GRP78 اوور ایکسپریشن پنک کو متحرک کرتا ہے

3.1.3 جی آر پی 78 اوور ایکسپریشن کے ذریعہ مائٹوفگی انڈکشن نیورو پروٹیکشن میں ثالثی کرتا ہے۔

ہم نے قیاس کیا کہ GRP78-ثالثی نیورو پروٹیکشن مائٹوکونڈریا کی سلیکٹیو آٹوفیجی کے ذریعے ہو سکتا ہے تاکہ عیب دار آرگنیلز کو ہٹانے میں تیزی لائی جا سکے۔

حالیہ برسوں میں، زیادہ سے زیادہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ مائٹوکونڈریا میموری کی تشکیل اور بحالی میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ مائٹوکونڈریا خلیوں میں ایک اہم عضو ہے جو توانائی پیدا کرنے کے لیے ذمہ دار ہے۔ اس کے علاوہ، مائٹوکونڈریا پورے سیل میٹابولزم کے ریگولیشن اور ریڈوکس رد عمل کے توازن میں بھی شامل ہیں۔ حالیہ مطالعات سے یہ بھی پتہ چلا ہے کہ مائٹوکونڈریا نیورونل اتیجیت میں تبدیلیوں کو منظم کرکے طویل مدتی یادداشت کی مضبوطی کو بھی متاثر کرسکتا ہے۔

مائٹوکونڈریا خلیوں میں آکسیڈیٹیو میٹابولزم کے لیے ذمہ دار ہے، اور خلیوں کی توانائی بنیادی طور پر مائٹوکونڈریا میں اڈینوسین ٹرائی فاسفیٹ (ATP) کے ذریعے منتقل ہوتی ہے۔ نیوران، انسانی جسم کے انفارمیشن ٹرانسمیشن یونٹ کے طور پر، خاص طور پر زیادہ توانائی کی طلب رکھتے ہیں، لہذا ان کے صحت مند مائٹوکونڈریا کا معمول کا کام نیوران کی جسمانی خصوصیات اور اعصابی نظام کے معمول کے کام کے لیے ضروری ہے۔ محققین نے پایا ہے کہ بیماری یا عمر بڑھنے کی حالت میں، مائٹوکونڈریا کی صحت کو نقصان پہنچے گا اور ان کے افعال میں کمی آئے گی، جس کے نتیجے میں اعصابی افعال میں کمی آئے گی اور یادداشت کی صلاحیت متاثر ہوگی۔

یادداشت کی تشکیل اور دیکھ بھال کے لیے ایک ہی وقت میں نیوران، synapses اور mitochondria کے درمیان پیچیدہ ہم آہنگی کی ضرورت ہوتی ہے۔ نیوران کے آخر میں synapses میں، mitochondria نیوران اور glial خلیات کے درمیان واقع ہوتا ہے جو نیوران کو سپورٹ کرتے ہیں۔ یہ Synapses ایک مخصوص ڈھانچہ پیش کرتے ہیں اور انتہائی پلاسٹک کے ہوتے ہیں، جنہیں یادداشت اور سیکھنے کی ضروریات کے مطابق ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔ مائٹوکونڈریا Synapses کے "پیداواری مرکز" کی طرح ہیں، جو نیوران اور Synapses کو ان کی ضرورت کے مطابق توانائی اور مادّہ فراہم کرتے ہیں، جو کہ نیوران کی اتیجیت کو تیزی سے منظم کر سکتے ہیں اور Synapses کی طویل مدتی پلاسٹکٹی اور استحکام کو برقرار رکھ سکتے ہیں۔

مائٹوکونڈریا اور میموری سے متعلق ایک اور تحقیقی سمت تبدیلی سے متعلق عوامل (ایک قسم کی پروٹین) کے ذریعے خلیوں کا علاج کرنا ہے۔ یہ علاج مائٹوکونڈریل فنکشن کو بڑھا سکتا ہے، میٹابولک ریٹ کو بڑھا سکتا ہے، اور نیوران اور Synapses کی صحت کی حفاظت کر سکتا ہے۔ ان مطالعات کی بنیاد پر، یہ تجویز کیا گیا ہے کہ مائٹوکونڈریا کی صحت کو مضبوط بنا کر، ہم الزائمر اور دیگر اعصابی بیماریوں کے خطرے کو کم کرتے ہوئے اپنی یادداشت اور ذہنی صلاحیت کو بڑھا سکتے ہیں۔

خلاصہ یہ کہ مائٹوکونڈریا میموری کی تشکیل اور دیکھ بھال کا ایک لازمی حصہ ہے۔ مائٹوکونڈریا کی صحت نیوران اور synapses کے معمول کے کام اور طویل مدتی پلاسٹکٹی اور استحکام کو برقرار رکھنے کے لیے ضروری ہے۔ ہمیں مائٹوکونڈریا کی صحت کو برقرار رکھنے، الزائمر اور دیگر اعصابی امراض کے خطرے کو کم کرنے اور اپنی ذہانت اور یادداشت کو بڑھانے کے لیے خوراک، ورزش اور طرز زندگی کی عادات پر توجہ دینی چاہیے۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche نمایاں طور پر یادداشت کو بہتر بنا سکتا ہے کیونکہ یہ نیورو ٹرانسمیٹر کے توازن کو بھی کنٹرول کر سکتا ہے، جیسے کہ acetylcholine کی سطح میں اضافہ اور ترقی کے عوامل، جو یادداشت اور سیکھنے کے لیے بہت اہم ہیں۔ اس کے علاوہ، Cistanche deserticola خون کے بہاؤ کو بہتر بنا سکتا ہے اور آکسیجن کی ترسیل کو فروغ دے سکتا ہے، جو اس بات کو یقینی بنا سکتا ہے کہ دماغ مناسب غذائیت اور توانائی حاصل کرے، اس طرح دماغی قوت اور برداشت کو بہتر بناتا ہے۔

اپنی یادداشت کو بہتر بنانے کے طریقے جانیں پر کلک کریں۔

اس مفروضے کی حمایت میں، GRP78 میکروآٹوفیجی کو فروغ دینے کے لیے ثابت ہوا ہے [4] (اس کے بعد اسے آٹوفجی کہا جاتا ہے)۔

