Arabidopsis میں RPX1 کا غیر فعال ہونا ہوموٹرپین ڈی ایم این ٹی کے جمع ہونے کے ذریعے پلوٹیلا زائلوسٹیلا کے خلاف مزاحمت فراہم کرتا ہے۔

خلاصہ

Lepidopteran فصلوں کے کیڑے Plutella xylostella Brassica کی کاشت میں شدید رکاوٹوں کا باعث بنتے ہیں۔ یہاں، ہم عربیڈوپسس تھالیانا میں اس کیڑوں کے خلاف مزاحمت میں RPX1 (P. xylostella کے خلاف مزاحمت) کے لیے ایک نئے کردار کی اطلاع دیتے ہیں۔ rpx1-1 اتپریورتی P. xylostella لاروا کو پیچھے ہٹاتا ہے، اور rpx1-1 اتپریورتی کو کھانا کھلانے سے لاروا کے مڈ گٹ میں پیریٹروفک میٹرکس کی ساخت کو شدید نقصان پہنچتا ہے، اس طرح لاروا کی نشوونما اور پیپشن کو منفی طور پر متاثر کرتا ہے۔ اس مزاحمت کا نتیجہ دفاعی مرکبات کے جمع ہونے سے ہوتا ہے، بشمول مونوٹرپین (3E)−4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene (DMNT)، PENTACYCLIC TRITERPENE SYNTHASE 1 (PEN1) کے اپ گریجولیشن کی وجہ سے، جو ایک کو انکوڈ کرتا ہے۔ کلیدی DMNT بائیو سنتھیٹک انزائم۔ P. xylostella infestation اور زخموں سے RPX1 پروٹین کی تنزلی ہوتی ہے، جو کیڑوں کے حملے کے لیے تیزی سے ردعمل دے سکتا ہے۔ RPX1 غیر فعال ہونا اور PEN1 اوور ایکسپریشن پودوں کی نشوونما کے لیے منفی تجارت سے وابستہ نہیں ہیں لیکن P. xylostella infestation کی موجودگی میں جنگلی قسم کے مقابلے بیج کی پیداوار بہت زیادہ ہے۔ یہ مطالعہ P. xylostella کے خلاف پودوں کی مالیکیولر افزائش کے لیے ایک نئی حکمت عملی پیش کرتا ہے۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

  مطلوبہ الفاظ

کیڑوں کے خلاف مزاحمت، ثانوی میٹابولزم، غیر مستحکم اخراج

1|تعارف

کیڑے مکوڑے نہ صرف فصل کی پیداوار کو کم کرتے ہیں بلکہ فصل کی مصنوعات کے معیار کو بھی متاثر کرتے ہیں (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016)۔ ان میں سے، ڈائمنڈ بیک موتھ پلوٹیلا زائیلوسٹیلا ایک وسیع پیمانے پر تقسیم کیا جانے والا اور نقصان دہ لیپیڈوپٹران کیڑا ہے جو پھولدار فصلوں جیسے گوبھی اور گوبھی کو کھاتا ہے، جس سے زبردست معاشی نقصان ہوتا ہے۔ فی الحال، زرعی انتظام میں، زرعی کیمیکلز (مثلاً کیڑے مار ادویات) کا استعمال کرتے ہوئے کیڑوں پر قابو پانا بہت کامیاب رہا ہے اور بہت زیادہ استعمال کیا گیا ہے، لیکن ممکنہ ماحولیاتی آلودگی اور انسانی صحت کو لاحق خطرات کی وجہ سے یہ نقطہ نظر مسئلہ بنتا جا رہا ہے (شکیل وغیرہ، 2017)۔ فصل کی پیداوار کے لیے ایک متبادل نقطہ نظر کیڑوں کے خلاف بہتر مزاحمت کے ساتھ جینیاتی طور پر انجینئرڈ فصلوں کا استعمال ہے، مثال کے طور پر بیسیلس تھورینجینس (جوزانی ایٹ ال۔، 2017) یا دوسرے ہیٹرولوگس اینٹوموٹوکسک پروٹینز (ڈگلس، 2018) کے پلانٹا اظہار میں۔ زراعت میں P. xylostella کو کنٹرول کرنے کے لیے نئے طریقوں کی نشاندہی کرنے کے لیے وسیع کوششیں کی گئی ہیں۔ تاہم، مؤثر جینز، قدرتی کیڑے مار ادویات، اور مزاحم جراثیم محدود ہیں (Zhou & Jander, 2021)۔ کیڑوں کے کیڑوں کے ساتھ ہتھیاروں کی مستقل دوڑ کے ذریعے، پودوں نے کیڑوں کے حملوں سے نمٹنے کے لیے مختلف صلاحیتیں تیار کی ہیں۔ اس کے مطابق، پودے دفاعی میٹابولائٹس کی صفوں کی ترکیب کرتے ہیں جیسے بینزوکسازینائڈز (Handrick et al., 2016; Varsani et al., 2019)، methyl benzoate (Feng & Zhang, 2017)، اور serotonin (Lu et al.)، 2018 کے جواب میں کیڑوں کی چوٹ. جیسمونک ایسڈ (JA)، جسے 'زخم کا ہارمون' بھی کہا جاتا ہے، کیڑوں کے انفیکشن (لورٹزنگ اینڈ سٹیپوہن، 2016) کے ذریعے شروع ہونے والے زخم سے متعلق نقصان کے مختلف ردعمل میں مرکزی کردار ادا کرتا ہے۔ بڑھتے ہوئے شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ JA دوسرے فائٹو ہارمونز، جیسے سیلیسیلک ایسڈ (SA) اور ایتھیلین (Costarelli et al.، 2020؛ Ma et al.، 2019) کے ساتھ ہم آہنگی اور/یا مخالفانہ طور پر کام کرتا ہے۔ براہ راست دفاع کے علاوہ، کیڑوں کے حملوں سے نقصان پہنچانے والے پودے مختلف غیر مستحکم مرکبات جاری کرتے ہیں جو سبزی خوروں کے قدرتی دشمنوں کو اپنی طرف متوجہ کرتے ہیں (گولز، 2014)۔ ان پیچیدہ اتار چڑھاؤ والے مرکبات میں سے، ہوموٹرپین مرکبات (3E)−4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene (DMNT) اور (E, E) −4,8,12-trimethyl-1,3,7، 11-tridecatetraene (TMTT) متعدد پودوں کی انواع جیسے Arabidopsis (Lee et al.، 2010; Sohrabi et al., 2015)، چاول (Li et al.، 2018)، مکئی (Gouinguené et al.، 2005) میں رپورٹ کیا گیا ہے۔ ; Richter et al.، 2016) اور کپاس (Liu et al.، 2018)۔ متعدد مطالعات نے یہ بھی اشارہ کیا ہے کہ ڈی ایم این ٹی ایک سگنل مالیکیول کے طور پر کام کرتا ہے جو پودوں سے پودوں کے مواصلات کے دوران جڑی بوٹیوں کے خلاف دفاع کو اکساتا ہے (Arimura et al., 2000; Meents et al., 2019)۔ مثال کے طور پر، چبانے والے کیڑوں سے نقصان اٹھانے کے بعد، کچھ شکرقندی DMNT کا اخراج کرتے ہیں، جس کے نتیجے میں پڑوسی میٹھے آلو کے پودوں میں پروٹیز روکنے والے موچ کو نظامی طور پر شامل کیا جاتا ہے اور وہ کیڑوں کے لیے ناقابلِ ہضم ہو جاتے ہیں (Meents et al.، 2019)۔ اسی طرح کے نتائج چائے کے پودوں کے لیے دیکھے گئے ہیں (Jing et al., 2020)۔ حال ہی میں، ہم نے پایا کہ ڈی ایم این ٹی کیڑے کے مڈ گٹ (چن ایٹ ال۔، 2021) میں پیریٹروفک میٹرکس (پی ایم) رکاوٹ کو ختم کرکے P. xylostella لاروا کو مارنے میں ایک کردار ادا کرتا ہے۔

اعلی پودوں میں، ڈی ایم این ٹی اور ٹی ایم ٹی ٹی بائیو سنتھیسس کے راستے ریورس جینیٹکس اور بائیو کیمیکل تجزیوں کے ذریعے اچھی طرح سے نمایاں کیے گئے ہیں۔ مکئی میں، DMNT اور TMTT دو P450 monooxygenases، CYP92C5 اور CYP92C6 (Richter et al.، 2016) کے ذریعے (E)-nerolidol اور (E, E)-geranyl linalool کے آکسیڈیٹیو انحطاط سے پیدا ہوتے ہیں۔ کپاس میں، دو CYP جین (GhCYP82L1 اور GhCYP82L2) (E) - nerolidol کو DMNT میں اور (E, E) - geranyl linalool کو TMTT (Liu et al.، 2018) میں تبدیل کرنے کے ذمہ دار ہیں۔ Arabidopsis جڑوں میں، DMNT پیشگی C30 triterpene diol، cannabidiol، سے cytochrome P450 monooxygenase کے ذریعے جڑ کے مخصوص جین CYP705A1 (سہرابی et al.، 2015) کے ذریعے انکوڈ کیا جاتا ہے۔ ایک نمونہ حیاتیات کے طور پر خمیر کا استعمال کرتے ہوئے ایک مطالعہ نے اس بات کا ثبوت پیش کیا ہے کہ کینابیڈیول 2,3-oxidosqualene سے cannabidiol synthase PEN1 (Xiang et al., 2006) سے تیار کیا جاتا ہے، اور جس کا اظہار ہم آہنگی سے CYP705A1 (Sohrabi et al. .، 2015)۔ بہر حال، ڈی ایم این ٹی بائیو سنتھیسس میں کلیدی جینوں کا ضابطہ بڑی حد تک نامعلوم ہے۔ اس مطالعے میں بیان کردہ RPX1 جین ایک ناول کیپ بائنڈنگ پروٹین (CBP) کے لیے انکوڈ کرتا ہے، جو یوکرائیوٹک انیشیشن فیکٹر 4E (eIF4E) جین فیملی کا رکن ہے۔ پودوں میں، eIF4E خاندان eIF4E1، eIF4E2، eIF(iso)4E، اور nCBP پر مشتمل ہوتا ہے، جو کیپ پر منحصر mRNA ترجمہ (Rhoads، 2009) کے آغاز میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ eIF4E خاندان کے افراد آلو وائرس Y (PVY) کے خلاف مزاحمت کے بنیادی ذرائع ہیں - آلو کی پیداوار اور معیار کو متاثر کرنے والا سب سے زیادہ نقصان دہ جراثیم، اور CRISPR-Cas9 ٹیکنالوجی کا استعمال جو eIF4E1 جین کو نشانہ بناتا ہے، سولانم کے آلو وائرس Y مزاحمتی سپیکٹرم کو بڑھاتا ہے۔ (Lucioli et al.، 2022)۔ اسی طرح، کاساوا eIF4E isoforms nCBP-1 اور nCBP-2 کی CRISPR/Cas9-ثالثی ترمیم کاساوا براؤن اسٹریک بیماری (Gomez et al.، 2019) کی وجہ سے ہونے والی علامات کی شدت اور واقعات کو کم کرتی ہے۔ مزید برآں، Arabidopsis کے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ nCBP کی کمی پودوں کے وائرسوں کی سیل سے سیل کی نقل و حرکت کو محدود کرنے میں کردار ادا کرتی ہے (Keima et al.، 2017)۔ اس کے باوجود، سبزی خوروں کے دفاع میں nCBPs کے کام کی اطلاع نہیں دی گئی ہے۔ یہاں، ہم Arabidopsis جین RPX1 کو فعال طور پر نمایاں کرنے کے لیے ایک مربوط طریقہ استعمال کرتے ہیں، جو P. xylostella کے خلاف پودوں کی مزاحمت میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ RPX1 کو دستک دینے کے نتیجے میں امتیازی طور پر اظہار شدہ جین (DEGs) اور مرکبات جمع ہوتے ہیں۔ اپریگولیٹڈ جینز میں سے ایک PEN1 ہے، جو DMNT بائیو سنتھیسس کے لیے کلید ہے۔ rpx1 اتپریورتی اور DMNT کے جمع ہونے کا انفیکشن P. xylostella کے PM ڈھانچے کو متاثر کرتا ہے اور لاروا کی نشوونما میں نقائص اور موت کا سبب بنتا ہے۔ مزید شواہد یہ ظاہر کرتے ہیں کہ P. xylostella infestation اور زخموں سے RPX1 پروٹین کی تنزلی ہوتی ہے، جو کہ بدلے میں پودوں کے کیڑوں کے خلاف مزاحمت کا باعث بن سکتی ہے۔

