حذف ہونے سے UUO میں گردوں کے بیچوالا فبروسس کے بڑھنے میں بھی رکاوٹ ہے۔ مزید برآں، ہمارے نتائج نے یہ بھی ظاہر کیا کہ DNA-PKcs کی کمی نے نلی نما اپکلا سیل فینوٹائپ کو محفوظ کیا اور وٹرو میں بیچوالا فبروبلاسٹ ایکٹیویشن کو منظم کیا۔ ان نتائج سے ظاہر ہوتا ہے کہ DNA-PKcs اپیٹیلیل ڈیفرینٹی ایشن اور میوفائبروبلاسٹ ایکٹیویشن میں ثالثی کرتا ہے، شاید لیمفوسائٹ کی کمی کے ساتھ کسی براہ راست تعلق کے بغیر۔ مزید برآں، ہم نے ایک انتہائی مخصوص DNA-PKcs inhibitor، NU7441 کے antifibrotic اثرات کی چھان بین کی، اور نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ NU7441 کے علاج نے UUO اور UIR ماؤس دونوں ماڈلز میں رینل انٹرسٹیشل فبروسس کی بڑھوتری کو نمایاں طور پر کم کیا۔ NU7441 جسمانی خوراکوں میں DNA-PK کا جزوی روکنا ہے۔ پچھلے مطالعہ نے اشارہ کیا کہ NU7441 کے علاج نے بالغ چوہوں میں بی سیل کے فنکشن کو نمایاں طور پر متاثر نہیں کیا۔ مزید یہ کہ، ہم نے UUO ماؤس ماڈل میں NU7441 کے ساتھ DNA-PKcs ناک آؤٹ چوہوں کا علاج کرکے DNA-PKcs پر NU7441 کی مخصوص کارروائی کی تصدیق کی۔ یہ نتائج CKD کے طبی علاج کے لیے NU7441 کی ممکنہ تبدیلی کا مشورہ دیتے ہیں، حالانکہ مزید تحقیق کی ضرورت ہے۔

ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DNA-PKcs کی کمی نے Vivo اور in Vitro میں DSBs کو بڑھا نہیں دیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ DNA-PKcs گردوں کی چوٹ اور رینل انٹرسٹیشل فبروسس میں ثالثی کرتا ہے، شاید DDR میں اس کے کردار کے ذریعے نہیں۔ فاسفوپروٹیومکس تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ DNA-PKcs-/- چوہوں کے گردے کے ٹشوز میں TAF7 کی فاسفوریلیشن میں کمی واقع ہوئی ہے۔ TAF7 کی کمی نے گردوں کے اپکلا خلیات اور TGF 1 کی طرف سے حوصلہ افزائی fibroblasts کے profibrotic فینوٹائپ کو روک دیا. TAF7 کے منافع بخش اثرات تقریبا مکمل طور پر گردوں کے اپکلا خلیوں میں DNA-PKcs کی کمی کی وجہ سے مسدود ہو گئے تھے۔ ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ TAF7 DNA-PKcs kinase سرگرمی کا سبسٹریٹ ہے اور TAF7 کا DNA-PKcs ثالثی فاسفوریلیشن رینل فبروسس کو بڑھاتا ہے۔

