مائیکل الکحل جگر کی بیماری میں Cistanche Phenylethanol Glycoside آنتوں کی رکاوٹ اور گٹ مائکروبیوٹا کا اثر

خلاصہ:

مقصد:کا ماؤس ماڈلالکحل جگر کی بیماری(ALD) Lieber-Decarli الکحل مائع فیڈ، اور اس کے اثرات کے ذریعہ قائم کیا گیا تھا۔Cistanche phenylethanoid glycosides(CPhGs) آنتوں کی رکاوٹ اور ALD چوہوں کی گٹ مائکرو بائیوٹا ساخت پر تبادلہ خیال کیا گیا تھا۔

طریقہ: 36 C57BL/6N مادہ چوہوں کو تصادفی طور پر عام گروپ، CPhGs نارمل گروپ، ماڈل گروپ، اور CPhGs کم، درمیانے اور زیادہ خوراک والے گروپ (175 mg·kg-1, 350 mg·kg{{6) میں تقسیم کیا گیا تھا۔ }}اور 700 mg·kg-1)، 6 چوہوں کے ساتھ۔ Lieber-Decarli الکحل مائع فیڈ کا استعمال کرتے ہوئے ALD ماؤس ماڈل کا قیام۔ CPhGs خوراک گروپ اور CPhGs نارمل گروپ کو روزانہ مناسب مقدار میں CPhGsby gavage دیا جاتا تھا۔ ایک خودکار بائیو کیمیکل تجزیہ کار نے سیرم ALT، AST، TG، اور TC کی سطحوں کا پتہ لگایا۔ SerumTNF- , IL-1 , LPS, LBP, D-LA, DAO, اور LBP جگر کے ELISA کے ذریعے پتہ چلا۔ جگر کے ہوموجنیٹ کے نمونوں میں ٹی جی اور ٹی سی کی سطح کو رنگین میٹری کے ذریعہ پتہ چلا۔ جگر کے ٹشو پر تیل سرخ O اور HE داغ لگا ہوا تھا۔ آنتوں کے ؤتکوں کو HE اور AB-PAS داغدار، اور Muc2 امیونو ہسٹو کیمسٹری سے داغ دیا گیا تھا۔ نارمل گروپ، CPhGs نارمل گروپ، ماڈل گروپ، اور CPhGs ہائی ڈوز گروپ کے آنتوں کے مواد کو اکٹھا کیا گیا، اور گٹ مائکروبیوٹا کو ترتیب دیا گیا۔

نتیجہ: ALD ماڈل کامیابی کے ساتھ قائم کیا گیا تھا۔ عام گروپ کے مقابلے میں، سیرم ALT، AST، اور TG کی سطح، اور ماڈل گروپ میں جگر کی TG اور TC کی سطحوں میں نمایاں اضافہ ہوا تھا (P<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01). 

نتیجہ: CPhGs ALD کی وجہ سے آنتوں کی رکاوٹ کی چوٹ کو کم کر سکتے ہیں۔، جو ہو سکتا ہے۔Akkermansia اور Allobaculum کی کثرت اور ساخت کو منظم کرکے حفاظتی کردار ادا کریں، اور آنتوں کے بلغمی رکاوٹ کے بلغم کی پرت ہومیوسٹاسس کو متاثر کرنا۔

مطلوبہ الفاظ:سی پی ایچ جی; الکحل جگر کی بیماری; آنتوں کی رکاوٹ؛ گٹ مائکروبیٹا

40% ایکچیناکوسائیڈ اور 16% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ قدرتی نامیاتی سیسٹانچ ایکسٹریکٹ

Wecistanche کی معاون خدمت - چین میں سب سے بڑا cistanche برآمد کنندہ:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

واٹس ایپ٪ 2ftel٪3a٪7b٪7b0٪7d٪7d

مزید تفصیلات کے لیے خریداری کریں:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

