Gossypitrin، قدرتی طور پر پیدا ہونے والا فلیوونائڈ، آئرن سے متاثرہ نیورونل اور مائٹوکونڈریل نقصان کو کم کرتا ہے: حصہ 2

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

2.5 Gos-Fe(I) کمپلیکس کا پتہ لگانا

مندرجہ بالا نتائج کی وضاحت کے لیے ایک قابل فہم مفروضہ یہ ہے کہ Gos Fe(ll) کے ساتھ ایک عارضی کمپلیکس بناتا ہے جو آکسیجن کے ذریعے اس کے آکسیڈیشن کو آسان بناتا ہے۔ یہ عبوری کمپلیکس اپنے الیکٹرانز کو Fe()-سائٹریٹ سے زیادہ آسانی سے فراہم کر سکتا ہے، جو Fe(Ill) کے ساتھ زیادہ مستحکم کمپلیکس پیدا کر سکتا ہے۔ شکل 6A 276، 332 اور 380 nm (سیاہ لائن) پر زیادہ سے زیادہ جذب کے ساتھ Gos کا ایک مخصوص سپیکٹرم دکھاتا ہے۔ Fe() کے اضافے نے زیادہ سے زیادہ جذب کی چوٹیوں میں ارتکاز پر منحصر کمی اور 500 nm (شکل 6A) کے قریب ایک نئے کی ظاہری شکل کو جنم دیا۔ Gos سپیکٹرم سے شروع ہونے والے سپیکٹرا کی ایک صف کی موجودگی کی تصدیق λiso=405 nm پر ایک isosbestic پوائنٹ کی موجودگی سے ہوئی ہے (سیاہ نقطے دیکھیں)، جو آزاد اور پیچیدہ Gos کے درمیان کیمیائی توازن (پیچیدگی) کی نشاندہی کرتا ہے۔ انسیٹ (شکل 6A) اسٹوچیومیٹری 2:1 (گوس آئرن) کے ساتھ ایک کمپلیکس کی تشکیل کو ظاہر کرتا ہے۔ اس طرح کے گوس آئرن کمپلیکس کی سٹوچیومیٹری کا تعین جاب کے طریقہ کار سے کیا گیا تھا جو 0.5 کے داڑھ کے تناسب پر بریکنگ پوائنٹ کو ظاہر کرتا ہے۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

آئرن اور گوس کے درمیان ارتباط پر مزید شواہد IR سپیکٹروسکوپی (شکل 6B) کے ذریعے حاصل کیے گئے تھے۔ فری گوس اور اس کے آئرن کمپلیکس کے لیے، 3000-4000 سینٹی میٹر کی رینج میں واقع براڈ بینڈ کو ہائیڈروجن کی کھینچ کے طور پر سمجھا جاتا تھا۔ پانی کے مالیکیولز کی موجودگی کی وجہ سے بندھے ہوئے ہائیڈروکسیل گروپس۔ مفت Gos کا v(C=O) سٹریچنگ موڈ 1654 cm-I پر ہوتا ہے، جسے 1636 cm-Iupon کمپلیکس فارمیشن کی طرف منتقل کر دیا گیا ہے۔ یہ نتیجہ بتاتا ہے کہ Fe(Ⅱ) کاربونیل آکسیجن [31] سے منسلک ہے۔ مزید یہ کہ، 630 cm-I پر v(Fe-O) اسٹریچنگ وائبریشن کی موجودگی آئرن-گوس کمپلیکس کی تشکیل کی تصدیق کرتی ہے، کیونکہ فری گوس ایسے بینڈ کی نمائش نہیں کرتا ہے۔

