نیند سے محروم ماڈل چوہوں میں سیکھنے کے ادراک اور Synaptic پلاسٹکٹی پر Cistanche کے گلیوسائیڈز کے اثرات

خلاصہ

مقصد:یہ دریافت کرنے کے لیے کہ آیا سیستانچ کے گلائکوسائیڈز Synaptic plasticity کو ریگولیٹ کرکے نیند سے محروم ماڈل چوہوں کے سیکھنے اور علمی کام کو بہتر بنا سکتے ہیں۔

طریقے: پچاس نر چوہوں کو تصادفی طور پر خالی کنٹرول گروپ (کنٹرول)، پلیٹ فارم کنٹرول گروپ (PC)، ماڈل گروپ (ماڈل) میں تقسیم کیا گیا تھا۔cistanche گروپ (GCs) کے گلائکوسائیڈز، اور ایسٹازولم گروپ ( Est )۔ چوہوں کی نیند سے محرومی کا ماڈل ایک ترمیم شدہ ملٹی پلیٹ فارم واٹر انوائرمنٹ طریقہ سے تیار کیا گیا تھا۔ مورس واٹر میز اور اوپن فیلڈ ٹیسٹ کا استعمال چوہوں کے مقامی علمی فعل اور جذباتی تبدیلیوں کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا۔ نسل سٹیننگ کا استعمال مورفولوجی میں تبدیلیوں اور عصبی خلیوں کی مقدار کو دیکھنے کے لیے کیا گیا تھا۔چوہوں کا ہپپوکیمپل سی اے ایل ایریا. ویسٹرن بلاٹ اور R'T - PCR کا استعمال Synaptophysin (SY'N)، پوسٹ سینیپٹک جھلی کے گھنے مادہ 95 (PSD -95) کے اظہار کی سطحوں کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک عنصر (BDNF). 

نتائج؛مورس واٹر بھولبلییا کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ کنٹرول گروپ کے مقابلے میںچوہوں کی سیکھنے اور علمی صلاحیتماڈل گروپ میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی ( پی<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasبہتر GCs علاج ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the BDNF کے پروٹین اور جین کے اظہار کی سطح، SYN، اور PSD -95 Mlodel گروپ میں نمایاں طور پر کم ہوئے تھے ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

ہربل CISTANCHE فارمولیشن سپلیمنٹس کے لیےسیکھنے اور علمی فنکشن کو بہتر بنانا

کلیدی الفاظcistanche کے Glycosides; ہپپوکیمپس؛ نیند کی کمی؛ سیکھنے اور میموری؛ بے چینی Synaptic پلاسٹکٹی

نیند کی خرابی (SD)ایک ہےغیر معمولی نیند کی فعال خرابیپیچیدہ عوامل کی ایک سیریز کی وجہ سے جیسےبے خوابی, خوابیدگی، اورآسان بیداری. حالیہ برسوں میں،SD کے واقعاتآہستہ آہستہ اضافہ ہوا ہے. متعلقہ مطالعات نے اطلاع دی ہے کہ ایس ڈی کا سبب بن سکتا ہے۔قلبی امراض,میٹابولک dysfunction,مدافعتی امراض، اورمرکزی اعصابی نظامانحطاطی بیماریاں جیسے الزائمر کی بیماری [1]۔ SD ہپپوکیمپل نیوران کو آکسیڈیٹیو نقصان پہنچا سکتا ہے، علمی خرابی کا سبب بن سکتا ہے، اور موڈ میں تبدیلیاں پیدا کر سکتا ہے جیسے کہ بے چینی اور ڈپریشن [2]۔ Cistanche deserticola ایک قیمتی دواؤں کا مواد ہے جسے چین میں دوا اور خوراک دونوں کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اس میں گردے کو ٹونیفائی کرنے اور کیوئ کو بھرنے، آنتوں کو نم کرنے اور آنتوں کی حرکت کو فروغ دینے اور یانگ کو مضبوط بنانے کے اثرات ہیں۔ Cistanche deserticola کے اہم نچوڑ، cistanche کے glycosides (GCs) میں اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی اپوپٹوٹک، جگر کی حفاظت، اور نیورو پروٹیکٹو اثرات ہوتے ہیں [3]۔ ہماری پچھلی تحقیق سے پتا چلا ہے کہ جی سیز SAMP8 چوہوں کے سیکھنے اور علمی فعل کو بہتر بنا سکتے ہیں ایک اینٹی آکسیڈینٹ اور اینٹی اپوپٹوٹک کردار ادا کر کے [4]۔

متعلقہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ SD کی وجہ سے علمی dysfunction کا synaptic plasticity [5] سے گہرا تعلق ہے۔ تاہم، اس طریقہ کار کے بارے میں کچھ رپورٹس موجود ہیں جن کے ذریعے GCs Synaptic plasticity کو منظم کرتے ہیں اور سیکھنے اور یادداشت کی خرابی اور نیند کی کمی کی وجہ سے چوہوں میں علمی کمی کو بہتر بناتے ہیں۔ لہذا، اس مطالعے کا مقصد یہ دریافت کرنا ہے کہ آیا GCs Synaptic سے متعلقہ مارکروں کے اظہار کو ریگولیٹ کرکے Synaptic plasticity کو متاثر کرتے ہیں، اس طرح نیند کی کمی کے ماڈلز کے ساتھ چوہوں کے سیکھنے اور علمی کام کو بہتر بناتے ہیں، اور GCs کو سیکھنے اور علمی علاج کے لیے نئے علاج کے آئیڈیاز اور منصوبے فراہم کرتے ہیں۔ نیند کی خرابی کی وجہ سے خرابی.

1 مواد اور طریقے

1.1 تجرباتی جانور

6 سے 8 ہفتوں کی عمر کے نر چوہے، جن کا وزن 280 سے 300 گرام ہے، بیجنگ سیبیفو سے جانوروں کی پیداوار کے لائسنس کے ساتھ خریدا گیا تھا [SCXK (Beijing) 2019-0010]۔ تمام جانوروں کو باؤتو میڈیکل کالج کے جانوروں کے تجرباتی مرکز میں درج ذیل شرائط کے تحت رکھا گیا تھا: درجہ حرارت (24 ± 1) ڈگری، نمی 50% سے 55%، 12 گھنٹے روشنی اور 12 گھنٹے اندھیرا، اور کھانے اور پانی پر کوئی پابندی نہیں۔ اس تجربے کو اسکول کی اخلاقیات کمیٹی [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)] نے منظور کیا تھا۔

1. 2 اہم ریجنٹس اور آلات

Cistanche deserticola کے کل glycosides Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (بیچ نمبر: KSM20220609011) سے خریدے گئے تھے۔ Estazolam گولیاں CSPC فارماسیوٹیکل گروپ Ouyi فارماسیوٹیکل (بیچ نمبر: 044220343) سے خریدی گئی تھیں۔ پروٹین لوڈنگ بفر (P1015)، RIPA lysis buffer (R0010)، chemiluminescent محلول (PE0010) وغیرہ سب بیجنگ سولیباؤ سے خریدے گئے تھے۔ 95 (PSD-95) اینٹی باڈی (AB192757) اور synaptophysin (SYN) اینٹی باڈی (ab32127) میں postsynaptic density مادہ Abcam، USA کمپنی سے خریدا گیا تھا۔ دماغ سے حاصل کردہ نیوروٹروفک فیکٹر (BDNF) (48503-2) اور -actin (52901) SAB کمپنی، USA سے خریدے گئے تھے۔ بکری اینٹی خرگوش IgG سیکنڈری اینٹی باڈی (SA00001-20) Proteintech کمپنی، USA سے خریدی گئی تھی۔ rat melatonin (MT) اور ELISA سائنٹیفک ریسرچ کٹ (MM-0657R1) Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Paraffin slicer (Leica, Germany) سے خریدے گئے تھے۔ آپٹیکل خوردبین (لائیکا، جرمنی)؛

