گردے کی پتھری کی تشکیل کو کیسے روکا جائے اور کم کیا جائے؟

مزید information:ali.ma@wecistanche.com

حصہ دوم.:P ہوسفیٹیڈلسبرائن ایورژن جو گردے کی پتھری کی تشکیل کے ابتدائی مرحلے میں ٹی جی ایف-β1/سمیڈ سگنلنگ کے ذریعہ فعال فاسفولیپڈ اسکرمبلاس کے ذریعہ منظم کیا جاتا ہے

ژیو گوو گان1 · ہے تاؤ ژو1 · ژی ہاؤ وانگ

مزید information:ali.ma@wecistanche.com

تعارف

یورولیتھیاسس انسانوں کو متاثر کرنے والی سب سے عام بیماریوں میں سے ایک ہے اور متعدد پیشاب کی پیچیدگیوں سے وابستہ ہے [1]۔ کیلشیم آکسلیٹ (کیو ایکس) مبینہ طور پر ثقافتی گردے کے ٹیوبلر خلیات کو زخمی کرتا ہے، جس کے بعد خلیات کی جھلی فاسفیٹیڈلسرین (پی ایس) اندرونی پرت سے بیرونی پرت ان ویٹرو میں اہم کردار ادا کرنے کے لئے پلٹ جاتی ہےگردے کی پتھریتشکیل [2] . اسی طرح کے نتائج خلوی سطح پر کیے گئے مختلف مطالعات [3-6] کے ذریعہ رپورٹ کیے گئے ہیں۔ تاہم، کیو کس ثالثی کے نقصان کی وجہ سے گردے کے ٹیوبول خلیوں میں پی ایس خارجیت کا بنیادی طریقہ کار ابھی تک واضح نہیں ہے۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلا ہے کہ کیلشیم آکسلیٹ کی زیادہ ارتکاز رد عمل آکسیجن کی اقسام (آر او ایس)[7] کی زیادہ پیداوار کا باعث بنتا ہے، جو بعد میں گردے کے ٹیوبول خلیوں میں پی ایس خارجیت میں حصہ ڈالتا ہے جس کے نتیجے میں مرکزے اور کیوکس کرسٹل کی نشوونما ہوتی ہے [8]۔ آر او ایس اور لپیڈ پیروکسیڈیشن فاسفولیپڈ اسکرمبلاس (پی ایل ایس سی آر)[9] کو مضبوطی سے فعال کرتے ہیں، جبکہ آر او ایس صفائی کرنے والوں، جیسے گلوٹاتھیون، کوانزائم کیو 10، یا آئیڈیبینون (ایک مصنوعی کواینزائم کیو 10 ہومولوگ) کی نمائش پولی سسٹک گردے کی بیماری [10] میں پی ایل ایس سی آر کی فعالیت کو کم کرتی ہے۔ پی ایل ایس سی آر، جو خلیات کی جھلی [11] پر لنگر انداز ہوتا ہے، ان تین فاسفولیپڈ فلپنگ انزائمز میں سے ایک کے طور پر کام کرتا ہے جو ارتکاز گریڈینٹ کے ساتھ جھلی کے دونوں اطراف پی ایس کی تیز رفتار دو طرفہ حرکت کو ترغیب دینے کی صلاحیت رکھتا ہے [12]۔ جسمانی حالات میں خلیات کی جھلی غیر متناسب حالت میں ہوتی ہے اور پی ایل ایس سی آر کا جھلی پر کوئی اثر نہیں ہوتا [13]۔ تاہم یوکیریوٹک خلیات کی چوٹ کے بعد پی ایل ایس سی آر فعال ہو جاتا ہے اور پی ایس کو اندرونی سے بیرونی پرت میں منتقل کرتا ہے[14,15]. مزید برآں، پی ایل ایس سی آر آئی این چینی ہیمسٹر بیضہ دانی کے 1 خلیوں کا زیادہ اظہار مبینہ طور پر پی ایس خارجیت کو متحرک کرتا ہے، اپوپٹوسس [16] کے دوران خلیات کی سطح پر پی ایس کی ظاہری نقل و حرکت کو بڑھاتا ہے۔ اس لئے، ہم نے تصور کیا کہ پی ایل ایس سی آر آر او ایس کی فعالیت کے ذریعے گردے کے ٹبول سیل جھلی میں پی ایس خارجیت میں بھی شامل ہے۔