2|مواد اور طریقے

2.1|پودوں کا مواد اور نشوونما کے حالات

عربیڈوپسس کے بیج نوٹنگھم عربیڈوپسس اسٹاک سینٹر (NASC، http://Arabidopsis.info/) سے منگوائے گئے تھے۔ بیجوں کو سطحی جراثیم سے پاک کیا گیا تھا، مراشیج اور اسکوگ (MS) میڈیم پر بویا گیا تھا، اور 3 دن کے لیے ایک مختصر دن کے فوٹو پیریڈ (8 گھنٹے روشنی، 16 گھنٹے اندھیرے) کے تحت گروتھ چیمبر میں 5 ڈگری پر درجہ بندی کی گئی تھی۔ اس کے بعد انہیں عام پودوں کی دیکھ بھال کے ساتھ طویل دن کے فوٹو پیریڈ (16 گھنٹے روشنی، 8 گھنٹے اندھیرے) کے تحت گرین ہاؤس میں 22 ڈگری پر منتقل کیا گیا۔

2.2|چوائس (ترجیح) اور بغیر انتخاب کے تجربات اور بائیوسیز

P. xylostella کے انڈے Henan Jiyuan Baiyun کمپنی سے خریدے گئے تھے (Cat: HJB004، 2009 میں تیار کیا گیا، ایک کنٹرول شدہ ماحول میں سائنسی تحقیق کے لیے پروپیگنڈہ کیا گیا) اور ایک گروتھ چیمبر میں 26 ڈگری، 16 h light/8 h اندھیرے پر رکھا گیا۔ انتخاب کے تجربات کے لیے، ہم نے 3 ہفتے پرانے عربیڈوپسس پلانٹس (بالترتیب آٹھ جنگلی قسم کے اور اتپریورتی پودے) کو ٹیسٹ ٹینک میں منتقل کیا جو شیشے کی ٹیسٹ ٹیوب کے ہر سرے سے جڑے ہوئے تھے، اور باقی تجرباتی اقدامات کیے گئے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے ( چن ایٹ ال، 2021)۔ چوتھے انسٹار لاروا کا استعمال کیا گیا تھا اور ہر تجرباتی نقل میں 15 لاروا شامل کیے گئے تھے۔

غیر انتخابی تجربے کے لیے، 3 ہفتے پرانے جنگلی قسم کے اور اتپریورتی پودوں کو علیحدہ اور نیم کھلے ہوئے پیٹری ڈشوں میں منتقل کیا گیا جس میں 15 ایس انسٹار P. xylostella لاروا کی ایک ہی تعداد تھی۔ اس کے بعد کے اقدامات انجام دیئے گئے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (چن ایٹ ال۔، 2021)۔

مردوں کے لئے cistanche فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط

2.3|P. xylostella کے خلاف مزاحم Arabidopsis mutants کی اسکریننگ

ہم نے P. xylostalle ریزسٹنس اسکریننگ کے لیے Arabidopsis کے 179 T-DNA داخل کرنے والے اتپریورتیوں کو جمع کیا۔ اتپریورتیوں کو MS میڈیم پر اگایا گیا تھا اور P7 برتنوں (سائز: 7 × 7 سینٹی میٹر) میں طویل دن کی نشوونما کے حالات (22 ڈگری، 16 گھنٹے روشنی/8 گھنٹہ تاریک) میں ٹرانسپلانٹ کیا گیا تھا۔ ممکنہ ماحولیاتی اثرات سے بچنے کے لیے، ہم نے روزانہ برتنوں کو حرکت دی اور گھمائی۔ ابتدائی اتپریورتی اسکریننگ کے لیے، ہم نے ہر ایک اتپریورتی کو دو برتنوں میں بڑھا کر دو نقلیں ترتیب دیں، جس میں Col-0 پلانٹس بطور کنٹرول ہیں۔ ٹرانسپلانٹنگ کے بعد 2 ہفتوں کی نشوونما کے بعد، تمام اتپریورتیوں کو تھرڈ انسٹار P. xylostella لاروا کا Col-0 کے ساتھ موازنہ کرکے ترجیحی ٹیسٹ کا نشانہ بنایا گیا، جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ Col-0 سے مختلف لاروا ترجیحات کو ظاہر کرنے والے اتپریورتیوں کو امیدوار کے خلاف مزاحم یا حساس اتپریورتی سمجھا جاتا تھا اور انہیں مزید تجرباتی توثیق اور فنکشنل اسٹڈیز کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔

2.4|پلازمیڈ کی تعمیر اور جین کی تبدیلی

RPX1pro: RPX1 کنسٹرکٹ کے لیے، RPX1 جینومک کوڈنگ ریجن جس میں 1.6 kb اپ اسٹریم سیکوئنس اور 1 kb ڈاون اسٹریم سیکوئنس Col-0 سے نکالے گئے جینومک ڈی این اے سے پی سی آر ایمپلیفائیڈ تھا۔ جمع شدہ ڈی این اے کے ٹکڑے کو pGreenII-0179 ویکٹر میں کلون کیا گیا تھا اور فلورل ڈپ طریقہ (Clough & Bent, 1998) کا استعمال کرتے ہوئے rpx1-1 اتپریورتی میں تبدیل کیا گیا تھا۔ RPX1pro کی تعمیر کے لیے: RPX1‐GFP، RPX1 پروموٹر (1.6 kb)، کوڈنگ ریجن، اور 1 kb 3′ غیر ترجمہ شدہ ترتیب کول‐0 جینومک ڈی این اے سے پی سی آر ایمپلیفائیڈ کیے گئے تھے۔ جی ایف پی کے ٹکڑے کو پلاسمیڈ سے بڑھا دیا گیا تھا جس میں جی ایف پی کی ترتیب تھی۔ ان ڈی این اے کے ٹکڑوں کو pGreenII-0179 ویکٹر میں کٹ اور ligation کا طریقہ استعمال کرتے ہوئے جمع کیا گیا تھا اور پھر ایک rpx1-1 اتپریورتی میں تبدیل کیا گیا تھا۔ 35Spro: RPX1-FLAG کنسٹرکٹ کے لیے، RPX1 کوڈنگ کے سلسلے کو PCR-ایمپلیفائیڈ cDNA سے ریورس-ٹرانسکرائبڈ Col-0 mRNA سے کیا گیا تھا۔ پی سی آر کے ٹکڑے کو انفیوژن طریقہ (کلونٹیک) کا استعمال کرتے ہوئے pCambia1300-FLAG ویکٹر میں کلون کیا گیا تھا اور Col-0 میں تبدیل کیا گیا تھا۔ 35Spro: PEN1، 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) اور 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): ان جینوں کے کوڈنگ کے سلسلے کو PCR سے بڑھا کر Col-lig-0 cDNA، اور p3GL-5 جی ایل میں بنایا گیا تھا۔ PEN1 کو نشانہ بنانے والا ایک مصنوعی مائیکرو آر این اے (amiR) ڈیزائن کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (Schwab et al.، 2006)، پلاسمڈ pRS300 کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کرتے ہوئے بڑھایا گیا، اور pCambia1300m ویکٹر کے ترمیم شدہ ورژن میں باندھا گیا۔ تمام پرائمر ترتیب معاون معلومات: ٹیبل S1 میں درج ہیں۔

2.5|P. xylostella لاروا میں glutathione s-transferase (GST) اور cytochrome P450 (CYP450) کی سرگرمی کے جائزے

دوسرے انسٹار P. xylostella لاروا کو 72 گھنٹے تک Col-0 یا rpx1-1 پودے کھلائے جانے کے بعد، انہیں اکٹھا کیا گیا اور مائع نائٹروجن میں باریک پاؤڈر میں پیس دیا گیا۔ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, cat: A004) اور CYP450 سرگرمی تجزیہ کٹس (Beijing Huabaitai Biology Company, cat: P450) کا استعمال کرتے ہوئے اسسیس کو انجام دیا گیا۔ ہر پرکھ میں تین حیاتیاتی نقلیں تھیں، اور ہر نقل 30 P. xylostella لاروا پر مشتمل تھی۔

2.6|Smurf assays

تین ہفتے پرانے Col-0 یا rpx1-1 پودے دوسرے انسٹار P. xylostella لاروا کو کھلانے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ پرکھ کی گئی تھی جیسا کہ پہلے معمولی ترمیم کے ساتھ بیان کیا گیا تھا (چن ایٹ ال۔، 2021)۔ چھ حیاتیاتی نقلیں استعمال کی گئیں، اور ہر نقل میں 15 P. xylostella لاروا تھا۔

2.7|لاروا کی PM ساخت کا خوردبینی مشاہدہ

لاروا پی ایم ڈھانچے کا اناٹومی تجزیہ اور لاروا آنت کا پیرافن کراس سیکشن تجزیہ کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (چن ایٹ ال۔، 2021)۔

2.8|جین کے اظہار کا تجزیہ اور ٹرانسکروم کی ترتیب (RNA-seq)

Col-{{0}} اور rpx1-1 پودے 22 ڈگری پر ایک طویل دن کی نشوونما کی حالت (16 گھنٹے روشنی، 8 گھنٹے اندھیرے) میں اگائے گئے تھے۔ دو ہفتے پرانے Col-0 اور rpx1-1 کے پودے ٹرانسکرپٹوم کی ترتیب کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ ہر نمونے میں تین حیاتیاتی نقلیں تھیں۔ کل RNA RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN، کیٹلاگ نمبر: DP441) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ فرسٹ اسٹرینڈ سی ڈی این اے کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق ون سٹیپ آر ٹی سسٹم (ٹاکارا بائیو) کا استعمال کرتے ہوئے ریورس ٹرانسکرپشن کے ذریعے ترکیب کیا گیا تھا۔ QRT-PCR معاون معلومات میں درج جین کے مخصوص پرائمر کے ساتھ انجام دیا گیا تھا: Roche Light Cycler 480 آلہ پر ٹیبل S1۔ RNA-seq لائبریریوں کی تعمیر اور ترتیب ایک Illumina HiSeq پلیٹ فارم پر بائیو مارکر (بیجنگ، چین) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دی گئی۔ آخر میں، ہم نے edgeR کو امتیازی اظہار کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا (اہم فرق کی حد مقرر کی گئی تھی:|log2foldchange|1 سے بڑا یا اس کے برابر، p <0.05)۔ Col-0 اور rpx1-1 کے لیے تین حیاتیاتی نقلیں انجام دی گئیں، اور مختلف جینز ڈیٹا سیٹ S1 میں درج ہیں۔

2.9|Arabidopsis میں DMNT اور DMNT-2 H کا نکالنے اور گیس کی کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری (GC-MS) تجزیہ

ڈی ایم این ٹی نکالنے اور تجزیہ کیے گئے جیسا کہ پہلے معمولی ترمیم کے ساتھ بیان کیا گیا تھا (سہرابی ایٹ ال۔، 2015)۔ اسسیس میں، 2 جی 3 ہفتے پرانے عربیڈوپسس کے بیجوں کو ڈی ایم این ٹی نکالنے اور پیمائش کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

Cistanche Enhance Immunity مصنوعات دیکھنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید پوچھیں】 ای میل:cindy.xue@wecistanche.com / واٹس ایپ: 0086 18599088692 / وی چیٹ: 18599088692

2.10|DMNT کی تیاری اور خصوصیات

ڈی ایم این ٹی کی ترکیب کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا، معمولی ترمیم کے ساتھ (HJ ہوانگ اور یانگ، 2007)۔ مختصراً، ٹیفلون لیپت مقناطیسی سٹرنگ بار سے لیس ایک 500 ملی لیٹر گول نیچے والا فلاسک 1 جی (6.48 ملی میٹر) ایلیلک الکحل اور 50 ملی لیٹر ڈائیکلورومیتھین سے چارج کیا گیا تھا۔ محلول کو بھرپور طریقے سے ہلایا گیا اور 3.6 جی فعال مینگنیج ڈائی آکسائیڈ کے ساتھ علاج کیا گیا، اس کے بعد رد عمل کی تکمیل تک ہر 2-3 گھنٹے میں 1-2 جی آکسیڈینٹ کا اضافہ کیا گیا۔ اس کے بعد مصنوع کا استعمال witting ردعمل کے ذریعے مطلوبہ مرکب پیدا کرنے کے لیے کیا جاتا تھا۔ DMNT کی ساخت اور پاکیزگی کی تصدیق 1 H جوہری مقناطیسی گونج (NMR) اور 13C NMR سپیکٹروسکوپک طریقوں سے ہوئی۔

2.11|P. xylostella کا DMNT علاج

اسیس کو پیٹری ڈشز میں انجام دیا گیا تھا جس میں ایک سے زیادہ سوراخوں والی واضح کلنگ پلاسٹک فلموں سے ڈھکا ہوا تھا۔ DMNT کو پیرافین آئل (Sigma-Aldrich) میں مطلوبہ خوراک (2.5 nmol/L−25 μmol/L) میں پتلا کر کے چارے میں انجکشن لگایا گیا جیسا کہ متن میں بیان کیا گیا ہے۔ تمام اسیس چھ حیاتیاتی نقلوں میں انجام دیئے گئے تھے ، ہر ایک نقل 15 لاروا پر مشتمل تھی۔ لاروا کی نمو فوٹو گرافی کی دستاویزات کے ذریعہ ریکارڈ کی گئی۔ پیرافین آئل سالوینٹس کے ایک ہی حجم کے ساتھ چارے کو ایک کنٹرول کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔

2.12|Arabidopsis seedlings میں JA اور SA کے مواد کی پیمائش

نانجنگ کنوینسڈ-ٹیسٹ ٹیکنالوجی کمپنی کی طرف سے جانچ کی گئی۔ دو ہفتے پرانے Col-{{0}} اور rpx1-1 کے پودے 15 s-instar P. xylostella لاروا سے متاثر ہوئے تھے، جس میں ایک کنٹرول کے طور پر غیر متاثرہ پودوں کے ساتھ۔ ہم نے انفیکشن گروپ کے ہر پودے پر دو لاروے رکھے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ تمام پودے متاثر ہوئے ہیں۔ 24 گھنٹے کے بعد، پودوں کے نمونے جمع کیے گئے اور JA اور SA کے تعین کے لیے مائع نائٹروجن میں جلدی سے منجمد کر دیے گئے۔ نمونوں کو مائع نائٹروجن میں ایک باریک پاؤڈر پر گراؤنڈ کیا گیا اور آئسوپروپینول-واٹر-ہائیڈروکلورک ایسڈ نکالنے کے محلول کے ساتھ نکالا گیا، اس کے بعد ڈیوٹریٹڈ سیلیسیلک ایسڈ (D-SA) اور dihydro jasmonic acid (2HJA) (1 ug) کا اضافہ کیا گیا۔ /ml ہر) اندرونی معیارات کے طور پر۔ اس کے بعد Dichloromethane کو شامل کیا گیا، اور اس محلول کو 30 منٹ تک روٹیٹر پر اچھی طرح ملایا گیا۔ 13،{{1{{20}}} rpm پر سنٹرفیوگریشن کے ذریعے نچلا نامیاتی مرحلہ حاصل کرنے کے بعد، اسے نائٹروجن کے ساتھ خشک کر کے اڑا دیا گیا، میتھانول میں دوبارہ تحلیل ہو گیا (0 .1% فارمک ایسڈ)، اور پھر 10 منٹ کے لیے 13،000 جی پر سینٹری فیوج کیا گیا۔ آخر میں، سپرنٹنٹ کو 0.22 μm نامیاتی فلٹر جھلی کے ذریعے فلٹر کیا گیا اور ماس اسپیکٹومیٹری (HPLC-MS/MS) کے ساتھ مل کر اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ نکالنے کے تمام اقدامات 4 ڈگری پر کیے گئے تھے۔ JA اور SA کی شناخت کا تعین ہدف والے مادوں کے چوٹی کے وقت اور متعلقہ آئنوں کے ماس ٹو چارج تناسب (m/z) کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔ JA اور SA کی مقدار کو اندرونی معیاری منحنی خطوط سے حاصل کردہ لکیری رجعت مساوات کا استعمال کرتے ہوئے لگایا گیا تھا۔ اندرونی معیاری منحنی خطوط کے حصول کے لیے، SA اور JA معیاری حل 0.1, 0.2, 0.5, 2, 5, 20, 50, اور 200 ng/ml کے گریڈینٹ کے ساتھ میتھانول (0.1% فارمک ایسڈ) کو سالوینٹ کے طور پر استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے، اور 20 ng/ml کی حتمی حراستی کے ساتھ اندرونی معیاری حل اصل پلاٹ میں شامل کیے گئے۔ لکیری بے ضابطگیوں کو معیاری منحنی خطوط کی مساوات سے ہٹا دیا گیا تھا۔ JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936)۔

2.13|عربیڈوپسس میں ڈی ایم این ٹی نقل و حمل کا تجزیہ

ڈی ایم این ٹی کو ڈی ایم ایس او میں تحلیل کیا گیا تھا اور بغیر گلوکوز کے ایم ایس میڈیم میں شامل کیا گیا تھا۔ تین ہفتے پرانے Arabidopsis پودوں کو ٹیسٹ ٹیوب میں منتقل کیا گیا اور ان کی جڑوں کو DMNT یا DMSO (کنٹرول) کے ساتھ MS میڈیم میں ڈبو دیا گیا۔ آلودگی کو روکنے کے لیے، ٹیسٹ ٹیوبوں کو پیرا فلم کی دو تہوں سے ڈھانپ دیا گیا تھا، اور فلم میں ایک چھوٹا سا سوراخ کیا گیا تھا، جس کے ذریعے پودوں کی جڑوں کو مزید بڑھنے کے لیے MS میڈیم میں رکھا گیا تھا۔ 24 گھنٹے کے بعد، علاج شدہ پودوں کی جڑیں ہٹا دی گئیں اور ان کے پتے P. xylostella کو کھلانے کے لیے استعمال کیے گئے، اور پھر لاروا کی بقا اور پیپشن کی شرح کا تجزیہ کیا گیا۔ اسی تجربے کو گروتھ میڈیم کے ساتھ دہرایا گیا جس میں یا تو 2 H- لیبل لگا DMNT یا DMSO بطور کنٹرول تھا۔ انکیوبیشن کے 24 گھنٹے کے بعد، پتے جمع کیے گئے اور GC-MS تجزیہ کے لیے کارروائی کی گئی۔ اس امکان کو مسترد کرنے کے لیے کہ DMNT DMNT میڈیم سے ہوائی حصوں تک اتار چڑھاؤ کا باعث بن سکتا ہے اور ٹریسنگ آلودگی کا سبب بن سکتا ہے، اسی طرح ایک کنٹرول گروپ قائم کیا گیا تھا، لیکن پودوں کی جڑیں نم روئی کے ساتھ دفن تھیں اور انہیں DMNT میڈیم میں نہیں ڈبویا گیا تھا۔ 24 گھنٹے کے بعد، GC-MS کا استعمال کرتے ہوئے مزید بائیو ایسے یا DMNT کا پتہ لگانے کے لیے فضائی حصوں کی کٹائی کی گئی۔

cistanche tubulosa کے فوائد- مدافعتی نظام کو مضبوط کرنا

2.14|P. xylostella infestation اور زخموں کے علاج کے بعد Arabidopsis میں RPX1 کا پروٹین نکالنا اور امیونو بلوٹنگ تجزیہ

ہم نے ٹرانسجینک RPX1pro پر دو طرح کے علاج ترتیب دیے ہیں: RPX1-GFP اور 35Spro: RPX1-FLAG Arabidopsis seedlings: P. xylostella infestation and زخم۔ لاروا کی افزائش کے لیے، ہم نے 2 ہفتوں کے لیے عربیڈوپسس کے پودے اگائے اور انہیں دوسرے انسٹار لاروا کو کھلایا (ہر ایک پودے پر کم از کم ایک لاروا رکھیں)، 15-120 منٹ کے بعد، لاروا ہٹا دیا گیا، اور متاثرہ پودوں کو منتخب کیا گیا اور ان کی کٹائی کی گئی۔ مزید تجربات. زخموں کی نقل کرنے کے لیے، ہم نے 1 ملی لیٹر سرنج کی سوئی کا استعمال کیا تاکہ ہر عربیڈوپسس کے پتے میں ایک سوراخ بنایا جا سکے۔ 15-120 منٹ کی ترقی کے بعد، پودے اکٹھے کیے گئے۔

اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا P. xylostella سے متاثرہ پودے RPX1 کے انحطاط کا باعث بن سکتے ہیں، ہم نے P. xylostella کے ساتھ Col-0 seedlings کو 15−120 منٹ تک متاثر کیا اور ٹرانسجینک پودوں میں RPX1-GFP پر اس کے اثر کا تجربہ کیا۔ تمام نمونوں کو مائع نائٹروجن میں پاؤڈر بنا دیا گیا، اور پھر مساوی مقدار میں متاثرہ اور غیر متاثرہ Col-0 کو الگ الگ اسی مقدار میں RPX1-GFP ٹشوز کے ساتھ ملایا گیا اور 15 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر محلول میں انکیوبیٹ کیا گیا۔ آخر میں، مرکب کو سینٹرفیوج کیا گیا، اور سپرنٹنٹ کو امیونو بلوٹنگ تجزیہ کا نشانہ بنایا گیا۔ مغربی دھبے کے تجزیہ کے لیے، کل پروٹین پروٹین نکالنے والے بفر [50 mmol/L Tris-HCl pH8.0، 2.5 mmol/L EDTA pH8.0، 150 mmol/L NaCl، 1/1000 IGPAL ( v/v)، 10% گلیسرول (v/v)، 7% 2-mercaptoethanol (v/v)، 1 mmol/L PMSF اور 1×proteinase inhibitor cocktail (Roche)]۔ اس کے بعد پروٹین کے عرق کو GFP (Roche، dilution: 1/1000) اور FLAG (Abcam، dilution: 1/2000) کے خلاف اینٹی باڈیز کے ساتھ PAGE علیحدگی اور امیونو بلوٹنگ تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا۔ Tanon 5200 chemiluminescence analysis system کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں۔

3|نتائج

3.1|Arabidopsis rpx1 mutant نے P. xylostella کے خلاف مزاحمت کو بہتر کیا ہے۔

P. xylostella مزاحمت میں ملوث جینوں کی شناخت کے لیے، ہم نے 179 Arabidopsis mutants کو اکٹھا کیا اور انہیں ایک کنٹرول شدہ گرین ہاؤس میں اگایا۔ ٹرانسپلانٹیشن کے دو ہفتے بعد، ہم نے تھرڈ انسٹار P. xylostella لاروا کا ترجیحی ٹیسٹ کیا، ہر ایک اتپریورتی اور جنگلی قسم کے Col-0 کے جواب میں۔ اس اسکریننگ کے تجربے میں، 15 اتپریورتیوں نے لاروا کی ترجیح پر مختلف اثرات دکھائے (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)، اور ان میں سے ایک کو اس مطالعے کے لیے منتخب کیا گیا اور اسے rpx1-1 (P. xylostella کے خلاف مزاحمت) کے طور پر نامزد کیا گیا۔ RPX1 ناول کیپ بائنڈنگ پروٹین (nCBP) (Ruud et al.، 1998) کے لیے انکوڈ کرتا ہے۔ T-DNA داخل کرنے والا اتپریورتی SALK_131503 تھا، اور RPX1 کا جین ایکسپریشن جنگلی قسم کے Col-0 (شکل 1a، معاون معلومات: Figure S1a، معاون معلومات: ٹیبل) کے مقابلے میں نمایاں طور پر گھٹ گیا تھا۔ S1)۔ قریب میں لگائے جانے پر، rpx1-1 پودوں نے جنگلی قسم کے پودوں کے مقابلے P.xylostella لاروا کے نقصان کی نمایاں طور پر کم سطح کو ظاہر کیا (معاون معلومات: Figure S1b)۔

شکل 1 RPX1 کو غیر فعال کرنا Arabidopsis میں Plutella xylostella کے خلاف مزاحمت فراہم کرتا ہے۔ (a) RPX1 کی جین کی ساخت (At5g18110)۔ نارنجی خانے ایکسونز کی نشاندہی کرتے ہیں اور ٹھوس لکیریں انٹرن اور غیر ترجمہ شدہ خطوں کی نمائندگی کرتی ہیں۔ SALK_131503 میں T-DNA داخل کرنا، جس کا نام rpx1-1 ہے، چوتھے ایکسون پر ہے۔ (b) P. xylostella لاروا ترجیحی طور پر جنگلی قسم کی Col-0 اور RPX1 تکمیلی لائنوں کی طرف بڑھتے ہیں (RPX1pro:RPX1/rpx1-1, RPX1com)، rpx1-1 کے مقابلے میں۔ (c‐) کولن کا موازنہ 0، rpx1-1، اور RPX1com پتے P. xylostella سے متاثر ہوتے ہیں۔ (d) P. xylostella لاروا rpx1-1 سے شدید متاثر ہوئے، ان کے مقابلے میں جنگلی قسم کے Col-0 اور RPX1com لائنوں پر، لاروا کے قد، سائز اور رنگ سے متعلق۔ (e، f) P. xylostella لاروا جو rpx1-1 کے ساتھ کھلایا جاتا ہے وہ زیادہ شرح اموات (e) اور کم پیپیشن (f) کی شرح جنگلی قسم کی Col-0 اور RPX1com لائنوں کے نسبت ظاہر کرتا ہے۔ (g, h) rpx1-1 پودوں کو کھلائے جانے والے P. xylostella لاروا نے glutathione S-transferase (GST, g) اور cytochrome P450 (CYP450, h) کی سرگرمیوں میں اضافہ کیا ہے، جبکہ RPX1com سے کھلائے جانے والے لاروا میں، سرگرمیوں نے ان سے کوئی فرق نہیں دکھایا۔ Col-0 پر۔ (b, e–h) میں، اعداد و شمار کو اوسط ± sem کے طور پر پیش کیا جاتا ہے ہر علاج میں مختلف حروف ایک اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (متغیر کا یک طرفہ تجزیہ، n=3 کے لیے b, g, h, n {{ 36}} کے لیے ای، ایف)۔

P. xylostella infestation کے خلاف rpx1-1 مزاحمت کے بنیادی طریقہ کار کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے ترجیحی اور غیر انتخابی ٹیسٹ کیے ہیں۔ ترجیحی تجربات میں، P. xylostella لاروا کو 10–6{{11} کے بعد Col-0 اور rpx1-1 seedlings سے مساوی فاصلے پر گلاس ٹیسٹ ٹیوب کے مرکز میں رکھا گیا تھا۔ } منٹ، rpx1-1 سائیڈ کے مقابلے میں Col-0 طرف نمایاں طور پر زیادہ لاروا جمع ہوئے (شکل 1b)۔ غیر انتخابی تجربات میں، ہم نے Col-0 اور rpx1-1 کے پودوں کو P. xylostella لاروا کو الگ سے کھلایا اور مشاہدہ کیا کہ Col-0 نے rpx1-1 اتپریورتی (شکل 1c) سے زیادہ پتوں کے ٹشوز کھوئے۔ اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ RPX1 مشاہدہ شدہ مزاحمت کے لیے کارآمد جین تھا، ہم نے RPX1 کی تکمیلی تعمیر کو rpx1-1 اتپریورتی میں متعارف کرایا۔ یہ RPX1 تکمیلی لائنیں (RPX1pro: RPX1/rpx1-1, RPX1com) P. xylostella انفیکشن کے لیے حساس تھیں، جیسا کہ ترجیح اور غیر انتخابی ٹیسٹ (شکل 1b,c) سے طے ہوتا ہے، جو تجویز کرتا ہے کہ RPX1 Arabidopsis torises میں ملوث ہے۔ P. xylostella.

