وٹرو میں پودے کے معاون کے طور پر Cistanche Deserticola سے پانی نکالنے کے قابل پولی سیکرائڈز کی مدافعتی سرگرمی

مزید معلومات کے لیے:ali.ma@wecistanche.com

ایلین ژانگ، زیومی یانگ، کوانشیاؤ لی، یو یانگ، گان ژاؤ، بن وانگ، داوچینگ وو

1 سنکیانگ کلیدی لیب آف حیاتیاتی وسائل اور جینیاتی انجینئرنگ، کالج آف لائف سائنس اینڈ ٹیکنالوجی، سنکیانگ یونیورسٹی، ارومچی، سنکیانگ، چین،

2 کلیدی لیب آف میڈیکل مالیکیولر وائرولوجی، اسکول آف بیسک میڈیکل سائنس، شنگھائی میڈیکل کالج، فوڈان یونیورسٹی، شنگھائی، چین،

3 کالج آف لائف سائنس اینڈ ٹیکنالوجی، ژیان جیاؤتونگ یونیورسٹی، ژیان، شانسی، چین

خلاصہ

جدید ویکسین میں ایک محفوظ اور موثر ویکسین کا معاون ضروری ہے۔ مختلف چینیجڑی بوٹیوں والی پولی سیکرائڈزمدافعتی نظام کو چالو کر سکتے ہیں.Cistanche deserticola(CD) ایک روایتی چینی جڑی بوٹی ہے اور ایک ضمنی امیدوار ہے۔ یہاں، ہم نے اس کی تصدیق کی۔پانی نکالنے کے قابل پولی سیکرائڈزCD (WPCD) کا وٹرو اور vivo میں مدافعتی ردعمل کو تبدیل کر سکتا ہے۔ خوراک پر منحصر انداز میں، WPCD نے MHC کے اظہار کی سطح کو اپ-ریگولیٹ کرنے کے ذریعے مورائن میرو سے حاصل شدہ ڈینڈرٹک سیلز (BM-DCs) کی پختگی اور کام کو نمایاں طور پر فروغ دیا۔ -II، CD86، CD80، اور CD40، allogeneic T سیل کا پھیلاؤ، اور IL-12اور TNF- کی پیداوار ٹول نما رسیپٹر4 (TLR4) کے ذریعے، جیسا کہ وٹرو تجربات سے ظاہر ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ چوہوں میں بھی اس کی مدافعتی سرگرمی دیکھی گئی۔ WPCD نے مؤثر طریقے سے IgG، IgG1، اور IgG2a کے ٹائٹرز کو بہتر بنایا اور T اور B خلیوں کے پھیلاؤ، CD4 پلس T خلیوں میں IFN- اور IL-4 کی پیداوار، اور CD8 میں IFN- کے اظہار کی سطح کو نمایاں طور پر بڑھایا۔ پلس ٹی سیلز پھٹکڑی سے بہتر ہیں۔ مزید برآں، WPCD تلی میں DCs پر CD40 اور CD80 کے اظہار کی سطح کو واضح طور پر اپ ریگولیٹ کر سکتا ہے اور Treg فریکوئنسی کو نیچے سے منظم کر سکتا ہے۔ مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ Cistanche deserticola کے پولی سیکرائڈز TLR4 سگنلنگ پاتھ وے کے ذریعے DCs کو فعال کر کے مزاحیہ استثنیٰ اور سیلولر امیونٹی دونوں کو حاصل کرنے کے لیے ایک محفوظ اور موثر ویکسین کے معاون ہیں۔

Cistanche اسٹیم مصنوعات پر کلک کریں۔

تعارف

بیماریوں کو کنٹرول کرنے یا روکنے کے لیے ویکسین اہم ہیں۔ نئی تیار کردہ اور موجودہ ترقی پذیر ویکسین انتہائی صاف شدہ ریکومبینینٹ ہیں۔اینٹیجنزاعلی حفاظت کے ساتھ، لیکن صاف شدہ اینٹیجنز اطمینان بخش حوصلہ افزائی نہیں کر سکتے ہیںمدافعتی جوابکم یا غیر فعال پیتھوجین تیاریوں کے مقابلے میں۔ معاونین کی مدد سے، ویکسین مسلسل آمادہ کر سکتے ہیںمدافعتی ردعمل[1,2]۔ ویکسین کی نشوونما اور انسانی صحت دونوں میں نئے طاقتور معاونین بڑے پیمانے پر فکر مند ہیں۔ آج تک، مختلف معاونین کی شناخت کی گئی ہے اور بڑے پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے. یہ ملحقہ ویکسین کو کئی فوائد فراہم کرتے ہیں، بشمول اینٹیجنز کی مطلوبہ مقدار کو کم کرنا، عام مدافعتی ردعمل کے لیے درکار حفاظتی ٹیکوں کی تعداد کو کم کرنا، اور زیادہ تیز، وسیع اور مضبوط بنانا۔مدافعتی ردعمل[3-5]۔ اگرچہ بہت سے طاقتور معاون تیار کیے گئے ہیں، جیسے لیپوپولیساکرائڈ (LPS) اور فرینڈ کے مکمل معاون (FCA)، ان کی زہریلا ہونے کی وجہ سے وسیع پیمانے پر لاگو نہیں ہوتے ہیں۔ لہذا، صرف چند معاونات، جیسے ایلم، طبی استعمال کے لیے لائسنس یافتہ ہیں [6]۔ مجموعی طور پر، متعدی اور غیر متعدی بیماریوں کے خلاف بہتر پروفیلیکٹک اور علاج معالجے کی ویکسین کو فروغ دینے کے لیے زیادہ موثر اور محفوظ معاون تیار کیے جانے چاہئیں۔

حفاظت معاونین کی نشوونما میں غور کرنے کا ایک اہم عنصر ہے۔ چینی جڑی بوٹیوں کے اجزاء میں غذائی اجزاء اور اہم فعال مرکبات شامل ہیں، جیسے فینولک مرکبات اور پولی سیکرائڈز، جو طاقتور امیونوسٹیمولینٹس کے طور پر کام کر سکتے ہیں [7-9]۔ ان میں سے، روایتی چینی جڑی بوٹیوں سے پولی سیکرائڈز کو ان کی مدافعتی سرگرمیوں اور کم زہریلا ہونے کی وجہ سے وسیع پیمانے پر دریافت کیا گیا ہے۔ مثال کے طور پر، inulin ایک مدافعتی معاون ہے جس میں دیگر معاونین جیسے FCA کے زہریلے اثرات کے بغیر۔ AdvaxTM ڈیلٹا inulin adjuvant نے بھی کامیابی سے ویکسین کی مدافعتی صلاحیت کو بڑھایا ہے [10,11]۔ Astragalus، جسے چینی میں Huangqi اور لاطینی میں Radix Astragali بھی کہا جاتا ہے، پوری دنیا میں وسیع پیمانے پر تقسیم کیا جاتا ہے۔ Polysaccharide اس کے اہم فعال اجزاء میں سے ایک ہے جو امیونوموڈولیٹری سرگرمی کے لیے ذمہ دار ہے۔ تجرباتی مطالعات نے یہ ثابت کیا ہے کہ Astragalus polysaccharide میں وٹرو اور vivo دونوں میں مضبوط امیونوموڈولیٹری اثرات ہوتے ہیں [12، 13]۔ Lycium barbarum polysaccharides بطور ویکسین کے معاون نے بھی اچھی بہتری اور محرک اثرات دکھائے [14، 15]۔ ان مطالعات نے تجویز کیا کہ چینی جڑی بوٹیوں والی پولی سیکرائڈس معاون ترقی کے لئے مثالی امیدوار تھے۔