مورس واٹر میز، اوپن فیلڈ ٹیسٹ باکس (شنگھائی زنروان)؛ عمودی الیکٹروفورسس اپریٹس (بیجنگ لیوئی کمپنی)؛ رنگین شیکر (بیجنگ لیوئی کمپنی)؛ پروٹین امیجنگ تجزیہ نظام (شنگھائی ٹینن ٹیکنالوجی)؛ فلوروسینس مقداری پی سی آر آلہ (ژیان تیان لونگ ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ)۔

1.3 تجرباتی طریقے

1.3.1 جانوروں کی گروپ بندی اور منشیات کی انتظامیہ

50 نر چوہوں کو تصادفی طور پر خالی کنٹرول گروپ (کنٹرول گروپ)، پلیٹ فارم کنٹرول گروپ (پلیٹ فارم کنٹرول، پی سی گروپ)، ماڈل گروپ (ماڈل گروپ)، Cistanche deserticola گروپ کے کل glycosides (GCs گروپ) میں تقسیم کیا گیا تھا۔ ، 50 ملی گرام/کلوگرام)، اور ایسٹازولن گروپ (ایسٹ گروپ، 0.54 ملی گرام/کلوگرام)، ہر گروپ میں 10 چوہوں کے ساتھ۔ کنٹرول گروپ اور پی سی گروپ کو گیویج کے ذریعہ 0.9٪ نمکین دیا گیا تھا۔ ماڈلنگ شروع ہونے کے بعد ہر دن صبح 7 بجے تمام گروپس کی جانچ کی جاتی تھی، اور گیجج 21 دن تک جاری رہا۔

1.3 2. نیند سے محروم جانوروں کے ماڈل کی تیاری

نیند سے محرومی کا ماڈل تبدیل شدہ ملٹی پلیٹ فارم واٹر انوائرمنٹ طریقہ [6] کا استعمال کرتے ہوئے قائم کیا گیا تھا۔ تجرباتی سامان 130 سینٹی میٹر × 50 سینٹی میٹر × 45 سینٹی میٹر آئتاکار پولیتھیلین رال واٹر ٹینک تھا۔ پانی کے ٹینک میں 5 سینٹی میٹر قطر اور 20 سینٹی میٹر اونچائی والا ایک چھوٹا سا پلیٹ فارم رکھا گیا تھا۔ پی سی گروپ کے پلیٹ فارم کا قطر 10 سینٹی میٹر اور اونچائی 20 سینٹی میٹر تھی۔ پانی کی ٹینک تقریباً 18 سینٹی میٹر کی گہرائی تک پانی سے بھری ہوئی تھی اور پانی کا درجہ حرارت (20 ± 1) ڈگری پر برقرار رکھا گیا تھا۔ تجربہ شروع ہونے سے ایک ہفتہ پہلے، چوہوں کو ہر روز 60 منٹ کے لیے نیند کی کمی کے خانے میں رکھا جاتا تھا تاکہ وہ ماحول سے خود کو واقف کر سکیں۔ ماڈل قائم ہونے کے بعد، کنٹرول گروپ کے علاوہ، ہر گروپ کے چوہوں کو روزانہ صبح 8 بجے سے رات 8 بجے تک چھوٹے پلیٹ فارم پر لگاتار 21 دن تک نیند کی کمی کے لیے رکھا گیا۔

تمام چوہوں کو خوراک اور پانی تک مفت رسائی حاصل تھی اور وہ پلیٹ فارم پر آزادانہ طور پر حرکت کرتے تھے۔ روشنی اور تاریک کا چکر روزانہ 12 گھنٹے کا تھا۔