3.2|P. xylostella لاروا کی نشوونما rpx1-1 اتپریورتن سے منفی طور پر متاثر ہوتی ہے۔

rpx1-1 اتپریورتیوں کے ساتھ کھانا کھلانے کے لیے P. xylostella کے جسمانی ردعمل کی چھان بین کے لیے، ہم نے Col-0، rpx1-1، اور RPX1com لائنوں کے 3 ہفتے پرانے پودوں کے ساتھ کھانا کھلانے کے بعد لاروا کی نشوونما کا معائنہ کیا۔ rpx1-1 پودوں کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا نے جسمانی سائز کے لحاظ سے شدید سمجھوتہ شدہ نشوونما کو ظاہر کیا۔ لاروا کے جسم کا رنگ بھی کول-0 پودوں سے کھلائے جانے والے لاروا سے مختلف تھا۔ تاہم، ہم نے RPX1com seedlings (شکل 1d) کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا میں ایسی تبدیلیوں کا مشاہدہ نہیں کیا۔ مزید فینوٹائپک تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ rpx1-1 کے ساتھ کھلائے جانے والے P. xylostella لاروا میں Col-0 یا RPX1com (شکل 1e,f) سے کھلائے جانے والوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ شرح اموات اور پیپشن کی شرح کم تھی۔ اس کے علاوہ، rpx1-1 کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا نے GST اور CYP450 کی اعلی انزیمیٹک سرگرمیوں کی نمائش کی، جو کہ اعضاء یا بافتوں کو پہنچنے والے نقصان کے لیے بائیو مارکر ہیں (Cheng et al., 2018; Mikstacki et al., 2015)، Col-0 اور RPX1com (شکل 1g,h)، تجویز کرتا ہے کہ لاروا ٹشو rpx1-1 کو کھلانے سے زخمی ہو سکتا ہے۔

3.3|P. xylostella لاروا کے مڈ گٹ rpx1-1 پودوں کے ساتھ کھانا کھلانے کے بعد خراب ہو جاتے ہیں۔

ہم نے مشاہدہ کیا کہ rpx1-1 کھلایا ہوا لاروا پودوں کے کم بافتوں کو کھاتا ہے اور جنگلی قسم کے Col-0 سے کھلائے جانے والوں کے مقابلے میں بہت کم فضلہ پیدا کرتا ہے۔ لہذا، ہم نے قیاس کیا کہ rpx1-1 کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کا عمل انہضام متاثر ہو سکتا ہے۔ یہ چیک کرنے کے لیے کہ آیا rpx1-1 کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کی آنت میں رساو ہوا ہے، ہم نے 'سمرف ٹیسٹ' کیا۔ جنگلی قسم کے Col-0 اور RPX1com لائنوں کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا نے ڈائی کو خارج کر دیا، اور لاروا کے جسم میں بصری طور پر کوئی رنگ نہیں بچا تھا، جب کہ rpx1-1- کھلائے جانے والے لاروا نے رنگ کی خاصی مقدار برقرار رکھی۔ مڈ گٹ اور آس پاس کے ٹشوز، اور لاروا نیلے ہو گئے (شکل 2a)۔ نیلے ('Smurf') اور نارمل ('no Smurf') لاروا کے مقداری تجزیے سے معلوم ہوا کہ rpx1-1 پودوں کو کھلانے کے نتیجے میں جنگلی قسم کے کولن کے ساتھ کھلائے جانے والے افراد کے مقابلے میں تین گنا سے زیادہ افراد 'Smurf' دکھاتے ہیں۔ 14}} یا RPX1com (شکل 2b)۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ rpx1-1 کو کھانا کھلانے سے لاروا کے مڈ گٹ میں گھاووں اور زیادہ پارگمیتا کا سبب بن سکتا ہے۔

3.4|P. xylostella کا پیریٹروفک میٹرکس rpx1-1 پودوں کو کھلانے سے خراب ہوتا ہے۔

ہم نے ایک سٹیریو مائکروسکوپ کے تحت ساختی تجزیہ کے لیے Col‐{{0}}، rpx1-1، اور RPX1com کے بیجوں کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا سے پیریٹروفک میٹرکس (PM) کو مزید الگ کیا اور الگ کیا۔ Col-0 اور RPX1com کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کے برقرار اور ساہول PM کے مقابلے میں، rpx1-1 کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا نے نقصان کی خصوصیات کو ظاہر کیا اور وہ پتلے، ڈھیلے اور منقطع تھے (شکل 2c–f)۔ PM کے نقصان کی خصوصیات کی مزید تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے لاروا کے نمونوں کے ٹرانسورس سیکشنز حاصل کیے۔ Hematoxylin-eosin (HE) کے داغدار نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ Col-0 کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کا PM موٹا اور برقرار تھا اور یہ کہ PM اور مڈگٹ ایپیڈرمل خلیوں (شکل 2g) کے درمیان ایک ایکٹوریٹروفک اسپیس (ES) موجود تھی۔ اس کے برعکس، rpx1-1 کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کے مڈ گٹ میں PM شدید طور پر متاثر ہوا، اور آنتوں کے مواد آنتوں کی دیوار کے قریب تھے (کوئی نہیں، شکل 2h)۔ جب لاروا کو RPX1com کے پودوں سے کھلایا جاتا تھا، تو ان کے PM اور ES میں نمایاں طور پر کوئی تبدیلی نہیں کی جاتی تھی (شکل 2i، j)۔ یہ نتائج اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ RPX1 دستک ڈاؤن نے P. xylostella لاروا کے PM کو نقصان پہنچایا ہے۔

3.5|rpx1-1 میں DMNT مواد کا جمع ہونا P. xylostella لاروا کے خلاف مزاحمت فراہم کرتا ہے۔

یہ جانچنے کے لیے کہ آیا RPX1 کا ناک ڈاؤن عربیڈوپسس کے میٹابولائٹس کو نئی شکل دیتا ہے اور P. xylostella لاروا کے خلاف مزاحمت کا باعث بنتا ہے، ہم نے rpx1-1 اور جنگلی قسم کے Col-0 پلانٹ سے جاری ہونے والے غیر مستحکم نامیاتی مرکبات (VOCs) کا موازنہ کیا۔ چار VOCs (Hexanol,3-ethyl-5methyl, Octance,2,6-dimethyl, Nonane,2,6-dimethyl, اور DMNT) rpx1-1 اور Col-0 (شکل 3a) کے درمیان مختلف طریقے سے جمع کیے گئے تھے۔ P. xylostella resistance میں rpx1-1 کے مالیکیولر میکانزم کو مزید جدا کرنے کے لیے، ہم نے RNA-seq تجزیہ کیا۔ Col-0 کے مقابلے میں، rpx1-1 اتپریورتی نے 211 مختلف قسم کے جینز (DEGs) کی نمائش کی (معاون معلومات: ڈیٹا سیٹ S1)۔ KEGG کی افزودگی کے تجزیہ نے اشارہ کیا کہ یہ DEGs 20 سے زیادہ مختلف میٹابولک راستوں سے تعلق رکھتے ہیں، بشمول sesquiterpenoid اور triterpenoid biosynthesis، alpha-linolenic acid metabolism، اور tyrosine metabolism pathways (Figure 3b: Supporting Information)۔ خاص طور پر، سب سے نمایاں طور پر افزودہ راستہ sesquiterpenoids اور triterpenoids کا بایو سنتھیسس تھا، جو تین DEGs پر مشتمل تھا: At4g15340، At5g42600، اور At5g48010 (شکل 3b، معاون معلومات: Figure S2a–c)۔ At4g15340 کو PEN1 کے لیے انکوڈ کرنے کی اطلاع دی گئی ہے، ایک آکسیڈوسکولین سائکلیس جو 2,3-آکسیڈوسکولین کو arabidiol میں تبدیل کرتا ہے اور CYP705A1 (فیلڈ اینڈ اوسبورن، 2008؛ سہرابی ال۔205) کے ذریعے بائیو ایکٹیو DMNT کی ترکیب کی طرف لے جاتا ہے۔ At5g42600 معدنی ترکیب 1 (MRN1) کے لیے انکوڈ کرتا ہے، جو معدنی بایو سنتھیسز میں کلیدی جزو ہے۔ At5g48010 تھیلینول سنتھیس (THAS) کے لیے انکوڈ کرتا ہے، جو ایک انزائم ہے جو تھیلینول بائیو سنتھیسز میں شامل ہے۔ مارنرل اور تھیلینول پودوں کی نشوونما کی دیکھ بھال میں ملوث ہونے کی اطلاع دی گئی ہے (فیلڈ اینڈ اوسبورن، 2008؛ گو ایٹ ال۔، 2012) (معاون معلومات: شکل S3)۔ ہم نے کیڑوں کے خلاف مزاحمت میں MRN1 اور THAS کے ممکنہ کرداروں کا مطالعہ P. xylostella کی ترجیحات، شرح اموات، اور pupation کی شرحوں کی چھان بین کر کے انہیں ٹرانسجینک Arabidopsis seedlings کے ساتھ کھلا کر کیا جو MRN1 (35Spro: MRN1) اور THAS (35Sporting) معلومات: شکل S4a,b)۔ دو ٹرانسجینز اور جنگلی قسم کے Col-0 (معاون معلومات: Figure S4c–n) کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ rpx1-1 کی کیڑوں کی مزاحمت کا امکان ان دو جینوں پر منحصر نہیں ہے۔

شکل 2 RPX1 غیر فعال ہونے سے لاروا مڈگٹ میں پیریٹروفک میٹرکس (PM) ڈھانچے کو نقصان پہنچتا ہے۔ (a) کول-0، rpx1-1، اور RPX1com لائنوں کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کی نمائندہ تصویریں جو کہ رنگ کی برقراری کو ظاہر کرتی ہیں، جیسا کہ ان کی نیلی شکل سے ظاہر ہوتا ہے، جیسے Smurf کارٹون کردار۔ (b) نتائج کی مقدار (a) میں دکھائی گئی ہے۔ ڈیٹا کو اوسط ± sem کے طور پر پیش کیا جاتا ہے؛ مختلف حروف ایک اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (تغیر کا یک طرفہ تجزیہ، n=6)۔ (c–f) Col-0 (c)، rpx1-1 (d)، اور RPX1com لائنوں (e، f) کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کا PM الٹرا سٹرکچر۔ نوٹ کریں کہ Col-0 اور RPX1com کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کا PM بولڈ اور برقرار ہے، لیکن rpx1-1 کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کا PM کچھ علاقوں میں پتلا، نازک اور منقطع ہوتا ہے۔ (g–j) ٹرانسورس سیکشن اور hematoxylin-eosin سٹیننگ Col‐0 (g)، rpx1-1 (h)، یا RPX1com لائنوں (i، j) کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا سے PM کو پہنچنے والے نقصان کو ظاہر کرتے ہیں۔ [کلر فگر کو wileyonlinelibrary.com پر دیکھا جا سکتا ہے]