ہم نے یہ تعین کرنے کی کوشش کی کہ آیا GRP78-کی حوصلہ افزائی نیورو پروٹیکشن کے لیے کئی اچھی خصوصیات والے آٹوفجی ماڈیولٹرز کا استعمال کرتے ہوئے آٹوفیجی ضروری تھی: ریپامائسن، جو ایم ٹی او آر سی 1 کو روک کر آٹوفجی کو چالو کرتی ہے، اور آٹوفجی فلوکس کے دو روکنے والے: 3-میتھیلاڈینین ({{4}) }}MA)، کلاس III phosphatidylinositolkinase PI3K کا ایک روکنے والا، اور LY294002، کلاس I PI3K کا ایک روکنا۔

تینوں آٹوفجی ماڈیولٹرز نے گاڑی کے مقابلے میں GFP اور GRP78 دونوں گروپوں میں ٹون ٹریٹڈ سیلز میں بقا کو کم کیا (شکل 4A)۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ PI3K-Beclin1 پاتھ وے کے ذریعے آٹوفجی کی صحیح شروعات، اور دیر سے بہاؤ ضروری تھا، اگرچہ کافی نہیں، ER- تناؤ والے خلیوں میں GRP78 اوور ایکسپریشن کے نیورو پروٹیکٹو اثرات کے لیے۔

شکل 3. GRP78 اوور ایکسپریشن تناؤ والے NSC34 خلیوں میں mitochondrial dysfunction کو بچاتا ہے۔ (A) امیونو بلوٹ اور بار گراف NSC34 خلیوں میں GRP78 کی سطح کو دکھاتے ہیں جو کہ پلازمڈ ویکٹر کے ساتھ GRP78 یا غیر متعلقہ پروٹیناس کنٹرول (GFP) کو اوور ایکسپریس کرنے کے لیے نیوکلیو فیکٹڈ ہیں۔ (B) 1 µg/mL tunicamycin (Tun) (بائیں) یا 10 µM nocodazole پر مشتمل میڈیم میں 24 گھنٹے کے بعد NSC34 خلیات (یعنی ± SEM) کا اظہار کرنے والے GFP- یا GRP78-کی بقا کا فیصد (دائیں) ایک MTT پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے طے کیا گیا )۔ (C) GFP orGRP78 کو اوور ایکسپریس کرنے والے خلیوں میں MitoSOX فلوروسینس کا مقداری تجزیہ اور Tun یا گاڑی (بائیں) یا efavirenz (EFV) کو بطور کنٹرول یا گاڑی (دائیں) کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے۔ (D) خلیوں میں TMRM فلوروسینس کا مقداری تجزیہ جو کہ GFP یا GRP78 کو زیادہ متاثر کرتا ہے اور Tun یا گاڑی (بائیں) یا EFV یا گاڑی (دائیں) کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے (GFP-Veh کنٹرول گروپ ہے)۔ (E) بائیں: O2 ارتکاز کا نمائندہ تجزیہ (ایک کلارک قسم O2 الیکٹروڈ کا استعمال کرتے ہوئے) GFP یا GRP78 کو اوور ایکسپریس کرنے والے خلیوں میں وقت کا فنکشن اور Tun کے ساتھ علاج۔ دائیں: GFP یا GRP78 (GFP-Veh کنٹرول گروپ ہے) (n=4؛ * p <0.05 vs. Veh-GFP, # p <0.05 vs.GRP78, یک طرفہ انووا)۔

تصویر 4. مائٹو فیگی کے لیے مائٹوکونڈریا ٹیگنگ GRP78 اوور ایکسپریشن کے ذریعے مراعات یافتہ ہے۔ (A) قابل عمل NSC34 خلیات کے فیصد کا بار گراف (مطلب ± SEM) نیوکلیوفیکٹڈ یا تو GFP یا GRP78 پلازمیڈ کے ساتھ اور Tun یا Tun کے مجموعے کے ساتھ آٹوفجی ماڈیولٹرز کے ساتھ علاج کیا گیا: rapamycin (RAPA)، 3MA، یا LY-902، متعلقہ کنٹرول وہیکل (Veh)، علاج کے 24 گھنٹے بعد MTT پرکھ کے ذریعے طے کیا جاتا ہے (GFP-Veh کنٹرول گروپ ہے) (n=4–8، * p < 0.05 بمقابلہ

Veh-GFP؛ # p < 0۔{14}}5 بمقابلہ Tun-GFP۔ (B) PARK کے ساتھ نیوکلیوفیکٹڈ سیلز کی نمائندہ کنفوکل تصاویر GRP78 پلاسمڈ (نیچے کے پینل) کا علاج یا تو گاڑی (Veh) یا Tun (5 h) سے کیا جاتا ہے اور HA (سبز) اور HSP60 (سرخ) کے لیے حفاظتی ٹیکوں سے لگایا جاتا ہے۔ اسکیل بار=10 µm۔ (C) Veh، Tun، اور Tun+GRP78 گروپس سے پارکن اور Hsp60 کے باہمی تعلق کے گتانک کا اوسط ± SEM (n=4؛ * p < 0.05 بمقابلہ پارکن-وہ، # p < 0.05 بمقابلہ۔

