Echinacoside HBX/TREM2 ثالثی NF‑κB سگنلنگ پاتھ وے کو مسدود کر کے انسانی رینل ٹیوبلر اپیتھیلیل سیلز کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے۔

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

یوفان ژانگ، کن فانگ وو، لیمن ژونگ، ڈونگ وی گونگ

خلاصہ

ہیپاٹائٹس بی وائرس X (HBX) پروٹین کی HBV کی نقل کے لیے ضروری ہے اور یہ انسانوں میں ہیپاٹائٹس کے بڑھنے میں کردار ادا کرتا ہے۔ تاہم، HBV-حوصلہ افزائی دائمی گلوومیرولونفرائٹس (HBV-Gn) کے دوران HBX کا بنیادی کام نامعلوم ہے۔ (cistanche سے echinacoside)(ecH) Cistanche genus سے ایک phenylethanoid glycoside ہے، جس میں مضبوط antiapoptosis اور neuroprotective سرگرمیاں ہوتی ہیں۔ موجودہ مطالعہ میں، HBX کے فنکشن اور HBX اور ecH کے درمیان انسانی گردوں کے نلی نما اپکلا خلیات (rTecs؛ HK-2 سیل لائن) کے درمیان تعلق کو تلاش کیا گیا۔ ریورس ٹرانسکرپشن مقداری Pcr اور ویسٹرن بلاٹ کے تجزیوں کا استعمال بالترتیب HK-2 خلیوں میں HBX کے mRNA اور پروٹین کے اظہار کی سطح کو درست کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ سیل کے پھیلاؤ کا تجزیہ کرنے کے لیے سیل گنتی کٹ-8 پرکھ کی گئی تھی۔ اپوپٹوسس کی شرح کا تعین کرنے کے لئے فلو سائٹومیٹری تجزیہ استعمال کیا گیا تھا۔ HBX نے HK-2 خلیوں میں antiproliferative اور proapoptotic اثرات دکھائے اور یہ مثبت طور پر myeloid cell 2 (TreM2) اظہار پر ظاہر ہونے والے ٹرگرنگ ریسیپٹر سے وابستہ تھا۔ مزید برآں، ECH نے HK-2 خلیات میں HBX کے کام میں خلل ڈالا، HBX دبانے والے کے طور پر کام کر رہا ہے۔ مزید یہ کہ، ایک مخصوص NF‑κB روکنے والا، PdTc، HBX اور nF-κB کے درمیان تعلقات کو مزید جانچنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج نے تجویز کیا کہ nF-κB HBX/TreM2 سگنلنگ پاتھ وے میں شامل تھا اور RTECS میں TreM2 اظہار کو منفی طور پر منظم کیا گیا تھا۔ موجودہ مطالعہ نے HBX کے کام کے بارے میں نئی ​​بصیرت فراہم کی، اور HBV-Gn کے علاج کے ایجنٹ کے طور پر ECH کی ممکنہ قدر کا بھی اشارہ کیا۔

تعارف

ہیپاٹائٹس بی وائرس (HBV) ایک Hepadnaviridae وائرس ہے، جو انسانوں میں شدید اور دائمی ہیپاٹائٹس کا باعث بنتا ہے (1)۔ ایچ بی وی، نہ صرف جگر میں مستقل یا عارضی انفیکشن کا سبب بنتا ہے بلکہ ایکسٹرا ہیپیٹک ٹشو کو بھی متاثر کرتا ہے، بشمول لبلبہ، بائل ڈکٹ، لمفائیڈ سسٹم اور گردے (2)۔ مزید یہ کہ، HBV انفیکشن کا دائمی گلوومیرولونفرائٹس (HBV-Gn) سے گہرا تعلق ہے۔ تاہم، HBV-Gn کے دوران HBV کے مالیکیولر میکانزم کو پوری طرح سے نہیں سمجھا جاتا ہے (3,4)۔