Cistanche deserticola YC Ma(سی ڈی، چینی زبان میں "رو کانگ رونگ") ایک قیمتی روایتی چینی جڑی بوٹی ہے اور اسے عام طور پر "صحراوں کا جینسینگ" کہا جاتا ہے کیونکہ اس کے اعلی ٹانک اثرات ہیں۔ یہ سنکیانگ کے بنجر یا نیم خشک علاقوں میں تقسیم کیا جاتا ہے۔ چین میں، اس کا سوکھا مانسل تنا سینکڑوں سالوں سے ٹانک کھانے کے طور پر استعمال ہوتا رہا ہے [16, 17]۔ کئی سالوں سے، ابلی ہوئی سی ڈی کو زیادہ دباؤ سے پیدا ہونے والی خرابی کے علاج کے لیے ٹانک فوڈ کے طور پر استعمال کیا جاتا رہا ہے، جو تجویز کرتا ہے کہ یہ زبانی استعمال کے لیے محفوظ ہے۔ یہ پودا اپنے وسیع دواؤں کے افعال کی وجہ سے بڑے پیمانے پر فکر مند ہے۔ حالیہ فائٹو کیمیکل اور فارماسولوجیکل اسٹڈیز نے ثابت کیا ہے کہ پولی سیکرائڈز اہم حیاتیاتی طور پر فعال اجزاء تھے اور ان کے مختلف حیاتیاتی اثرات تھے، بشمول امیونوموڈولیٹری سرگرمی، اینٹی آکسیڈینٹ اثر، اور سوزش کے اثرات [18–21]۔ تاہم، سنکیانگ میں C. deserticola سے پانی نکالنے کے قابل پولی سیکرائڈز کی قوت مدافعت بڑھانے کی سرگرمی شاذ و نادر ہی رپورٹ ہوئی تھی۔

یہ بات اچھی طرح سے معلوم ہے کہ DCs اہم اینٹیجن پیش کرنے والے خلیات (APCs) ہیں جو مدافعتی ردعمل کو شروع کرنے اور فطری اور موافقت پذیر خلیوں کو ماڈیول کرنے کے لیے ضروری سگنل فراہم کرتے ہیں۔ DCs کے ذریعے اینٹیجن کی مقدار کو بہتر بنانے والے کچھ معاون اجزاء کو محرک یا MHC مالیکیولز کو بڑھا سکتے ہیں اور قوت مدافعت کو بڑھا سکتے ہیں۔ جب DCs کی پختگی شروع ہوتی ہے تو، مزید شریک محرک مالیکیولز اور سائٹوکائنز تیار ہوتے ہیں اور DCs الگ الگ فینوٹائپس دکھاتے ہیں [22، 23]۔

اس مطالعے میں، ہم نے سب سے پہلے اس بات کا استحصال کیا کہ آیا WPCD Vivo میں TLR4 سگنلنگ پاتھ وے کے ذریعے DCs کی ایکٹیویشن کو فروغ دے سکتا ہے۔ چونکہ DCs پیدائشی اور انکولی مدافعتی ردعمل کے درمیان ربط تھے، اس لیے ہم نے قیاس کیا کہ WPCD کے ذریعے متحرک DCs کی ایکٹیویشن انکولی استثنیٰ کے نتائج کو متاثر کرے گی۔ ہم نے WPCD کے ساتھ علاج کیے جانے والے چوہوں میں اوولبومن (OVA) کے لیے مخصوص مدافعتی ردعمل کا جائزہ لیا، بشمول IgG، IgG1، اور IgG2a ذیلی طبقے، T- اور B- پھیلاؤ، اور سائٹوکائن کی پیداوار۔ ہم نے تفتیش کی کہ آیا WPCD کا علاج ان چوہوں کی تلی میں DCs اور Treg خلیوں کی سرگرمی میں اضافہ کرے گا۔ ہمارے نتائج نے C. deserticola سے قدرتی polysaccharides کی ممکنہ مدافعتی سرگرمی کو ثابت کیا اور اس کے اطلاق کے دائرہ کار کو بڑھا دیا۔

مواد اور طریقے

جانور

آٹھ سے دس ہفتے پرانے C57BL/6، BALB/c، یا ICR مادہ چوہوں کو سنکیانگ میڈیکل یونیورسٹی کے فرسٹ ہاسپٹل (ارومچی، سنکیانگ، چین) سے خریدا گیا تھا۔ چوہوں کو سنکیانگ یونیورسٹی برائے جانوروں کی صحت اور فلاح و بہبود کے جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی (ACUC) کے رہنما خطوط کے مطابق روگزن سے پاک حالات میں رکھا گیا تھا۔ جانوروں کے تجربات کے طریقہ کار کو سنکیانگ یونیورسٹی کے AUCC نے منظور کیا تھا۔

آبی عرق نکالنا

C. deserticola چین کے سنکیانگ صوبے میں ایک پودا ہے۔ خام پولی سیکرائڈ پانی نکالنے اور ایتھنول کی بارش کے ذریعے حاصل کیا گیا تھا۔ مختصراً، 100 گرام خشک C. deserticola کو پاؤڈر میں پیس کر فلٹر کیا گیا۔ پاؤڈر کو بار بار کمرے کے درجہ حرارت پر پیٹرولیم ایتھر کے ساتھ ریفلکس کیا جاتا تھا اور پھر رنگین اجزاء اور لپڈس کو ہٹانے کے لیے 1 گھنٹے کے لیے اینہائیڈروس ایتھنول کے ساتھ ریفلکس کیا جاتا تھا۔ باقیات کو ابلتے ہوئے پانی سے تین بار نکالا گیا اور نچوڑ کو ایک ساتھ جمع کیا گیا، 10 منٹ کے لیے 4000 rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا، اور 4 گھنٹے کے لیے 60˚C پر ریفلکس کیا گیا۔ خام پولی سیکرائڈز کو تیز کرنے کے لئے محلول میں 95 فیصد ایتھنول کے حجم کے چار گنا شامل کیے گئے تھے۔ خام پولی سیکرائڈز کو آست پانی میں دوبارہ تحلیل کیا گیا اور پروٹین کو ہٹانے کے لیے سیویج ریجنٹ کے ساتھ علاج کیا گیا۔ عرقوں کو PBS میں تحلیل کیا گیا اور 0{{9}μm فلٹر کے ذریعے جراثیم سے پاک کیا گیا۔ آخر میں، WPCD میں شوگر کی کل مقدار 59.58 فیصد تھی، جیسا کہ فینول – سلفورک ایسڈ کے تجزیہ سے ظاہر ہوتا ہے [24]۔