KEGG تجزیہ (شکل 3b) میں terpenoid biosynthesis کی افزودگی اور rpx1-1 (شکل 3a) میں پائے جانے والے DMNT کے تفریق جمع نے تجویز کیا کہ DMNT P. xylostella کے خلاف پودوں کی مزاحمت میں شامل مرکبات میں سے ایک ہو سکتا ہے۔ پچھلی رپورٹس کی طرح جنہوں نے Col-0 (Liu et al., 2018; Sohrabi et al., 2015) میں GC-MS تجزیہ کے ذریعے بمشکل DMNT کا پتہ لگایا تھا۔ ہم غیر متاثرہ Col-0 (شکل 4a،b) میں DMNT کی ٹریس مقدار کا پتہ لگا سکتے ہیں۔ اس کے برعکس، rpx1-1 میں DMNT کی سطحیں بہت زیادہ افزودہ (~8 ng/g) تھیں، اور RPX1com لائنوں نے DMNT کی بہت کم سطح ظاہر کی، جیسا کہ Col‐0 پودوں میں ہوتا ہے (شکل 4)۔ اس کے علاوہ، P. xylostella infestation پر، DMNT کی سطح میں اضافہ ہوا (~20 ng/g) rpx1‐1 میں، جو Col‐0 اور RPX1com لائنوں میں اس سے زیادہ تھا (شکل 4) . ہم نے ایک ترمیم شدہ طریقہ استعمال کرتے ہوئے DMNT کو وٹرو میں ترکیب کیا (Chen et al., 2021)۔ پچھلے مشاہدات سے مطابقت رکھتے ہوئے (Chen et al., 2021)، DMNT نے P. xylostella کی نمو کو دبایا، جیسا کہ ترجیح (2.5 μmol/L) اور غیر انتخابی کارکردگی (0.25–25 μmol/L) سے ظاہر ہوتا ہے ( معاون معلومات: شکل S5a,b)۔ مزید برآں، ایچ ای کے داغ لگانے کے نتائج سے یہ بات سامنے آئی کہ کنٹرول لاروا کا PM موٹا اور برقرار تھا (معاون معلومات: Figure S5c)، جبکہ لاروا کا PM 2.5 μmol/L DMNT کے ساتھ 48 گھنٹے کے لیے پتلا اور کچھ علاقوں میں منقطع تھا (معاون معلومات: شکل S5d)۔ ایک ساتھ مل کر، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ rpx1-1 اتپریورتن DMNT کے جمع ہونے کا سبب بنتی ہے، جو Arabidopsis میں P. xylostella لاروا کو مارنے میں معاون ہے۔ JA اور SA پودوں کی ثانوی میٹابولائٹس ہیں جن کا حیاتیاتی تناؤ سے گہرا تعلق ہے۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا یہ مادے rpx1-1 کے کیڑوں کے خلاف مزاحمت میں حصہ ڈالتے ہیں، ہم نے P. xylostella کے انفیکشن سے پہلے اور بعد میں Col-0 اور rpx1-1 کے JA اور SA کی سطحوں کو چیک کیا۔ علاج نہ کیے جانے والے حالات میں، rpx1-1 اور Col-0 پودوں کے درمیان JA اور SA کی سطح میں کوئی خاص فرق نہیں تھا (معاون معلومات: Figure S6)، اور P. xylostella کے انفیکشن کے بعد دونوں ہارمونز کی سطح میں 24 گھنٹے میں نمایاں اضافہ ہوا۔ . خاص طور پر، انفیکشن کے بعد، Col-0 کے مقابلے rpx1-1 میں SA کا مواد نمایاں طور پر کم تھا، جبکہ JA کا مواد Col-0 کے مقابلے rpx1-1 میں بہت زیادہ تھا (معاون معلومات: Figure S6)۔

شکل 3 اتار چڑھاؤ والے مرکبات اور جین کے اظہار کا موازنہ Col-0 اور rpx1-1 کے درمیان فرق سے افزودہ۔ (a) Col-0 اور rpx1-1 میں متفرق طور پر افزودہ غیر مستحکم مرکبات کا پتہ گیس کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (GC-MS) طریقہ سے کیا گیا۔ ڈیٹا کو اوسط ± sem کے طور پر پیش کیا جاتا ہے؛ ستارے ایک اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (*p < 0۔{9}}5، **p < 0۔{14}}1، دو دم والا غیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ)۔ (b) Col-0 اور rpx1-1 کا ٹرانسکرپٹومک تجزیہ۔ Col-0 اور rpx1-1 اتپریورتی کے درمیان مختلف اظہار کردہ جینوں سے راستے کی افزودگی کا KEGG تجزیہ۔ ایک افزودہ راستہ (سرخ تیر) sesquiterpenoid اور triterpenoid biosynthesis سے متعلق ہے اور تین جینز پر مشتمل ہے، جیسا کہ تصویر میں دکھایا گیا ہے۔ [کلر فگر کو wileyonlinelibrary.com پر دیکھا جا سکتا ہے]

3.6|RPX1 PEN1 پر انحصار میں DMNT کے جمع ہونے کو منظم کرتا ہے۔

rpx1-1 ریگولیٹڈ DMNT جمع میں PEN1 کی شراکت کی چھان بین کرنے کے لیے، ہم نے مصنوعی miRNA (PEN1amiR) پر مشتمل ایک تعمیر تیار کی اور اسے rpx1-1 اتپریورتیوں میں تبدیل کیا۔ ہم نے PEN1 اوور ایکسپریشن کنسٹرکٹ بھی تیار کیا، جسے Col-0 (35pro: PEN1/Col-{{10}}) میں تبدیل کر دیا گیا۔ جین ایکسپریشن تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ PEN1 کو rpx1-1 کے مقابلے PEN1amiR/rpx1-1 میں گرا دیا گیا (4-7 گنا)، اور 35Spro میں (~2.5 گنا) زیادہ اظہار کیا گیا: PEN1 Col‐{31}} کے مقابلے میں (شکل 5a)۔ ان ٹرانسجینک لائنوں میں، RPX1 کا اظہار PEN1 دستک ڈاؤن یا اوور ایکسپریشن (شکل 5b) سے متاثر نہیں ہوا تھا۔ جب P. xylostella سے 6-24 گھنٹے تک متاثر ہوا تو، PEN1 اظہار کو Col-0 اور rpx1-1 میں نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا، اور انفیکشن کے 24 گھنٹے کے بعد rpx1-1 میں PEN1 کا بہت زیادہ اظہار حاصل کیا گیا تھا (شکل 5c) . اگلا، ہم نے Col-0، rpx1-1، PEN1amiR/rpx1-1، اور 35Spro: PEN1/Col-{{50}} میں DMNT مواد کی پیمائش کی۔ P. xylostella انفیکشن کے بغیر، rpx1-1 نے Col-0 (شکل 5d,e,f,k,l) ​​کے مقابلے DMNT کی اعلی سطح پیدا کی، اور جب PEN1 کو rpx1-1 (PEN1amiR) میں مصنوعی مائیکرو آر این اے کے ذریعے گرایا گیا۔ /rpx1-1)، DMNT کی سطح کو کم کر دیا گیا تھا، جو rpx1-1 (شکل 5d,g,h,m,n) کے مقابلے میں بہت کم سطح کی نمائش کرتا ہے۔ لاروا کی افزائش پر، Col-0 اور rpx1-1 بیجوں میں DMNT کی سطح کو نمایاں طور پر بڑھا دیا گیا تھا، لیکن PEN1amiR/rpx1-1 پودوں میں، DMNT کی سطح کی حوصلہ افزائی نہیں کی جا سکتی تھی اور یہ rpx1-5d کے مقابلے میں بہت کم تھی۔ g,h,m,n)، تجویز کرتا ہے کہ PEN1 RPX1-ریگولیٹڈ DMNT بائیو سنتھیسس میں اہم کردار ادا کر سکتا ہے، جیسا کہ معاون معلومات میں واضح کیا گیا ہے: شکل S3۔ اس سے مطابقت رکھتے ہوئے، DMNT کو 35Spro: PEN1/Col-0 کے بیجوں میں بہت زیادہ جمع کیا گیا تھا (شکل 5d, i,j,o,p)۔

شکل 4 RPX1 کے نقصان سے ڈائمتھائل-1,3,7-nonatriene (DMNT) کے جمع ہونے میں اضافہ ہوتا ہے۔ (a) Col-0، rpx1-1 اور RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1-1) لائنوں میں DMNT کا گیس کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (GC-MS) تجزیہ۔ DMNT معیار نیچے دکھایا گیا ہے۔ (b) Col-0، rpx1-1، اور RPX1com سے حاصل کردہ DMNT کی کل آئن کرومیٹوگرافی (TIC)۔ (c) DMNT مواد rpx1-1 اتپریورتی میں بڑھتا ہے لیکن RPX1com ٹرانسجینک پودوں میں جنگلی قسم کی سطح پر واپس آتا ہے۔ ڈیٹا کو اوسط ± sem کے طور پر پیش کیا جاتا ہے؛ مختلف حروف ایک اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (تغیر کا یک طرفہ تجزیہ، n=3)۔ [کلر فگر کو wileyonlinelibrary.com پر دیکھا جا سکتا ہے]

3.7|PEN1 rpx1-1 میں P. xylostella کو مارنے میں معاون ہے۔

اس مشاہدے کو دیکھتے ہوئے کہ PEN1 دستک ڈاؤن RPX1 غیر فعال ہونے (شکل 5) کے ذریعے پیدا ہونے والے DMNT جمع کو کم کر سکتا ہے، ہم نے اس کے حیاتیاتی کردار کو ظاہر کرنے کے لیے PEN1 دستک ڈاؤن اور اوور ایکسپریشن ٹرانسجینک عربیڈوپسس پر بائیوسیز کیے۔ ہم نے پایا کہ P. xylostella لاروا نے Col-0 (معاون معلومات: Figure S7) کے مقابلے amiR-PEN1/rpx1-1 پودوں کے لیے کوئی ترجیح نہیں دکھائی۔ دریں اثنا، P. xylostella لاروا کو PEN1-amiR/rpx1-1 کے ساتھ کھلائے جانے سے شرح اموات نمایاں طور پر کم اور rpx1-1 کے مقابلے میں زیادہ پیپشن کی شرح ظاہر ہوئی، جبکہ 35Spro: PEN1/Col-0 کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا نے شرح اموات میں کمی اور شرح اموات کو کم دکھایا۔ Col-0 (شکل 6a،b) کے ساتھ کھلائے جانے والے نرخوں سے۔ ان نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، مزید 'اسمرف ٹیسٹ' اور ٹرانزیکشن تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ PEN1-amiR/rpx1-1 میں rpx1-1 (شکل 6c,d,g,h) کے ساتھ کھلائے جانے والے لاروا کے مقابلے میں نارمل اور برقرار آنتیں اور PM ہیں۔ اور PEN1 کے زیادہ اظہار نے P. xylostella لاروا کے مڈگٹ اور PM کو شدید نقصان پہنچایا (شکل 6c,d, i,j)۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ PEN1 ناک ڈاؤن RPX1 غیر فعال ہونے کی وجہ سے لاروا کی نشوونما پر ہونے والے منفی اثرات کو دبا سکتا ہے، اس طرح P. xylostella لاروا پر rpx1-1-کی حوصلہ افزائی زہریلے اثر میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔

3.8|ڈی ایم این ٹی جڑوں سے عربیڈوپسس کے ہوائی حصوں تک پہنچاتا ہے۔ 

PEN1 کو بنیادی طور پر Arabidopsis roots (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (معاون معلومات: Figure S8a) میں ظاہر ہونے کی اطلاع دی گئی ہے، جو ان نتائج سے مختلف ہے جو rpx1-1 کے فضائی حصوں نے ظاہر کیے ہیں۔ P. xylostella کو PEN1 پر منحصر انداز میں زہریلا ہونا (شکل 6)۔ لہذا، ہم نے ایک متبادل مفروضہ تیار کیا: پودے بنیادی طور پر جڑوں میں DMNT کی ترکیب کرتے ہیں اور اسے فضائی حصوں میں منتقل کرتے ہیں، جہاں یہ کیڑوں کے خلاف مزاحمت کو فروغ دیتا ہے۔ اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، ہم نے دو DMNT ٹرانسپورٹ اسسز کیے ہیں۔ پہلے پرکھ (شکل 7a) میں، ہم نے DMSO کو بطور کنٹرول استعمال کرتے ہوئے، 2.5 μmol/L DMNT پر مشتمل ایک مائع پودے کی نشوونما کے درمیانے درجے میں 3‐3-ہفتے پرانی Arabidopsis seedlings کی جڑوں کو انکیوبیٹ کیا۔ 24 گھنٹے تک کاشت کرنے کے بعد، ہم نے Arabidopsis کے پتوں کو نکالا اور P. xylostella لاروا کو پیش کیا۔ ڈی ایم ایس او کنٹرول کے مقابلے میں، ڈی ایم این ٹی سے علاج شدہ پودوں کی پتیوں کی وجہ سے لاروا کی شرح اموات نمایاں طور پر زیادہ ہوتی ہے اور کنٹرول سے کم پیپشن کی شرح ہوتی ہے (شکل 7b،c)۔ دوسرے تجربے میں جس کا مقصد DMNT ٹرانسپورٹ کی مزید آزادانہ توثیق حاصل کرنا ہے، ہم نے DMNT کو 2 H کے ساتھ لیبل کیا اور DMNT-2 H کو مائع پودوں کی نشوونما کے درمیانے درجے میں شامل کیا۔ انکیوبیشن کے 24 گھنٹے کے بعد، DMNT-2 H پتوں میں بہت زیادہ افزودہ ہوا (شکل 7d–i)۔ اس امکان کو مسترد کرنے کے لیے کہ DMNT مائع نمو کے درمیانے درجے سے ہوا میں اتار چڑھاؤ پیدا کر سکتا ہے اور پودوں کے فضائی حصوں کو آلودہ کر سکتا ہے، ہم نے ایک متوازی کنٹرول قائم کیا، جو کہ شکل 7a کی طرح انجام دیا گیا تھا، سوائے اس کے کہ عربیڈوپسس کی جڑیں مائع میں ڈوبی ہوئی نہیں تھیں۔ ترقی کا ذریعہ نتائج سے معلوم ہوا کہ پودوں کے فضائی حصوں میں کوئی DMNT-2 H نہیں پایا گیا (معاون معلومات: Figure S8b,c)۔ اس طرح، ہم تجویز کرتے ہیں کہ DMNT جڑوں سے، جہاں یہ پیدا ہوتا ہے، عربیڈوپسس کے پتوں میں منتقل ہوتا ہے، جہاں یہ کیڑوں کی موت کا سبب بنتا ہے۔