شکل 6. (A) Gos UV-VIS سپیکٹرم (200-600 nm) پر Fe(II) کے اثرات۔ انکیوبیشن مکسچر جس میں 125 mM سوکروز، 65 mM KCl، 10 mM HEPES بفر (pH 7.2)، 2 mM سائٹریٹ، اور Gos 1.6 μM. Fe（I） کی ارتکاز اوپر سے نیچے تک نشانات {{12} تھے }}، 0.16، 0.32، 0.48، {{20}}.64,0.8,0.96، اور 1.12 μM.Inset∶ Gos-Fe（II） کمپلیکس کے لیے جاب کا پلاٹ ایک مستقل کل ارتکاز 【Fe（D）】 plus 【Gos】=1.6 μM۔ سیاہ نقطہ isosbastic پوائنٹ کی نشاندہی کرتا ہے۔ نیچے اور اوپر والے تیر بالترتیب 380 اور 500 nm پر جاذب قدروں میں کمی اور اضافے کی نشاندہی کرتے ہیں۔ 28 ڈگری پر تجربات کیے گئے۔ اسکین کی رفتار 2nm/sA تھی بیس لائن انکیوبیشن مکسچر پلس 1.6 μM Fe (I) کے ساتھ قائم کی گئی تھی۔ (B) Gos اور Gos-Fe (I) کے انفراریڈ سپیکٹرا۔ عام مثالیں دکھائی جاتی ہیں۔

2.6۔ Gos Prevented Fe(III) Reduction by Ascorbate

Gos کی طرف سے فروغ دینے والی لوہے کی فیرک حالت ایک قابل قیاس اینٹی آکسیڈینٹ طریقہ کار کی نمائندگی کرتی ہے کیونکہ یہ Fe(II) کی اتپریرک سرگرمی میں رکاوٹ ہے۔ اس کے باوجود، Fe(III) کو پھر بھی اس کی فیرس شکل میں قدرتی طور پر کم کرنے والے ایجنٹ جیسے ascorbate کے ذریعے کم کیا جا سکتا ہے۔ مؤخر الذکر Fe(II) کے ساتھ حیاتیاتی نظام کو دوبارہ لوڈ کر سکتا ہے، جو Fenton-Haber-Weiss کے رد عمل میں حصہ لیتا ہے، انتہائی رد عمل ·OH ریڈیکل پیدا کرتا ہے۔ ان امکانات کو جانچنے کے لیے، ہم نے 1،10-فیننتھرولین کا استعمال کیا تاکہ ایک Gos محلول سے Fe(II）) کی تشکیل کی سطح کی پیمائش کی جا سکے } μM)۔ شکل 7 سے پتہ چلتا ہے کہ Gos کی غیر موجودگی نے Fe(II) سے Fe(II) کی زیادہ سے زیادہ کمی کی شرح کی اجازت دی (5.85×10-3 کی ڈھلوان والی سیاہ لکیر)؛ تاہم یہ عمل Gos (1-منٹ انکیوبیشن، گرین لائن) کی موجودگی کی وجہ سے سست ہوگیا، اور Gos کے ساتھ انکیوبیشن کے 5 منٹ کے بعد، Ascorbate کے ذریعے Fe(I) کی کمی کی شرح تقریباً 3 گنا کم ہوگئی (سرخ لکیر) 2.04× 10-3) کی ڈھلوان کے ساتھ۔ یہ نتیجہ ظاہر کرتا ہے کہ Gos کی ascorbate-mediated Fe() Fe(I) میں کمی کو روکنے کی صلاحیت

شکل 7. Gos چوہے کے جگر کے مائٹوکونڈریا کی عدم موجودگی میں Fe(ⅢI) کو ascorbate کے ذریعے کم کرنے سے روکتا ہے۔ تجرباتی حالات: 125 ایم ایم سوکروز، 65 ایم ایم کے سی ایل، 10 ایم ایم ایچ ای پی ای ایس بفر (پی ایچ 7.2)، 1 ایم ایم سائٹریٹ، گوس 100μM۔ 28 ڈگری پر تجربات کیے گئے۔ Ascorbate（4 mM） اور 5 mM 1،10- phenanthroline کو Gos-Fe(I) انکیوبیشن کے 1 منٹ یا 5 منٹ کے بعد شامل کیا گیا۔ لائنیں تین اسس کی نمائندہ ہیں۔