الکحل خطرے کے اہم عوامل میں سے ایک بن گیا ہے۔دنیا بھر میں دائمی بیماریاں۔ورلڈ ہیلتھ آرگنائزیشن کی طرف سے جاری کردہ "شراب اور صحت پر عالمی رپورٹ 2018" ظاہر کرتی ہے کہ 2016 میں دنیا بھر میں الکحل کے زیادہ استعمال کی وجہ سے تقریباً 30 لاکھ افراد ہلاک ہوئے، جو کہ کل کا 5.3 فیصد بنتا ہے [1]۔ ہمارے ملک میں شراب کی وجہ سے جگر کے امراض میں سال بہ سال اضافہ ہو رہا ہے اور یہ جگر کے سرروسس کی دوسری بڑی وجہ ہے [2] جو کہ صحت عامہ کا ایک سنگین مسئلہ بن چکا ہے۔ الکحل جگر کی بیماری (ALD) کے آغاز اور بڑھنے کے طریقہ کار پیچیدہ اور متعدد ہیں، بنیادی طور پر ایتھنول میٹابولائٹ ایسٹیلڈہائڈ اور رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کے جگر کو نقصان پہنچانے کا طریقہ کار [3]۔ ان میں، ALD کی ترقی میں "گٹ-جگر کے محور" کا کردار رہا ہے جس نے کافی توجہ مبذول کرائی ہے [4-5]۔ جگر الکحل کے آکسیڈیٹیو میٹابولزم کا مرکزی مقام ہے۔ طویل مدتی بھاری شراب پینے سے جگر کو براہ راست نقصان پہنچ سکتا ہے، جس سے ALD [6] ہوتا ہے۔ ہیپاٹک سٹیٹوسس شراب پینے کے بعد ایک ابتدائی ردعمل ہے۔ انسانی گٹ مائکرو بائیوٹا (GM) کا تخمینہ 10 ٹریلین ہے [7]۔ آنتوں کے نباتات، وائرس، فنگی اور میٹابولائٹس پر مشتمل ایک مائیکرو ایکولوجیکل توازن۔

توازن، یعنی آنتوں کی مائیکرو ایکولوجی، "گٹ-جگر کے محور" کے ذریعے ALD کے بڑھنے سے قریب سے جڑی ہوئی ہے، لیکن متعلقہ میکانزم ابھی تک واضح نہیں ہیں [8-9]۔ آنتوں کی رکاوٹ اور نباتات "گٹ-جگر کے محور" پر حاوی ہیں، اور GM dysregulation اور اشتعال انگیز عوامل کا زیادہ اظہار ALD [10-11] کی موجودگی اور نشوونما میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔

مطالعات سے پتہ چلا ہے کہ شدید GM dysregulation اور اشتعال انگیز عوامل کا زیادہ اظہار ALD کی موجودگی اور نشوونما کے دوران ہوتا ہے [12]۔ زیادہ مقدار میں الکحل کا طویل مدتی دائمی استعمال یا قلیل مدتی استعمال آنتوں کی پارگمیتا کو تبدیل کر دے گا، جس سے آنتوں کا LPS پورٹل گردش میں داخل ہو جائے گا، ایک اشتعال انگیز ردعمل پیدا کرے گا اور جگر کے نقصان کو بڑھا دے گا [12-13]۔

سنکیانگ میں ایک خصوصیت کے چینی دواؤں کے مواد کے طور پر سنکیانگ، وی اور جن خاندانوں کی وو پُو کی میٹیریا میڈیکا، سونگ خاندان کے "کمپینڈیم آف میٹیریا میڈیکا" اور منگ خاندان کے "کمپینڈیم آف میٹیریا میڈیکا" میں ریکارڈ کیا گیا ہے۔ ] جدید فارماسولوجیکل ریسرچ نے پایا ہے کہ Cistanche phenylethanoid glycosides (CPhGs) سوزش اور اینٹی ہیپاٹک فائبروسس [15-16] میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ تاہم، فی الحال اس بارے میں تحقیق کا فقدان ہے کہ آیا CPhGs آنتوں کی رکاوٹ کے فعل یا ALD میں آنتوں کے نباتات کو منظم کر سکتے ہیں اور ہیپاٹوپروٹیکٹو اثر ڈال سکتے ہیں۔