Parkin-Tun، یک طرفہ ANOVA)۔ (D)بائیں، مغربی دھبے مائٹوکونڈریل (mito) اور سائٹوسولک (cyto) پولڈ فریکشنز میں اشارہ شدہ پروٹینز کے لیے GFP- orGRP78-اوور ایکسپریسنگ سیلز جو گاڑی یا Tun کے ساتھ 5 گھنٹے تک علاج کیے گئے ہیں۔ تجزیہ کیے گئے پروٹینز OPA-1، CV-، PDI، GRP78، Ubiquitinated residues، LC3، اور actin ہیں۔ دائیں، ایکٹین (سائٹوسول) یا کمپلیکس V کے بیٹا سبونائٹ کے نسبت مائٹوکونڈریل فریکشن میں پولڈ فریکشنز اور ایل سی{{1{{20}}}II دونوں میں GRP78 کی اوسط فولڈ تبدیلی کے بار گراف (CV-B) (mitochondria) GFP گروپ میں۔ (E) قابل عمل خلیات کے فیصد کا بار گراف (یعنی ± SEM) GFP یا GRP78 پروٹین کو زیادہ ظاہر کرتا ہے اور Tun کے ساتھ اکیلے یا CCCP، CSA، یا BAPTA-AM کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے، جس کا تعین MTT پرکھ کے ذریعے 24 گھنٹے کے بعد کنٹرول گاڑی کے علاج سے متعلق علاج کے بعد کیا جاتا ہے۔ خلیات (F) CCCP کے ساتھ یا اس کے بغیر تھپسیگارگین (THA) کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں کے لیے سیل کے قابل عمل ہونے کا اسی طرح کا بار گراف (GFP-Veh کنٹرول گروپ ہے) (n=4–8، 3 مختلف تجربات میں، * p <0.05 بمقابلہ کنٹرول-Veh;# p <0.05 بمقابلہ GRP78-ٹن)۔

پارکن ہمیشہ مائٹوفجی میں حصہ نہیں لیتا کیونکہ اسے متبادل طریقہ کار کے ذریعے بھی متحرک کیا جا سکتا ہے [46]۔ یہ معلوم کرنے کے لیے کہ آیا پارکن GRP78-ثالثی اثر میں شامل ہے، ہم نے ER تناؤ کے ساتھ اور اس کے بغیر NSC34 خلیوں میں ظاہر کیے گئے HA-tagged Parkin کے ذیلی خلوی مقام کا تعین کیا۔

کنفوکل مائیکروسکوپی کے ذریعے، ہم نے مشاہدہ کیا کہ پارکن پورے NSC34 سیل میں 5 گھنٹے گاڑی یا Tun ٹریٹمنٹ کے بعد تقسیم کیا گیا تھا (شکل 4B)۔ اس کے برعکس، GRP78 کو زیادہ ظاہر کرنے والے خلیوں میں، HSP60 کے ساتھ پارکن کی شریک لوکلائزیشن میں اضافہ ہوا، جو ایک مائٹوکونڈریل پروٹین ہے۔ ، اس آرگنیل فارمیٹوفجی کو نشانہ بنانے کی تجویز کرتا ہے (شکل 4B، C)۔

اس کے علاوہ، ہم نے خلیوں سے مائٹوکونڈریل اور سائٹوسولک فریکشنز کو الگ تھلگ کیا جو GFP یا GRP78 میں سے کسی ایک کا زیادہ اظہار کرتے تھے اور توہین کے بعد 5 گھنٹے پر Tun یا گاڑی کے ساتھ بطور کنٹرول سلوک کیا جاتا تھا۔ پولڈ مائٹوکونڈریل فریکشنز کی پاکیزگی کی تصدیق OPA1 اور CV کی موجودگی، اور ER-resident پروٹین کی عدم موجودگی، proteindisulfide isomerase (PDI) (شکل 4D) کے ذریعے کی گئی۔

دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے کنٹرول کے مقابلے ER- تناؤ والے خلیوں کے پولڈ مائٹوکونڈریل فریکشنز میں GRP78 کی کثرت کو بڑھانے کا رجحان بھی دیکھا۔ نوٹ کریں کہ اگرچہ Tun محرک سائٹوسول میں GRP78 کی سطح میں اضافہ بھی کر سکتا ہے، لیکن یہ مائٹوکونڈریل فریکشن میں نہیں دیکھا گیا۔

GRP78 کے زبردستی اوور ایکسپریشن نے تھیمیٹوکونڈریل فریکشن (فگر 4D اور فگر S4) میں PINK1 اور پارکن دونوں کو جمع کرنے کے رجحان کو فروغ دیا۔ یہ اطلاع دی گئی ہے کہ پارکین کی موجودگی Ub کے جمع ہونے کو بہتر بناتی ہے اور اکیلے پنک کی موجودگی کے مقابلے میں مائٹوفجی کو بڑھاتی ہے [42,47]۔ اس کے مطابق، Ubiquitin (Ub) امیونو بلوٹنگ نے GFP گروپ (Figure 4D) کے مقابلے GRP78- کا اظہار کرنے والے خلیوں سے مائٹوکونڈریل فریکشنز میں اس کے پروفائل میں فرق ظاہر کیا۔

دباؤ والے حالات میں، مائٹوکونڈریل پروٹین کی ہر جگہ آٹوفاگوسم مشینری کے اجزاء کی بھرتی ہوتی ہے جو LC3، اور LC3II [42,48] کے لپیڈیٹڈ آئسفارم کے جمع ہونے سے شروع ہوتی ہے۔

مائٹوکونڈریل فریکشن میں وافر مقدار میں LC3II پروٹین کا مشاہدہ کیا گیا تھا جس میں دباؤ والے خلیوں میں زیادہ موجودگی کو بڑھانے کے رجحان کے ساتھ دیکھا گیا تھا جو GRP78 کو اسی طرح کے حالات میں GFP والے افراد کے بارے میں زیادہ ظاہر کرتے ہیں (شکل 4D)۔ ایک ساتھ لیا جائے تو، ان اعداد و شمار نے تجویز کیا کہ GRP78 کا جبری اظہار اس کے مائٹوکونڈریل ٹرانسمیشن کو آسان بنا سکتا ہے۔ mitophagy کے لئے ٹیگنگ.