HBV ریپلیکیشن (5,6) کے لیے HBV ریگولیٹری ہیپاٹائٹس بی وائرس X (HBX) پروٹین کی ضرورت ہوتی ہے۔ متعدد مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ HBX HBV انفیکشن سے وابستہ ہیپاٹو کارسینوم (7-9) کے دوران خلیوں کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے۔ انسانی رینل ٹیوبلر اپیٹیلیل سیل (rTecs) رینل ٹیوبلر انٹرسٹیٹیئم کا ایک بڑا حصہ ہیں اور گردوں کی سوزش (10) میں فعال کردار ادا کرتے ہیں۔ rTec apoptosis کا تعلق نلی نما انٹرسٹیٹیئم کی خرابی کے ساتھ ہے، جو بعد میں HBV-Gn (10) کی ترقی کا باعث بنتا ہے۔ HBX بنیادی طور پر rTec خلیوں میں ظاہر ہوتا ہے اور HBV-Gn (11,12) والے مریضوں میں rTec اپوپٹوس اور رینل ٹیوب کے گھاووں کا سبب بنتا ہے۔ مزید برآں، HBX کو چوہا rTecs (13) کے پھیلاؤ کو دبانے کی اطلاع دی گئی ہے، اور HBX اوور ایکسپریشن پرائمری rTecs میں G1 سے S مرحلے تک سیل سائیکل کی ترقی کو تیز کرتا ہے، جس کے نتیجے میں S مرحلے (14) میں سیل سائیکل گرفتاری کا باعث بنتا ہے۔ لہذا، HBX روکنے والے کی شناخت HBV-Gn کے لیے ایک نیا علاج فراہم کر سکتی ہے۔ تاہم، انسانی rTecs میں HBX کے عین مطابق مالیکیولر نیٹ ورک کو پوری طرح سے سمجھا نہیں گیا ہے۔(cistanche سے echinacoside)(ecH) ایک قدرتی مرکب ہے جس سے نکالا گیا ہے۔Cistancheپودے، جو اینٹی پوپٹوٹک اور اینٹی سوزش اثرات دکھاتے ہیں (15,16)۔ پچھلے مطالعے میں بتایا گیا ہے کہ ECH پھیلاؤ کو اکساتا ہے اور آنتوں کے اپکلا خلیوں کے اپوپٹوسس کو روکتا ہے (17)۔ مزید برآں، ای سی ایچ کو آسٹیو بلاسٹ خلیوں (18) کے پھیلاؤ میں اضافہ کرکے ہڈیوں کی تخلیق نو کو تیز کرنے کی اطلاع دی گئی ہے۔ ecH چوہے کے آنتوں کے اپکلا خلیات (16,19) میں HBV کی نقل، اینٹیجن کے اظہار اور سوزش کو بھی کم کر سکتا ہے۔ تاہم، rTecs پر ecH کے حیاتیاتی اثر کو مکمل طور پر واضح نہیں کیا گیا ہے۔

TreM2 اوور ایکسپریشن نے گلیوما خلیوں (22) کے پھیلاؤ کو فروغ دیا۔ اس کے برعکس، TreM2 دستک ڈاؤن nF-κB کی نقل مکانی کو کم کر دیتا ہے انحطاط پذیر انسانی نیوکلئس پلپوسس خلیوں (23) میں نیوکلئس میں۔ مزید برآں، TreM2 کو انسانی انٹرورٹیبرل ڈسک انحطاط (23) کے لیے ایک نئے علاج کے ہدف کے طور پر شناخت کیا گیا ہے۔ تاہم، انسانی rTecs میں TreM2 کے حیاتیاتی فعل کی اطلاع نہیں دی گئی ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، HBX overexpression (oeHBX) کو انسانی rTecs (HK-2 سیل لائن) میں شامل کیا گیا تھا اور اس کے نتیجے میں، ecH (cistanche سے echinacoside) منتقلی oeHBX خلیوں پر تفتیش کی گئی۔ موجودہ مطالعہ کا مقصد HBX کے افعال اور HBV-Gn کے لیے ایک مؤثر علاج کے ایجنٹ کے طور پر ecH کی ممکنہ قدر کی چھان بین کرنا تھا۔

مواد اور طریقے

سیل ثقافتانسانی rTec سیل لائن HK-2 کو شنگھائی یاجی بائیو ٹیکنالوجی کمپنی، لمیٹڈ سے خریدا گیا تھا۔ HK-2 خلیوں کو DME/F12 میڈیا (cat. no. SH30023.01B; Hyclone; cytiva) میں 10 فیصد فیٹل بوائین سیرم (بلی نمبر 16000‑044؛ گبکو؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، .)، 2 mM l-glutamine اور 1 فیصد پینسلن/سٹریپٹومائسن (کیٹ نمبر P1400-100؛ بیجنگ سولاربیو سائنس اینڈ ٹیکنالوجی کمپنی، لمیٹڈ) 37˚C پر 5 فیصد CO2 کے ساتھ۔