2.7۔ Gos 2-Deoxyribose آکسیڈیٹیو انحطاط کے خلاف حفاظت کرتا ہے۔

آزاد ریڈیکلز کے بجائے لوہے پر ترجیحی طور پر کام کرنے کے لیے Gos کی صلاحیت کو دستاویز کرنے کے لیے، 2.8 یا 28 mM 2-ڈی آکسائیربوز کو لوہے سے بچانے میں Gos اور دو ·OH scavengers (DMSO اور salicylate) کی تاثیر کا جائزہ لینے کے لیے مقابلے کے مطالعے کیے گئے۔ ثالثی آکسیڈیٹیو نقصان (تصویر 8)۔20 ایم ایم پر OH اسکیوینجرز نے 28 ایم ایم کو محفوظ کیا 2-ڈی آکسیربوز نمایاں طور پر 2.8 ایم ایم سے کم2-ڈی آکسیربوز (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Figure 8. Gos and·OH scavengers dimethyl سلفوکسائیڈ (DMSO) اور سیلسیلیٹ کا اثر 2.8 یا 28 mM 2-ڈی آکسیریبوز کو آکسیڈیٹیو نقصان پر جو Fe(II)-EDTA پلس ایسکوربیٹ کے ذریعے متاثر ہوتا ہے۔ سلوشنز کو 30 منٹ کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا اور اس میں 10 mM فاسفیٹ بفر (pH7.2)،2-deoxyribose (2.8 or 28 mM）، 150 μM EDTA، اور 50 μM Fe（ⅢII) شامل تھے۔ 2 mM کے حتمی ارتکاز میں ascorbate کے اضافے سے رد عمل شروع ہوئے۔ بارز کا مطلب ±SD (n=3) ظاہر ہوتا ہے۔ کنٹرولز میں صرف DMSO (0.001 فیصد) ہوتا ہے، جو Gos نمونوں میں سالوینٹ کا ارتکاز ہے۔ ون ٹیلڈ ٹی ٹیسٹ * پی کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔<0.05, n.s.,="">

3. بحث

اسکیمک اور ہیمرجک اسٹروک سمیت متعدد نیوروڈیجینریٹیو حالات کے تحت جاری ہونے والا آئرن دماغی آئرن ہومیوسٹاسس کی ڈی ریگولیشن کو اکساتا ہے، جس سے اعصابی چوٹ کی پیتھوفیسولوجی ہوتی ہے [4،32-34]۔ ذیلی خلوی سطحوں پر، ایسا لگتا ہے کہ مائٹوکونڈریل خرابی لوہے کی ثالثی نیورونل موت [10,15,35-38] میں ملوث ہے۔ کلینیکل شواہد نیوروڈیجنریشن کے خلاف آئرن چیلیٹرس، بنیادی طور پر ڈیفیروکسامین میسیلیٹ کے استعمال کے فائدے کی حمایت کرتے ہیں، بشمول تمام قسم کے فالج [7,16]۔ تاہم، ان کی زیادہ قیمت اور عدم دستیابی، اور کلاسیکی آئرن چیلیٹرس کے منفی اثرات کی وسیع رینج نے ڈیشومیوسٹاسس [39,40] میں آئرن مینجمنٹ کے لیے قدرتی چیلیٹرز کے استعمال کا باعث بنا ہے۔