اس مطالعہ نے الکحل کے بدسلوکی اور شراب نوشی پر قومی انسٹی ٹیوٹ (این آئی اے اے اے) [17] کے قیام کے لئے Lieber-Decarli الکحل مائع فیڈ کا استعمال کیا [17] قلیل مدتی الکحل جگر کی چوٹ کے ماؤس ماڈل کو ALD کی آنتوں کی مائکرو ایکولوجی پر CPhGs کے اثر کو تلاش کرنے کے لئے۔ اثر و رسوخ. ALD ماڈل چوہوں میں آنتوں کی رکاوٹ کے فنکشن اور آنتوں کے مائکرو بائیوٹا ہومیوسٹاسس پر CPhGs کے اثرات پر خصوصی توجہ دی گئی۔ یہ CPhGs کے hepatoprotective میکانزم کو آنتوں کی مائیکرو ایکولوجی کے نقطہ نظر سے ظاہر کرنے میں مدد کرتا ہے اور منشیات کی نشوونما کے لیے تجرباتی حوالہ فراہم کرتا ہے۔

1. مواد

1.1 جانور

SPF گریڈ C57BL/6N مادہ چوہے، 17~20 گرام، بیجنگ وٹونگ لیہوا تجرباتی جانوروں کی ٹیکنالوجی کمپنی، لمیٹڈ، سرٹیفکیٹ نمبر SCXK (بیجنگ) 2021-0006 سے خریدے گئے تھے۔ سنکیانگ میڈیکل یونیورسٹی (SYXK (نیا) 2022-0003 کے جانوروں کے تجرباتی مرکز کے SPF ماحول میں جانوروں کی پرورش اور تجربات کیے گئے۔ سخت

سنکیانگ میڈیکل یونیورسٹی (IACUC-20220127-4) کی تجرباتی جانوروں کی اخلاقیات کمیٹی کے جانوروں کی فلاح و بہبود اور اخلاقی تقاضوں کی تعمیل کریں۔

1.2 ری ایجنٹس

مطلق ایتھنول، آئسو پروپیل الکحل (تیانجن ڈاماؤ کیمیکل ریجنٹ فیکٹری، بیچ نمبر 20230201 اور 20190103 بالترتیب)؛ Lieber-Decarli کنٹرول مائع فیڈ، Lieber-Decarli الکحل مائع فیڈ (Daitz Biotechnology (Wuxi) Co., Ltd.، 710027 اور 710260 کے لیے بالترتیب بیچ نمبرز؛

Paraformaldehyde fixative، Carnoy's fixative اور electron microscope fixative (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd.، بیچ نمبرز CR2208028، CR2305094 اور CR2210001 بالترتیب)؛ ایل بی پی انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کٹ، TNF- ELISA کٹ، IL-1

ELISA kit, D-LA ELISA kit, DAO ELISA kit, TG Colorimetric test kit اور TC colorimetric ٹیسٹ کٹ (Wuhan Yilerite Biotechnology Co., Ltd.، بیچ نمبرز CV072V649815, CV112VX05028, CV106T38, G328}{449})

GY010XN08244, GY03P04Z5104 اور GY02DHB82603)؛ LPS ELISA کٹ (Wuhan Fein Biotechnology Co., Ltd.، بیچ نمبر U3126I069T)؛ ALT پرکھ کٹ، AST پرکھ کٹ، TG پرکھ کٹ اور TC پرکھ کٹ (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.، بیچ نمبرز 140122014، 140223002، 141722001 اور 14122001 ہیں)؛ HE سٹیننگ سلوشن، سیچوریٹڈ آئل ریڈ O سٹیننگ سلوشن، AB-PAS سٹیننگ سلوشن؛ Muc2 پرائمری اینٹی باڈی، بکری اینٹی ماؤس سیکنڈری اینٹی باڈی (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd.، بیچ نمبر بالترتیب G1005, G1015, G1049, GB11344 اور GB23301 ہیں)۔