GRP78 اوور ایکسپریشن کے ذریعہ ثالثی نیوروپروٹیکٹو اثر سے مائٹوفگی انڈکشن کی ممکنہ مطابقت کا تعین کرنے کے لئے، ہم نے مائٹوفگی کے ایکٹیویٹرز اور انابیٹرز کے ذریعہ پیدا ہونے والی تبدیلیوں کا اندازہ کیا۔ ہم نے آکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن کو کیمیائی طور پر غیر جوڑنے اور مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل [49,50] کو ختم کر کے مائٹوفجی کو اکسانے کے لیے کاربونیل سائینائیڈ ایم-کلوروفینائل ہائیڈرزائن (سی سی سی پی) کا استعمال کیا، ساتھ ہی ساتھ دو مائٹوفجی انحیبیٹرز: BAPTA-AM، سیلولر انبیٹرز کا ایک خلیہ۔ 2+ اور سائکلوسپورن A (CSA)، تھیمیٹوکونڈریل پارمیبلٹی ٹرانزیشن پور (mPTP) روکنے والا جو مائٹوکونڈریا [51] سے Ca2+ بہاؤ کو روکتا ہے۔

اگرچہ NSC34 میں CCCP کا علاج قابل عملیت کو کم کرنے کے لیے ناکافی تھا، جیسا کہ وسیع پیمانے پر رپورٹ کیا گیا ہے، ہم نے پایا کہ ER-stressedcells پر ایک ہی علاج نے اس کی بقا میں اضافہ کیا، قطع نظر اس کے کہ GRP78 زیادہ متاثر ہوا تھا یا نہیں (شکل 4E)۔

اہم بات یہ ہے کہ GRP78 overexpression onER-stressed خلیات کے ذریعے فروغ پانے والے نیورو پروٹیکٹو اثر کو CSA یا BAPTA-AM (شکل 4E) کی موجودگی میں ختم کر دیا گیا تھا۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ مائٹوفجی انڈکشن خلیوں کو ER تناؤ اور Ca2+- بہاؤ سے نمٹنے کی اجازت دیتا ہے۔ GRP78 کی طرف سے فروغ دینے والے نیوروپروٹیکٹو اثر کے لیے اہم ہے۔

GRP78 کے لیے مائٹوفجی کو آمادہ کرنے کا ایک امکان ضروریCa2+-ثالثی کارروائی کی سہولت فراہم کر رہا ہے، شاید ER-resident inositol 1,4,5 triphosphate receptor (IP3R) کی کارروائی کے ذریعے جس کے کھلنے سے Ca2+ بہاؤ کی اجازت ملتی ہے۔ ER سے مائٹوکونڈریا تک۔ ہم thapsigargin(THA)، ایک Ca2+ ATPase inhibitor [52] کا استعمال کرتے ہوئے IP3R کے فعال ہونے میں رکاوٹ ڈال کر اس امکان کو تلاش کرنا چاہتے تھے۔

تھاپسیگارگین کو خلیات میں ER تناؤ پیدا کرنے کے لیے بھی جانا جاتا ہے کیونکہ یہ علاج ER سے Ca2+ اسٹورز کو ختم کرتا ہے، اور اس وجہ سے کینونیکل انفولڈ پروٹین ردعمل کے حصے کے طور پر GRP78 اظہار میں اضافہ ہوتا ہے [53]۔ شکل 4F سے پتہ چلتا ہے کہ تھاپسیگارجن GFP-کنٹرول سیلوں میں ٹونیکامائسن کے علاج کی طرح سیل کی قابل عملیت کو متاثر کرتا ہے اور یہ کہ CCCP ہم آہنگ علاج سیل کی موت کو روکتا ہے جیسا کہ Tun کے ساتھ مشاہدہ کیا گیا ہے۔

تاہم، جی آر پی 78 کی زبردستی اوور ایکسپریسنگ نقصان دہ تھپسیگارگین اثر کو روکنے کے قابل نہیں تھی جیسا کہ اس نے ٹونیکامائسن کی توہین کے ساتھ کیا تھا۔ یہ مشاہدہ GRP78 کے نیورو پروٹیکٹو اثر میں Ca2+ بہاؤ کی ضروری شمولیت کی تصدیق کرتا ہے، شاید IP3R کے ذریعے۔

3.1.4 GRP78 کے ذریعے ثالثی کی گئی نیورو پروٹیکشن PINK1 اور IP3R پر منحصر ہے۔

GRP78 نیورو پروٹیکٹو اثر کے ثالثوں کی شناخت شروع کرنے کے لیے، shRNA ٹیکنالوجی کا استعمال کیا۔ سب سے پہلے، ہم نے تصدیق کی کہ منتخب کردہ shRNA نے بالترتیب GRP78، PINK1، یا IP3R کے اظہار کو کم کیا ہے (فگر S4A–C) اور یہ کہ انہوں نے کنٹرول سیلز (فگر S4D) کی عملداری پر سمجھوتہ نہیں کیا۔ ہم نے پہلے تصدیق کی کہ GRP78 کا اظہار خود GRP78- اور CCCP-ثالثی نیورو پروٹیکشن دونوں کے لیے Tun-InducedER تناؤ (شکل 5A) کا سامنا کرنے کے لیے ضروری تھا۔

اس کے بعد، PINK1 یا IP3R کو خاموش کرنے سے GRP78 اوور ایکسپریشن یا CCCP ٹریٹمنٹ (شکل 5A) کے ذریعے فروغ پانے والے نیورو پروٹیکٹو اثر کو روک دیا گیا۔ مزید برآں، ہم نے GRP78 شفٹ پایا، جو کہ عام طور پر نیوکلئس کے ارد گرد ایک ہموار داغدار تقسیم میں تقسیم کیا جاتا ہے، جب اسے زیادہ متاثر کیا گیا تھا تو اسپیکل فوکی میں آئی پی 3 آر کے ساتھ مقامی بنایا جائے گا (شکل 5B)۔

ان نتائج نے ایک ساتھ تجویز کیا کہ GRP78 ہمارے وٹرو ماڈل میں حفاظتی مائٹوفجی کو ماڈیول کرتا ہے، اور یہ اس نیورو پروٹیکشن کو پنک1- اور IP3R پر منحصر انداز میں استعمال کرتا ہے۔

4. بحث

نیورو پروٹیکشن کے اینڈوجینس میکانزم کو بڑھانے سے تکلیف دہ گھاووں یا بیماری [3,54,55] کے بعد neurodegenerative عمل کو روکنے کے لیے موثر علاج کے اوزار مل سکتے ہیں۔ ماڈلز [4]۔