ڈی سی کی نسل

BM-DCs پہلے بیان کردہ طریقہ کے مطابق معمولی ترمیم کے ساتھ تیار کیے گئے تھے [25]۔ C57BL/6 چوہوں کے بون میرو ڈی سی کو RPMI-1640 مکمل میڈیم (Gibco) کے ساتھ 10 فیصد فیٹل کاف سیرم (Hyclone) کے ساتھ فلش کیا گیا۔ جمع کردہ خلیوں کو RPMI-1640 میڈیم میں 50 μM -mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO) اور 20 ng/mL murine GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) کے ساتھ دوبارہ معطل کیا گیا اور 37˚ پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ 5 فیصد CO2 ماحول میں C۔ کلچر میڈیم کا آدھا حصہ ہر 1-2 دن میں GM-CSF پر مشتمل ایک تازہ میڈیم سے بدل دیا گیا۔ سیلز 6 دن کو جمع کیے گئے، 24 گھنٹے کے لیے WPCD، LPS (100 ng/mL) (Sigma، St Louis, MO) کی مختلف خوراکوں کے ساتھ علاج کیا گیا، اور پھر بہاؤ سائٹومیٹری کے ذریعے ان کا اندازہ لگایا گیا۔

وٹرو میں DCs اور T سیل ایکٹیویشن کی پختگی کا پتہ لگانا

BM-DCs پر WPCD کے وٹرو میچوریشن اثر کا اندازہ FACs کے فینوٹائپک تجزیہ کے نتائج کی بنیاد پر کیا گیا۔ 7 ویں دن، C57BL/6 سے BM–DCs کو GM-CSFand کی موجودگی میں شامل کیا گیا اور پھر WPCD (0۔{7}}1، 0 کے مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج کیا گیا۔{11} }} 2، 0.05، 0.1، اور 0.2 mg/mL) 12 گھنٹے کے لیے سہ رخی میں۔ ایل پی ایس (100 این جی / ایم ایل) کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ PBS میں BM-DCs کو دھونے کے بعد اور Fc Block (BD Biosciences, CA) کو غیر مخصوص اینٹی باڈی بائنڈنگ کو روکنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، مناسب FITC-، PE-، یا APC-conjugated CD40، CD11c، CD{ کا استعمال کرتے ہوئے PBS میں خلیات کو داغ دیا گیا تھا۔ {24}}، CD80، اور MHC-II اینٹی باڈیز (BD) 20 منٹ کے لیے 37˚C پر۔ داغدار خلیوں کا پتہ FACs Calibur (BD) کے ذریعہ لگایا گیا تھا۔ ڈیٹا کا تجزیہ FlowJo سافٹ ویئر (Tree Star) کے ساتھ کیا گیا تھا۔

وٹرو میں DCS پختگی کے تجربے میں، مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق سائٹوکائن پرکھ کٹس (بوسٹر، ووہان، چین) کا استعمال کرکے IL-12 اور TNF- کا تجزیہ کرنے کے لیے سیل کلچر سپرنٹینٹس کو بھی اکٹھا کیا گیا۔ 450 nm پر جذب کی پیمائش ELISA پلیٹ ریڈر (Bio-Rad، USA) سے کی گئی۔ نمونوں میں سائٹوکائن کی مقدار کا حساب ریگریشن لکیری طریقہ کے مطابق ریکومبیننٹ سائٹوکائنز کے معیاری منحنی خطوط کے ساتھ کیا گیا تھا۔

ان کی آلوجینک محرک سرگرمی کو جانچنے کے لیے، ایم ٹی ٹی (سگما، سینٹ لوئس، ایم او) پرکھ کے ذریعے پچھلے طریقہ [26] کے مطابق مخلوط لیمفوسائٹ ری ایکشن (MLR) کا تجربہ کیا گیا۔ مختصراً، محرک خلیات کے طور پر استعمال ہونے والے C57BL/6 چوہوں سے BM-DCs 7 ویں دن RPMI-1640 میڈیم پلس GM-CSF میں بازیافت ہوئے اور 37˚C پر 12 گھنٹے کے لیے WPCD کے مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج کیا گیا۔ سیلوں کو کنویں پلیٹ میں چڑھانے سے پہلے RPMI-1640 میڈیم میں دھویا اور دوبارہ معطل کیا گیا۔ سنگل پلینوسائٹ معطلی بطور جواب دہندہ خلیوں کو BALB/c چوہوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ BM-DCs کو 1:5 اور 1:10 کے تناسب کے مطابق splenocytes کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ خلیات کو 37˚C پر 5 فیصد CO2 ماحول میں تین دن تک سہ رخی میں کلچر کیا گیا۔ ایل پی ایس کے علاج کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ کلچرز کو بعد میں 20 μL MTT کے ساتھ حتمی 4-گھنٹہ کاشت کے لیے شامل کیا گیا۔ ٹی سیل پھیلاؤ کے تجزیہ کے لیے ماپنے والی طول موج (490 nm) اور حوالہ طول موج (650 nm) پر جاذبیت کی پیمائش کی گئی۔ تمام نمونے پس منظر کے کنٹرول سے ماپا گئے تھے۔

وٹرو میں TLR4 inhibitor کے ذریعے علاج

BM-DCs کا پہلے سے علاج 5 μM TAK-242 (TLR4 کی روک تھام کرنے والا، Medchemexpress Inc.USA) کے ساتھ 1 گھنٹے کے لیے کیا گیا اور پھر 12 گھنٹے کے لیے WPCD (100 اور 200 ug/mL) کے مختلف ارتکاز کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا۔ گولگی سٹاپ کی موجودگی یا غیر موجودگی میں ٹرپلیکیٹ میں۔ مثبت کنٹرول میں، LPSwas نے مزید کہا۔ سیلز اور سپرنٹینٹس کا پتہ FACs کے ذریعے سطحی نشانات CD86اور CD40 کا تجزیہ کرنے کے لیے اور ELISA کے ذریعے بالترتیب سائٹوکائنز TNF-a اور IL-12 کا تجزیہ کرنے کے لیے کیا گیا۔

امیونائزیشن پروٹوکول

شدید زہریلا ٹیسٹ۔ اس مطالعہ میں زبانی شدید زہریلے ٹیسٹ میں، 40 صحت مند بالغ ICR چوہوں کا استعمال کیا گیا۔ ICR چوہوں کو خوراک دینے سے پہلے روزہ رکھا گیا (کھانا لیکن رات بھر پانی نہیں)۔ WPCD کو بالترتیب 0، 50، 500، یا 5000 mg/kg جسمانی وزن کی مقدار میں ہر جانور کو 7 دن تک زبانی طور پر دیا گیا۔ کنٹرول گروپ میں نمکین علاج اور پھٹکڑی سے علاج شدہ چوہوں کو شامل کیا گیا تھا۔ جانوروں کو لگاتار 14 دنوں کے اندر روزانہ دیکھا گیا۔ موت کی شرح اور طبی علامات کو ریکارڈ کرنے کے لیے چوہوں کو انفرادی طور پر دیکھا گیا۔ اس کے علاوہ، پورے تجربے میں جسمانی وزن اور ان کے کھانے اور پانی کی کھپت کی پیمائش کی گئی۔ 14 دن، تلی یا تھائمس انڈیکس کا حساب لگایا گیا (تلی یا تھامس وزن/جسم کا وزن) × 10۔