1.3 دوائیں

سے سیستانچے کا عرق خریدا گیا تھا۔سنکیانگ ہوٹن ڈیچین فارماسیوٹیکل اینڈ بائیولوجیکل کمپنی لمیٹڈ. (echinaceaside 40% سے بڑا یا اس کے برابر، verbascoside 16% سے بڑا یا اس کے برابر، phenylethanoid glycoside 85% سے بڑا یا اس کے برابر، بیچ نمبر 20230103)۔

1.4 آلات

BS-240VET خودکار بائیو کیمیکل تجزیہ کار (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.)؛ HT7800 ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ (Hitachi Manufacturing Co., Ltd., Japan)۔

2. طریقہ

2.1 گروپ بندی اور جانوروں کے ماڈل کا قیام

36 چوہوں کو تصادفی طور پر نارمل گروپ، نارمل ایڈمنسٹریشن گروپ، ماڈل گروپ اور CPhGs کم، درمیانے اور زیادہ خوراک والے گروپ (175 mg·kg-1، 350mg·kg-1 اور 700mg·kg{{ میں تقسیم کیا گیا تھا۔ 6}})، ہر ایک گروپ کے 6۔ تمام چوہوں کو سب سے پہلے Lieber-Decarli کنٹرول مائع فیڈ دیا گیا اور 3 دن کے لیے خوراک کے لیے ڈھال لیا گیا۔ عام

کنٹرول گروپ اور عام خوراک گروپ کو Lieber-Decarli کنٹرول مائع فیڈ کھلایا گیا تھا۔ ماڈل گروپ اور CPhGs کم، درمیانے اور زیادہ خوراک والے گروپوں کو LieberDecarli الکحل مائع فیڈ کھلایا گیا۔ تجربے کے چوتھے دن سے شروع کرتے ہوئے، ماڈل گروپ اور CPhGs کے کم، درمیانے اور زیادہ خوراک والے گروپوں نے بتدریج الکحل فیڈ میں الکوحل کی مقدار کو 0% سے بڑھا کر 5% کر دیا، اور 5% الکوحل فیڈ کو برقرار رکھا جب تک تجربے کے اختتام پر، اور مواد کو جمع کرنے سے 9 گھنٹے پہلے دبایا گیا۔ 0.2 mL·10 g-1 معدے میں 30% ایتھنول کے ساتھ داخل کیا گیا۔

تمام فیڈ اب تیار اور استعمال کی جاتی ہے، اور تازہ فیڈ ہر روز 17:00 سے 19:00 تک تبدیل کی جاتی ہے۔ ہر روز چوہوں کے کھانے، سرگرمی اور ذہنی حالت کا مشاہدہ کریں۔ جب ماڈل گروپ میں چوہے شرابی حالت میں نمودار ہوتے ہیں جیسے کہ بے حسی، سرگرمی میں کمی، اور کھانے کی مقدار میں کمی، تو یہ ظاہر کرتا ہے کہ ماڈلنگ کامیاب ہے [17]۔ جب CPhGs کم، درمیانے اور زیادہ خوراک والے گروپس اور عام انتظامیہ کے گروپ نے الکوحل والی خوراک کھلانا شروع کی، تو اسی ارتکاز کے CPhGs کے محلول کو کل 14 دنوں کے لیے ہر روز گیویج کیا جاتا تھا، اور بقیہ کے لیے نارمل نمکین گایا جاتا تھا۔

2.2 عمومی مشاہدہ

چوہوں کے کھانے، سرگرمی، دماغی حالت اور اخراج کا ہر روز مشاہدہ کیا گیا۔ ماڈلنگ اور منشیات کی انتظامیہ کے دوران، موت کی صورت حال اور چوہوں کا وزن ریکارڈ کیا گیا۔ اعضاء کا گتانک=آرگن ماس/(باڈی ماس/100)×100%۔