آکسلیٹ سے متاثرہ آر او ایس کی پیداوار کا ایک ممکنہ سالماتی طریقہ کار ٹی جی ایف-β1/سمیڈ سگنلنگ کی شمولیت کے ذریعے ہوتا ہے، جو آر او ایس [17,18] کی پیداوار میں کردار ادا کر سکتا ہے۔ درحقیقت ٹی جی ایف-β1/ سمیڈ سگنلنگ مبینہ طور پر گردے کی متعدد بیماریوں میں ملوث ہے، جیسے کہ گلومیرولونفریٹس، گردے کی بین السطور فائبروسس، اور نیفرولیتھیاسس[19]۔ مزید برآں، ٹی جی ایف β1 کے ساتھ علاج کیے جانے والے مونو نیوکلیئر خلیات اندرونی سے بیرونی پرت تک پی ایس کی فلپ پنگ کا سبب بن کر خلیات کی جھلی میں پی ایسایکسٹرنلائزیشن کی نمائش کرتے ہیں [20]۔ تاہم، ہماری معلومات کے مطابق، ٹی جی ایف-β1/سمیڈ سگنلنگ اور گردے کے ٹبول خلیات کی جھلیوں میں پی سیورژن کے درمیان تعلق ابھی تک نامعلوم ہے۔ ہم نے تصور کیا کہ ٹی جی ایف β1 چوہے کے ابتدائی مرحلے میں پی ایل ایس سی آر کو فعال کرکے گردے کے ٹیوبول سیل جھلیوں میں پی ایس نفرت میں حصہ لیتی ہےگردے کی پتھریتشکیل آر او ایس کی طرف سے ثالثی.

لہذا، ہم نے تحقیقات کی کہ کیا ٹی جی ایف-β1/سمیڈ سگنلنگ آر او ایس ایکٹیویشن کے ذریعے پی ایس ایکسٹرونائزیشن کو متحرک کرتی ہے اور کیا ٹی جی ایف ابتدائی مرحلے کے دوران گردے کے ٹیوبول سیل جھلی میں پی ایل ایس سی آر کو فعال کرتا ہےگردے کی پتھریان ویٹرو اور ان ویوو میں ترقی، اس طرح کی ایٹیولوجی کے لئے ایک نظریاتی بنیاد رکھیگردے کی پتھریتاليف.

گردے کی بیماری کے لئے سیستانچے ڈی ایچ ٹی پر کلک کریں

مواد اور طریقے

ابتدائی مرحلے کے کیو ایکس گردے کی پتھری کی تشکیل کا چوہا ماڈل

ہاربن میڈیکل یونیورسٹی کے تجرباتی جانوروں کے مرکز کی طرف سے 200±20 گرام وزنی ساٹھ صاف ستھرے 3 ماہ کے نر وسٹار چوہے فراہم کیے گئے تھے اور انہیں کمرے کے درجہ حرارت (22°سینٹی ±2°سینٹی) اور 50-70 فیصد نمی پر رکھا گیا تھا۔ 3 دن کی موافق افزائش نسل کے بعد، انہیں بے ترتیب طور پر تین گروپوں (20 چوہوں/گروپ) میں تقسیم کیا گیا—کنٹرول،گردے کی پتھریاورگردے کی پتھری+ایس بی 431542 (ایک ٹی جی ایف-β1/ سمیڈ سگنلنگ پاتھ وے انہیبیٹر)۔