1. 3. 3 مورس واٹر میز کا تجربہ

مورس کے پانی کی بھولبلییا کو 4 علاقوں میں تقسیم کیا گیا تھا، پانی سے بھرا ہوا تھا، اور پلیٹ فارم کو چوتھے کواڈرینٹ میں رکھا گیا تھا۔ پانی کی سطح پلیٹ فارم سے تقریباً 2 سینٹی میٹر اوپر تھی۔ فوڈ گریڈ خوردنی میلانین پانی میں شامل کیا گیا، اور پانی کا درجہ حرارت (25 ± 1) ڈگری پر برقرار رکھا گیا۔ (1) پوزیشننگ نیویگیشن تجربہ: ہر علاقے کا مرکز منتخب کیا گیا اور چوہوں کو آہستہ سے پانی میں رکھا گیا۔ انہیں آزادانہ طور پر دریافت کرنے کی اجازت تھی۔ چوہوں کو 60 سیکنڈ کے اندر ہدف کا پلیٹ فارم تلاش کرنے میں لگنے والا وقت ریکارڈ کیا گیا۔ جن چوہوں کو پلیٹ فارم نہیں ملا انہیں پلیٹ فارم تک پہنچایا گیا اور وہ 20 سیکنڈ تک ٹھہرے رہے۔ تربیت 5 دن تک جاری رہی۔ (2) مقامی ایکسپلوریشن ٹیسٹ: 6 ویں دن، پلیٹ فارم کو ہٹا دیا گیا اور چوہوں کو دیوار کے خلاف دوسرے کواڈرینٹ کے بیچ سے پانی میں رکھا گیا۔ چوہوں کے پلیٹ فارم سے 120 سیکنڈ کے اندر گزرنے کی تعداد اور چوتھے کواڈرینٹ میں رہنے کا وقت ریکارڈ کیا گیا۔

1. 3. 4 اوپن فیلڈ تجربہ

ایک 100 سینٹی میٹر × 100 سینٹی میٹر × 50 سینٹی میٹر تجرباتی باکس استعمال کیا گیا تھا، اور باکس کے نچلے حصے کو 9 گرڈز میں تقسیم کیا گیا تھا۔ چوہوں کے ہر گروپ کو 60 منٹ تک اندرونی ماحول کے مطابق ڈھالنے کے لیے پہلے سے کھلے میدان کے تجرباتی کمرے میں رکھا گیا تھا۔ تجربے کے آغاز میں، آزمائشی چوہوں کو کھلے میدان کے تجرباتی خانے کے مقررہ کونوں میں باری باری رکھا گیا، اور رویے کے تجزیہ سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے 5 منٹ کے اندر چوہوں کے کھڑے ہونے کے اوقات، نقل و حرکت کا فاصلہ، اور جامد وقت ریکارڈ کیا گیا۔ تجربے کے دوران ماحول کو پرسکون رکھنے کی ضرورت تھی، اور تجرباتی آلے کو دو تجربات کے درمیان بالترتیب پانی اور الکحل سے صاف کیا گیا تاکہ پہلے چوہے کی بو کو اگلے چوہے کے طرز عمل پر اثر انداز ہونے سے روکا جا سکے۔

1. 3. 5 انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA)

چوہوں میں سیرم ایم ٹی کی سطح کا پتہ لگانا چوہوں کو انٹرا پیریٹونیل انجیکشن کے ذریعے بے ہوشی کی گئی تھی، اور پیٹ کی شہ رگ سے 5 ملی لیٹر خون جمع کیا گیا تھا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ انتظار کرنے کے بعد، خون کو سیرم حاصل کرنے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ ہر کنویں میں 40 μL نمونہ ملاوٹ شامل کیا گیا تھا، اور پھر ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کا 10 μL شامل کیا گیا تھا۔ سگ ماہی فلم کے ساتھ سیل کرنے کے بعد، پلیٹ کو 37 ڈگری پر 30 منٹ تک سینک دیا گیا۔ 5 بار دھویا گیا، 50 μL انزائم لیبلنگ سلوشن شامل کیا گیا، اور پلیٹ کو سیلنگ فلم کے ساتھ سیل کر دیا گیا اور 37 ڈگری پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ 5 بار دھویا، اور پھر رنگ تیار کرنے والا حل اور رد عمل ختم کرنے کا حل باری باری شامل کیا گیا۔ ہر کنویں کی OD قدر 450 nm کی طول موج پر ایک انزائم لیبلر کے ذریعے ناپی گئی۔