RNA-Seq کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ TAF7 Raptor کے اظہار کو بہتر بنا کر mTORC1 ایکٹیویشن کو فروغ دیتا ہے، جو mTORC149,50 کا ایک مثبت ریگولیٹر ہے۔ فاسفوپروٹیوم کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ WT کنٹرولز کے مقابلے DNA-PKcs-/- چوہوں کے گردوں میں سیرین-213 پر TAF7 کی فاسفوریلیشن میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے۔ ماس سپیکٹومیٹری تجزیہ نے اشارہ کیا کہ انسانی TAF7 کی S213، T137، Y24، اور S171 سائٹس کو وٹرو میں DNA-PKcs کے ذریعے فاسفوریلیٹ کیا گیا تھا۔ مزید برآں، TAF7-WT، TAF7-S213D، اور TAF7-S213A سمیت مختلف TAF7 اتپریورتیوں کی منتقلی نے HK-2 خلیات میں انسانی Rptor کی ٹرانسکریشنل ایکٹیویشن میں اضافہ کیا۔ ان نتائج سے ظاہر ہوتا ہے کہ TAF7 TGF 1 کے ذریعے حوصلہ افزائی Rptor کی ٹرانسکرپشنی ایکٹیویشن میں ثالثی کرتا ہے، شاید نہ صرف اس کی سائٹ کے فاسفوریلیشن کے ذریعے۔ TAF7 ایک بنیادی ٹرانسکرپشن عنصر نہیں ہے لیکن یہ دوسرے TAFs کے ساتھ تعامل کرتا ہے، جیسے TAF141,51، اور ٹرانسکرپشن عوامل کی انزیمیٹک سرگرمیوں کو منظم کرتا ہے، جو اس بات کی وضاحت کر سکتا ہے کہ TAF7 کے زیادہ اظہار نے HK میں انسانی RPTOR کی نقل کو کیوں فعال نہیں کیا؟ } خلیات بغیر TGF 1 کے علاج کے۔ TAF7 کی کئی سیرین باقیات کو نقل کو چالو کرنے یا روکنے کے لیے فاسفوریلیٹ کیا جا سکتا ہے41۔ مثال کے طور پر، ایک پچھلی تحقیق سے پتا چلا ہے کہ سیرین 264 پر TAF7 کے فاسفوریلیشن نے TAF7 کو TAF1 کے پابند کرنے میں خلل ڈالا، جس کے نتیجے میں سائکلن D141 کی ٹرانسکرپشن اپ گریجولیشن ہوئی۔ TAF1-انحصار ٹرانسکرپشن کے علاوہ، TAF7 TAF1-آزاد ٹرانسکرپشن51 کو بھی ریگولیٹ کرتا ہے۔ اس مطالعہ میں، ChIP پرکھ کے نتائج نے یہ ظاہر کیا کہ TAF7 Rptor پروموٹر سے براہ راست منسلک ہو سکتا ہے، تجویز کرتا ہے کہ TAF7 شاید Rptor اظہار کو شروع کرنے کے لیے دوسرے ٹرانسکرپشن عوامل کے ساتھ تعاون کرے۔ اگرچہ Rptor کے TAF7-ثالثی ٹرانسکرپشن اپ گریجولیشن کے طریقہ کار کو مزید تحقیق کی ضرورت ہے، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ DNA-PKcs Rptor کے اظہار کو اپ گریڈ کرکے mTORC1 ایکٹیویشن کو فروغ دینے کے لیے TAF7 کے فاسفوریلیشن میں ثالثی کرتا ہے۔

پچھلے کئی مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ ایم ٹی او آر سی 1 سگنلنگ فبروٹک کڈنی 9,52 سے مختلف اپکلا خلیوں اور میوفائبروبلاسٹ میں چالو ہوتا ہے۔ اگرچہ DNA-PK کو DNA breaks53 کے جواب میں ٹیومر سیلز میں AKT/mTOR سگنلنگ کو فاسفوریلیٹ اور چالو کرنے کی بھی اطلاع دی گئی ہے، لیکن درست طریقہ کار نامعلوم ہے۔ ہمارے نتائج نے انکشاف کیا کہ TAF7 کا DNA-PKcs-ثالثی فاسفوریلیشن ریپ ٹور کے اظہار کو اپ گریڈ کرکے mTORC1 ایکٹیویشن کو فروغ دیتا ہے، fibrotic گردوں میں mTORC1 ایکٹیویشن کا ممکنہ طریقہ کار فراہم کرتا ہے۔ mTORC1 کی دائمی ایکٹیویشن بہت سی بیماریوں میں میٹابولک ری پروگرامنگ کو فروغ دیتی ہے، بشمول CKD9,54۔ حالیہ مطالعات نے اس بات پر روشنی ڈالی ہے کہ CKD9,10,13 کے جواب میں گردوں کے نلی نما خلیات اور فائبروبلاسٹ دونوں میٹابولک فینوٹائپس کو تبدیل کرتے ہیں۔ فیٹی ایسڈ آکسیڈیٹیو پاتھ ویز اور آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن سے گلائکولائسز میں تبدیلی میٹابولک ری پروگرامنگ 9,10 کی بنیادی خصوصیت ہے۔ چونکہ ایم ٹی او آر میٹابولک ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے میں مرکزی کردار ادا کرتا ہے، ایم ٹی او آر کی روک تھام ضمنی اثرات کو ظاہر کرتی ہے۔ مزید یہ کہ، TGF- سگنلنگ کی طویل مدتی روکنا بھی ناقابل قبول منفی اثرات سے وابستہ ہے۔ اس مطالعہ میں، ہم نے پایا کہ DNA-PKcs کی سرگرمی عام گردوں میں تقریباً ناقابل شناخت تھی، CKD کے تحت اس کے مضبوط اضافہ کے برعکس۔ اس طرح، DNA-PKcs کی روک تھام فائبروٹک گردوں میں میٹابولک ری پروگرامنگ کو درست کرتی ہے۔