گردے کی پتھریتشکیل کا آغاز گردے کے ٹیوبلر خلیات کی چوٹ [21,22] کے بعد ابتدائی پیتھالوجیکل تبدیلی کے طور پر کیا جاتا ہے۔ چوٹ کے اس عمل کا مطالعہ کرنے کے لئے، ابتدائی مرحلے کا چوہا ماڈلگردے کی پتھریتشکیل قائم کی گئی تھی، کیونکہ ابھی تک ایک معیاری نقطہ نظر کی اطلاع نہیں دی گئی ہے۔ گردے کے ٹیوبلر خلیات کی چوٹ کے بعد ابتدائی تبدیلیوں کا مشاہدہ کرنے کے لیے ہم نے لیٹ ال کی رپورٹ کردہ طریقہ کار کا اطلاق کیا۔ [23]۔ مختصر اختصار کے ساتھ کنٹرول گروپ کے چوہوں کو زبانی گیوج کے ذریعے روزانہ 2 ملین میٹر ڈسٹلڈ پانی دیا جاتا تھا جبکہ چوہوں کو اس میں شامل کیا جاتا تھا۔گردے کی پتھریگروپ کو زبانی گاویج کے ذریعے روزانہ 2 ملین ایم ایل 1 فیصد ایتھیلین گلیکول حل اور 1 فیصد این ایچ سی ایل حل دیا گیا۔ چوہوں میںگردے کی پتھری+ایس بی 431542 گروپ کو انٹراپیریٹونیلی طور پر ایس بی 431542 کو-سالوینٹ (5 ملی گرام/کلوگرام، ایس 1067) کے ساتھ انجکشن لگایا گیا؛ سیلکیکیم، شنگھائی، چین)ہر 7 دن [24]. خوراک اور پانی اشتہاری لیبیٹم فراہم کیا گیا تھا۔ 14 ویں دن چوہوں کو اینستھیٹک اوورڈوز (پینٹوباربٹل سوڈیم، 200 ملی گرام فی کلو گرام، انٹراپیریٹونیئل انجکشن کے ذریعے) سے ایتھونیز کیا گیا اور ان کے گردوں کو ایکسائز کیا گیا۔ بعد میں پروٹین کا پتہ لگانے کے لئے بائیں گردوں کو فوری طور پر مائع نائٹروجن میں محفوظ کیا گیا تھا۔ دائیں گردے ٹھیک کیے گئے تھے، اور پھر پانی کی کمی اور پیرافین موم میں شامل کیا گیا تھا۔ لیبارٹری جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کے لئے نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ گائیڈ کے مطابق جانوروں کے تمام مطالعے کیے گئے۔ تجرباتی طریقہ کار کو ہاربن میڈیکل یونیورسٹی کے پہلے ملحقہ اسپتال (منظوری نمبر:2020005، ہاربن، چین) کی جانوروں کے تجربے کے استعمال کی اخلاقیات کمیٹی نے منظوری دی۔

گردے کے ٹشو میں کرسٹل کی تشکیل

ٹشو کے نمونے پیزولاٹو طریقہ [23] کا استعمال کرتے ہوئے داغدار تھے اور کیوکس کرسٹل ایک پولرائزڈ لائٹ آپٹیکل مائیکرواسکوپ (سینیکو آپٹیکل انسٹرومنٹ کمپنی، شینزن، چین) کے تحت مشاہدہ کیا گیا تھا۔ پیزولاٹو مثبت علاقوں کی پیمائش کی گئی اور ان کا اظہار امیج جے 1.49وی (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے کراس سیکشنز کے کل ٹشو ایریا کی پرمل عمروں کے طور پر کیا گیا۔

ویوو میں رینل ٹیوبلر سیل جھلی میں پی ایس کا پتہ لگانا بلحاظ فلو سائٹومیٹری

رینل ایپیتھیلیئل سیل پی ایس ایکسپوزر کا جائزہ فلوریسین آئسوتھیوکینیٹ (ایف آئی ٹی سی) لیبل والے اینیکسین وی سٹیننگ اسی کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا [2]۔ خلیوں کا مشاہدہ (ہر گروپ میں) ایک کنفوکل لیزر مائیکرواسکوپ (اولمپس، ٹوکیو، جاپان) کے تحت کیا گیا۔ پی ایس خارجیت کی مقدار کا تعین ضمیمہ وی مثبت خلیوں کے فیصد کے طور پر کیا گیا تھا۔ نمونوں کے ضمیمہ وی فلوریسینس کی پیمائش فلو سائٹومیٹر (488 این ایم ایکسٹیشن/530 این ایم اخراج) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی؛ بیک مین کولٹر، بری، سی اے، امریکہ).