ویوو میں ڈبلیو پی سی ڈی امیونو مودولیٹری سرگرمی کا پتہ لگانا۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا ڈبلیو پی سی ڈی میں امیونوموڈولیٹری سرگرمی تھی، اوولبومین (OVA) (سگما) کو ماڈل اینٹیجن کے طور پر استعمال کیا گیا تھا اور خواتین ICR چوہوں کو تصادفی طور پر 7 گروپوں میں الگ کیا گیا تھا (منفی کنٹرول گروپ (0.9 فیصد NaCl اور WPCD 400 ug)) اور مثبت کنٹرول (OVA کے ساتھ Alum 200 ug))۔ چوہوں کو 10 ug OVA کے ساتھ اکیلے یا WPCD کو OVA کے ساتھ 20، 100، یا 400 ug کی خوراک کے مطابق 2- ہفتے کے وقفے کے ساتھ ذیلی طور پر دو بار دیا گیا۔ خون کے نمونے اور تلی کو بوسٹر ویکسینیشن کے بعد حاصل کیا گیا تھا تاکہ آئی جی جی ٹائٹرز، آئی جی جی سب کلاسز، اسپلینوسائٹ پھیلاؤ اور سائٹوکائن، ڈی سی کی سطح کے مارکر، اور ٹریگ فریکوئنسی کا پتہ لگایا جا سکے۔

OVA مخصوص اینٹی باڈیز کا پتہ لگانا

OVA مخصوص IgG ٹائٹرز اور ذیلی طبقات کی جانچ ELISA نے پچھلے طریقہ [27] کے مطابق کی تھی۔ ELISA پلیٹیں (Nunc، Thermo Fisher Scientific) کو راتوں رات لیپت کیا گیا اور پھر بلاک کر دیا گیا۔ IgG ٹائٹر تجزیہ یا IgG1 اور IgG2a (سدرن بائیوٹیک، انکارپوریٹڈ) کی کھوج کے لیے سیرم کے نمونوں کو سلسلہ وار پتلا کیا گیا تھا۔ اس کے بعد پلیٹوں کو PBST کے ساتھ 37˚C پر 1 گھنٹہ کے لیے HRP-conjugated anti-mouse IgG، IgG1، اور IgG2a پر مشتمل تھا۔ رنگین رد عمل ٹیٹرامیتھائل بینزائڈائن (TMB) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا اور پھر 450 nm/655 nm پر جذبوں کو ماپا گیا تھا اور آپٹیکل کثافت (OD) یونٹ کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔

splenocyte کے پھیلاؤ اور cytokine کا پتہ لگانا

Splenocyte پھیلاؤ کا تعین MTT پرکھ کے ذریعہ کیا گیا تھا۔ پہلی ویکسینیشن کے بعد 21 ویں دن، ایک ہی splenocyte معطلی حاصل کی گئی۔ سیلز کو RPMI-1640 میڈیم ان96-کنوین پلیٹوں میں 1×106 سیلز کے ارتکاز کے مطابق ٹرپلیکیٹ میں کلچر کیا گیا تھا۔ ثقافتوں کو OVA (حتمی ارتکاز 10 ug/mL)، ConA (حتمی ارتکاز 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) اور LPS (حتمی ارتکاز 100 ng/mL) کے ساتھ 37˚C پر 48 گھنٹے کے لیے متحرک کیا گیا تھا۔ . خلیوں کو 48 گھنٹے کے لئے کلچر کیا گیا تھا اور 20 μL (5 mg/mL) MTT (سگما، سینٹ لوئس، MO) کو ہر کنویں میں شامل کیا گیا تھا اور مزید 4 گھنٹے کے لئے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ رنگ کی نشوونما (سگما) کو روکنے کے لیے ہر کنویں میں 50 μL DMSO شامل کرنے کے بعد، مائیکرو ٹائٹر پلیٹ ریڈر (Bio-Rad, CA, USA) کے ذریعے پلیٹوں کو 570 nm پر پڑھا گیا۔ Splenocyte کے پھیلاؤ کو محرک انڈیکس (SI) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا، جو ایک محرک کنویں سے غیر محرک کنویں کا OD570 nm تناسب تھا۔

IL-4 اور IFN- in T خلیوں کی پیداوار کو معمولی ترمیم کے ساتھ شائع شدہ پروٹوکول کے مطابق انٹرا سیلولر سائٹوکائن سٹیننگ کے ذریعے ماپا گیا تھا [27, 28]۔ پہلی ویکسینیشن کے بعد 21 دن کو سنگل اسپلینوسائٹ معطلی تیار کی گئی تھی۔ سرخ خون کے خلیے کے لیسز کے بعد، اسپلینوسائٹ (2×106 سیل/mL) کو OVA (10 ug/mL) کے ساتھ 4-h محرک کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا اور گولگی اسٹاپ (BD) کو 12 گھنٹے انکیوبیشن کے لیے شامل کیا گیا، PMA بطور ایک مثبت کنٹرول. سیلز کو جمع کیا گیا، PBS سے دھویا گیا، CD4-FITC/CD8-FITC سے داغ دیا گیا، اور مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق Cyto fix/Cytoperm kit (BD) کے ساتھ فکس اور پارمیبلائز کیا گیا۔ انٹرا سیلولر سائٹوکائن سٹیننگ IL-4-PE یا IFN- -APC اینٹی باڈیز کے مناسب ارتکاز کے ساتھ 4˚C پر 20 منٹ تک انجام دی گئی۔ ایف اے سی کے ذریعہ داغدار خلیوں کا پتہ چلا۔ FlowJo میں ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔

تللی میں ڈی سی کی پختگی اور ٹریگ خلیوں کا اندازہ

چوہوں میں splenocytes سے DCs کی پختگی کے تجزیے کے لیے، CD11c-PE، CD40-FITC، اور CD80-APC اینٹی باڈیز کے ساتھ خلیے کی سطح کے داغ داغے گئے۔ پہلی ویکسینیشن کے بعد 3 دن پر، سنگل اسپلینوسائٹ معطلی (1 × 106 خلیات / ایم ایل) حاصل کی گئی تھی اور خلیوں کو دوہری داغ کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ فلوروسینٹ کی شدت کی پیمائش FACs Calibur کے ذریعے کی گئی تھی اور ماپا ڈیٹا کا تجزیہ FlowJo کے ذریعے کیا گیا تھا۔

یہ مشاہدہ کرنے کے لیے کہ آیا WPCD CD4 پلس CD25 پلس Foxp3 پلس Treg خلیات کی فریکوئنسی کو کم کر سکتا ہے۔ دوسری ویکسینیشن کے بعد ساتویں دن سنگل اسپلینوسائٹ معطلی تیار کی گئی۔ splenocyte (2×106 خلیات/mL) کو CD4-APC اینٹی باڈی کے ساتھ سیل کی سطح کے داغوں کا نشانہ بنایا گیا، اس کے بعد مناسب CD25-FITC اور Foxp3-PE اینٹی باڈیز کے ساتھ جوہری سائٹوکائن سٹیننگ ماؤس ریگولیٹری ٹی سیل سٹیننگ کٹ (eBios ciences) کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق۔ ایف اے سی پر سی ڈی 4 پلس سی ڈی 25 پلس فاکس 3 پلس ٹریگ سیلز کی فریکوئنسی کی جانچ کی گئی۔ FlowJo میں ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔

شماریاتی تجزیہ

متعدد تجرباتی گروپوں کے درمیان فرق کا تجزیہ کرنے کے لیے تغیر (ANOVA) ٹیسٹ (Tukey's Multiple-comparison Test) کا یک طرفہ تجزیہ کیا گیا۔ تمام اقدار کو اوسط ±SD کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ پی< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