بنیادی میکانزم کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے اسپائنل روٹ avulsion [55] کا ایک ماڈل استعمال کیا جو motoneuron کنیکٹیویٹی میں خلل ڈالتا ہے جس کے نتیجے میں ریٹروگریڈ نیوروڈیجینریٹو عمل ہوتا ہے [20]۔

اس ماڈل میں موٹونیرون کی موت ER تناؤ کی خصوصیت ہے، ایک بلاک شدہ آٹوفجی فلوکس، اور یہ ناناپوپٹوٹک ہے کیونکہ کیسپیس 3 یا 12 کی کوئی فعال شکل نہیں دیکھی گئی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ apoptosisis عصبی انتقال کا حتمی عمل کرنے والا نہیں ہے [20]۔ اس کے مطابق، ہم نے پہلے پروٹومکس نقطہ نظر سے تصدیق کی تھی کہ اینٹی اپوپٹوٹک خصوصیات آر اے کے بعد اپوپٹوٹک کے متوازی طور پر ہوتی ہیں، جو ایک مؤثر اپوپٹوسس پر عمل درآمد کو روکتی ہیں [25]۔

اس نیوروڈیجینریٹو سیاق و سباق میں، GRP78 کے اوور ایکسپریشن نے موٹر نیورو پروٹیکشن [20,26,27] کا استعمال کیا۔ یہاں، ابتدائی طور پر، ہم نے اس نیورو پروٹیکشن کی بنیادی بنیاد کو ننگا کرنے کے لیے پروٹوم کا غیر جانبدارانہ تقابلی اور مقداری تجزیہ استعمال کیا۔

غیر متوقع طور پر، مائٹوکونڈریا اصل ہدف تھا، جس میں آرگنیل پروٹین کے مواد کے ساتھ نقصان دہ موٹونورونز کے اندر موجود مائٹوکونڈریا کے ویسکلز کی سجاوٹ تھی جس نے GRP78 کو زیادہ متاثر کیا۔

ان مشاہدات نے نیورو پروٹیکشن کے لیے ایک کلیدی عنصر کے طور پر مائٹوفگی کی موجودگی کا مشورہ دیا۔ ڈیپرین وٹرو تجربات نے اس مفروضے کی توثیق کی کیونکہ GRP78 نے نیورو پروٹیکشن کی ثالثی کی (i) مائٹوکونڈریا سانس اور ROS کی سطح کو بحال کر کے، (ii) PINK1/PARKIN mitochondria translocation کو متحرک کرنا، mitophagy کے لیے organelle کو ٹیگ کرنا، اور (iii) ایک ضروری میڈیاٹر کے طور پر ایک ضروری میڈیاٹر کے طور پر۔

ہمارے علم کے مطابق، یہ پہلا مطالعہ ہے جس میں دکھایا گیا ہے کہ GRP78 اوور ایکسپریشن حفاظتی مائٹوفجی کو فروغ دیتا ہے۔ ایک کیلشیم بائنڈنگ پروٹین [4,56] ہونے کے ناطے غلط فولڈنگ پروٹین اور چاند کی روشنی کے دیگر افعال میں GRP78 کے کردار کے علاوہ، ہم نے اس کے فعال عمل کو شامل کیا۔ mitophagy کی حوصلہ افزائی. مزید یہ کہ ہمارا مطالعہ حالیہ مطالعات کے ایک سیٹ میں شامل ہوتا ہے جو ER تناؤ کو مائٹوکونڈریل dysfunction [57–59] سے جوڑتا ہے۔

ہمیں Vivo میں mitophagy کے لیے خاص نشانات ملے جب GRP78 کو زیادہ متاثر کیا گیا تھا اور نیورو پروٹیکشن کو فروغ دیا گیا تھا۔ وٹرو ماڈلز کا استعمال کرتے ہوئے بھی یہی مشاہدہ کیا گیا جو نیوروڈیجینریٹیو عمل کی کچھ خصوصیات کی نقل کرتے ہیں جو RA کے بعد ہوتا ہے جیسے ER تناؤ [20,26]۔

مائٹوکونڈریل مواد اور میٹابولزم ہومیوسٹاسس کی نگرانی کے لیے مائٹو فیگی کے ذریعے مائٹوکونڈریا کا کوالٹی کنٹرول بہت ضروری ہے۔ ادب میں، یہ اب بھی متنازعہ ہے کہ آیا مائٹوفجی انڈکشن اپوپٹوسس سگنلنگ کے ساتھ وسیع کراسسٹالک کی وجہ سے کئی بیماریوں کی بقا کو فروغ دیتا ہے یا سیل کی موت کو فروغ دیتا ہے [60]، حالانکہ یہ بیان کیا گیا ہے کہ تباہ شدہ مائٹوکونڈریا کی کلیئرنس الزائمر جیسی بیماریوں میں بنیادی کردار رکھتی ہے۔ ، پارکنسن کی بیماری، یا inaging [61].

اس سے قبل، یہ اطلاع دی گئی ہے کہ GRP78 CHOP انڈکشن [62,63]، کیسپیس 7 کو چالو کرنے، یا PI3K-AKT-mTOR سگنلنگ ایکسس [4] کو چالو کرنے سے ER تناؤ سے شروع ہونے والے apoptosis کو روکتا ہے۔ یہ آکسیڈیٹیو تناؤ اور ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی کم سطح کو برقرار رکھنے کا بھی مظاہرہ کیا گیا ہے [4,64]۔ خاص طور پر، کینسر کے خلیوں میں، یہ ظاہر کیا گیا ہے کہ GRP78 پروٹین کناز RNA-likeendoplasmic reticulum kinase (PERK)-NRF2 سگنلز [65,66] کو چالو کر کے ROS کو کم کرتا ہے، جس کے نتیجے میں اینٹی آکسیڈینٹ سے متعلق جینز کو اپ گریڈ کرنے کے ساتھ ساتھ پروٹین کی سطح میں اضافہ ہوتا ہے۔ glycolytic خامروں [67].