آر این اے علیحدگی اور معکوس نقل کی مقداری پی سی آر (RT‑qPCR)۔مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، کل آر این اے HK-2 خلیوں سے Trizol® (cat. no. 1596 -026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, inc.) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول (بلی نمبر K1622؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ) کے مطابق فرسٹ اسٹرینڈ سی ڈی این اے سنتھیسس کٹ کا استعمال کرتے ہوئے ٹوٹل آر این اے کو سی ڈی این اے میں الٹا نقل کیا گیا تھا۔ qPCR کو مینوفیکچرر کے پروٹوکول (کیٹ نمبر K0223؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریشن) کے مطابق ABI‑7300 ​​ریئل ٹائم ڈیٹیکٹر (اپلائیڈ بایو سسٹم؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریشن) کے مطابق SYBr-Green premix کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ پی سی آر کی شرائط یہ تھیں: 10 منٹ کے لیے 95˚C اس کے بعد 15 سیکنڈ کے لیے 95˚C کے 40 چکر، 45 سیکنڈ کے لیے 60˚C۔ ہر ردعمل کے لیے تین دہرانے کی ضرورت تھی۔ qPCR کے لیے درج ذیل پرائمر جوڑے استعمال کیے گئے تھے: HBX فارورڈ، 5'-GGcTGcTaGGTTGTacTG-3' اور ریورس، 5'-caGaGGTGaaGcGaaGTG -3'; TreM2 فارورڈ، 5'-TGGcacTcTcaccaTTacG-3' اور ریورس، 5'-ccTccc aTcaTcTTccTTcac-3'; اور GaPdH فارورڈ، 5'-AAT cccaTcaccaTcTTc-3' اور ریورس، 5'-aGGcTGTTG TcaTacTTc-3'۔ mRNA کی سطح کو 2‑ΔΔCq طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے مقدار کا تعین کیا گیا اور اندرونی حوالہ جین میں معمول بنایا گیا۔جی اے پی ڈی ایچ (24).

اوور ایکسپریشن اور مار گرانا.HBX اور TreM2 کے اوور ایکسپریشن کو دلانے کے لیے، مکمل طوالت کے HBX یا TreM2 cDNA کے سلسلے کو plVX-puro ویکٹر (cleantech لیبارٹریز، inc.) میں ڈبل ہاضمہ کے ذریعے داخل کیا گیا تھا۔ہندiii اورایکو آر آئی)۔ اس کے بعد، دوبارہ ملاپ شدہ پلازمیڈ (1.5 µg) HK-2 خلیات (2x105) میں تبدیل ہو گیا۔ فرضی پلازمیڈ (ایک خالی ویکٹر، 1 µg) کو عارضی طور پر HK-2 خلیات (2x105) میں لیپوفیکٹامین® 2000 (بلی نمبر 11668-027، انویٹروجن، تھرمو) کا استعمال کرتے ہوئے منفی کنٹرول (oenc) کے طور پر منتقل کیا گیا تھا۔ فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ)۔ ecH(cistanche سے echinacoside)(cat. no. 82854-37-3; Biopurify Phytochemicals, ltd.) کو DMSO (cat. no. d2650; Sigma-Aldrich; Merck KGaa) میں 1, 2.5, 5, 10, 20 اور ارتکاز میں تحلیل کیا گیا تھا۔

بالترتیب 50 mg/l؛ اور منتقلی oeHBX یا oeTreM2 خلیوں کی ثقافت میں شامل کیا گیا۔ اس کے بعد کا تجربہ 48 گھنٹے بعد شروع ہوا۔

TreM2 اظہار کو گھٹانے کے لیے، تین چھوٹی مداخلتیں (si)RNAs (siTreM2-1, siTreM2-2 اور siTreM2-3; 20 µM) TreM2 کو نشانہ بنانے کی ترکیب کی گئی تھی (شنگھائی میجربیو بائیو فارم ٹیکنالوجی co لمیٹڈ) اور بعد میں مینوفیکچرر کے پروٹوکول (انویٹروجن؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ) کے مطابق لیپوفیکٹامین® 2000 کا استعمال کرتے ہوئے HK-2 خلیات (2x105) میں منتقل ہوا۔ ایک غیر مخصوص سکیمبلڈ siRNA ترتیب (5'uucccGaacGuGucacGu3, 25 nM) si-negative control (nc) کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ TreM2 سرناس کے ٹارگٹڈ لوکس اور تسلسل ٹیبل سی میں فراہم کیے گئے ہیں۔ اس کے بعد کا تجربہ 48 گھنٹے بعد کیا گیا۔