2.3 تجرباتی جانوروں کا انتخاب

12 گھنٹے تک خوراک اور پانی سے محروم رہنے کے بعد، چوہوں کو بے ہوشی کی گئی، ان کی آنکھوں کے بال نکالے گئے، اور قربانی سے پہلے خون جمع کیا گیا۔ سب سے بڑے لوب سے جگر کے ٹشو کو پیرافارمیلڈہائڈ محلول میں طے کیا گیا تھا۔ جیجنل ٹشو کو جلدی سے برف پر الگ کر دیا گیا اور ایک الیکٹران مائکروسکوپ فکسٹیو میں طے کیا گیا۔ 3 سینٹی میٹر جیجنل اور بڑی آنت کے بافتوں کو (مضمون کو فلش کیے بغیر) الگ کیا گیا تھا اور کارنائے کے فکسٹیو میں طے کیا گیا تھا۔ جیجنم اور بڑی آنت کے ٹشو کے مزید 3 سینٹی میٹر (جسم کو جسمانی نمکین سے دھویا گیا ہے) کو پیرافارمیلڈہائڈ محلول میں طے کیا گیا تھا۔ تمام آنتوں کے حصوں کے مواد کو جراثیم سے پاک انزائم سے پاک کریوویئلز میں جمع کیا گیا، فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد کیا گیا، اور پھر ذخیرہ کرنے کے لیے -80 ڈگری ریفریجریٹر میں منتقل کر دیا گیا۔

2.4 ELISA اور سیرم اور جگر کے بافتوں کے ہوموجنیٹ اشارے کی رنگین شناخت

سیرم ALT، AST، TG اور TC کی سطحوں کا پتہ لگانے کے لیے خودکار بائیو کیمیکل آلہ استعمال کیا گیا تھا۔ ELISA طریقہ سیرم TNF- , IL-1 , LPS, LBP, DAO اور D-LA کی سطحوں اور جگر کے LBP کی سطحوں کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہدایات کے مطابق کام کریں۔ جگر کے بافتوں کو ہم آہنگ کرنے کے لیے، جگر کے تازہ بافتوں کا 0.05~100 گرام لیں، وزن (g): حجم (mL) {9}}:9، ہوموجنیٹ میں پیس لیں، اور 20000g·min-1 15 منٹ پر سینٹری فیوج کریں، سپرنٹنٹ لیں اور اسے جانچ کے لیے برف پر رکھیں، اور ہدایات کے مطابق چلائیں۔ جگر کے ٹشو ہوموجنیٹ کے نمونوں میں ٹی جی اور ٹی سی کی سطحوں کا رنگین پتہ لگانا۔

2.5 HE اور آئل ریڈ O سٹیننگ جگر کے ٹشو پیتھالوجی کا پتہ لگانے کے لیے

hematoxylin-eosin staining (HE) کے لیے، جگر کے فکسڈ ٹشو کو ہٹا دیا گیا، پیرافین کو سیکشن کیا گیا، HE کو داغ دیا گیا، اور پانی کی کمی اور نصب کر دیا گیا۔ فکسڈ جگر کے ٹشو کو باہر نکالا گیا، سیکشن کو منجمد کیا گیا، آئسوپروپل الکحل سے دھویا گیا، آئل ریڈ O سے داغ دیا گیا، سیل کیا گیا، اور ہلکی خوردبین کے نیچے مشاہدہ کیا گیا۔