Cistanche قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتا ہے۔

Gos کا حفاظتی عمل HT-22 خلیات اور چوہے کے دماغ کے مائٹوکونڈریا پر دکھایا گیا ہے جو آئرن/سائٹریٹ مکسچر کے ساتھ لگائے گئے ہیں، جہاں ہمیں آئرن سے متاثر آکسیڈیٹیو نقصان کے خلاف مضبوط تحفظ ملا ہے۔ آئرن اوورلوڈ (24 گھنٹے) کے سامنے آنے والے ماؤس ہپپوکیمپل HT-22 خلیوں نے کم عملداری کو ظاہر کیا، جو ابتدائی مائٹوکونڈریل جھلی کی ممکنہ کھپت اور اے ٹی پی میں کمی (بالترتیب شکل 2A-C) کے ساتھ قریب سے وابستہ تھا۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ مائٹوکونڈریل خرابی نیورونل مہلکیت میں معاون ہے۔ درحقیقت، ہماری شرائط کے تحت، نیوران پر اپ لوڈ کردہ Fe(II) کا کم از کم ایک حصہ آرگنیلز تک پہنچنے کی توقع ہے، کیونکہ آئرن سے متاثرہ نیورونل موت مائٹوکونڈریل فنکشن کے نقصان سے پہلے ہوئی تھی۔ لہذا، یہ دکھایا گیا ہے کہ آئرن اوورلوڈ ماؤس ہپپوکیمپل HT-22 سیل کی موت اور مائٹوکونڈریل فریگمنٹیشن [41,42] کو اکساتا ہے۔ اسی طرح، لوہے کی مسلسل نمائش ڈوپامینرجک نیوروبلاسٹوما SHSY5Y خلیوں میں مائٹوکونڈریل ROS کی سطح کو بڑھاتی ہے [43]۔ مزید برآں، ہپپوکیمپل نیورونز میں لوہے کی وسیع آمد، نیز مائٹوکونڈریل نقصان کی تصدیق 100 یو ایم فیرس آئرن [36] کی نمائش کے بعد ہوئی۔ یہاں ہم نے مشاہدہ کیا کہ لوہے سے متاثر ہپپوکیمپل نیورون کی عملداری کے Gos کی حوصلہ افزائی کا تحفظ ان کے مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت اور اے ٹی پی کی سطح کے تحفظ سے گہرا تعلق رکھتا ہے۔

برقرار خلیوں کی طرح، فیرس آئرن کے براہ راست مائٹوکونڈریل کی نمائش نے آرگنیل کی وسیع سوجن، جھلی کی صلاحیت کی کھپت، اور ATP (بالترتیب شکل 3A-C) کے نقصان کو اکسایا۔ لوہے سے زیادہ بوجھ والا مائٹوکونڈریا، جس کا اظہار مذکورہ بالا پیرامیٹرز کے تحفظ سے ہوا تھا۔ اس لحاظ سے، یہ دیکھا گیا ہے کہ لوہے کے مائکرومولر ارتکاز سے لدے مائٹوکونڈریا میں مائٹوکونڈریل پارگمیٹی ٹرانزیشن پور اوپننگ اور △Y کی کھپت اس انداز میں ہوئی جو آئرن کیلیشن کے لیے حساس ہے لیکن کیٹالیس اینٹی آکسیڈنٹ ایکشن پر منحصر نہیں ہے |44]۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ مائٹو-ٹیمپو اینٹی آکسیڈینٹ کو ہپپوکیمپل نیوران میں آئرن اوورلوڈ نقصان سے بچانے کے لیے مائٹوکونڈریل سپر آکسائیڈ ایون ریڈیکل کو ختم کرکے اور مائٹوکونڈریل مورفولوجیکل سالمیت اور جھلی کی صلاحیت کو محفوظ رکھنے کی اطلاع دی گئی تھی [36]۔ ہم نے حال ہی میں اس فلیوونائڈ کے اینٹی آکسیڈینٹ اثرات اور پی سی 12 خلیوں کو کیمیائی ہائپوکسیا کی وجہ سے ہونے والی موت [29] سے بچانے کی اس کی صلاحیت کو بیان کیا، جہاں یہ نتیجہ اخذ کیا گیا کہ گوس کی فری ریڈیکل اسکیوینگنگ اور اینٹی آکسیڈینٹ کی صلاحیت جزوی طور پر آئرن ثالثی کے خلاف تحفظ میں شامل ہے۔ HT-22 اور مائٹوکونڈریل نقصان۔ تاہم، tertbutyl hydroperoxide-mediated lipoperoxidation کے خلاف Gos کی بہتر افادیت (Figure 4A,B، بالترتیب) سختی سے بتاتی ہے کہ اس کی آئرن سے تعامل کرنے کی صلاحیت آئرن سے ہونے والے نقصان کے خلاف بنیادی طریقہ کار ہے۔