مغربی دھبہکل پروٹین HK-2 خلیوں سے نکالا گیا تھا۔

RIPA lysis بفر کا استعمال کرتے ہوئے (بلی نمبر BYl40825؛ Jrdun Biotech Co., Ltd.)۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق Bicinchoninic Acid assay kit (cat. no. PICPI23223; Thermo Fisher Scientific, inc.) کا استعمال کرتے ہوئے کل پروٹین کی مقدار درست کی گئی اور 20 µg پروٹین/لین کو SDS-PaGe کے ذریعے 15 فیصد جیل پر الگ کیا گیا۔ نمونوں کی کثافت کا تعین مائکروپلیٹ ریڈر (dnM-9602، Pulangxin) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، علیحدہ پروٹین PVDF جھلی پر منتقل کر دیا گیا تھا. کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے 5 فیصد غیر چکنائی والے خشک دودھ کے ساتھ بلاک کرنے کے بعد، جھلی کو پرائمری اینٹی باڈیز (ٹیبل SII) کے ساتھ راتوں رات 4˚C پر انکیوبیٹ کیا گیا اور ثانوی اینٹی باڈی اینٹی ماؤس igG (1:1، 000، بلی نمبر a0216، بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی) 37˚C پر 1 گھنٹے کے لیے۔ مدافعتی پروٹین بینڈ کو ایک ای سی ایل سسٹم (سیٹیوا) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔ دھبوں کو سہ رخی میں انجام دیا گیا تھا۔جی اے پی ڈی ایچاور H3 کو بالترتیب سائٹوپلاسمک اور نیوکلیئر پروٹین کے لیے لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

نتائج

ای سی ایچ (cistanche سے echinacoside)دباتا ہے فنکشن کی ایچ بی ایکس میں HK-2 خلیاتاندازہ کرنے کے لئے

HBX کا فنکشن، HBX اوور ایکسپریشن HK-2 سیلز میں ہوا تھا۔ oeHBX خلیوں میں HBX کے رشتہ دار mrna اور پروٹین کی سطحوں کو oenc خلیات (تصویر 1a اور B) کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھا دیا گیا تھا۔ اس کے بعد، oeHBX خلیوں کو ecH کے مختلف ارتکاز (1، 2.5، 5، 10، 20 اور 50 mg/l؛ e1، e2.5، e5، e10، e20 اور e50، بالترتیب) کے ساتھ کلچر کیا گیا۔ HBX اوور ایکسپریشن نے HK-2 خلیوں کے پھیلاؤ کو نمایاں طور پر کم کر دیا، اور یہ کمی خوراک پر منحصر انداز میں ecH کے ذریعے 24 اور 48 گھنٹے (تصویر 1c) پر تبدیل ہو گئی۔

مزید برآں، oeHBX خلیوں کے پھیلاؤ کی شرح میں E1 سے علاج شدہ خلیات (تصویر 1c) کے مقابلے میں کوئی خاص فرق نہیں دکھایا گیا۔ اس کے برعکس، E10 علاج نے E20 اور E50 علاج کے مقابلے oeHBX خلیوں کے پھیلاؤ کی شرح میں نمایاں اضافہ کیا جس میں کوئی خاص فرق نہیں دکھایا گیا (تصویر 1c)۔ لہذا، e2.5، e5 اور e10-علاج شدہ خلیوں میں apoptosis پر ecH کے اثر کی جانچ کی گئی۔ HBX کے زیادہ اظہار نے HK-2 خلیوں کے apoptosis میں نمایاں اضافہ کیا، اور oeHBX خلیوں کی apoptosis کی شرح خوراک پر منحصر طریقے سے ECH علاج کے ساتھ کم ہوئی (تصویر 1d)۔ مجموعی طور پر، نتائج نے تجویز کیا کہ ecH نے HK-2 خلیوں میں HBX کے کام کو خوراک پر منحصر انداز میں روک دیا۔

TREM2 اظہار ہے روک دیا کی طرف سے ای سی ایچ(cistanche سے echinacoside) میں منتقلی oeHBX

خلیاتrT-qPcr اور ویسٹرن بلاٹنگ کا استعمال بالترتیب oeHBX خلیوں میں TreM2 کے رشتہ دار mrna اور پروٹین کے اظہار کی سطح کی جانچ کرنے کے لئے کیا گیا تھا۔ TreM2 mrna اور پروٹین کے اظہار کی سطح کو oeHBX خلیات میں oenc خلیات (تصویر 2a اور B) کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھا دیا گیا تھا۔ تاہم، ecH نے خوراک پر منحصر انداز میں منتقلی oeHBX خلیوں میں TreM2 کے اظہار کی سطح کو کم کیا (تصویر 2a اور B)۔ لہذا، نتائج نے تجویز کیا کہ HBX اظہار مثبت طور پر TreM2 اظہار کے ساتھ منسلک تھا، اور HK-2 خلیوں میں HBX پر ecH کے دبانے والے اثر کی مزید نشاندہی کی۔

