MTT پرکھ کے ساتھ Cistanche Tubulosa سے Phenylethanoid Glycosides کی مداخلت

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

یو جی وانگ، سی من چاؤ، گینگ سو اور یو کیو گاو

خلاصہ:

MTT پرکھ، اسکریننگ کے طریقہ کار کے طور پر، خلیات کی عملداری اور پھیلاؤ کی پیمائش کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے۔ تاہم، یہ غور کرنا چاہیے کہ ایم ٹی ٹی پرکھ کے اثر کو درست طریقے سے ظاہر نہیں کر سکتاCistanche tubulosaEA.hy926 خلیات عملداری پر ethanolic اقتباس. MTT پرکھ کے متضاد مشاہدات کے لیے ذمہ دار اجزاء کی چھان بین اور شناخت کرنے کے لیے، echinacoside، اور acteoside، دو اہم phenylethanoid glycosides، C. tubulosa ethanolic extract سے الگ تھلگ کیے گئے تھے۔ CCK-8، Hoechst 33342 اور annexin V-FITC/PI asses سے اخذ کردہ ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ دونوں الگ تھلگ مرکبات میں موجود caffeoyl گروپ MTT پرکھ کے متضاد نتائج کے لیے ذمہ دار تھا۔ یہ اعداد و شمار گمراہ کن نتائج پیدا کرنے سے بچنے کے لیے خلیوں کی عملداری پر دواؤں کے ایجنٹوں کے اثر کا تعین کرنے کے لیے مختلف طریقوں کو استعمال کرنے کی ضرورت پر زور دیتے ہیں۔

مطلوبہ الفاظ: MTT پرکھ؛phenylethanoid glycoside; کیفیک ایسڈ؛ سیل کی عملداری؛ مداخلت

تعارف

طفیلی پوداCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceae family) شمالی افریقی، عرب اور ایشیائی ممالک میں وسیع پیمانے پر تقسیم کیا جاتا ہے [1]۔ سے تناCistanche tubulosaاورCistanche deserticolaروایتی چینی طب میں اہم ہیں، جو بڑی آنت کی جڑت کی وجہ سے نامردی، بانجھ پن، لمباگو، اور قبض کے علاج کے لیے استعمال ہوتے ہیں [2]۔ اس کے علاوہ، Cistanche tubulosa کے ایتھانولک عرق کو چوہوں میں دماغی ہائپوکسیا کے خلاف ایک اہم حفاظتی اثر دکھایا گیا ہے [3]۔

اینڈوتھیلیل خلیات ہائپوکسک پلمونری ہائی بلڈ پریشر کے روگجنن میں ایک اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ EA.hy926 اینڈوتھیلیل سیل لائن کافی حد تک بنیادی اینڈوتھیلیل سیلز سے ملتی جلتی ہے۔ کے اینٹی ہائپوکسک اثر کے ہمارے اپنے مطالعہ کے دورانCistanche tubulosaEA.hy926 اینڈوتھیلیل سیل پر ایتھانولک ایکسٹریکٹ، ہم نے دیکھا کہ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) پرکھ، جو عام طور پر cytotoxicity اور cytostatic سرگرمی کے مطالعے میں سیل کی قابل عملیت کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، علاج کے بعد EA.hy926 سیل کی عملداری میں اضافہ دکھا کر متضاد نتائج پیدا کرتا ہے۔

دواؤں کے ایجنٹ کے ممکنہ سائٹوٹوکسک یا سائٹو پروٹیکٹو اثرات کی نشاندہی کرنے کے لیے سیل کی قابل عملیت کا درست اندازہ ضروری ہے۔ لہذا، ہم نے تحقیق کی کہ C. tubulosa ethanolic extract میں موجود کون سے اجزاء MTT پرکھ کے ساتھ مشاہدہ کیے گئے متضاد نتائج کے لیے ذمہ دار ہو سکتے ہیں۔ ہم نے C. tubulosa ethanolic extract سے دو اہم phenylethanoid glycosides (PhGs) کو الگ تھلگ کیا، echinacoside (اس کے بعد کمپاؤنڈ 1) اور ایکٹیوسائیڈ (اس کے بعد کمپاؤنڈ 2)، اور مختلف طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے EA.hy926 سیل کی عملداری پر ان کے اثر کا تعین کیا۔ اس کے علاوہ، مزید واضح کرنے کے لیے کہ مرکبات 1 اور 2 کا کون سا متبادل متضاد نتائج کے لیے ذمہ دار ہو سکتا ہے، ہم نے ان کے aglycones، caffeic acid (اس کے بعد مرکب 3) اور 3،4-dihydroxylphenylethanol (اس کے بعد مرکب 4) کا تجربہ کیا۔ اسی طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے EA.hy926 سیل کی قابل عملیت پر۔