مغربی بلوٹنگ کے ذریعہ گردے کے ٹیوبلر خلیہ جھلی میں ٹی جی ایف-β1 اور سمیڈ7 کی سطح کی پیمائش

منجمد ٹشو کے نمونوں کی بحالی کے بعد، پروٹین قدرتی جھلی پروٹین نکالنے کی کٹ پروٹیو ایکسٹریکٹ (ایم پی ای کے) (ایم آر اے سی کمپنی، کینیلورتھ، این جے، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا، اور پروٹین ارتکاز کا تعین مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق بائیو راڈ پروٹین اسی کٹ (ہرکولیس، سی اے، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، 40یو جی پروٹین کو 8 فیصد ایس ڈی ایس-پولیایکرائلامائڈ جیل (اسٹیکنگ جیل 100 وی، حل کرنے والے جیل 200 وی) پر 300ایم اے کے الیکٹروڈ مستقل کرنٹ پر 1ایچ کے لئے لوڈ کیا گیا تھا۔ جیل میں موجود پروٹین کو نائٹروسیلولوز جھلی (کیکسنگ کمپنی، بیجنگ، چین) پر منتقل کیا گیا، جو 37° سن 5 فیصد سکیم دودھ پاؤڈر پر 1 ایچ کے لئے بلاک کیا گیا تھا، اور راتوں رات 4 °سی سی پر بھیڑ مخالف چوہے TGFβ1 (اے بی 208466) کے ساتھ انکوبیٹ کیا گیا تھا؛ ابکام، کیمبرج، برطانیہ) اور سمیڈ7 (66,478؛ پروٹین ٹیک، ووہان، چین) اینٹی باڈیز [25]. ہارس ریڈش پیروکسیڈیس لیبل والا خرگوش اینٹی بھیڑ سیکنڈری اینٹی باڈی شامل کیا گیا تھا (1:400؛ ناکاسوگی جنکیاو کمپنی، بیجنگ، چین) اور 1 ایچ کے عوض 37° سی پر انکیوبیٹ کیا۔ سگنل کا پتہ بڑھے ہوئے کیملامائنسینس ری ایجنٹ (ابکام) کا استعمال کرتے ہوئے لگایا گیا تھا۔ جیل پرو 4.0 جیل آپٹیکل کثافت تجزیہ سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے مثبت بینڈز کا تجزیہ کیا گیا، اور مجموعی آپٹیکل کثافت (آئی او ڈی ویلیو) کی پیمائش کی گئی، جس میں آر ویلیو نسبتی پروٹین مواد کی نمائندگی کرتی ہے: آر=حوالہ پی ایل ایس سی آر (ہدف)/حوالہ جی اے پی ڈی ایچ (حوالہ پروٹین) کی آئی او ڈی قدر کا حوالہ دیتا ہے۔

سیل کلچر اور آر این اے مداخلت

ایک گردے کی ایپیتھیلیئل سیل لائن (ایم ڈی سی کے خلیات، سی سی ایل 34، اقتباسات 53-90؛ اے ٹی سی سی، ماناساس، وی اے، امریکہ) ڈلبیکو کے ترمیم شدہ ایگل میڈیم میں اگائی گئی جس میں اینٹی بائیوٹکس (100 یو/ایم ایل پینسلین، 100 ملی گرام/ایم ایل اسٹریپٹومائیسن) شامل ہیں؛ لائف ٹیکنالوجیز، کارلس آباد، سی اے، امریکہ) اور 10 فیصد فیٹل بووائن سیرم (لائف ٹیکنالوجیز کمپنی) 37 °سن 5 فیصد سی او، ماحول اور 0.25 فیصد ٹرپسن اور 1 ایم ایتھیلینڈیامائنٹیٹرااسیٹک ایسڈ (لائف ٹیکنالوجیز کمپنی، سی اے، امریکہ) کے ساتھ ذیلی ثقافت۔ خلیوں کا علاج کیو ایکس (0.5 میٹر) سے کیا گیا؛ سگما الڈرچ، سینٹ لوئس، ایم او، امریکہ) 2 ایچ کے لئے اور 0.5 ایم کیو ایکس اور 100 μg/ایم ایل کے ساتھ اینٹی ٹی جی ایف β1 اینٹی باڈی (آر ڈی سسٹمز، منیاپولس، ایم این، امریکہ) کو 2 ایچ کے لئے بے اثر کر رہا ہے۔ تمام تجربات ٹرپلیکیٹ میں کیے گئے۔