Gos-Fe کے تعامل کو مزید نمایاں کرنے کے لیے، کئی سیل فری اور مائٹوکونڈریا سے پاک تجربات کیے گئے۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ جب پولی فینول کو Fe (II) کے ساتھ ملایا جاتا تھا، تو دھاتی آئنوں کا ارتکاز کم ہوتا ہے، جبکہ آکسیجن کی کھپت کی شرح میں اسی طرح اضافہ ہوتا ہے (شکل 5A-C)۔ یہ اثرات بتاتے ہیں کہ Gos Fe(II) کو سائٹریٹ کمپلیکس سے ہٹاتا ہے، اور اسے ایک ایسے عمل میں فیرک شکل میں آکسائڈائز کرتا ہے جس میں الیکٹران قبول کرنے والے کے طور پر O2 کی ضرورت ہوتی ہے۔ نتیجتاً، Gos Fe(II) کے ارتکاز میں کمی کو فروغ دیتا ہے جو فینٹن کے رد عمل کے ذریعے ہائیڈروکسیل ریڈیکلز کو روک سکتا ہے۔ چونکہ Gos-Fe (II) کمپلیکس متعلقہ کم کرنے والے ایجنٹوں جیسے ascorbate کے آکسیڈیشن کو قابل بناتا ہے، جس کے نتیجے میں Fe(II) کی تشکیل/تعمیر ہوتی ہے، اس لیے ہم یہ ظاہر کرنے کے قابل تھے کہ Gos Fe(II) کی ascorbate ثالثی میں کمی کو روکتا ہے۔ فی (II) تک۔

اس مفروضے کی کہ گوس مضبوطی سے لوہے کے ساتھ تعامل کرتا ہے اس کی بھی یہاں سپیکٹروسکوپک تکنیکوں کے ذریعے تصدیق ہوئی اور پچھلے نتائج کی تصدیق کی گئی جہاں مختلف صفوں

گوس آئرن کمپلیکس اسٹوچیومیٹری کی خصوصیت الیکٹران اسپن آئنائزیشن ماس اسپیکٹروسکوپی [45] تھی۔

ان نتائج نے لوہے کی ثالثی سے ہونے والے نیورونل نقصان کے خلاف Gos کے حفاظتی اثرات کا ثبوت دیا، شاید فیرس آئنوں کے ساتھ تعامل کرکے، اتپریرک رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کی تشکیل میں اس کی شمولیت کو روکتا ہے۔ مزید برآں، یہ Fe(Ⅱ) اور Gos کے درمیان ایک عارضی چارج ٹرانسفر کمپلیکس کی تشکیل، Fe(II) کے آکسیکرن کو تیز کرنے اور زیادہ مستحکم Fe(III)-Gos کمپلیکس کی تشکیل کی تجویز کرتا ہے جو لپڈ کے پھیلاؤ کے مرحلے میں حصہ نہیں لے سکتا۔ peroxidation مزید برآں، ایک حیاتیاتی لحاظ سے متعلقہ کم کرنے والا ایجنٹ جیسا کہ ایسکوربیٹ گوس کی موجودگی میں فیرک آئرن کو کم کرنے سے قاصر تھا، جس سے فیرس آئن ری سائیکلنگ میں شامل بعض فلیوونائڈز کی پرو آکسیڈینٹ خصوصیت کو محدود کیا گیا۔ [30]۔ مائیکرومولر ارتکاز میں Gos کلاسیکی سکیوینجرز کے مقابلے میں زیادہ موثر تھا جو کہ 2-ڈی آکسیربوز کے لوہے کی ثالثی آکسیکرن کو روکتا ہے۔ اس اعلی افادیت کو ریڈوکس ایکٹیو Gos-Fe(II)/() کی تشکیل سے منسوب کیا جا سکتا ہے جیسا کہ ہم نے پہلے دیگر پولیفینولز کے لیے مشاہدہ کیا تھا جس نے آکسیڈیٹیو نقصان کے مختلف ان وٹرو پیراڈائمز میں آئرن کے ساتھ تعامل پر اینٹی آکسیڈنٹ کے طور پر اپنی کارکردگی کو بہتر بنایا۔ 22،{12}}]۔