نتائج اور مباحثہ

مرکبات کی شناخت

C. tubulosa ethanolic extract سے الگ تھلگ دو مرکبات کے ڈھانچے کی شناخت جوہری مقناطیسی گونج (NMR) اور ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے تجزیوں کے ذریعے کی گئی تھی اور انہیں شکل 1 میں دکھایا گیا ہے۔ کمپاؤنڈ 1 کی شناخت پہلے کی اطلاع کردہ NMR (ٹیبل) کے مقابلے میں ایکچیناکوسائیڈ کے طور پر کی گئی تھی۔ 1) اور MS (m/z 785 [M−H]− ) ڈیٹا [4]۔ کمپاؤنڈ 2 NMR سپیکٹرا کمپاؤنڈ 1 سے بہت زیادہ ملتا جلتا تھا، سوائے ایک -D-glucopyranosyl گروپ (ٹیبل 1) کی عدم موجودگی کے۔ کمپاؤنڈ 2 (m/z 623 [M−H]− ) کی شناخت ایکٹیوسائیڈ کے طور پر کی گئی تھی [5]۔ اہم بات یہ ہے کہ دونوں مرکبات میں ایک ہی ایگلی کون ہے، جس میں کیفیک ایسڈ (مرکب 3) اور 3،4-ڈائی ہائیڈروکسائلفینیلتھانول (مرکب 4) شامل ہیں۔

سیل وائبلٹی اسیسز

MTT اور CCK{{0}} اسیس کا استعمال EA.hy926 سیل کی قابل عملیت پر مرکبات 1–4 کے اثر کا تجزیہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ MTT پرکھ سے پتہ چلتا ہے کہ 25 اور 50 μM کمپاؤنڈ 1، 2، یا 3 (166.3 فیصد اور 174.1 فیصد کمپاؤنڈ 1، 205.8 فیصد اور 224.3 فیصد کمپاؤنڈ کے لئے 224.3 فیصد) کے ساتھ علاج کے بعد EA.hy926 خلیوں کی عملداری میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ 2، اور 164.8 فیصد اور 189.6 فیصد مرکب 3 کے لیے، بالترتیب؛ p <0.05)، جب="" کنٹرول="" سیلز="" کے="" مقابلے="" میں="" (شکل="" 2a)۔="" مزید="" برآں،="" خلیات="" کے="" مورفولوجیکل="" معائنہ="" نے="" یہ="" طے="" کیا="" کہ="" 50="" μm="" کمپاؤنڈ="" 1،="" 2،="" یا="" 3="" کے="" ساتھ="" علاج="" سے="" جامنی="" رنگ="" کے="" فارمازان="" کرسٹل="" کی="" تشکیل="" میں="" اضافہ="" ہوا،="" جو="" زندہ="" خلیوں="" کے="" تناسب="" کا="" براہ="" راست="" اشارہ="" سمجھا="" جاتا="" ہے="" (شکل="" 3)۔="" اس="" کے="" برعکس،="" cck-8="" پرکھ="" نے="" تجویز="" کیا="" کہ="" 12.5،="" 25،="" اور="" 50="" μm="" مرکب="" 1،="" 2،="" یا="" 3="" (75.5="" فیصد،="" 45.1="" فیصد،="" اور="" 43.7="" فیصد="" مرکب="" 1،="" 85.5="" فیصد،="" 51.8="" فیصد،="" اور="" کمپاؤنڈ="" 2="" کے="" لیے="" 34.3="" فیصد،="" اور="" کمپاؤنڈ="" 3="" کے="" لیے="" بالترتیب="" 64.5="" فیصد،="" 48.2="" فیصد،="" اور="" 36.4="" فیصد؛="" p=""><0.05)، کنٹرول="" سیلز="" کے="" مقابلے="" (شکل="" 2b)۔="" کمپاؤنڈ="" 4="" نے="" mtt="" یا="" cck-8="" پرکھ="" میں="" سیل="" کی="" عملداری="" کو="" متاثر="" نہیں="" کیا۔="" دونوں="" پرکھوں="" کے="" ساتھ="" حاصل="" کردہ="" نتائج="" کے="" درمیان="" تضاد="" سے="" پتہ="" چلتا="" ہے="" کہ="" دونوں="" پرکھوں="" میں="" سے="" ایک="" ea.hy926="" سیل="" کی="" عملداری="" پر="" مرکبات="" 1="" اور="" 2="" کے="" اثرات="" کو="" درست="" طریقے="" سے="" ظاہر="" نہیں="" کر="">