اس کے بجائے، ہم نے پایا ہے کہ GRP78 اوور ایکسپریشن نے گلائکولٹک انزائمز (مثلاً، ENO1 اور ENO2) (ضمنی جدولوں) کو کم کر دیا ہے۔ یہ نتائج تجویز کر سکتے ہیں کہ ہمارے ماڈل میں، ROS کا مشاہدہ کیا جانے والا تناؤ مائٹوفگی میں اضافے سے متعلق ہو سکتا ہے، حالانکہ اس میں شامل میکانزم کی تفصیلات کی مزید چھان بین کی جانی چاہیے۔ پارکنسنز [49,69]، ہنٹنگٹن [70,71]، اور الزائمر کے امراض اور تاؤ پیتھیز [72] میں۔

متعدد مصنفین نے نشاندہی کی کہ مائٹوفگی کے راستوں کو مناسب طریقے سے منظم کرنے سے، جسم نقصان دہ آکسیڈیٹیو پرجاتیوں سے بچ سکتا ہے، اور ریڈوکس توازن اور ہومیوسٹاسس کو منظم کر سکتا ہے [73]۔ اس طرح، اس کنٹرول شدہ مائٹوفگی انڈکشن کے ذریعے GRP78 اوور ایکسپریشن کو ان بیماریوں میں ایک نیورو پروٹیکٹو حکمت عملی سمجھا جا سکتا ہے۔ GRP78 اوور ایکسپریشن کے ذریعے ثالثی کی گئی نیورو پروٹیکشن Ca2+ بہاؤ پر منحصر دکھائی دیتی ہے کیونکہ اسے BAPTA-AM کے ذریعے بلاک کیا گیا تھا۔ Ca2+ کی BAPTA-AM چیلیٹنگ آٹوفیجک فلوکس پاتھ وے کے ساتھ ساتھ کئی مختلف مراحل پر مداخلت کر سکتی ہے، جو نہ صرف آٹوفجی کے متحرک ہونے کو روکتی ہے بلکہ آٹوفاگوسوم کی تشکیل اور پروسیسنگ کے مراحل کو بھی روکتی ہے [74]۔

اس کے برعکس، Ca2+ بہاؤ کو متاثر کرنے والے دوسرے ایجنٹ کے استعمال، جیسے asthapsigargin، نے حیران کن نتائج برآمد کیے ہیں۔ تھیپسیگارگین سارکو اینڈوپلاسمک ریٹیکولم سی اے2+ اے ٹی پیسیس (ایس ای آر سی اے) کو روکتا ہے، جو سائٹوسولک Ca2+ کی بلندی کو برقرار رکھتا ہے، لیکن یہ انٹرا سیلولر Ca2+ اسٹورز کی دائمی کمی اور کھلے ہوئے پروٹین کے جمع ہونے کے ذریعے ER تناؤ کو بھی متحرک کرتا ہے۔

اس صورت حال میں، ہم نے مشاہدہ کیا کہ GRP78 اوور ایکسپریشن مرنے والے خلیوں کو نہیں بچا سکتا، اور ہمیں شبہ ہے کہ یہ اس لیے ہو سکتا ہے کہ تھاپسیگارگین IP3R عمل میں بھی رکاوٹ پیدا کرتا ہے [52]۔ بیسل IP3R سرگرمی اور ER سے مائٹوکونڈریا کی طرف مسلسل کم سطح کا Ca2+ بہاؤ۔ مائٹوکونڈریل سانس اور سیل بائیو اینرجیٹکس کو فروغ دینے کے لیے ضروری ہے [75]۔

GRP78 سگما-1 رسیپٹر (SIGR1) اور IP3R [76,77] کے ذریعہ تشکیل کردہ کمپلیکس کے ساتھ MAMs کا تعامل کرتا ہے۔ ERstress پر، SIGR1-GRP78 کا تعامل Ca2+ کی کمی کی وجہ سے کم ہو جاتا ہے جو بعد میں ER سے IP3Rs [76] کے ذریعے مائٹوکونڈریا میں Ca2+ بہاؤ کو بڑھاتا ہے۔ اس کے علاوہ، یہ بھی ظاہر کیا گیا کہ IP3R پارکن سے متاثرہ مائٹوفگی کے لیے خاص طور پر مائٹوکونڈریل کلسٹرنگ ڈاون اسٹریم پارکن بھرتی کی اجازت دینے کے لیے ضروری تھا [78]۔

ہمارے نتائج اس بات سے متفق ہیں کہ shRNA ٹیکنالوجی کے ذریعے IP3R کی کمی نے ER-دباؤ والے خلیوں میں GRP78 اوور ایکسپریشن کے ذریعے لگائے گئے نیورو پروٹیکشن کو ختم کر دیا۔ GRP78 کا پتہ مائٹوکونڈریا کے اندرونی جھلی کے درمیانی جگہ اور میٹرکس کے اندر پایا گیا ہے، حالانکہ اس کے کام کو واضح کرنا باقی ہے [79]۔

بہر حال، اور اس کے متعدد افعال کے حوالے سے، ہم قیاس کرتے ہیں کہ یہ بفرنگ کا ہو سکتا ہے2+۔ اگر یہ معاملہ تھا تو، ER- تناؤ والے خلیوں میں مائٹوکونڈریا کے اندر اس کی بڑھتی ہوئی موجودگی جب زیادہ اظہار کیا جاتا ہے تو ڈرائیونگ apoptosis سے بچنے کے لیے بڑے پیمانے پر Ca2+ کی آمد کو کم کر سکتا ہے۔ اس پر مزید تجربہ بہت قیمتی ہو گا۔

مطالعہ کی حدود اور مستقبل کی تحقیق

یہ مطالعہ نیورو ٹراما کے بعد نیورونل موت میں GRP78- منحصر مائٹوفگی کے نیورو پروٹیکٹو کردار پر مستقبل کے تجزیوں کی راہ ہموار کرتا ہے۔ اس مطالعے کی پہلی حد یہ ہے کہ RA کے بعد ایک مخصوص ٹائم ونڈو میں mitophagy کا تجزیہ کیا گیا تھا، اور چونکہ mitophagy ایک متحرک عمل ہے، اس کے بہاؤ کو سمجھنا دلچسپ ہوگا اور کون سے مالیکیول اس میں شامل ہیں۔