مار گرانا اور حد سے زیادہ اظہار کی TREM2 میں HK-2 خلیاتTreM2 کے فنکشن کا مزید جائزہ لینے کے لیے بالترتیب rna مداخلت اور ایک lentiviral vector کا استعمال کرتے ہوئے HK-2 سیلز میں TreM2 ناک ڈاؤن اور اوور ایکسپریشن کی حوصلہ افزائی کی گئی۔ ناک ڈاؤن پرکھ کے لیے، انسانی جین کو نشانہ بنانے والے تین siRNAsTREM2(siTreM2-1, siTreM2-2 اور siTreM2-3) کو HK-2 خلیوں میں تبدیل کیا گیا تھا، اور ایک غیر مخصوص siRNA کو منفی کنٹرول (sinc) کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ تینوں TreM2 سرناس نے HK-2 خلیات (تصویر 3a اور B) میں TreM2 کے endogenous اظہار کو کامیابی سے گرا دیا۔ تاہم، سب سے کم رشتہ دار TreM2 mrna اور پروٹین کے اظہار کی سطح siTreM2-1 اور siTreM2-2-منتقل شدہ خلیات (تصویر 3a اور B) میں دیکھی گئی، لہذا، siTreM2-1 اور siTreM{{13} }} منتقلی شدہ خلیوں کو بعد کے تجربات کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔ اوور ایکسپریشن تجربات کے لیے، ایک پلاسمڈ جس میں مکمل طوالت کا انسانی TreM2cdna ترتیب تھا بنایا گیا اور بعد میں HK-2 خلیات (oeTreM2) میں تبدیل کیا گیا۔ a

فرضی پلازمڈ نے منفی کنٹرول (oenc) کے طور پر کام کیا۔ oeTREM2 خلیوں میں TREM2 اظہار کی سطح oenc خلیات (تصویر 3c اور d) کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھی تھی۔ لہذا، oeTreM2 خلیات کو بعد کے تجربات کے لیے استعمال کیا گیا۔

TREM2 خاموشی کم ہو جاتا ہے دی apoptosis کی oeHBX خلیاتsiTREM2 یا sinc سے تبدیل شدہ oeHBX خلیوں کے apoptosis پروفائل کا اندازہ کیا گیا۔ کھلے خلیوں کے مقابلے oeHBX پلس سنک خلیوں کی اپوپٹوس کی شرح نمایاں طور پر زیادہ تھی۔ تاہم، oeHBX پلس siTreM2-1 یا siTreM2-2 خلیوں میں oeHBX پلس سنک سیلز (تصویر 4a) کے مقابلے میں اپوپٹوس کی شرح میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی۔ نتائج نے تجویز کیا کہ TreM2 دستک ڈاؤن HK-2 سیل اپوپٹوسس کے دوران HBX کے کام کو روکتا ہے۔

سروائیوین کا تعلق اپوپٹوسس پروٹین فیملی کے روکنے والے سے ہے، جو اپوپٹوٹک سرگرمی کو روکتا ہے اور سیل کی موت کو دباتا ہے (25)۔ ٹارگٹنگ سروائیوین کو رینل سیل کارسنوما (26) کے علاج کے لیے ایک نئے نقطہ نظر کے طور پر شناخت کیا گیا ہے۔ nF-κB ایک apoptosis inhibitor بھی ہے جو antiapoptotic ٹیومر کے عمل میں کردار ادا کرتا ہے (27)۔ مزید برآں، caspase3 ایکٹیویشن apoptosis (28) کے ساتھ گہرا تعلق ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، HK-2 خلیوں میں TreM2، Survivin اور cleaved caspase3 کے پروٹین کے مواد کی مقدار درست کی گئی۔ oeHBX پلس siTreM2-1/2 خلیوں میں oeHBX پلس سنک سیلز (تصویر 4B) کے مقابلے میں TREM2 اظہار کی سطح میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی۔ oeHBX سیلز کے مقابلے oeHBX plus siTreM2-1/2 سیلز میں Survivin اظہار کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔ مزید برآں، oeHBX پلس siTreM2-1/2 سیلز میں oeHBX پلس سنک سیلز (تصویر 4B) کے مقابلے کلیویڈ کیسپیس3 ایکسپریشن کی سطح میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی۔ مزید برآں، oeHBX نے NF‑κB کی نیوکلیئس میں نقل مکانی میں نمایاں کمی کی، اور siTREM2‑1/2 منتقلی نے نمایاں طور پر nF-κB جوہری نقل مکانی (تصویر 4B) میں اضافہ کیا۔ ایک ساتھ لے کر، نتائج نے تجویز کیا کہ TreM2 HK-2 خلیوں میں HBX کا ایک بہاو عنصر تھا، لہذا، HBX انسانی rTecs میں TreM2 اظہار کو ریگولیٹ کر کے اپوپٹوسس کو فروغ دے سکتا ہے۔