شکل 5 PEN1 rpx1-1 میں dimethyl-1,3,7-nonatriene (DMNT) کے جمع ہونے میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ (a) Col-0، rpx1-1، rpx1-1 پس منظر میں PEN1 ناک آؤٹ (PEN1-amiR/rpx1-1) اور PEN1 اوور ایکسپریشن (35Spro:PEN1/Col-{{2{{2}) میں PEN1 اظہار تجزیہ 22}}}}) لائنیں (b) Col-{{30}}, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 اور 35Spro:PEN1/Col-0 میں RPX1 اظہار۔ (c) PEN1 اظہار Col-0 اور rpx1-1 میں Plutella xylostella infestation سے ہوا ہے۔ (d) Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 اور 35Spro:PEN1/Col-0 کے درمیان DMNT جمع کا موازنہ۔ (e–j) Col-0 (e)، rpx1-1 (f)، PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) سے خارج ہونے والے اتار چڑھاؤ کا گیس کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (GC-MS) تجزیہ اور 35Spro: PEN1/ Col‐0 (i، j) لائنیں۔ (k–p) DMNT کا TIC Col-0 (k)، rpx1-1 (l)، PEN1-amiR/rpx1-1 (m, n) اور 35Spro: PEN1/Col-0 (o, p) لائنوں سے لیا گیا , (e–j) میں ڈیٹا کے مطابق۔ (a-d) میں، اعداد و شمار کو اوسط ± sem کے طور پر پیش کیا جاتا ہے؛ مختلف حروف ایک اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (متغیر کا یک طرفہ تجزیہ، n=3)۔ [کلر فگر کو wileyonlinelibrary.com پر دیکھا جا سکتا ہے]

3.9|RPX1 P. xylostella کے انفیکشن اور زخموں کے علاج کے ذریعے کم ہو جاتا ہے۔

ہم نے دکھایا کہ PEN1 ایکسپریشن کو rpx1-1 میں اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا اور P. xylostella لاروا (شکل 5a,c) سے متاثرہ عربیڈوپسس سیڈلنگز، اس امکان کو بڑھاتے ہیں کہ RPX1 لاروا کے انفیکشن کا بھی جواب دے سکتا ہے۔ اس پیشین گوئی کی توثیق کرنے کے لیے، ہم نے P. xylostella infestation کے لیے RPX1 کے ممکنہ ردعمل کی چھان بین کی۔ جین کے اظہار کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ RPX1 کا اظہار مختلف ٹشوز میں کیا گیا تھا (معاون معلومات: Figure S9a)، لیکن 6–24 h لاروا انفیکشن (معاون معلومات: Figure S9b) پر کوئی خاص ردعمل نہیں تھا۔ لہذا، ہم نے RPX1pro میں RPX1 پروٹین کی سطح کی جانچ کی: RPX1-GFP ٹرانسجینک پلانٹس امیونو بلوٹنگ کا مظاہرہ کرتے ہوئے۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ لاروا کے انفیکشن کے بغیر، RPX1-GFP 0-12{{40}} منٹ کے دوران مستحکم تھا۔ اس کے برعکس، لاروا کے 15 منٹ تک انفیکشن کے بعد، RPX1-GFP کم ہونا شروع ہو گیا۔ 120 منٹ کے بعد، RPX1-GFP پروٹین تقریباً 6% آغاز کے وقت تک مسلسل نیچے چلا گیا (شکل 8a، معاون معلومات: شکل S10a)۔ ایک کنٹرول کے طور پر، GFP ٹرانسجن پر مشتمل Arabidopsis seedlings میں، GFP لاروا کے انفیکشن کے بعد نسبتاً مستحکم تھا (شکل 8b)۔ RPX1 کے استحکام پر GFP ٹیگ کے ممکنہ اثر کو مسترد کرنے کے لیے، ہم نے لاروا انفیکشن کے تجربات کرنے کے لیے FLAG ٹیگ (35Spro: RPX1-FLAG) کے ساتھ ٹرانسجینک RPX1 پلانٹس تیار کیے، جس نے مستقل نتائج ظاہر کیے کہ RPX1-FLAG کو بھی لاروال کے ذریعے خراب کیا جا سکتا ہے۔ انفیکشن، RPX1-GFP کی طرح (شکل 8c)۔ کیڑوں کا حملہ اکثر پودوں میں زخموں کا سبب بنتا ہے، اور جسمانی نقصان جزوی طور پر سبزی خور کیڑوں کے کھانے کے عمل کی نقالی کر سکتا ہے۔ یہ ظاہر کرنے کے لیے کہ آیا زخم RPX1 کی تنزلی کا باعث بن سکتا ہے، ہم نے زخموں کی نقل کرنے کے لیے پودوں کے پتوں میں سوراخ بنانے کے لیے سوئی کا استعمال کیا اور پایا کہ RPX1-GFP 30 منٹ کے علاج کے بعد انحطاط پذیر ہوا (شکل 8d، معاون معلومات: شکل S10b)۔ P. xylostella infestation پر RPX1 کے انحطاط کی وجہ کو بہتر طور پر سمجھنے کے لیے، ہم نے RPX1-GFP ٹرانسجینک پودوں کے ٹشوز کو 15 منٹ کے لیے کول-0 کے ساتھ حل کیا، جو P. xylostella سے 15-120 منٹ تک متاثر ہوا تھا۔ ، یا کول -0 ٹشوز بغیر انفیکشن کے۔ امیونوبلوٹنگ تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ پہلے سے متاثرہ Col-0 کے ساتھ لگائے گئے نمونوں میں سے RPX1-GFP کی سطح غیر متاثرہ Col-0 (شکل 8e) کے مقابلے میں بہت کم تھی، جس سے پتہ چلتا ہے کہ P. xylostella انفیکشن نے Col-0 میں کچھ عوامل یا اشارے پیدا کیے ہیں۔ جو RPX1 کی تنزلی کا باعث بن سکتا ہے۔

3.10|rpx1-1 اتپریورتن پودوں کی نشوونما اور تولید میں ایک فائدہ فراہم کرتی ہے۔

جڑی بوٹیوں سے متعلق مخصوص دفاعی ردعمل کی ایک عام خصوصیت کیڑوں کے خلاف مزاحمت اور پودوں کی نشوونما اور تولید کے درمیان تجارت ہے (Li et al., 2018)۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا RPX1 لوکس میں جینی ٹائپ اس طرح کے ٹریڈ آف کے تابع ہے، ہم نے بیج کی پیداوار کا موازنہ Col-{{10}} اور rpx1-1 اتپریورتیوں میں کیا۔ P. xylostella infestation کی غیر موجودگی میں، فی پودا بیج کی پیداوار دو جین ٹائپس کے درمیان یکساں تھی (معاون معلومات: Figure S11)۔ اس کے برعکس، 3 ہفتے پرانے rpx1-1 اور Col-0 پودوں کو 15 s-instar P. xylostella کے انفیکشن کے لیے صرف 72 گھنٹے کے لیے ظاہر کرنے سے Col-0 کی آخری بیج کی پیداوار میں تین گنا کمی واقع ہوئی، جبکہ rpx1-1 میں بیج کی پیداوار نمایاں طور پر متاثر نہیں ہوئی۔ مزید برآں، RPX1com کی بیج کی پیداوار Col-0 کی طرح تھی، لیکن rpx1-1 کے مقابلے میں بہت کم تھی، یہ تجویز کرتی ہے کہ RPX1 غیر فعال ہونے سے لاروا کے انفیکشن پر بیج کی پیداوار میں فائدہ ہوتا ہے (معاون معلومات: شکل S11)۔ ہم نے 35Spro: PEN1 transgenic Arabidopsis میں بیج کی پیداوار کا بھی جائزہ لیا اور مشاہدہ کیا کہ PEN1 کی زیادہ کارکردگی نے لاروا سے متاثرہ اور غیر متاثرہ دونوں حالتوں میں بیج کی زیادہ پیداوار پیدا کی (معاون معلومات: شکل S11)۔ یہ نتائج تجویز کرتے ہیں کہ rpx1-1 اتپریورتن اور اعلی PEN1 اظہار P. xylostella کے خلاف مزاحمت فراہم کرتے ہیں عام طور پر وابستہ ترقی کی تجارت کی عدم موجودگی میں، RPX1 اور PEN1 کی مالیکیولر بریڈنگ پروگراموں میں صلاحیت کو اجاگر کرتے ہیں جس کا مقصد فصل کی پیداوار کو بہتر بنانا ہے۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

4|بحث

کیڑے زرعی پیداوار اور معیار کو ڈرامائی طور پر کم کرتے ہیں، جس سے پودوں کے تحفظ کو کسانوں اور پالنے والوں کے لیے ایک ترجیح اور طویل مدتی مقصد بنایا جاتا ہے۔ اس مطالعہ میں، ہم نے Arabidopsis mutant rpx1-1 کی نشاندہی کی، جس نے P. xylostella، فصلوں کے ایک اہم lepidopteran کیڑوں کے خلاف زیادہ مزاحمت ظاہر کی۔ ہمارے تجزیے سے پتہ چلا کہ rpx1-1 اتپریورتن کے نتیجے میں PEN1 ٹرانسکرپٹ کی اعلی سطح، DMNT جمع، اور کیڑوں کے خلاف پودوں کی مزاحمت میں بہتری آئی۔ ہم نے یہ بھی دکھایا کہ RPX1 پروٹین کو لاروا کے انفیکشن اور زخموں کے علاج سے کم کیا جا سکتا ہے۔

تصویر 6 PEN1 Plutella xylostella کے خلاف rpx1-1 کی مزاحمت میں اضافہ کرتا ہے۔ (a، b) PEN1-amiR ٹرانسجن نمایاں طور پر rpx1-1 کی P. xylostella infestation کے خلاف مزاحمت کو کم کرتا ہے، جبکہ 35Spro: PEN1 مزاحمتی اثر کو بڑھاتا ہے، جیسا کہ شرح اموات (a) اور pupation (b) P. xylostella کی شرح سے ظاہر ہوتا ہے۔ . (c) کول-0، rpx1-1، PEN1-amiR/rpx1-1، اور 35Spro کے ساتھ کھلائے گئے لاروا کی نمائندہ تصویریں: PEN1 کے پودے رنگ کی برقراری کو ظاہر کرتے ہیں، جیسا کہ اسمرف کارٹون کی طرح ان کی نیلی شکل سے ظاہر ہوتا ہے۔ کردار (d) (c) میں دکھائے گئے امیجز کے کوانٹیفیکیشن کے نتائج۔ (e–j) ٹرانسورس سیکشن اور hematoxylin-eosin سٹیننگ Col-0 (e)، rpx1-1 (f)، PEN1-amiR/rpx1-1 (g، h) اور 35Spro: PEN1 seedlings (i، j)۔ ڈیٹا کو اوسط ± sem کے طور پر پیش کیا جاتا ہے؛ ہر علاج کے مختلف حروف (a, b, d) میں ایک اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں (متغیر کا یک طرفہ تجزیہ، n=6)۔ [کلر فگر کو wileyonlinelibrary.com پر دیکھا جا سکتا ہے]

غیر انتخابی ٹیسٹوں میں، rpx1-1 اتپریورتی نے P. xylostella infestation (شکل 1c) کے خلاف نمایاں مزاحمت کا مظاہرہ کیا۔ اس کے برعکس، rpx1-1 پودوں کے ساتھ کھلائے جانے والے P. xylostella لاروا نے شدید منفی ترقیاتی مصیبتیں ظاہر کیں (شکل 1d,e)۔ یہ فینوٹائپس RPX1 کے غیر فعال ہونے سے منسوب ہیں، کیونکہ RPX1 تکمیلی خطوط (RPX1com) جنگلی قسم کے Col‐0 (شکل 1c–e) کی طرح حساس ہیں، جو اس نتیجے کی حمایت کرتے ہیں کہ RPX1 کیڑوں کے خلاف مزاحمت میں ملوث ہے۔ لاروا کو مارنے کے علاوہ، rpx1-1 اتپریورتی کا لاروا کی نشوونما پر بھی طویل مدتی اثر پڑتا ہے، بشمول pupation (Figure 1f)، جس کی وجہ سے کیڑوں کی تولید کم ہوتی ہے۔