2.6 HE اور AB-PSA کا داغ آنتوں کے بافتوں کے پیتھولوجیکل مشاہدے کا پتہ لگانے کے لیے

جیجنل ٹشو کو ہٹا دیا گیا تھا اور HE داغدار ہونے کے لیے پیرافارمیلڈہائڈ محلول میں طے کیا گیا تھا۔ بڑی آنت کے ٹشو کو ہٹا دیا گیا تھا اور AB-PAS داغدار ہونے کے لیے کارنوئے کے فکسٹیو میں فکس کیا گیا تھا۔ امیونو ہسٹو کیمسٹری کے اقدامات: ڈی ہائیڈریٹ پیرافین سیکشنز، اینٹیجن ریٹریول، بلاک اینڈوجینس پیرو آکسیڈیز، سیرم بلاک کرنا، پرائمری اینٹی باڈی شامل کرنا، سیکنڈری اینٹی باڈی شامل کرنا، رنگ کی نشوونما کے بعد سیل نیوکلی کا مقابلہ کرنا، ڈی ہائیڈریٹ اور ماؤنٹ کرنا، اور روشنی خوردبین کے تحت مشاہدہ کرنا۔ جیجنل ٹشو کو ہٹا دیا گیا، 1 ملی میٹر × 1 ملی میٹر × 1 ملی میٹر چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹا گیا، ماہواری سے پہلے طے کیا گیا، بعد میں طے شدہ، پانی کی کمی، ایمبیڈڈ، پولیمرائزڈ، اور انتہائی حد تک سیکشن کیا گیا۔ ہر گروپ میں جیجنل اپیٹیلیل خلیوں کی مائکروویلی تبدیلیاں ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ کے تحت دیکھی گئیں۔

2.7 16S طریقہ استعمال کرتے ہوئے آنتوں کے پودوں کی ترتیب اور تجزیہ

V3-V4 ریجن 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') اور 806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT پر مبنی نارمل گروپ، نارمل ڈوزنگ گروپ، ماڈل گروپ اور CPhGs ہائی ڈوز گروپ کے آنتوں کے مواد -3')، بیکٹیریل کمیونٹی کی ترتیب کے لیے 16S rDNA ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ ٹیکنالوجی کا استعمال۔ اس مطالعہ میں ترتیب کا تجربہ شینزین مائیکرو ٹیک ٹیکنالوجی گروپ کمپنی لمیٹڈ نے مکمل کیا تھا۔ اس مطالعہ میں گٹ مائکرو بائیوٹا کی ترتیب کا ڈیٹا پروجیکٹ نمبر PRJNA1006676 کے تحت نیشنل سینٹر فار بائیو ٹیکنالوجی انفارمیشن پر اپ لوڈ کر دیا گیا ہے۔

amplicon sequence variants (ASVs) کے تجزیہ کے نتائج کی بنیاد پر، الفا تنوع، بیٹا تنوع کا تجزیہ، پرجاتیوں کی درجہ بندی کی تشریح اور فرق کا تجزیہ کیا جاتا ہے۔ ان میں، الفا ڈائیورسٹی انڈیکس میں بنیادی طور پر شینن انڈیکس اور چاو 1 انڈیکس شامل ہیں، اور شماریاتی ٹیسٹ ولکوکسن ٹیسٹ کا استعمال کرتا ہے۔ پی سی او اے

پرنسپل کوآرڈینیٹ تجزیہ (PCoA) گروپوں کے درمیان اختلافات کا تجزیہ کرنے کے لیے Anosim کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ LEfSe کا استعمال LEfSe کا تجزیہ کرنے کے لئے کیا گیا تھا) گروپوں کے مابین نمایاں فرق کے ساتھ پرجاتیوں کو حاصل کرنے کے لئے۔ بائیو انفارمیٹکس کا تجزیہ مائیکروٹیک الائنس کے بائیو انکلاؤڈ پلیٹ فارم (https://www.bioincloud.tech) ٹولز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

2.8 شماریاتی تجزیہ

تمام پیمائشی ڈیٹا کو igh̅± 𝑠 کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔ اعداد و شمار کے لئے جو عام تقسیم کی پابندی کرتا ہے اور تغیر ٹیسٹ کی یکسانیت کو پورا کرتا ہے، تغیر کا ایک عنصر کا تجزیہ استعمال کیا جاتا ہے۔ دوسری صورت میں، غیر پیرامیٹرک ٹیسٹ استعمال کیا جاتا ہے. اعداد و شمار کا SPSS 24 کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا جاتا ہے۔{3}}۔ پی<0.05 means the difference is statistically significant.