TREM2 حد سے زیادہ اظہار دباتا ہے دی نقل مکانی کیNF-κB کو دی نیوکلئس میں HK-2 خلیاتecH کا اثر(cistanche سے echinacoside)oeTreM2-پر منتقلی خلیوں کا تجزیہ کیا گیا۔ TreM2 اوور ایکسپریشن نے HK-2 خلیوں کے اپوپٹوسس کو فروغ دیا (تصویر 5a)۔ ECH علاج (E10؛ تصویر 5A) سے oeTREM2 خلیوں کے apoptosis میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ مزید برآں، ECH نے oeTreM2 خلیوں میں TreM2 کے اظہار میں نمایاں کمی کی۔ TREM2 اوور ایکسپریشن نے Survivin کے اظہار کی سطح کو نمایاں طور پر کم کیا، تاہم، اظہار میں یہ کمی ECH کے ذریعے الٹ گئی۔ مزید برآں، oeTreM2 خلیوں میں oenc خلیات کے مقابلے کلیویڈ کیسپیس 3 کے پروٹین کے اظہار کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ ایک اثر جو ECH علاج سے نمایاں طور پر کم ہوا تھا۔ مزید برآں، ecH نے oeTreM2 خلیات (تصویر 5B) میں nF-κB کے نیوکلئس میں ٹرانسلوکیشن کو فروغ دیا۔ ایک ساتھ لے کر، نتائج نے اشارہ کیا کہ ecH نے انسانی rTec خلیوں میں TreM2 کے کام کو بھی دبایا۔

ایچ بی ایکس فنکشنز ہیں دبایا کی طرف سے دی NF-κB روکنے والا پی ڈی ٹی سیمیں انسان RTECsکے درمیان تعلقات کا مزید جائزہ لینے کے لیے

HBX اور nF-κB، HK-2 خلیوں کو ایک مخصوص nF-κB روکنے والے، PdTc (10 µmol/l؛ P10) کے ساتھ مہذب کیا گیا تھا۔ oeHBX خلیوں کے سیل اپوپٹوس کی شرح میں oenc خلیات (تصویر 6a) کے مقابلے میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔ تاہم، oeHBX پلس PdTc خلیوں نے oeHBX خلیوں کے مقابلے میں apoptosis کی شرح میں نمایاں اضافہ کیا۔ مزید برآں، oeHBX سیلز (تصویر 6B) کے مقابلے oeHBX پلس PdTc خلیوں میں TreM2 کے متعلقہ mRNA اور پروٹین کے اظہار کی سطح میں کمی واقع ہوئی ہے۔ لہذا، نتائج

تجویز کیا کہ NF-κB منفی طور پر oeHBX سے منتقلی خلیوں میں TreM2 اظہار کو منظم کرتا ہے۔

NF-κB روکنے والا پی ڈی ٹی سی دباتا ہے TREM2 پروموٹر سرگرمی میں oeHBX خلیاتایک luciferase رپورٹر (pGl3-enhancer-luc2) جس میں TreM2 (pGl3-enhancer-luc2-pTreM2) کے جنگلی قسم کے فروغ دینے والے تسلسل پر مشتمل ہے تعمیر کیا گیا تھا اور بعد میں اسے oenc، oeHBX اور میں تبدیل کیا گیا تھا۔ oeHBX پلس P10 کلچرڈ سیل۔

جنگلی قسم کے TREM2 پروموٹر پر مشتمل رپورٹر ویکٹر کی لوسیفریز سرگرمی oeHBX خلیوں میں oenc خلیوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھی تھی۔ تاہم، PdTc نے oeHBX خلیات (تصویر 7) میں رپورٹر کی لوسیفریز سرگرمی کو نمایاں طور پر دبا دیا۔ مجموعی طور پر، نتائج نے اشارہ کیا کہ PdTc نے oeHBX خلیوں میں TreM2 کی پروموٹر سرگرمی کو دبا کر TreM2 کی نقل کو روک دیا۔

بحث

HBX بنیادی طور پر HBV-Gn والے مریضوں کے rTecs میں ظاہر ہوتا ہے، اور وائرل روگجنن (11,29) کے تعین کنندہ کے طور پر کام کرتا ہے۔ لہذا، HBX مالیکیول نیٹ ورک کے فنکشن کے بارے میں معلومات میں اضافہ HBV-Gn کے علاج کے لیے ایک نیا نقطہ نظر تیار کرنے میں ایک اہم قدم ہے۔ موجودہ مطالعے کا مقصد HBX کے کام کی مزید جانچ کرنا اور انسانی rTecs میں اس کے ممکنہ مالیکیولر نیٹ ورک کو تلاش کرنا تھا۔

HBX rTecs (11) کے پھیلاؤ کو روکتا ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، انسانی RTECs میں HBX کے antiproliferation اور pro-apoptosis افعال کی نشاندہی کی گئی تھی، جس سے معلوم ہوتا ہے کہ HBX نے انسانی rTecs کی نشوونما کو دبایا ہے۔ پچھلے مطالعے نے اشارہ کیا تھا کہ ecH(cistanche سے echinacoside)HBV نقل اور اینٹیجن اظہار کو روکتا ہے (19)۔ موجودہ مطالعہ میں، ecH(cistanche سے echinacoside)علاج نے HK-2 خلیوں میں HBX کے کام میں خلل ڈالا، لہذا، HBX HK-2 خلیوں میں ecH سے متاثر ہو سکتا ہے۔