یہ قائم کیا گیا ہے کہ چیلیٹنگ ایجنٹ جو آکسیجن کو بطور لیگنڈ (oxo ligand, O2-) پر مشتمل ہوتے ہیں آئرن کو چیلیٹ کر سکتے ہیں اور Fe(I) کے آکسیکرن کو فروغ دے سکتے ہیں، Fe(II) کے استحکام کو بڑھا سکتے ہیں، اور نتیجتاً اس میں کمی پیدا کر سکتے ہیں۔ اس کی صلاحیت کو کم کرنے کی49]۔ فزیولوجیکل پی ایچ پر، کیٹیکول آسانی سے فیرک آئرن کے ساتھ تھرموڈینامک طور پر مستحکم bis کمپلیکس تشکیل دیتے ہیں، جو ligands کی کم ارتکاز کی وجہ سے پسند کرتے ہیں۔ گوس کے ڈھانچے میں کیٹیکول موئیٹی کی موجودگی آئرن کے ساتھ اسی طرح کے تعامل کے طریقہ کار کی تجویز کرتی ہے، جو نیورونل سیلز اور مائٹوکونڈریا کے آئرن سے متاثر ہونے والے نقصان کے خلاف حاصل کردہ تحفظ کی وضاحت کر سکتی ہے۔ اس سلسلے میں، ہم نے پہلے بھی یہ ظاہر کیا ہے کہ مینگیفرین اور گٹی فیرون اے فیرس آئرن آکسیڈیشن کو متحرک کرتے ہیں اور فیرک آئرن کی کمی کو روکتے ہیں [23,24,26-28]۔

گوس کی آئرن کو چیلیٹ کرنے کی صلاحیت سگنلنگ کے راستوں کو بھی تیز کر سکتی ہے جو نیورو پروٹیکشن میں حصہ ڈالتے ہیں۔ مثال کے طور پر، prolyl hydroxylase domain enzymes (PHD)، کلاسیکی Hypoxia Inducible Factor-lalpha(HIF-1o) hydroxylation-modifying enzymes نارموکسیا کے تحت، کو آئرن چیلیٹرس کے اہم اہداف کے طور پر شناخت کیا گیا ہے جو بہت سے لوگوں میں طبی طور پر فائدہ مند ہیں۔ اعصابی عوارض [50,51]۔یہ بات قابل فہم ہے کیونکہ پی ایچ ڈی ایک جوڑے کے عنصر کے طور پر ڈائیویلنٹ آئرن پر منحصر ہے [52]۔ کئی جین جو نیورو پروٹیکشن میں شامل ہیں HIF-la کے ذریعے ریگولیٹ ہوتے ہیں، جیسے eNOS، VEGF، اور EPO[53]۔ مزید یہ کہ، پی ایچ ڈی کی روک تھام کے نتیجے میں ایچ آئی ایف ایکٹیویشن آکسیڈیٹیو تناؤ میں ثالثی مائٹوکونڈریل خرابی اور اپوپٹوسس کو روک سکتا ہے، آزادانہ طور پر ٹرانسکرپشن فیکٹر [54] کے طور پر اپنے کردار سے۔

فیروپٹوس، حال ہی میں آئرن پر منحصر ریگولیٹڈ سیل ڈیتھ کی خصوصیت کو اس طریقہ کار کے طور پر تجویز کیا گیا ہے جس کے ذریعے ہیمرج کے نقصان سے متاثر ہونے والے نیوران مر جاتے ہیں [8]۔ Mitochondrial dysfunction حال ہی میں ferroptosis سیل کی موت سے متعلق تھا [55]۔ لہٰذا، فیروپٹوسس کی روک تھام، جو مائٹوکونڈریل فنکشن کو آئرن کے نقصان سے بچاتی ہے، گوس کے ذریعہ محفوظ کردہ آئرن کی ثالثی سے متعلق اعصابی عوارض کے خلاف نیورو پروٹیکشن کا ایک قابل عمل طریقہ کار بھی ہو سکتا ہے، جو مزید توجہ کا مستحق ہوگا۔ آئرن سے وابستہ نیوروڈیجنریشن کے Vivo جانوروں کے ماڈلز پر Gos کے قیاس شدہ فائدہ مند اثرات کے بارے میں اضافی تحقیق کی جانی چاہیے، تاکہ اس flavonoid کو آئرن ہومیوسٹاسس ڈی ریگولیشن کی وجہ سے دماغی بافتوں کو پہنچنے والے نقصان کے خلاف علاج کی مداخلت کے طور پر تجویز کیا جا سکے۔