نتائج

WPCD نے وٹرو میں BM-DCs کی پختگی اور فنکشن کو فروغ دیا۔

انکولی استثنیٰ کا تعین DCs کے ایکٹیویشن سے ہوتا ہے، بشمول co-stimulatory molecules اور cytokines [29، 30]۔ ابتدائی طور پر، ہم نے تفتیش کی کہ آیا WPCD شریک محرک مالیکیولز کے اظہار کو فروغ دے سکتا ہے۔ WPCD کی مختلف خوراکوں کے مطابق، C57BL/6 سے BM-DCs کا انتظام کیا گیا۔ خلیوں میں CD11c، CD86، CD80، CD40، اور MHC-II کے اظہار کی سطحوں کا تجزیہ کیا گیا (تصویر 1)۔ ایس ایس سی اور ایف ایس سی کے ساتھ بنائے گئے خلیوں نے ظاہر کیا کہ ڈبلیو پی سی ڈی کی مختلف خوراکوں کے ساتھ علاج سے BM-DCs کی شکل میں کوئی تبدیلی نہیں آئی (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ CD86، CD80، اور CD40 کے اظہار کی سطح غیر علاج شدہ گروپ کے مقابلے خوراک پر منحصر انداز میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کی گئی تھی اور WPCD کی 20 ug/mL کی خوراک کے تحت سطح مرتفع تک پہنچ گئی تھی، لیکن فرق یہ تھا LPS گروپ (تصویر 1A-1C) کے مقابلے میں اہم نہیں ہے۔ MHC-II کے اظہار کی سطح کو 50 ug/mL (تصویر 1D) کی خوراک کے تحت اس کی زیادہ سے زیادہ قیمت تک نمایاں طور پر بڑھا دیا گیا تھا۔ سیلولر سطح کے نشانات کے تجزیہ کے نتائج نے یہ ظاہر کیا کہ LPS یا WPCD کے ساتھ علاج کیے جانے والے DCs نے CD86، CD80، CD40، اور MHC-II کے اظہار کی سطح میں نمایاں طور پر اضافہ کیا اور فینوٹائپک میچوریشن کو فروغ دیا۔

کچھ ملحقہ DCs پر شریک محرک مالیکیولز کو بڑھا سکتے ہیں یا براہ راست سائٹوکائنز کے سراو کو آمادہ کر سکتے ہیں۔ IL-12 اور TNF- Th1 مدافعتی ردعمل کو چالو کرنے کے لیے اہم سائٹوکائنز ہیں۔ ہم نے WPCD علاج پر BM – DCs میں سائٹوکائن کی پیداوار کا تجزیہ کیا۔ BM– DCs کے ساتھ WPCD کے مختلف مواد کے ساتھ 12 گھنٹے تک علاج کیے جانے کے بعد، ایک ELISA کٹ کے ساتھ IL-12 اور TNF- کے مواد کا پتہ لگانے کے لیے سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا۔ WPCD خوراک پر منحصر IL-12 (تصویر 2A) اور TNF- (تصویر 2B) کی پیداوار کو بڑھا سکتا ہے۔ نتائج نے ظاہر کیا کہ ڈبلیو پی سی ڈی ڈی سی کی فنکشنل پختگی کو آمادہ کر سکتا ہے۔

مدافعتی ردعمل میں، ڈی سی کو فعال طور پر فعال کرنا ضروری ہے۔ اس کے بعد، ایلوجینک ٹی سیل پھیلاؤ کی اعلی سطح کو مکمل طور پر بالغ ڈی سی کے ذریعہ حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ لہذا، WPCD پر DCs کے فعال ردعمل کی تحقیقات MLR کے ذریعے کی گئی۔ ایل پی ایس کی طرح ڈبلیو پی سی ڈی سے حوصلہ افزائی شدہ ڈی سی کی الاسٹیمولیٹری صلاحیت کو ڈرامائی طور پر خوراک پر منحصر انداز میں اشارہ شدہ تناسب (تصویر 2 سی اور 2 ڈی) پر بڑھایا گیا تھا۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ ڈبلیو پی سی ڈی نے اینٹیجن پریزنٹیشن کو بہتر بنایا اور وٹرو میں ایم ایل آر کے ذریعہ ٹی سیل ردعمل کو بہتر بنایا۔

WPCD نے TLR4 پاتھ وے کے ذریعے DCs کی پختگی کو فروغ دیا۔

مندرجہ بالا نتائج سے یہ اندازہ لگایا جا سکتا ہے کہ WPCD کے ذریعے چالو BM-DCs نے LPS (ایک TLR4 ligand) سے ملتے جلتے DCs سطح کے مالیکیول اظہار کی نشاندہی کی۔ اس طرح ہم نے یہ قیاس کیا کہ BM-DCs WPCD کے ذریعے TLR4 پاتھ وے کے ذریعے چالو ہوتے ہیں۔ BM-DCs کو TAK-242 (TLR4 inhibitor) کے ساتھ پہلے سے علاج کرنے کے بعد اور WPCD اور LPS کے ساتھ 12 گھنٹے تک ہم آہنگ کیا گیا، CD40، CD86، TNF-a، یا IL{{12} کا اظہار }} کا پتہ FACs یا ELISA کے ذریعے ہوا۔ جیسا کہ تصویر 3A اور 3B میں دکھایا گیا ہے، TAK-242 کے علاج کے نتیجے میں CD40 اور CD86 کے نمایاں طور پر نیچے ریگولیٹڈ ایکسپریشنز جو LPS یا WPCD سے متاثر ہوئے، اور IL-12 یا سائٹوکائن کی پیداوار TNF-a میں بھی نمایاں کمی واقع ہوئی تھی (تصویر 3C اور 3D)۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ WPCD TLR4 راستے کے ذریعے DC پختگی کو چالو کر سکتا ہے۔

ڈبلیو پی سی ڈی نے مزاحیہ اور سیلولر قوت مدافعت میں اضافہ کیا۔

موازنے کے مقصد کے لیے، ہم نے OVA سے حفاظتی ٹیکوں والے چوہوں میں مزاحیہ مدافعتی ردعمل کے اخراج پر WPCD کے اثرات کا جائزہ لیا۔ ویکسینیشن سے پہلے اور پہلی ویکسینیشن کے بعد 14، 21,35 اور 49 دنوں کو، ELISA کے ذریعے IgG ٹائٹر اور IgG ذیلی طبقے کے سیرم کا پتہ لگانے کے لیے خون جمع کیا گیا۔ خوراک پر منحصر انداز میں WPCD انتظامیہ (100 اور 400 ug) کی خوراک میں اضافے کے ساتھ OVA پر IgG اینٹی باڈی ردعمل میں اضافہ ہوا (تصویر 4)۔ زیادہ سے زیادہ ارتکاز WPCD کا 100 ug/mL تھا اور 21، 35 اور 49 دنوں (تصویر 4A) پر اکیلے OVA کے مقابلے میں IgG ردعمل میں دو گنا اضافہ ہوا۔ WPCD انتظامیہ کے 20 اور 100 ug کے تحت OVA مخصوص IgG1 اور IgG2a اینٹی باڈی کی سطح میں خاطر خواہ اضافہ 35 دن (تصویر 4B) کو سیرم میں OVA گروپ کے مقابلے میں حاصل کیا گیا تھا۔ دریں اثنا، ایلم نے حفاظتی ٹیکوں والے چوہوں میں صرف OVA مخصوص IgG اور IgG1 اینٹی باڈیز کے اظہار کی سطح کو فروغ دیا۔ اکیلے WPCD نے OVA مخصوص اینٹی باڈیز کو متحرک نہیں کیا۔ مندرجہ بالا نتائج نے واضح طور پر اشارہ کیا کہ ڈبلیو پی سی ڈی نے ایلم کے مقابلے میں اعلی اینٹی باڈی ٹائٹرز اور زیادہ متوازن Th1/Th2 ردعمل پیدا کیے ہیں۔