1. 3. 6 نسل کا داغ لگانا

ہر گروپ سے تین چوہوں کا انتخاب کیا گیا تھا، اور دماغی بافتوں کو منقطع کرکے ہٹا دیا گیا تھا اور 4٪ پولی آکسیتھیلین محلول کے ساتھ طے کیا گیا تھا۔ ٹشو کو پانی کی کمی، موم کے محلول میں ڈبو کر، سرایت کی گئی اور روایتی طریقوں سے کاٹا گیا۔ ٹکڑوں کو 5 μm کی موٹائی کے ساتھ رکھا گیا تھا، PBS سے دھویا گیا تھا، 0.1% toluidine نیلے رنگ سے 0.5 h کے لیے داغ دیا گیا تھا، 95% الکحل سے فرق کیا گیا تھا، 100% الکحل سے پانی کی کمی تھی، شفاف xylene کے ساتھ، اور غیر جانبدار گم کے ساتھ مہربند. چوہے کے ہپپوکیمپس کے CA1 خطے میں مورفولوجی اور نیوران کی تعداد میں تبدیلیوں کو ایک خوردبین کے نیچے دیکھا گیا اور تصاویر اکٹھی کی گئیں۔

1. 3. 7 مغربی دھبے کا تجربہ

ہر گروپ سے چار چوہوں کا انتخاب کیا گیا تھا، اور ہپپوکیمپس کو سر کاٹ کر الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ ہپپوکیمپس ٹشو کو برف کے غسل کے ماحول میں RIP A lysis بفر کے ساتھ ملایا گیا تھا اور ٹشو کو سپرنٹنٹ حاصل کرنے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ پروٹین کی حراستی کا پتہ BCA طریقہ سے لگایا گیا تھا۔ الیکٹروفورسس کے لئے پروٹین لوڈنگ بفر کے ساتھ 20 ug پروٹین شامل کیا گیا تھا۔ پروٹین الیکٹروفورسس مکمل ہونے کے بعد، جھلی کو 300 ایم اے مستقل بہاؤ پر منتقل کیا گیا، 5% سکم دودھ پاؤڈر کے ساتھ بلاک کر دیا گیا، پرائمری اینٹی باڈی کو راتوں رات 4 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا، اور سیکنڈری اینٹی باڈی کو کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ رنگ کی نشوونما کے حل کے استعمال کے بعد، پروٹین بینڈ کا شماریاتی طور پر ایک کیمیلومینیسینس امیجنگ تجزیہ نظام کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔

1. 3. 8 RT-PCR تجربہ

ہپپوکیمپل ٹشو ہوموجنیٹ تیار کرنے کے لئے ہر گروپ سے تین چوہوں کا انتخاب کیا گیا تھا۔ ٹشو فلو میں کل RNA کو Trizol طریقہ سے نکالا گیا تھا اور ارتکاز کی پیمائش کی گئی تھی۔ ایک فاسٹنگ سی ڈی این اے ترکیب کٹ ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے استعمال کی گئی تھی، اور سینیپٹک سے متعلق پروٹین ایم آر این اے کے رشتہ دار اظہار کی سطح کا پتہ لگانے کے لیے فلوروسینس کوانٹیٹیو کٹ کا استعمال کرتے ہوئے فلوروسینس مقداری امپلیفیکیشن ری ایکشن کیا گیا تھا۔ 2-ΔΔCt کا استعمال کرتے ہوئے نتائج کا تجزیہ کیا گیا۔ پرائمر کی ترتیب کو ٹیبل 1 میں دکھایا گیا ہے۔

ٹیبل 1 RT-PCR پرائمر کی ترتیب

1.4 شماریاتی طریقے

اعداد و شمار کے نتائج جو عام تقسیم کے مطابق تھے ان کا اظہار اوسط ± معیاری انحراف (x ± s) کے طور پر کیا گیا تھا، اور گراف پیڈ پرزم 9.5 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا گیا تھا۔ متعدد نمونوں کے درمیان موازنہ کے لیے تغیر کا یک طرفہ تجزیہ استعمال کیا گیا، اور P < 0.05 نے اشارہ کیا کہ فرق شماریاتی لحاظ سے اہم تھا۔