پی ایل ایس سی آر این پی ایس ایورژن کے کردار کا تعین کرنے کے لئے، گردے کے ٹیوبلر ایپیتھیلیئل خلیات پی ایل ایس سی آر ایس آئی آر این اے [26] سے متاثر ہوئے۔ سی آر این اے کو انہوئی جنرل بائیولوجیکل سسٹم (انہوئی، چین؛ دیکھیں ٹیبل 1) نے ڈیزائن اور سنتھیسائز کیا تھا۔ لیپوفیکٹامین ٹی ایم 2000 (سن شائن بائیو ٹیکنالوجی کمپنی، لمیٹڈ، شنگھائی، چین) کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق ٹرانسفیکشن کے لیے استعمال کیا گیا۔ 24 گھنٹہ ٹرانسفیکشن کے بعد، خلیات ٹرائیپسن کے ساتھ ہضم ہو گئے، 1000 پر سنٹرفیوز× گرام 5 منٹ کے لئے، پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھویا گیا اور دوبارہ سنٹرفیوز کیا گیا۔ سپرناٹنٹ کو مسترد کر دیا گیا اور پی بی ایس میں پیلٹ کو معطل کر دیا گیا تاکہ کثافت 1×10° خلیات/ایم ایل کی سنگل سیل معطلی ہو سکے۔ ایف اے ایم (کاربوکسی فلوریسن) اظہار کی مثبت شرح 93٪±5٪تھی جیسا کہ بہاؤ سائٹومیٹری کے ذریعہ طے کیا گیا تھا۔ TGFβ1 اور پی ایل ایس سی آر کے درمیان تعلقات کا مزید جائزہ لینے کے لئے خلیوں کا علاج 0.5 میٹر کیو ایکس یا 10 این جی/ایم ایل ٹی جی ایف β1 سے 2 گھنٹے تک کیا گیا اور اس کے بعد پی ایل ایس سی آر ایس آئی آر این اے سے متاثر کیا گیا۔

مغربی بلٹنگ کے ذریعہ گردے کے ٹیوبلر خلیات کی جھلیوں میں پی ایل ایس سی آر کی سطح کی پیمائش

پروٹین ایک قدرتی جھلی پروٹین نکالنے کی کٹ پروٹیو ایکسٹریکٹ (کیمیکل بک کمپنی، بیجنگ، چین) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا، اور پروٹین ارتکاز کا تعین بائیو راڈ پروٹین اسسی کٹ (نوبل رائیڈر کمپنی، بیجنگ، چین) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ اس کے بعد 40 یو جی پروٹین 8 فیصد ایس ڈی ایس پولیاکریالامیڈ جیل (اسٹیکنگ جیل 100 وی، حل کرنے والے جیل 200 وی) پر 300 ایم اے کے مستقل کرنٹ پر 1 ایچ کے لئے لوڈ کیا گیا۔ جیل میں پروٹین کو نائٹروسیلولوز جھلی (کیکسنگ کمپنی، شینزن، چین) پر منتقل کیا گیا اور 37 سی پر 1 ایچ کے لئے 5 فیصد سکیم دودھ کے ساتھ بلاک کیا گیا اور راتوں رات 4° سی پر بھیڑ مخالف چوہا پی ایل ایس سی آر مونوکلونل اینٹی باڈی (1:200، پی اے بی 781ہواو1) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا؛ ابکام، گوانگ ژو، چین) . اس کے بعد ہارس ریڈش پیروکسیڈسے لیبل والے خرگوش اینٹی شیپ سیکنڈری اینٹی باڈی کا اضافہ کیا گیا (1:400) اور اس آمیزے کو 37°سی سی فار ایل ایچ پر انکوبیٹ کیا گیا۔ جھلی دھونے کے بعد سگنل کا پتہ ایک بڑھے ہوئے کیملاومینسینس ری ایجنٹ (ابکام، گوانگ ژاؤ، چین) سے ملا۔ جیل پرو 4.0گیل آپٹیکل کثافت تجزیہ سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے مثبت بینڈز کا تجزیہ کیا گیا، اور آئی او ڈی ویلیو کی پیمائش کی گئی، جس میں آر ویلیو نسبتی پروٹین مواد کی نمائندگی کرتی ہے جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔

پی ایل ایس سی آر کے لئے جدول 1 سی آر این اے ترتیبات

جھلی فاسفیٹیڈلیرین تقسیم کی پیمائش

خلیات کی جھلی پی ایس کی نفرت کی مقدار کا تعین کم ایٹ ال[27] اور ہماری تحقیقی ٹیم [2] کی طرف سے بیان کردہ فلوریسینس کیوننگ طریقہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، جس میں نائٹروبینزین-2-آکسا-1,3-ڈیازول (این بی ڈی، شنگھائی، چین) فلوریسینس پروب کے طور پر شامل تھے۔ خلیات کی جھلی کی بیرونی پرت میں پی ایس کو این بی ڈی کے ساتھ لیبل لگانے کے بعد، خلیوں کو پی بی ایس میں 5 ایم ڈیسوپروپیئلفلوروفاسفیٹ پر مشتمل ثقافت کیا گیا تھا۔ اس کے بعد کیلشیم آکسلیٹ (1.0 میٹر) پر مشتمل پی بی ایس کا اضافہ کیا گیا اور خلیوں کو 37° سینٹی میٹر پر انکوبیٹ کیا گیا۔ سیل کی معطلی کی یکساں مقدار ہر 10 منٹ میں خارج کی جاتی تھی اور فلوریسینس کی شدت آر ایف 5000 اسپیکٹروفلورومیٹر (شیماڈزو، کیوٹو، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے ریکارڈ کی گئی تھی۔ اسپیکٹروفلورومیٹر کی ترتیبات درج ذیل تھیں: 530 این ایم کے اخراج طول موج کے لئے 10 این ایم سلیٹ چوڑائی؛ اور 470 این ایم کے ایکسٹیشن طول موج کے لئے 5 این ایم سلیٹ چوڑائی۔ اس کے بعد 50 کی دہائی میں اوسط فلوریسینس ویلیو (ایف ٹی) ریکارڈ کی گئی۔ سیل کی بیرونی پرت سے این بی ڈی فلوریسینس کو بجھانے کے لئے ڈیتھیونائٹ حل استعمال کرنے کے بعد اوسط کم فلوریسینس کی شدت (ایف ڈی) بھی ریکارڈ کی گئی۔ اس کے بعد خلیہ جھلی کو پرمیبیلیائز کرنے کے لیے ٹرائیٹن ایکس 100 شامل کیا گیا۔ اس کے بعد خلیات کی جھلی کی اندرونی پرت سے این بی ڈی فلوریسینس کو بجھایا گیا اور فلوریسینس کی شدت (ایف او) ریکارڈ کی گئی۔ اندرونی لوبلز میں این بی ڈی پی ایس کے فیصد کا حساب بعد میں مندرجہ ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا: اندرونی این بی ڈی پی ایس=100×[(ایف ڈی-ایف او)/(ایف ٹی-ایف او)] کی فیصد عمر۔

پی ایس خارجیت کے فیصد کا تعین این بی ڈی پی ایس انٹرنلائزیشن کی پیمائش کے لئے استعمال ہونے والے اصول کے مطابق کیا گیا تھا۔ بیرونی لوبلز میں این بی ڈی پی ایس کے فیصد کا حساب بھی مندرجہ ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا: بیرونی لوبلز میں این بی ڈی پی ایس کا فیصد=100×[(ایف ٹی ایف ڈی)/(ایف ٹی-ایف او)]۔

شماریاتی تجزیہ

مسلسل متغیرات کو گھٹیا± معیاری انحراف کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ ایک غیر پیرامیٹرک جوڑا رینک سم ٹیسٹ، ٹی ٹیسٹ، اور چی اسکوائر ٹیسٹ استعمال کیا گیا تھا. تمام تجزیے ایس پی ایس ایس سافٹ ویئر 19.0 (ایس پی ایس ایس، انک، شکاگو، آئی ایل، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔ نتائج مع پی<0.05 were="" considered="" statistically="">