Splenocyte پھیلاؤ سیلولر استثنیٰ کا ایک اور اشارہ ہے۔ کونا ٹی سیلز کو متحرک کرتا ہے اور ایل پی ایس بی سیل کے پھیلاؤ کو متحرک کرتا ہے۔ پہلی ویکسینیشن کے بعد 21 ویں دن، واحد splenocyte معطلی حاصل کی گئی اور بالترتیب OVA (10 ug/mL)، OVA323-339 (10 ug/mL) پیپٹائڈ، ConA (5 ug/mL) اور LPS (5) کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی۔ ug/mL) 48 گھنٹے کے لیے۔ پھر ٹی خلیوں کے پھیلاؤ کو MTT طریقہ سے ماپا گیا۔ WPCD OVA اور WPCD (تصویر 5) کے ساتھ حفاظتی ٹیکے لگائے گئے چوہوں میں OVA-antigen، Con A-mitogen اور LPS mitogen-stimulated splenocyte کے پھیلاؤ کو نمایاں طور پر فروغ دے سکتا ہے اور WPCD کا زیادہ سے زیادہ ارتکاز 100 ug/mL تھا۔ ان اعداد و شمار نے اشارہ کیا کہ WPCD OVA-امیونائزڈ چوہوں میں ایک ویکسین کے معاون کے طور پر ایلم کے مقابلے T-cells اور B خلیات کو زیادہ مؤثر طریقے سے متحرک کر سکتا ہے۔

OVA ویکسین کے ساتھ تیار کردہ تمام ٹیسٹ شدہ WCPD ایڈوینٹس نے یکساں طور پر مضبوط مزاحیہ اور سیلولر قوت مدافعت پیدا کی (تصویر 4 اور 5)۔ ان اعداد و شمار کی بنیاد پر، OVA مخصوص T مددگار (Th) سیل کے ردعمل پر WPCD اثرات کا مزید جائزہ لینے کے لیے، ہم نے فلو سائٹومیٹری (تصویر 6) کے ذریعے CD8 پلس اور CD4 پلس T خلیوں میں سائٹوکائن اظہار کا مزید تجزیہ کیا۔ پہلی ویکسینیشن کے بعد 21 ویں دن، چوہوں کے ایک واحد اسپلینوسائٹ کو الگ تھلگ کیا گیا اور پھر OVA (10 ug/mL) کے ساتھ مل کر کلچر کیا گیا۔ 100 ug OVA/WPCD کے زیر انتظام گروپ میں CD4 پلس T سیلز میں IL-4 پیداوار OVA/Alum گروپ اور OVA گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی اور PMA (تصویر 6A) کی طرح۔ مزید یہ کہ OVA/WPCD (20، 100، اور 400 ug) (تصویر 6B اور 6C) کے زیر انتظام چوہوں میں CD8 پلس اور CD4 پلس T خلیوں میں IFN- پیداوار کو بھی نمایاں طور پر بڑھایا گیا تھا۔ ایلم ایڈجوینٹ کے مقابلے میں، ڈبلیو پی سی ڈی نے ٹی سیلز سے IL-4 اور IFN- رطوبت کو دلانے کی بہتر صلاحیت دکھائی۔

WPCD نے DCs کی پختگی کو متحرک کیا اور Vivo میں Treg فریکوئنسی کو کم کیا۔

ڈی سی ایس کو سب سے زیادہ طاقتور اے پی سی کے طور پر پہچانا جاتا ہے جو بنیادی مدافعتی ردعمل کو شروع کرنے میں شامل ہے۔ اس طرح، پہلی ویکسینیشن کے بعد تیسرے دن، ہم نے چوہوں میں تلی میں CD40 اور CD80 پر DCs پر WPCD کے اثرات کی بھی تحقیقات کی (تصویر 7A اور 7B)۔ 100-ug OVA/WPCD گروپ میں چوہوں نے DCs پر CD40 اور CD80 کی نمایاں طور پر اعلیٰ سطحیں OVA/Alum گروپ کے چوہوں کے مقابلے میں پیدا کیں۔ ان اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ WPCD DCs کو چالو کر سکتا ہے اور چوہوں میں DCs کی پختگی کو آمادہ کر سکتا ہے۔ ٹریگ سیلز رواداری اور مدافعتی ردعمل کو متوازن کر سکتے ہیں۔ مزید تفتیش کرنے کے لیے کہ ڈبلیو پی سی ڈی نے مدافعتی ردعمل کو کیسے ماڈیول کیا، چوہوں میں تلی کے ٹریگ سیلز کو ماؤس ریگولیٹری ٹی سیل سٹیننگ کٹ سے داغ دیا گیا تھا۔ پہلی ویکسینیشن کے بعد 21 ویں دن، کل CD4 پلس T خلیات (تصویر 7C) میں CD25 پلس Foxp3 پلس Treg خلیات کی تعدد میں کمی دیکھی گئی۔ OVA اور OVA/Alum گروپوں کے مقابلے میں، WPCD گروپ نے Treg فریکوئنسی میں نمایاں کمی دکھائی۔

چوہوں میں WPCD کی حفاظت کی تشخیص

زبانی شدید زہریلا کا اندازہ لگانے کے لئے، ہم نے شدید زہریلا ٹیسٹ کیا. 5000 mg/kg جسمانی وزن کے ساتھ زبانی طور پر دیے گئے چوہوں نے کوئی غیر معمولی رویہ یا ضمنی اثرات نہیں دکھائے اور زہریلے کی تشخیص کے ٹیسٹ میں کوئی موت نہیں پائی گئی۔ چوہوں کے مختلف گروپوں میں WPCD کی مختلف خوراکوں کے ساتھ جسمانی وزن میں اضافے، تھامس انڈیکس، اور اسپلین انڈیکس میں کوئی خاص فرق نہیں دیکھا گیا اور اس میں کوئی خاص فرق نہیں تھا (ٹیبل 1)۔ 14 دن کے بعد کوئی موت نہیں دیکھی گئی۔ لہذا، WPCD کی LD50 قدر 5000 ملی گرام فی کلوگرام جسمانی وزن سے زیادہ تھی۔

یہ جانچنے کے لیے کہ آیا WPCD نے چوہوں کی نشوونما پر منفی اثرات مرتب کیے ہیں، ذیلی ویکسینیشن سے پہلے اور بعد میں، ہر ماؤس کے لیے بالترتیب جسمانی وزن کا تعین کیا گیا تھا (ٹیبل 2)۔ چوہوں کے بعد کے مشاہدے میں، ضمنی اثرات یا غیر معمولی رویے کا مشاہدہ نہیں کیا گیا تھا. اس کے علاوہ، WPCD کے زیر انتظام چوہوں کے جسمانی وزن اور نمکین محلول یا OVA/Alum کے ساتھ دیے گئے چوہوں میں کوئی خاص فرق نہیں دکھایا گیا۔ ان مشاہدات کے نتائج نے ظاہر کیا کہ ڈبلیو پی سی ڈی کی انتظامیہ محفوظ تھی۔