اس طرح، mitophagy کو ماڈیول کرنے والے مزید تجربات (فارماکولوجیکل یا جینیاتی نقطہ نظر کے ذریعے) کی ضرورت ہے تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا ویوو کے مشاہدے کے اثرات مکمل طور پر مائٹوفجی پر منحصر ہیں۔

یہ ہمیں اس بات کی تصدیق کرنے کی اجازت دے گا کہ GRP78 کا زیادہ اظہار مائٹوفگی کے ذریعے MN کی بقا کو فروغ دیتا ہے۔ چونکہ مائٹوکونڈریا اور اپوپٹوس کے درمیان ایک اچھی طرح سے بیان کردہ کراسسٹالک موجود ہے، اس لیے مزید وٹرو اور ویوو میں ہیرا پھیری یہ سمجھنے کے لیے ضروری ہے کہ ہمارے ماڈل میں موت کا کون سا طریقہ کار MN موت کو متحرک کرتا ہے۔ اس سے یہ واضح کرنے میں مدد ملے گی کہ آیا GRP78 سیل ڈیتھ میکانزم کو براہ راست تبدیل کرتا ہے یا اسے روکتا ہے یا اس کی موجودگی MNs کو اس سے نمٹنے اور زندہ رہنے کی اجازت دیتی ہے۔

5. نتائج

موجودہ مطالعہ GRP78 کے لیے motoneuronal تحفظ کے حصول کے لیے mitophagy کو ماڈیول کرنے میں ایک نئے کردار کی وضاحت کرنے والا پہلا تھا۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ GRP78 شدید تکلیف دہ اعصابی چوٹ کے بعد انحطاط پذیر موٹر نیورونز کے نیورو پروٹیکشن کو فروغ دینے کے لیے مائٹوفجی کو چلا سکتا ہے، نیورون سیلز میں خراب مائٹوکونڈریل فنکشن کو بحال کرتا ہے۔ مزید برآں، یہ GRP78-ثالثی نیورو پروٹیکشن PINK1 اور IP3R پر منحصر ہے۔ لہٰذا، GPR78 دیگر امیدواروں کے ساتھ جین تھراپی کے ذریعے فائن ٹیونڈ مائٹوفگی کو چالو کرنا، اعصابی نظام کی تکلیف دہ چوٹوں کے لیے ایک نئے علاج کے طریقہ کار کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ .

ضمنی مواد: درج ذیل آن لائن https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines9081039/s1 پر دستیاب ہیں۔ شکل S1: بایو انفارمیٹک تجزیہ۔ شکل S2: Tun علاج کے بعد Endogenous GRP78 کی سطح۔ شکل S3: Tun اور EFV NSC34 خلیوں میں mitochondrial dysfunction کا باعث بنتے ہیں۔ Figure S4: کوئی عنوان نہیں۔ شکل S5: shRNA نیوکلیوفیکشن کے بعد سیل کے قابل عمل تجزیہ ضمنی مواد میں پروٹومک تجزیہ میں پائے جانے والے تمام پروٹینوں کے ساتھ ٹیبل بھی شامل ہیں۔

مصنف کی شراکتیں: TL-R. اور DR-G. تجربات کو ڈیزائن اور انجام دیا، نتائج کا تجزیہ کیا، اور مخطوطہ کا کچھ حصہ لکھا۔ MH-G اور JF نے Vivo تجربات میں مدد کی۔ PM-G۔ اور جے ایم ایل نے مائٹوکونڈریل صاف کیا۔ ایم پی، سی بی، اور این اے نے مائٹوکونڈریا فنکشنل تجزیہ میں مدد کی۔ VP اور AB نے تمام GRP78 پلازمیڈ اور وائرل ویکٹر استعمال کیے ہیں۔ CC نے تمام تجربات کا تصور، ڈیزائن، نگرانی اور تجزیہ کیا اور مخطوطہ لکھا۔ تمام مصنفین نے مخطوطہ کے شائع شدہ ورژن کو پڑھا اور اس سے اتفاق کیا ہے۔

فنڈنگ: یہ کام بنیادی طور پر اسپین کے Ministrio de Economía y Competitividad (#SAF 2014-59701) اور Marató de TV3 (#201607.10) کے ذریعے تعاون کیا گیا تھا۔ ہم CIBERNED اور Generalitat de Catalunya کی مالی امداد کے لیے بھی شکر گزار ہیں۔ CB کارلوس III ہیلتھ انسٹی ٹیوٹ سے Miguel Servet کے معاہدے (CP19/00077) کا وصول کنندہ ہے۔

ادارہ جاتی نظرثانی بورڈ کا بیان: وہ تمام طریقہ کار جن میں جانور شامل تھے Universitat Autònoma de Barcelona اور Generalitat de Catalunya کی طرف سے منظور کیے گئے تھے اور یورپی کمیونٹی کونسل کی ہدایت 2010/63/EU کی پیروی کی گئی تھی۔

باخبر رضامندی کا بیان: قابل اطلاق نہیں ہے۔

ڈیٹا کی دستیابی کا بیان: اس مطالعہ کے دوران تیار کردہ یا تجزیہ کردہ تمام ڈیٹا اس شائع شدہ مضمون اور اس کی اضافی معلوماتی فائلوں میں شامل ہیں۔

اعترافات: ہم UAB میں مارٹا مونسیراٹ، اریادنا آرانسنز، میگوئل چیلن، جولیا لورینزو، سارہ مارمولیجو، اور نیوروپلاسٹیٹی اینڈ ریجنریشن گروپ کا شکریہ ادا کرتے ہیں۔ ہم کارلوس گیلم (یونیورسٹی کمپلیٹنس ڈی میڈرڈ) کا خصوصی شکریہ ادا کرتے ہیں کہ انہوں نے مہربانی سے پارک2-HAplasmid اور UAB میں ایلینا گیلیا اور ایستھر ڈالفو کو اینٹی باڈیز فراہم کیں۔