نتائج

ٹی جی ایف β1/ سمیڈ سگنلنگ ویوو میں پی ایس ایکسٹرنلائزیشن کو متحرک کرتی ہے

چوہے کے ماڈل کے گردے کے ٹشو میں کرسٹل کی تشکیل

ابتدائی مرحلے کا چوہے کا نمونہ قائم کرناگردے کی پتھریتشکیل، ایتھیلین گلیکول اور امونیم کلورائڈ کو 2 ہفتوں تک چوہوں کے پیٹ میں دیا گیا اور پھر گردے کے ہر حصے کا ڈیجیٹل مائیکرواسکوپ سے معائنہ کیا گیا۔ کنٹرول گروپ کے نمونوں میں عام گردے کے نلی دار ڈھانچے 14 دن (انجیر.1 اے) پر کرسٹل کی تشکیل کے بغیر دیکھے گئے تھے۔ جب گردے کے ٹشو سےگردے کی پتھریگروپ کو مائیکرواسکوپی کے ذریعہ مشاہدہ کیا گیا تھا، گردے کے ٹیوبلز نظر آنے والے مائیکرو کرسٹل سے پھیلے ہوئے نظر آئے؛ کبھی کبھار کچھ گردے کے ٹیوبلز میں کیوکس کرسٹل کا جمع ہونا دیکھا گیا، جو ابتدائی مرحلے کے چوہوں کے ماڈل کے کامیاب قیام کی نشاندہی کرتا ہےگردے کی پتھریتشکیل اور گردے کے ٹبول خلیات کی چوٹ کی نسل.

گردے کے نلی خلیہ جھلی میں پی ایس کی موجودگی

ضمیمہ وی ایف آئی ٹی سی، ایک فلوریسنٹ مالیکیول جو خلیات کی سطح پر پی ایس سے بندھتا ہے، وسیع پیمانے پر پی ایس کی دوبارہ تقسیم کا پتہ لگانے کے لئے استعمال کیا جاتا ہے۔ ہمارے مطالعے میں، عام کنٹرول میں ایم ڈی سی کے خلیات،گردے کی پتھریاورگردے کی پتھری+ایس بی 431542 گروپوں کو ایک کنفوکل لیزر مائیکرواسکوپ (انجیر.1 بی) کے تحت دیکھا گیا۔ پی ایس سے نفرت کی شرح میں اضافہگردے کی پتھریگروپ اس کے مقابلے میں کنٹرول گروپ میں(P)<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">گردے کی پتھری+ایس بی 431542 گروپ نے پی ایس کی خارجیت کی سطح پی ایس کی نسبت کم بیسل سطح ظاہر کیگردہپتھرگروہ (پ)<0.05, fig.="" 1c,="">

ٹی جی ایف β1 اور سمیڈ7 کی سطحوں کی پیمائش

ٹی جی ایف β1 سطح میںگردے کی پتھریگروہ کو مغربی بلوٹنگ سے متعین کیا گیا تھا۔ ایک عام مغربی دھبہ انجیر.2 اے میں ٹی جی ایف β1 سطح کے کثافت تجزیے کے ساتھ دکھایا گیا ہے۔ کنٹرول کے لوگوں کے لئے اقدار کو معمول پر لایا گیا اور ٹی جی ایف β1 اور ٹیوبلین کے تناسب کے طور پر ظاہر کیا گیا۔ ایتھیلین گلیکول اور این ایچ سی ایل کے اضافے سے ٹی جی ایف β1 کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا اور کنٹرول سیلز (انجیر.2 اے) کے مقابلے میں سمیڈ7 کی سطح میں کمی واقع ہوئی؛ تاہم ایس بی 431542+ایتھیلین گلیکول اور این ایچ کالڈ کے ساتھ علاج سے ٹی جی ایف β1 کی سطح میں نمایاں کمی آئی اور ایس ایم اے ڈی 7 کی سطح میں اضافہ ہوا جبکہ ایستھیلین گلیکول اور این ایچ، سی ایل کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں میں اضافہ ہوا۔

ٹی جی ایف ان ویٹرو میں گردے کے ٹبول سیل جھلی میں پی ایل ایس سی آر سرگرمی کو فعال کرتا ہے

پی ایل ایس سی آر

پی ایل ایس سی آر کی سطح کا جائزہ مغربی بلاٹنگ کے ذریعہ لیا گیا تھا۔ خلیوں کا علاج 2 ایچ کے لئے کیو کس کے ساتھ کیا گیا تھا۔ کنٹرول سیلوں میں پی ایل ایس سی آر کی سطح نہ ہونے کے برابر تھی لیکن سی او ایکس گروپ (پی) میں نمایاں اضافہ ہوا۔<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