شکل 7 Dimethyl-1,3,7-nonatriene (DMNT) Arabidopsis جڑوں سے پتوں تک منتقل کرتا ہے۔ (a) Arabidopsis seedlings کا استعمال کرتے ہوئے DMNT ٹرانسپورٹ پرکھ کی مثال۔ ڈی ایم این ٹی کو مراشیج اور اسکوگ مائع میڈیم میں تحلیل کیا گیا تھا۔ ایک 24-گھنٹے کی ثقافت کے بعد، جڑوں کو نکال دیا گیا، اور پتوں کو پلوٹیلا زائیلوسٹیلا لاروا کو کھانا کھلانے کے لیے استعمال کیا گیا تاکہ شرح اموات اور پیپشن کی شرح اسکور کی جا سکے۔ (b, c) DMNT، جڑوں سے پتوں تک پہنچایا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں P. xylostella لاروا کی شرح اموات (b) اور کم پیپشن (c) کی شرح ہوتی ہے۔ (d–f) 2 H- لیبل والا DMNT (DMNT-2 H) جڑ سے پتوں تک پہنچایا جاتا ہے۔ DMNT-2 H کو مائع MS میڈیم میں تحلیل کیا گیا جیسا کہ (a) میں 24 گھنٹے کے لیے، اور پھر پتے GC-MS تجزیہ (e) کے لیے کاٹے گئے۔ DMSO کو بطور کنٹرول (d) استعمال کیا جاتا تھا۔ DMNT-2 H معیار حوالہ کے لیے دکھایا گیا ہے (f)۔ (g–i) (d–f) میں دکھائے گئے ٹرانسپورٹ اسیس کے دوران حاصل کردہ DMNT-2 H کا TIC۔ اعداد و شمار کو اوسط ± sem کے طور پر پیش کیا جاتا ہے، (b، c) n=6 میں، p-values ​​کو ہسٹوگرام کالم کے ساتھ ملحق دکھایا جاتا ہے تاکہ ایک اہم فرق کی نشاندہی کی جا سکے (دو دم والا غیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ)۔ نوٹ کریں کہ ٹرانسپورٹ اسیسز کے لیے مزید کنٹرول معاون معلومات میں شامل ہیں: شکل S8۔ [کلر فگر کو wileyonlinelibrary.com پر دیکھا جا سکتا ہے]

مزید برآں، ترجیحی ٹیسٹوں نے اشارہ کیا کہ جنگلی قسم کے Col-{{0}} اور rpx1-1 اتپریورتی مختلف غیر مستحکم مرکبات کا اخراج کر سکتے ہیں۔ ان میں سے ایک DMNT ہے، جو کیڑوں کو بھگانے میں موثر ہے (اعداد و شمار 1b، 3a، معاون معلومات: Figure S5a)۔ مندرجہ بالا نتائج کی بنیاد پر، ہم تجویز کرتے ہیں کہ rpx1-1 میں DMNT کا جمع ہونا کیڑوں کے زہر کی ایک وجہ ہے۔ JA اور SA سگنلنگ راستے کیڑوں کے خلاف مزاحمت میں ملوث ہونے کی اطلاع دی گئی ہے (Costarelli et al., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016)۔ اس تحقیق میں، کیڑے کھانے کے 24 گھنٹے کے بعد، Col-0 اور rpx1-1 دونوں میں JA اور SA کے مواد میں اضافہ ہوا، اور rpx1-1 میں SA کے مواد میں اضافہ Col-0 کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھا، جبکہ JA کے مواد میں اضافہ بہت زیادہ تھا (معاون معلومات: Figure S6)، تجویز کرتا ہے کہ JA اور SA بھی P. xylostella کے خلاف rpx1-1 کی مزاحمت میں اہم کردار ادا کر سکتے ہیں۔ لہذا، ہم تجویز کرتے ہیں کہ rpx1-1 کے بالواسطہ اور بالواسطہ اثرات کیڑوں کے خلاف عربیڈوپسس کی مزاحمت میں اضافہ کرتے ہیں۔

شکل 8 RPX1 پروٹین کا انحطاط Plutella xylostella infestation اور زخموں کے علاج سے ہوتا ہے۔ (a) RPX1pro سے RPX1-GFP: RPX1-GFP ٹرانسجینک پودوں کو P. xylostella کے انفیکشن پر 15−120 منٹ تک انحطاط کیا جاتا ہے۔ (b) (a) کے کنٹرول کے طور پر، GFP بذات خود 35Spro سے: GFP ٹرانسجینک پودے لاروا کے انفیکشن پر کوئی انحطاط نہیں دکھاتے ہیں۔ (c) RPX1-پرچم 35Spro سے: RPX1-پرچمے والے ٹرانسجینک پودوں کو لاروا کی افزائش پر تنزلی کا سامنا کرنا پڑتا ہے۔ (d) RPX1-GFP RPX1pro سے: RPX1-GFP ٹرانسجینک پودے 15-120 منٹ کے زخموں کے علاج سے کم ہو جاتے ہیں۔ (e) RPX1-GFP RPX1pro سے: RPX1-GFP ٹرانسجینک پودوں کو انحطاط پذیر کیا جاتا ہے جب ٹشوز کو کول-0 پودوں کے ٹشوز کے ساتھ محلول میں انکیوبیٹ کیا جاتا ہے جن کو P. xylostella سے 15-120 منٹ تک متاثر کیا گیا ہے۔ مدافعتی بلوٹنگ بینڈ کے نیچے کی اقدار امیج جے کا استعمال کرتے ہوئے رشتہ دار پروٹین کی کثرت کو ظاہر کرتی ہیں۔ یہ تمام تجربات کم از کم تین بار دہرائے گئے ہیں، اور نمائندہ نتائج دکھائے گئے ہیں۔ آزاد ٹرانسجینک لائنوں کے ساتھ مزید تجرباتی ڈیٹا معاون معلومات میں دکھایا گیا ہے: شکل S10۔ [کلر فگر کو wileyonlinelibrary.com پر دیکھا جا سکتا ہے]

ہم ثبوت کی کئی سطریں پیش کرتے ہیں جو یہ ظاہر کرتے ہیں کہ کس طرح PEN{{0}}ثالثی DMNT جمع P. xylostella کے خلاف پودوں کی مزاحمت میں RPX1 افعال میں حصہ ڈالتا ہے۔ PEN1، ایک کلیدی جین جس کا تعلق sesquiterpenoid اور triterpenoid biosynthesis پاتھ وے سے ہے، کی شناخت rpx1-1 اتپریورتی (شکل 3b) سے RNA-seq ڈیٹا کے KEGG تجزیہ سے کی گئی، جو RPX1، PEN1، اور DMNT (سہرابی الیمیٹ) کے درمیان ایک ربط فراہم کرتا ہے۔ ، 2015)۔ کیڑوں کے لاروا کو مارنے والے کارآمد مرکبات میں سے ایک کے طور پر DMNT کی حمایت میں، DMNT Col-0 (شکل 3a) کے مقابلے rpx1-1 اتپریورتیوں میں زیادہ جمع ہوا، لیکن RPX1com لائنوں میں سطح کو کول-0 میں تبدیل کر دیا گیا ( شکل 4a–c)۔ اس کے علاوہ، کیمیائی طور پر ترکیب شدہ DMNT P. xylostella لاروا (معاون معلومات: Figure S5a,b) کو پسپا اور مار سکتا ہے، جو rpx1-1 (شکل 1b,e) کے نتائج کے مطابق ہے۔ مزید برآں، ٹرانسجینک پودوں نے PEN1 سے زیادہ کارکردگی کا مظاہرہ کرتے ہوئے Col-0 میں DMNT کے چار گنا سے زیادہ پیداوار دی اور P. xylostella کو rpx1-1 (اعداد و شمار 5d, i, j,o, p اور 6) جیسی مزاحمت عطا کی۔

اہم بات یہ ہے کہ، rpx1-1 میں PEN1 ٹرانسکرپٹ کی سطح کو کم کرنا DMNT بائیو سنتھیسس (فگر 5d,g,h,m,n) کو روکتا ہے اور P. xylostella لاروا پر مارنے والے اثر کو کم کرتا ہے، جو P. xylostella infestation (شکل 6a) کے لیے حساس ہوتے ہیں۔ )۔ یہ مشترکہ نتائج بتاتے ہیں کہ PEN1 اتپریورتن کیڑوں کے خلاف مزاحمت میں RPX1 غیر فعال ہونے کے فنکشن کو دبا سکتا ہے۔ RPX1 گھاو PEN1 کی کثرت کا سبب بنتا ہے (شکل 5a)، اس کے باوجود کس طرح RPX1 PEN1 کو ریگولیٹ کرتا ہے اور DMNT بایو سنتھیسس میں ثالثی کرتا ہے اس کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے۔ چونکہ RPX1 کی پیش گوئی eIF4E خاندان سے تعلق رکھنے والے ایک ناول کیپ بائنڈنگ پروٹین کے طور پر کی گئی ہے (Rhoads, 2009; Ruud et al., 1998)، یہ ممکن ہے کہ RPX1 PEN1 کو متاثر کر کے اس کے mRNA استحکام یا پروٹین ٹرانسلیشن کی کارکردگی کو متاثر کرے، جو کہ ایک اہم ہوگا۔ مستقبل کے مطالعہ میں موضوع. مزید یہ کہ، یہ واضح رہے کہ rpx1-1 اتپریورتی (شکل 5d) میں P. xylostella infestation کے ذریعے DMNT کی سطحیں اب بھی اعلیٰ سطح پر آ سکتی ہیں، یہ تجویز کرتی ہے کہ RPX1 سے آزاد DMNT جمع کو منظم کرنے والے کچھ اور راستے بھی ہو سکتے ہیں۔ ڈی ایم این ٹی کا پتہ پودوں کی وسیع اقسام میں پایا گیا ہے، جیسے کہ عربیڈوپسس (سہرابی ایٹ ال۔، 2015)، کپاس (لیو ایٹ ال۔، 2018) اور مکئی (ریکٹر ایٹ ال۔، 2016)۔ اس کے علاوہ، یہ شکاریوں کو اپنی طرف متوجہ کرکے جڑی بوٹیوں کے کیڑوں کے خلاف بالواسطہ تحفظ فراہم کرتا ہے، جس سے پودوں کو کیڑوں کے خطرات کو دور کرنے کی اجازت ملتی ہے (Kappers et al.، 2005؛ Lee et al.، 2010؛ Li et al.، 2018)۔ ہم نے حال ہی میں اطلاع دی ہے کہ یہ لاروا مڈ گٹ میں PM کو نقصان پہنچا کر P. xylostella لاروا کو پیچھے ہٹا سکتا ہے اور مار سکتا ہے (Chen et al., 2021)۔ یہاں، ہم نے پایا کہ جب لاروا کو rpx1-1 یا PEN1 اوور ایکسپریسنگ سیڈلنگ (اعداد و شمار 2c–j اور 6i،j) کے ساتھ کھلایا جاتا ہے تو PM ڈھانچہ کو شدید نقصان پہنچ سکتا ہے۔ یہ نتائج DMNT کے علاج کے تجربات کے نتائج کے مطابق ہیں جو ہم نے پہلے بیان کیے تھے (Chen et al., 2021)، پھر سے اس تجویز کی حمایت کرتے ہیں کہ rpx1-1 میں DMNT کا جمع ہونا کیڑوں کے خاتمے اور موت کا سبب بننے والے عوامل میں سے ایک ہو سکتا ہے۔ RPX1 کا تعلق eIF4E جین فیملی (Rhoads، 2009) سے ہے اور پودوں کے وائرسوں کی سیل ٹو سیل حرکت میں شامل ہے (Keima et al.، 2017)۔ تاہم، آیا ڈی ایم این ٹی کے جمع ہونے کا پودوں میں وائرل مزاحمت سے تعلق واضح نہیں ہے۔ PEN1 کا اظہار خاص طور پر Arabidopsis جڑوں میں ہوتا ہے، جہاں یہ DMNT بایو سنتھیسس (Sohrabi et al.، 2015) کو متحرک کرتا ہے۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