مالیکیولر میڈیسن رپورٹس 22: 1137-1144, 2020 1143

مزید برآں، نتائج نے تجویز کیا کہ ecH(cistanche سے echinacoside)HBV-Gn کے لیے ممکنہ علاج کے ایجنٹ کے طور پر کام کر سکتا ہے۔

TreM2 ایک پیدائشی مدافعتی رسیپٹر ہے جو اشتعال انگیز ردعمل میں کردار ادا کرتا ہے (30)۔ موجودہ مطالعے میں، HBX اظہار مثبت طور پر انسانی RTECS میں TreM2 اظہار کے ساتھ وابستہ تھا۔ مزید یہ کہ، TREM2 دستک ڈاؤن نے oeHBX خلیوں کی apoptosis کی شرح میں نمایاں کمی کی، اور ecH(cistanche سے echinacoside)علاج نے سیل apoptosis پر oeTreM2 کے اثر کو کم کیا۔ ایک ساتھ لے کر، ان نتائج نے تجویز کیا کہ HK-2 سیلز میں HBX کے ذریعے TreM2 کو نشانہ بنایا گیا تھا۔ لہذا، ECH(cistanche سے echinacoside)HBX/TreM2 سگنلنگ پاتھ وے کی سرگرمی کو روک کر انسانی rTecs کے apoptosis کو روک سکتا ہے۔

ایک پچھلی رپورٹ نے یہ ظاہر کیا کہ nF-κB، نہ صرف سیل اپوپٹوسس میں کردار ادا کرتا ہے بلکہ مدافعتی ردعمل اور سوزش کے ضابطے میں بھی شامل ہے (31)۔ مزید برآں، TreM2 کو الزائمر کی بیماری اور میکولر انحطاط (32,33) کے دوران nF-κB-حساس مائکرو آر این اے-34 کے ذریعے ثالثی کیا جاتا ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، PdTc کی موجودگی میں oeHBX خلیوں کی apoptotic شرح میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔ ہمارے بہترین علم کے مطابق، موجودہ مطالعہ نے پہلی بار تجویز کیا کہ، NF‑κB inhibitor PdTc نے TreM2 کی پروموٹر سرگرمی کو دبا دیا۔ مزید برآں، نتائج نے تجویز کیا کہ TreM2 نے HK-2 خلیوں میں nF-κB کے نیوکلئس میں نقل مکانی کو منفی طور پر منظم کیا، لیکن کلیویڈ کیسپیس3 اظہار کی سطحوں سے مثبت طور پر وابستہ تھا۔ TreM2 نے HK-2 خلیوں میں انسانی انحطاط پذیر نیوکلئس پلپوسس اور گلیوما خلیات (22,23) میں اپنے کردار کے برعکس کردار ادا کیا۔ لہذا، موجودہ مطالعہ نے تجویز کیا ہے کہ TreM2 مختلف قسم کے انسانی خلیوں میں مختلف افعال رکھتا ہے.

ایک ساتھ مل کر، موجودہ مطالعہ نے نہ صرف یہ اشارہ کیا کہ nF-κB HBX/TreM2 سگنلنگ پاتھ وے کا ایک نیا جزو تھا بلکہ یہ بھی تجویز کیا کہ nF-κB انسانی rTecs میں TreM2 اظہار کو منفی طور پر منظم کرتا ہے۔ تاہم ، موجودہ مطالعے کی بڑی حدود کی کمی تھی۔میں vivoتجربات اور کلینیکل ڈیٹا۔ لہذا، مزیدمیں vivoاور موجودہ مطالعہ کے نتائج کی تصدیق کے لیے طبی مطالعات کی ضرورت ہے۔

موجودہ مطالعہ میں، ecH کی تقریب(cistanche سے echinacoside)کی تحقیقات کی گئیں اور نتائج نے ECH کے ممکنہ اثرات کی تجویز پیش کی۔(cistanche سے echinacoside)انسانی rTecs میں سگنلنگ کے راستوں پر۔ مزید برآں، موجودہ مطالعہ نے انسانی rTec خلیوں میں ecH کے حیاتیاتی فعل کے موجودہ علم میں اضافہ کیا اور HBV-Gn کے لیے ایک نئے علاج کے ایجنٹ کے طور پر اس کی صلاحیت کو بھی تجویز کیا۔

حوالہ جات

1. Karayiannis P: ہیپاٹائٹس بی وائرس: وائرولوجی، مالیکیولر بائیولوجی، لائف سائیکل، اور انٹرا ہیپیٹک پھیلاؤ۔ ہیپاٹولوجی انٹرنیشنل 11: 1-9، 2017۔