بحث

ویکسین [31] میں معاون اجزاء کلیدی اجزاء ہیں۔ جینومکس اور پروٹومکس میں ترقی کی وجہ سے، زیادہ سے زیادہ ریکومبیننٹس اور مصنوعی ویکسین کے مالیکیولز کی نشاندہی کی گئی ہے۔ لہذا، مزید معاون اور فارمولیشنز کی ضرورت ہے. کچھ طاقتور معاون عام طور پر بڑھتی ہوئی زہریلا سے متعلق ہیں، مثال کے طور پر، ایف سی اے. لہذا، یہ ضروری ہے کہ ایک محفوظ فارمولیشن تلاش کی جائے جس میں مختلف ہم آہنگی والے اجزاء شامل ہوں جو بالآخر مطلوبہ مدافعتی ردعمل کو آگے بڑھائے۔ چینی جڑی بوٹیوں سے پولی سیکرائڈز غیر زہریلا ہیں اور کوئی خاص ضمنی اثرات نہیں دکھاتے ہیں [32,28]۔ کسی مخصوص ویکسین کے لیے ایک محفوظ معاون کی ضرورت ہوتی ہے۔

Cistanche deserticola ایک اہم ٹانک جڑی بوٹی ہے اور چین کے شمال مغرب میں بنجر زمینوں اور گرم صحراؤں میں وسیع پیمانے پر موجود ہے۔ Cistanche deserticola اس کی حیاتیاتی سرگرمیوں کی وجہ سے بڑے پیمانے پر فکر مند ہے جس میں امیونوموڈولیٹری، اینٹی آکسیڈیٹیو، اینٹی بیکٹیریل، اور اینٹیٹیمر اثرات شامل ہیں [20,21]۔ Cistanche deserticola کی ساختی خصوصیات اور امیونولوجیکل سرگرمی میں کچھ پیش رفت ہوئی ہے، جو کہ ترقی پذیر معاونین کے لیے ایک اچھا امیدوار ہے۔ ہم نے تجرباتی طور پر وٹرو اور ویوو میں WPCD کے ضمنی اثرات اور طریقہ کار کا جائزہ لیا۔ WPCD کی ذیلی انتظامیہ نے سیرم اینٹی باڈیز اور لیمفوسائٹ کے پھیلاؤ میں اضافہ کرکے، سائٹوکائنز کے اظہار کو بڑھا کر، DC کی پختگی کو اپ-ریگولیٹ کرکے، اور CD4 پلس CD25 پلس Foxp3 پلس Treg خلیات کی فریکوئنسی کو کم کرکے مزاحیہ اور سیلولر مدافعتی ردعمل کو نمایاں طور پر فروغ دیا۔

DCS کلیدی APCs ہیں پرائمنگ Nive T سیل کے لیے۔ DCs کی ایکٹیویشن معاونین کے لیے اہم ہے۔ DCS، خاص طور پر مورین میرو سے ماخوذ DCs، اکثر معاون اور ویکسین کا اندازہ کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ فلو سائٹومیٹری ان خلیوں کی تمیز کر سکتی ہے جو آس پاس کے خلیوں سے اینٹیجن کو پکڑنے کے بعد چالو ہوئے ہیں۔ ایف سی ایم تجزیہ میں، محرک خلیوں کے جمع ہونے کی ڈگری امیونو موڈیولٹرز کی حفاظت کا اندازہ کرنے کا ایک بالواسطہ اشارہ ہے [3]۔ اس طرح، وٹرو میں DCs میں WPCD معاون سرگرمی کا ڈیٹا جانوروں کے ماڈلز کے لیے قیمتی معلومات فراہم کر سکتا ہے۔ BM-DC ماڈل کی بنیاد پر، MHC-II، CD86، CD80، اور CD40، سائٹوکائن پروڈکشن، اور ایلوجینک ٹی سیل کے پھیلاؤ کے اظہار کی سطحوں کو WPCD ارتکاز کی بہترین حد میں پایا گیا۔ BM-DCs میں MHC-II، CD86، CD80، اور CD40 کے اظہار کی سطحوں کو اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا اور TNF-a اور IL-12 کی پیداوار خوراک پر منحصر انداز میں بڑھائی گئی تھی۔ اللوجینک ٹی سیل پھیلاؤ کا مشاہدہ کیا گیا۔ BM-DCs کی شکل کو تبدیل نہیں کیا گیا تھا۔ BM-DCs کی ایکٹیویشن اور وٹرو میں سوزش والی سائٹوکائنز کے اخراج کو دلانے سے، WPCD معاون اینٹیجن کی مقدار اور APCs کی مقدار کو نمایاں طور پر بڑھا سکتا ہے اور IFN- کو خارج کرنے کے لیے T خلیات کو تحریک دیتا ہے، جو امیونوموڈولیٹری سرگرمی کو بڑھانے میں معاون ہے۔

مختلف چینی جڑی بوٹیوں والے پولی سیکرائڈز مدافعتی نظام کو فعال کرنے کی صلاحیت رکھتے ہیں اور TLR4 راستے [33,28] کے ذریعے DCs کی پختگی کو متحرک کرنے کے ذریعے بہترین معاون صلاحیتوں کے مالک ہیں۔ اس طرح، ہم فرض کرتے ہیں کہ TLR4 WPCD-حوصلہ افزائی DCs کی پختگی کے سگنلنگ پاتھ وے میں حصہ لیتا ہے۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، TLR4 روکنے والے علاج کے نتیجے میں TNF-a اور IL-12 میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ مزید برآں، TLR4 راستے کی روک تھام نے DCs پر CD 40 اور CD80 کے اظہار میں بھی رکاوٹ ڈالی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ DCs کی پختگی TLR4 پر منحصر تھی۔ لہذا، یہ واضح ہے کہ TLR4 WPCD-حوصلہ افزائی DCs کی پختگی میں حصہ لیتا ہے۔

متعدد تجربات میں معاون اور ویکسین کی تشکیل کی زیادہ سے زیادہ خوراک تجرباتی طور پر طے کی جاتی ہے۔ چوہوں میں WPCD معاون اور OVA اینٹیجنز کے خوراک کے ردعمل کے تعلقات کو دریافت کرنے کے لیے، ہم نے وٹرو میں BM-DCs سے پہلے رپورٹ کردہ ڈیٹا کی بنیاد پر مختلف WPCD خوراکوں کا انتخاب کیا تاکہ ICR چوہوں کو دو بار ذیلی طور پر انتظام کیا جا سکے۔ ہم نے پایا کہ WPCD نے OVA مخصوص اینٹی باڈیز کی پیداوار میں نمایاں اضافہ کیا اور IgG1 اور IgG2a کی سطحوں میں اضافے کے ساتھ متوازن Th1/Th2 مدافعتی ردعمل پیدا کیا۔ خاص طور پر، IgG2a کی سطح اس سے زیادہ تھی جس کا علاج Alum کے ساتھ بہترین خوراک میں کیا گیا تھا۔ لہذا، WPCD کے نتیجے میں مخصوص اینٹی باڈیز کی اعلی سطح اور کم انجیکشن کے ساتھ اعلی افادیت پیدا ہوئی۔