اس مطالعے میں مستقل طور پر، ہم نے جڑوں میں اعلی PEN1 اظہار اور پتوں میں بہت کم اظہار پایا (معاون معلومات: شکل S8a)۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ rpx1-1 اتپریورتی کے پتے P. xylostella لاروا (شکل 1) کے لیے زہریلے تھے، جو تجویز کرتے ہیں کہ پتوں میں DMNT کے جمع ہونے اور اس سے وابستہ کیڑوں کے خلاف مزاحمت کو ان ٹشوز میں منٹ PEN1 اظہار کے ذریعے آسانی سے بیان نہیں کیا جا سکتا۔ معنی خیز طور پر، ہم نے پایا کہ ڈی ایم این ٹی کو پودوں کی جڑوں سے ہوائی حصوں تک پہنچایا جا سکتا ہے، جیسا کہ ڈی ایم این ٹی ٹرانسپورٹ اسسیس اور جی سی-ایم ایس کے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ ان کی جڑوں میں ڈی ایم این ٹی-2 ایچ کے ساتھ لگائے گئے پودوں سے پتے کے نچوڑ (شکل 7)۔ یہ مرکب پودوں کے اندر کیسے منتقل کیا جاتا ہے یہ واضح نہیں ہے، اور یہ مزید تحقیقات کا موضوع ہو سکتا ہے۔ پودے مختلف طریقوں سے کیڑوں کے حملوں کو برداشت کرنے اور ان سے لڑنے کی صلاحیت رکھتے ہیں۔ یہاں، RPX1pro: RPX1-GFP اور 35Spro: RPX1-FLAG ٹرانسجینک پلانٹس کا امیونوبلوٹنگ تجزیہ کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ P. xylostella کے انفیکشن پر، RPX1 پروٹین کو تیزی سے کم کیا جا سکتا ہے (شکل 8a،c، معاون معلومات: Figure 1) ، mRNA اظہار کی سطح پر، RPX1 غیر متاثر رہا (معاون معلومات: Figure S9b)۔ فی الحال، RPX1 پروٹین کو کس طرح انحطاط کیا جاتا ہے یہ واضح نہیں ہے، لیکن ہمارے اعداد و شمار نے بنیادی طور پر تجویز کیا ہے کہ پروٹین کے انحطاط کا طریقہ کار زخموں کے سگنلنگ راستوں میں شامل ہو سکتا ہے (شکل 8d، معاون معلومات: Figure S10b)۔

مزید برآں، P. xylostella pre-fested Col-0 نے مختلف پودوں میں RPX1-GFP کے انحطاط کو متاثر کیا (شکل 8e)، یہ تجویز کرتا ہے کہ P. xylostella انفیکشن پودوں میں سگنلز کے جمع ہونے کا سبب بن سکتا ہے، جس کے نتیجے میں، RPX1 انحطاط۔ مستقبل میں سگنلز کی شناخت کا پتہ لگانا دلچسپ ہوگا۔ RPX1 انحطاط کی یہ خصوصیت پودوں کے لیے اہم ہے، جو ڈی ایم این ٹی کے جمع ہونے کا باعث بن سکتی ہے اور کیڑوں کے نقصان پر فوری ردعمل فراہم کر سکتی ہے (معاون معلومات: شکل S3)۔ کیڑوں کے خلاف پودوں کی برداشت میں اضافہ اکثر فٹنس کی قیمت پر آتا ہے۔ یہ مشاہدہ کہ rpx1-1 اتپریورتن Arabidopsis میں بڑھتی ہوئی مزاحمت (شکل 1) اور اعلی بیج کی پیداوار (معاون معلومات: Figure S11) کا باعث بنتی ہے بغیر کسی اہم تجارت کے اعلیٰ کیڑوں کے خلاف مزاحمت کے ساتھ انجینئرنگ فصلوں کے لیے ایک امید افزا راستہ فراہم کرتا ہے۔ مثال کے طور پر، CRISPR-Cas9 کے ذریعے جینوم ایڈیٹنگ فصلوں کی بہتری کے لیے ایک طاقتور ٹول ہے (Yang et al., 2017) جو RPX1 میں تغیرات کو متعارف کرانے کی اجازت دیتا ہے اور ممکنہ طور پر اس کے اطلاق کو مختلف فصلوں تک پھیلاتا ہے۔

حوالہ جات

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W. & Takabayashi, J. (2000) جڑی بوٹیوں سے متاثرہ اتار چڑھاؤ لیما کی پھلیوں کے پتوں میں دفاعی جین نکالتے ہیں۔ فطرت، 406، 512-515۔

چن، سی، چن، ایچ، ہوانگ، ایس، جیانگ، ٹی، وانگ، سی، تاؤ، زیڈ وغیرہ۔ (2021) اتار چڑھاؤ والا DMNT کیڑے کے مڈ گٹ میں پیریٹروفک میٹرکس رکاوٹ میں خلل ڈال کر پلوٹیلا زائیلوسٹیلا سے پودوں کی براہ راست حفاظت کرتا ہے۔ eLife, 10, e63938.

چینگ، ایکس، ہو، جے، لی، جے، چن، جے، وانگ، ایچ، ماو، ٹی، وغیرہ۔ (2018) ریشم کے غدود کو پہنچنے والے نقصان اور فوکسیم کی نمائش کے تحت بومبیکس موری کے انزائمز سے متعلق جینوں کو ڈیٹوکسفائنگ کرنے کے لیے نقلی ردعمل۔ کیموسفیئر، 209، 964-971۔

Clough, SJ & Bent, AF (1998) فلورل ڈِپ: Arabidopsis thaliana کے Agrobacterium-mediated Transformation کے لیے ایک آسان طریقہ۔ دی پلانٹ جرنل، 16، 735-743۔

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. et al. (2020) سبزی خوروں کی خوراک سے پیدا ہونے والا سیلیسیلک ایسڈ کیڑوں کے حملے کے خلاف جیسمونک ایسڈ کی ثالثی والے پودوں کے دفاع کا مخالف ہے۔ پلانٹ سگنلنگ اور برتاؤ، 15، e1704517۔

Douglas, AE (2018) کیڑے مکوڑوں کے خلاف فصل کی مزاحمت کو بڑھانے کے لیے حکمت عملی۔ پودوں کی حیاتیات کا سالانہ جائزہ، 69، 637-660۔

Feng, Y. & Zhang, A. (2017) پھولوں کی خوشبو، میتھائل بینزویٹ، ایک موثر سبز کیڑے مار دوا ہے۔ سائنسی رپورٹس، 7، 42168۔

فیلڈ، بی اور اوسبورن، اے ای (2008) میٹابولک ڈائیورسیفکیشن-مختلف پودوں میں اوپیرون نما جین کلسٹرز کی آزاد اسمبلی۔ سائنس، 320، 543-547۔

Go, YS, Lee, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK et al. (2012) معدنی ترکیب کی شناخت، جو عربیڈوپسس میں ترقی اور نشوونما کے لیے اہم ہے۔ دی پلانٹ جرنل، 72، 791–804۔

Gols, R. (2014) ایک کثیر ٹرافک فریم ورک میں کیڑوں کے خلاف براہ راست اور بالواسطہ کیمیائی دفاع۔ پلانٹ، سیل اور ماحولیات، 37، 1741–1752۔

Gomez, MA, Lin, ZD, Moll, T., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, K., et al. (2019) کاساوا eIF4E isoforms nCBP-1 اور nCBP-2 کی بیک وقت CRISPR/Cas9 ثالثی ترمیم کاساوا براؤن اسٹریک بیماری کی علامات کی شدت اور واقعات کو کم کرتی ہے۔ پلانٹ بائیوٹیکنالوجی جرنل، 17، 421–434۔

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA & Turlings, TCJ (2005) مکئی (Zea mays)، کپاس (Gossypium herbawcea)، اور cotton (Gossypium herbawcea) سے کیٹرپلر سے متاثرہ اتار چڑھاؤ کے لیے تین پرجیوی تتیوں کے اینٹینل الیکٹرو فزیولوجیکل ردعمل (Vigna unguiculata)۔ جرنل آف کیمیکل ایکولوجی، 31، 1023–1038۔

Handrick, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. et al. (2016) مکئی میں 8-O-methylated benzoxazinoid دفاعی مرکبات کا بایو سنتھیسس۔ پلانٹ سیل، 28، 1682-1700۔

ہوانگ، اے سی، جیانگ، ٹی، لیو، وائی ایکس، بائی، وائی سی، ریڈ، جے، کیو، بی وغیرہ۔ (2019) ایک خصوصی میٹابولک نیٹ ورک عربیڈوپسس روٹ مائکرو بائیوٹا کو منتخب طور پر ماڈیول کرتا ہے۔ سائنس، 364، eau6389۔

ہوانگ، ایچ جے اور یانگ، ڈبلیو بی (2007) جولیا-کوسینسکی اولیفینیشن میں بی ٹی سلفون کا استعمال کرتے ہوئے موینوسینول اور اس کے اینالاگ کی ترکیب۔ ٹیٹراہیڈرون کے خطوط، 48، 1429–1433۔

Jing, T., Du, W., Gao, T., Wu, Y., Zhang, N., Zhao, M. et al. (2020) CYP82D47 کی طرف سے اتپریرک ہربیور-حوصلہ افزائی DMNT پڑوسی چائے کے پودوں کی JA پر منحصر جڑی بوٹیوں کی مزاحمت کو شامل کرنے میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ پلانٹ، سیل اور ماحولیات، 44، 1178–1191۔

جانسن، SN & Züst, T. (2018) موسمیاتی تبدیلی اور حشرات الارض: مزاحمت بیکار نہیں ہے؟ پلانٹ سائنس میں رجحانات، 23، 367–369۔

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: نئی ماحولیاتی خصوصیات اور خبروں کے ساتھ ایک کامیاب کیڑے مار دوا۔ اپلائیڈ مائکرو بایولوجی اینڈ بائیو ٹیکنالوجی، 101، 2691–2711۔

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) terpenoid metabolism کی جینیاتی انجینئرنگ نے محافظوں کو Arabidopsis کی طرف راغب کیا۔ سائنس، 309، 2070-2072۔

Keima, T., Hagiwara- Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, H., Iwabuchi, N., et al. (2017) eIF4E isoform nCBP کی کمی Arabidopsis thaliana میں ٹرپل-جین-بلاک پروٹین کو انکوڈنگ کرنے والے پلانٹ وائرس کی سیل ٹو سیل کی نقل و حرکت کو محدود کرتی ہے۔ سائنسی رپورٹس، 7، 39678۔

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. & Tholl, D. (2010) Herbivore induced اور floral monoterpene volatiles کو Arabidopsis میں ایک P450 انزائم (CYP82G1) کے ذریعے بایو سنتھیسائز کیا جاتا ہے۔ . نیشنل اکیڈمی آف سائنسز کی کارروائی، 107، 21205–21210۔

لی، بی، فرسٹر، سی، رابرٹ، سی اے ایم، زیسٹ، ٹی، ہو، ایل، ماچاڈو، آر اے آر، وغیرہ۔ (2018) اناج میں افیڈ اور کیٹرپلر مزاحمت کے درمیان میٹابولک سوئچ کا متضاد ارتقاء۔ سائنس ایڈوانسز، 4، eaat6797۔

Liu, D., Huang, X. Jing, W., An, X., Zhang, Q., Zhang, H. et al. (2018) DMNT اور TMTT بائیو سنتھیسس میں شامل Gossypium hirsutum کے دو P450 انزائمز کی شناخت اور فعال تجزیہ۔ پلانٹ بائیو ٹیکنالوجی جرنل، 16، 581–590۔

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) پودوں میں جیسمونیٹ سگنلنگ پلانٹ-کیڑوں کے تعامل کی ماحولیات کو شکل دیتا ہے۔ کیڑے سائنس میں موجودہ رائے، 14، 32-39.

لو، ایچ، لو، ٹی، فو، ایچ، وانگ، ایل، ٹین، وائی، ہوانگ، جے، وغیرہ۔ (2018) کیڑے مکوڑوں کے خلاف چاول کی مزاحمت سیروٹونن بائیو سنتھیسس کو دبانے سے ثالثی کی گئی۔ فطرت کے پودے، 4، 338–344۔

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) CRISPR-Cas9 eIF4E1 جین کو نشانہ بنانا سولانم کے آلو وائرس Y مزاحمتی سپیکٹرم کو بڑھاتا ہے tuberosum L. cv. خواہش مائکرو بایولوجی میں فرنٹیئرز، 13، 873930۔

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. & Miao, X. (2019) چاول میں چھیدنے والے کیڑے کے لیے ethylene- اور jasmonic acid-pathway کے ردعمل کے درمیان ناول کراسسٹالک۔ نیو فائیٹولوجسٹ، 225، 474–487۔

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW et al. (2019) اتار چڑھاؤ والا DMNT میٹھے آلو (Ipomoea batatas) کے پودوں کے پتوں میں جیسمونیٹ سے آزاد براہ راست اینٹی جڑی بوٹیوں کے دفاع کو آمادہ کرتا ہے۔ سائنسی رپورٹس، 9، 17431۔

Mikstacki, A., Zakerska-Banaszak, O., Skrzypczak-Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Glutathione S-transferase ایک زہریلے اشارے کے طور پر: عام طور پر anestheticia بائیو کیمیکل فنکشن جرنل آف کلینیکل اینستھیزیا، 27، 73-79۔

Rhoads, RE (2009) eIF4E: نئے خاندان کے افراد، نئے پابند شراکت دار، نئے کردار۔ جرنل آف بائیولوجیکل کیمسٹری، 284، 16711–16715۔

ریکٹر، A.، Schaff، C.، Zhang، Z.، Lipka، AE، Tian، F.، Köllner، TG et al. (2016) Zea mays میں غیر مستحکم ہوموٹرپینز DMNT اور TMTT کی پیداوار کے لیے بایو سنتھیٹک راستوں کی خصوصیت۔ پلانٹ سیل، 28، 2651–2665۔

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ & Browning, KS (1998) Arabidopsis thaliana سے ناول کیپ بائنڈنگ پروٹین کی شناخت اور خصوصیت۔ جرنل آف بائیولوجیکل کیمسٹری، 273، 10325–10330۔