2. سیجر سی اور میسن ڈبلیو ایس: ہیپاٹائٹس بی وائرس حیاتیات۔ Microbiol Mol Biol rev 64: 51-68، 2000۔

3. اسامہ ای، اینا ماریا ایس، ڈبلیو رے کے اور فروینزا ایف سی: ہیپاٹائٹس بی وائرس سے وابستہ نیفروپیتھی کا علاج۔ نیفرون کلین پریکٹ 119: c41-c49، 2011۔

4. Zhang Y, li J, Peng W, Yu G, Wang l, chen J اور Zheng F: HBV سے وابستہ پوسٹ انفیکشن ایکیوٹ گلومیرولونفرائٹس: 10 کیسز کی رپورٹ۔ PloS one 11: e0160626، 2016۔

5. سلیگل بی ایل اور بوچرڈ ایم جے: ہیپاٹائٹس بی وائرس ایکس اور وائرل جین اظہار کا ضابطہ۔ کولڈ اسپرنگ ہارب پرسپیکٹ میڈ 6: a021402، 2016۔

6. Guerrieri F, Belloni l, d'andrea d, Pediconi n, le Pera l, Testoni B, Scisciani c, Floriot o, Zoulim F, Tramontano a,وغیرہ al: براہ راست HBx جینومک اہداف کی جینوم وسیع شناخت۔ بی ایم سی جینومکس 18: 184، 2017۔

7. شی ٹی، ہوا کیو، ما زیڈ اور ایل وی کیو: ہیپاٹائٹس بی وائرس X (HBx) پروٹین کے ذریعے حوصلہ افزائی میر-200a-3p کی کمی HBV-انفیکشن سے وابستہ میں سیل کے پھیلاؤ اور حملے کو فروغ دیتی ہے۔ ہیپاٹو کارسنوما پاتھول ریس پریکٹ 213: 1464-1469، 2017۔

8. Tian Y, Xiao X, Gong X, Peng F, Xu Y, Jiang Y اور Gong G: HBx mir-181a اور PTen کے درمیان کراس ٹاک میں خلل ڈال کر سیل کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے۔ سائنس کا نمائندہ 7: 40089، 2017۔

9. Idris Me، Hachem H، Koering c، Merle P، Thénoz M، Montreux F، اور Wattel e: HBx سیلولر فینوٹائپ کے لحاظ سے سیلولر سنسنی یا سیل کے پھیلاؤ کو متحرک کرتا ہے۔ جے وائرل ہیپاٹ 23: 130-138، 2016۔

10. Wang X، Wang l، Zhu n، Zhou Y، Gu lJ اور Yuan WJ: ہیپاٹائٹس بی وائرس X پروٹین رینل ٹیوبلر اپیتھیلیل سیل کی حوصلہ افزائی ٹی سیل اور میکروفیج ردعمل کو ماڈیول کرتا ہے۔ امیونول سیل بائیول 94: 266-273، 2016۔

11. He P, Zhang d, li H, Yang X, li d, Zhai Y, Ma l اور Feng G: ہیپاٹائٹس بی وائرس X پروٹین JaK2/STaT3 سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کر کے انسانی گردوں کے قربت والے نلی نما اپکلا خلیوں میں اپوپٹوس کو ماڈیول کرتا ہے۔ int J Mol Med 31: 1017-1029، 2013۔

12. یانگ وائی، وانگ ایکس، ژانگ وائی اور یوآن ڈبلیو: ہیپاٹائٹس بی وائرس ایکس پروٹین اور پروینفلامیٹری سائٹوکائنز dr4 کو اپ گریجولیشن کرکے رینل ٹیوبلر سیلز کے ٹریل انڈسڈ اپوپٹوس کو بڑھانے کے لیے ہم آہنگی پیدا کرتے ہیں۔ int J Biochem cell Biol 97: 62-72، 2018۔

13. He P, Zhou G, Qu d, Zhang B, Wang Y اور li d: HBx پھیلاؤ کو روکتا ہے اور چوہے کے گردوں کے نلی نما اپکلا خلیوں میں Fas/Fasl upregulation کے ذریعے apoptosis کو اکساتا ہے۔ جے نیفرول 26: 1033، 2013۔

14. Han W, luo M, He M, Zhu Y, Zhong Y, ding H, Hu G, liu l, chen Q اور lu Y: HBx جین کی منتقلی سائکلن ایکسپریشن کو ریگولیٹ کرنے کے ذریعے پرائمری رینل ٹیوبلر اپیٹیلیل سیلز کے سائیکل کو متاثر کرتی ہے۔ Mol Med rep 18: 1947-1954, 2018۔