نئی ویکسینز کو مضبوط سیلولر ردعمل کی شمولیت کی ضرورت ہوتی ہے، جس میں اینٹی باڈیز، ٹی مددگار (Th) خلیات، اور سائٹوٹوکسک T لیمفوسائٹس (CTLs) شامل ہوتے ہیں۔ علاج کی ویکسین کا مقصد مضبوط T-سیل ردعمل پیدا کرنا ہے۔ مثالی معاون ویکسین کی طاقت کو بڑھاتا ہے اور زہریلے اثرات پیدا کیے بغیر خلیے کی ثالثی قوت مدافعت کو فروغ دیتا ہے [34]۔ حفاظتی ٹیکوں والے چوہوں کے ماڈلز میں مشاہدات میں سے، ڈبلیو پی سی ڈی نے ایلم کے مقابلے OVA مخصوص اور غیر مخصوص اسپلینوسائٹ پھیلاؤ میں اضافہ کیا۔ کچھ معاون اجزاء سائٹوکائنز اور مدافعتی نظام کو منظم کرتے ہیں۔ مثال کے طور پر، saponins ایک اینٹیجن کے خلاف خلیے کی ثالثی کے مدافعتی ردعمل کو متحرک کر سکتے ہیں جو عام طور پر صرف اینٹی باڈیز کو اکساتی ہے۔ ہم نے IL-4 اور IFN- کو بطور اشارے چوہوں میں قوت مدافعت کی سطحوں کا بالواسطہ جائزہ لینے کے لیے منتخب کیا۔ WPCD ایلم سے زیادہ IL-4 اور IFN- رطوبت پیدا کر سکتا ہے۔ اس طرح، ڈبلیو پی سی ڈی ویکسینیشن کے نتیجے میں مضبوط مددگار ٹی سیل ردعمل اور سائٹوکائن کی رطوبتوں کا مشاہدہ کیا گیا، جس سے معلوم ہوتا ہے کہ ڈبلیو پی سی ڈی لیمفوسائٹس کو زیادہ مؤثر طریقے سے متحرک کر سکتا ہے تاکہ Th1-ٹائپ سائٹوکائن اور Th2-ٹائپ سائٹوکائن کو خفیہ کر سکے۔ پھٹکڑی

اینٹیجن پریزنٹیشن کو متاثر کرنے والے معاون اجزاء پیچیدہ مدافعتی عمل کو متاثر کر سکتے ہیں۔ ٹریگ سیل Th1 اور Th2 ردعمل کو ماڈیول کر سکتے ہیں [35]۔ ڈبلیو پی سی ڈی کی ایک مناسب خوراک CD80 اور CD40 کے اظہار کی سطح کو بڑھا کر اور ابتدائی مدافعتی ردعمل میں OVA اینٹیجن پریزنٹیشن کی صلاحیت کو بڑھا کر چوہوں میں DCs کی پختگی کو فروغ دے سکتی ہے۔ DCS ایکٹیویشن اور Treg فریکوئنسی کے تجرباتی نتائج نے یہ ظاہر کیا کہ WPCD نے DCs کی پختگی کی حوصلہ افزائی کی اور چوہوں میں تلی میں Treg فریکوئنسی کو کم کیا۔ ان نتائج نے ثابت کیا کہ ڈبلیو پی سی ڈی نے اینٹیجن پیش کرنے والے خلیات کو بڑھا کر اور ٹی سیل مخصوص ایکٹیویشن کو فروغ دے کر OVA ویکسین کی افادیت کو بڑھایا۔

معاونین کی نشوونما میں، متعلقہ انفیکشن کے خلاف مناسب مدافعتی ردعمل کو منتخب طور پر دلانا مشکل ہے۔ مناسب معاون میں انسانوں یا جانوروں کے لیے کم مضر اثرات اور زہریلا ہونا چاہیے۔ اس طرح، ڈبلیو پی سی ڈی کی حفاظت پر غور کیا جانا چاہئے، بشمول فوری اور طویل مدتی ضمنی اثرات۔ اس مطالعے میں، ہم نے WPCD کی شدید زہریلا اور WPCD کے 110 دنوں تک چوہوں کی نشوونما کی کارکردگی پر منفی اثر کو دریافت کیا۔ ڈبلیو پی سی ڈی کے شدید زہریلے کے نتائج سے معلوم ہوا کہ جسمانی وزن، تھیمس انڈیکس، یا اسپلین انڈیکس میں کوئی خاص فرق نہیں تھا۔ ڈبلیو پی سی ڈی کی ایل ڈی 50 ویلیو 5000 ملی گرام فی کلوگرام جسمانی وزن سے زیادہ تھی۔ چوہوں کے تجرباتی بعد کے مشاہدے کے دوران، چوہوں میں کوئی ضمنی اثر یا غیر معمولی رویہ نہیں پایا گیا۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ WPCD محفوظ تھا۔

آخر میں، اس تحقیق میں، WPCD، سنکیانگ کے C. deserticola سے نکالا گیا ایک خام پولی سیکرائیڈ، نے ملحقات کی کچھ خصوصیات کو ظاہر کیا۔ مثال کے طور پر، WPCD نے DCs کو چالو کرکے، اینٹی باڈی کے ردعمل میں اضافہ کرکے، سائٹوکائن کی پیداوار کو بہتر بنا کر Th1 اور Th2 دونوں ردعمل کو بڑھایا۔ مزید یہ کہ، ہم نے وٹرو میں TLR4 پاتھ وے کے ذریعے DCs میچوریشن اور فنکشن کا تجزیہ کرکے WPCD افادیت کے طریقہ کار کو دریافت کیا۔ صرف ڈبلیو پی سی ڈی کے ساتھ علاج کیے گئے چوہوں میں، کوئی واضح ضمنی اثر نہیں دیکھا گیا۔ لہذا، ڈبلیو پی سی ڈی کے پاس سیلولر اور مزاحیہ مدافعتی ردعمل میں اعلی مدافعتی سرگرمی ہے۔ معاون کئی مرکبات کا مرکب ہیں۔ کئی خام عرقوں کا مرکب ایک پودے کے عرق سے زیادہ فائدہ مند اثرات رکھتا ہے۔ WPCD کے نچوڑ کو منظم طریقے سے دریافت کرنا، ان کی افادیت اور حفاظت کی جانچ کرنا، اور ان کے اثرات کے طریقہ کار کو واضح کرنا ضروری ہے۔

امدادی معلومات

S1 فائل۔ چیک لسٹ پہنچیں۔ (DOCX)

اعترافات

Bing Wang اور Daocheng Wu کا خصوصی شکریہ کے ساتھ تجربات میں اچھے خیالات فراہم کرنے کے لیے۔

مصنف کی شراکتیں۔

تصورات: ایلین ژانگ، بن وانگ، داوچینگ وو۔

ڈیٹا کیوریشن: Xiumei Yang، Yu Yang. رسمی تجزیہ: Ailian Zhang، Quanxiao Li.

فنڈنگ ​​کا حصول: Ailian Zhang.Project انتظامیہ: Ailian Zhang.

وسائل: ایلین ژانگ، گان ژاؤ۔ تحریر – اصل مسودہ: ایلین ژانگ۔

تحریر - جائزہ اور ترمیم: ایلین ژانگ، داوچینگ وو۔