مفادات کے تصادم: مصنفین مفادات کے تصادم کا اعلان نہیں کرتے ہیں۔

خصوصی بیان: مصنفین کیٹی کاساس، ایک بااثر سائنسدان، اور ایک شاندار اور بہادر شخص کی یاد میں ایک خصوصی تذکرہ کرنا چاہتے ہیں، جو 54 سال کی عمر میں قبل از وقت انتقال کرگئیں۔ ان کا حصہ بانٹنا ایک اعزاز اور اعزاز کی بات ہے۔ زندگی، اس کی پیشہ ورانہ صلاحیت، اور اس کی اخلاقیات اور انسانی اقدار۔

حوالہ جات

1. کنفورٹی، ایل۔ گلی، جے؛ کولمین، ایم پی والیرین انحطاط: ایک ابھرتا ہوا ایکسن موت کا راستہ جو چوٹ اور بیماری کو جوڑتا ہے۔ Nat.Rev. نیوروسکی 2014، 15، 394–409۔ [کراس ریف]

2. رومیو گٹارٹ، ڈی۔ Forés, J.; Herrando-Grabulosa, M.; والز، آر. Leiva-Rodríguez, T.; Galea, E.; González-Pérez, F.; ناوارو، ایکس؛ پیٹگنیف، وی.؛ بوش، اے. وغیرہ مصنوعی ذہانت کا استعمال کرتے ہوئے اعصابی صدمے کے لیے نیورو پروٹیکٹو دوا کا انکشاف۔ سائنس Rep. 2018, 8,1879. [کراس ریف]

3. رومیو گٹارٹ، ڈی۔ Forés, J.; ناوارو، ایکس۔ Casas, C. نیورو ہیلن کے ذریعہ دوبارہ پیدا ہونے والی بحالی اور کم ہونے والی تنزلی شدہ پٹھوں کی ایٹروفی میں تاخیر سے دوبارہ لگانے کے ساتھ لمبر روٹ ایولشن کا پری کلینیکل ماڈل۔ سائنس Rep. 2017, 7, 12028. [CrossRef]

4. کاساس، C. Grp78 نیوروڈیجنریشن اور کینسر میں سٹیج کے مرکز میں۔ سامنے والا۔ نیوروسکی 2017، 11، 1-15۔ [کراس ریف]

5. ریڈی، آر کے؛ ماؤ، سی. بومیسٹر، پی. آسٹن، آر سی؛ کاف مین، آر جے؛ لی، AS Endoplasmic reticulum chaperone پروٹین GRP78 خلیات کو topoisomerase inhibitors کی طرف سے حوصلہ افزائی apoptosis سے بچاتا ہے۔ کیسپیس-7ایکٹیویشن کو دبانے میں ATP بائنڈنگ سائٹ کا کردار۔ J. Biol کیم 2003، 278، 20915–20924۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

6. وانگ، ایم؛ کافمین، آر جے پروٹین انسانی بیماری کے راستے کے طور پر اینڈوپلاسمک ریٹیکولم میں غلط فولڈنگ۔ فطرت 2016، 529,326–335۔ [کراس ریف] [پب میڈ] 7۔ Printsev, I.; کیوریل، ڈی. کیرا وے، اینڈوپلاسمک ریٹیکولم میں KL جھلی پروٹین کی مقدار کا کنٹرول۔ جے ممبر بائول 2016,250، 1–14۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

8. شو، سی-ڈبلیو؛ سورج، F.-C.؛ Cho, J.-H.; لن، C.-C.؛ لیو، پی ایف؛ چن، P.-Y.؛ چانگ، MD-T. فو، ایچ ڈبلیو؛ لائی، وائی کے۔ GRP78 اور Raf-1باہمی تعاون سے اینڈوپلاسمک ریٹیکولم اسٹریس انڈسڈ اپوپٹوسس کے خلاف مزاحمت فراہم کرتے ہیں۔ جے سیل فزیول 2008، 215، 627–635۔ [کراس ریف]

9. کک، KL؛ کلارک، R. ہیٹ شاک 70 kDa پروٹین 5/گلوکوز ریگولیٹڈ پروٹین 78 "AMP" آٹوفجی کو بڑھاتا ہے۔ آٹوفیجی 2012، 8,1827–1829۔ [کراس ریف]

10. لی، زیڈ. وانگ، وائی؛ نیوٹن، آئی پی؛ ژانگ، ایل. جی، پی. Li, Z. GRP78 IKK کے آٹوفیجک انحطاط کو فروغ دے کر ٹیومر ایروبک گلائکولائسز کی ماڈلن میں ملوث ہے۔ سیل سگنل 2015، 27، 1237–1245۔ [کراس ریف]

11. چا-مولسٹاد، ایچ. یو، جے ای؛ لی، ایس ایچ؛ کم، جے جی؛ سنگ، کے ایس؛ ہوانگ، جے؛ یو، وائی ڈی؛ لی، وائی جے؛ کم، ایس ٹی؛ لی، ڈی ایچ؛ وغیرہ اینڈوپلاسمک ریٹیکولم چیپیرون HSPA5/GRP78/BiP کے N-ٹرمینل ارجینیلیشن کے ذریعے SQSTM1/p62 سرگرمی کی ماڈیولیشن۔ آٹوفیجی 2016,12, 426–428۔ [کراس ریف]

12. چا-مولسٹاد، ایچ. سنگ، کے ایس؛ ہوانگ، جے؛ کم، کے اے؛ یو، جے ای؛ یو، وائی ڈی؛ جنگ، جے ایم؛ ہان، ڈی ایچ؛ مولسٹاد، ایم. کم، جے جی؛ et al.Amino-terminal arginylation p62 بائنڈنگ کے ذریعے آٹوفجی کے لیے اینڈوپلاسمک ریٹیکولم چیپیرون BiP کو ہدف بناتا ہے۔ نیٹ Cell Biol.2015, 17, 917–929. [کراس ریف] [پب میڈ]

For more information:1950477648nn@gmail.com