کمزور این بی ڈی پی ایس اندرونی نقل و حرکت

ہم نے پی ایل ایس سی آر سرگرمی کا جائزہ لینے کے لئے گردے کے ٹیوبلر ایپیتھیلیئل سیل جھلی میں پی ایس کی اندرونی اور ظاہری حرکات کا تعین کیا۔ اس بات کا جائزہ لینے کے لئے کہ آیا پی ایل ایس سی آر بیرونی پرچے سے پلازما جھلی کے اندرونی پرچے تک پی ایس کی نقل و حرکت کو متاثر کرتا ہے، ہم نے فلوریسنٹ لیبل والے پی ایس (این بی ڈی پی ایس) کو پلازما جھلی کے بیرونی پرچے میں ضم کیا اور اس کی داخلیت (انجیر.3) کی نگرانی کی۔ کنٹرول اور سی اے او ایکس گروپوں میں ایم ڈی سی کے سیلز کے ذریعہ داخل کردہ این بی ڈی پی ایس کی مقدار بالترتیب تقریبا 46.2 فیصد اور 17.8 فیصد تھی۔ لہذا، کیو ایکس گروپ سیلز میں پی ایس انٹرنلائزیشن کی شرح کنٹرول گروپ سیلز (پی) کے مقابلے میں کافی کم تھی۔<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

انجیر۔ 1 کرسٹل فارمیشن اور پی ایس ایکسٹرنلائزیشن کنٹرول، گردے کی پتھری اور گردے کی پتھری+ایس بی 431542 گروپوں میں دیکھی گئی۔

(اے) 14 دن گردے کے ٹشو میں کرسٹل کی تشکیل؛ تیر مائیکرو کرسٹل ساختوں کی نشاندہی کرتا ہے۔ (بی) ایم ڈی سی کے خلیات کو کنفوکل لیزر مائیکرواسکوپی کے ذریعے دیکھا گیا۔

(ج) نفرت کی شرح کے فلو سائٹومیٹرک پلاٹ۔ (د) نفرت کی شرح (٪) مثلث سے پتہ چلتا ہے کہ پی<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">گردے کی پتھریگروپ

این بی ڈی پی ایس ظاہری نقل و حرکت میں اضافہ

یہ تعین کرنے کے لئے کہ آیا پی ایس بیرونی نقل و حمل آکسلیٹ سے متاثر ہے، ایم ڈی سی کے خلیوں پر این بی ڈی پی ایس کا انٹرا سیلولر لیبل لگا ہوا تھا اور مثالوں کے طور پر مائیک لیفلٹ تک اس کی نقل و حرکت کی حد کا تعین کیا گیا تھا۔ انکیوبیشن میڈیم میں بووائن سیرم البومین (1 فیصد ڈبلیو/وی) تھا، جس نے تیزی سے سطح پر ظاہر ہونے والے این بی ڈی پی ایس کو نکالا۔ این بی ڈی پی ایس کا تقریبا 34.5 فیصد کنٹرول سیلوں میں بیرونی لیفلٹ میں منتقل ہوا جبکہ کیو ایکس گروپ سیلز میں آؤٹ ورڈ پی ایس ٹرانسفر کی شرح کو مجموعی اندرونی لیبل والے این بی ڈی پی ایس کے مقابلے میں 75.3 فیصد تک بڑھا دیا گیا جو کنٹرول گروپ سیلوں (پی) میں اس سے کافی زیادہ تھا۔<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

کنٹرول میں انجیر.2 ٹی جی ایف-β1/سمیڈ اظہار کنٹرول، گردے کی پتھری، اور گردے کی پتھری+ایس بی 431542 گروپس، اور گردے کے ٹبول سیل جھلی میں پی ایل ایس سی آر اظہار.

(الف) ٹی جی ایف-β1/ سمیڈ اظہار. (بی) رشتہ دار فاسفولیپڈ اسکلرامبلاس (پی ایل ایس سی آر) کی سطح اور نمائندہ دھبہ جس کا اظہار جی اے پی ڈی ایچ کے لئے معمول پر لایا گیا ہے۔ P<>

مثلث سے پتہ چلتا ہے کہ پی<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

حصہ دوم کے لیے یہاں کلک کریں۔