تصویر 8|DNA-PK کو حذف کرنا میٹابولک ری پروگرامنگ کو درست کرتا ہے۔ ہر گروپ سے گردے کے ٹشوز کا میٹابولومکس تجزیہ جیسا کہ اشارہ کیا گیا ہے۔ ہیٹ میپ کی تصویر ہر گروپ (n=4) کے گردے میں گلائکولیسس پاتھ وے، فیٹی ایسڈ میٹابولزم، اور کربس سائیکل میں میٹابولائٹس کی رشتہ دار سطح کو دکھاتی ہے۔ سلاخیں ہر گروپ کے گردوں میں نمائندہ میٹابولائٹس کے شماریاتی تجزیہ کی نمائندگی کرتی ہیں (مطلب ± SD، ہر گروپ کے n=4 چوہوں)۔ پی ویلیوز کا تعین کرنے کے لیے ٹوکی کے متعدد موازنہ ٹیسٹ کے بعد یک طرفہ ANOVA کا استعمال کیا گیا۔ بی ورکنگ ماڈل (یہ ٹیمپلیٹ BioRender.com کے ساتھ بنایا گیا تھا) جس کی وضاحت کرتا ہے جس میں DNA-PKcs TAF7 کے فاسفوریلیشن کے ذریعے Raptor/mTORC1 سگنلنگ کو چالو کرنے میں ثالثی کرتا ہے اور زخمی اپکلا خلیوں اور myofibroblasts میں میٹابولک ری پروگرامنگ کو فروغ دیتا ہے۔

حوالہ جات

1. رومگنانی، P. et al. دائمی گردے کی بیماری. نیٹ Rev. Dis. پرائمر 3، 17088 (2017)۔

2. ہمفریز، رینل فبروسس کے بی ڈی میکانزم۔ انو Rev. Physiol. 80، 309–326 (2018)۔

3. ناتھ، کے اے دی ٹیوبولوئنٹرسٹیٹیم ان پروگریسو رینل ڈیزیز۔ کڈنی انٹ۔ 54، 992–994 (1998)۔

4. Zhou, D. & Liu, Y. 2015 میں رینل فبروسس: گردے کے فبروسس کے طریقہ کار کو سمجھنا۔ نیٹ Rev. Nephrol. 12، 68–70 (2016)۔

5. وین، ٹی اے اور راملنگم، ٹی آر میکانزم آف فائبروسس: فبروٹک بیماری کے لیے علاج کا ترجمہ۔ نیٹ میڈ. 18، 1028–1040 (2012)۔

6. Meng, XM, Nikolic-Paterson, DJ & Lan, HY TGF-beta: fibrosis کا ماسٹر ریگولیٹر۔ نیٹ Rev. Nephrol. 12، 325–338 (2016)۔

Wecistanche کی معاون خدمت - چین میں سب سے بڑا cistanche برآمد کنندہ:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

واٹس ایپ٪ 2ftel٪3a٪7b٪7b0٪7d٪7d

مزید تفصیلات کے لیے خریداری کریں:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

گردے کے لیے 25% ایکیناکوسائیڈ اور 9% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ قدرتی آرگینک سیسٹانچ ایکسٹریکٹ حاصل کرنے کے لیے یہاں کلک کریں۔