ہوچسٹ سٹیننگ کے ذریعہ اپوپٹوسس کی تشخیص

Hoechst 33342 ایک سیل پارگمیبل DNA داغ ہے جو الٹرا وایلیٹ روشنی سے پرجوش ہوتا ہے اور 460 سے 490 nm پر نیلے رنگ کا فلوروسینس خارج کرتا ہے۔ اپوپٹوٹک خلیوں کا گاڑھا کرومیٹن عام خلیوں کے کرومیٹن سے زیادہ چمکدار ہوتا ہے [6]۔ جبکہ کنٹرول سیلز یکساں طور پر منتشر کرومیٹن، نارمل آرگنیلز، اور برقرار سیل جھلیوں کی نمائش کرتے ہیں، 48 گھنٹے کے لیے 50 μM مرکبات 1، 2، یا 3 کے ساتھ لگائے گئے خلیات نے اپوپٹوٹک خلیوں کے مخصوص داغ کو دکھایا (شکل 4A)۔ اس کے برعکس، کمپاؤنڈ 4 کے 50 μM تک خلیوں کی نمائش نے کنٹرول ٹریٹمنٹ کے مقابلے اپوپٹوٹک نیوکلیئ کی تعداد میں اضافہ نہیں کیا۔

اپوپٹوٹک سیلز کا فلو سائٹومیٹرک تجزیہ

annexin V-FITC/PI ڈبل سٹیننگ پرکھ اپوپٹوٹک خلیوں کی شناخت فاسفیٹائڈیلسرین کے ساتھ annexin V-FITC کے اعلی وابستگی کے ذریعہ کرتا ہے، جو اپوپٹوسس سے گزرنے والے خلیوں میں بیرونی ہوتا ہے [7]۔ اس پرکھ میں، قابل عمل خلیے نہ تو annexin V اور نہ ہی PI سے جڑے ہوتے ہیں اور اس لیے داغدار نہیں ہوتے (نچلے بائیں کواڈرینٹ)، ابتدائی اپوپٹوٹک خلیات انیکسین V-FITC (نچلے دائیں کواڈرینٹ) کے پابند ہونے سے سبز رنگ کے ہوتے ہیں، اور دیر سے اپوپٹوٹک خلیات۔ annexin V-FITC کے فاسفیٹائڈیلسرین اور PI کو بالترتیب نیکروٹک خلیات (اوپری دائیں کواڈرینٹ) کے ساتھ باندھنے سے سبز اور سرخ رنگ کے ہیں۔ جیسا کہ شکل 4B میں دکھایا گیا ہے، 48 گھنٹے کے لیے 50 μM مرکبات 1، 2، یا 3 کے ساتھ انکیوبیٹڈ سیلز، اپوپٹوٹک سیلز کا فیصد بالترتیب 3.74 فیصد (کنٹرول سیل) سے بڑھ کر 10.32 فیصد، 12.95 فیصد اور 11.30 فیصد ہو گیا۔ کنٹرول سیلز کے مقابلے میں، کمپاؤنڈ 4 نے اپوپٹوٹک EA.hy926 سیلز کے فیصد میں اضافہ نہیں کیا۔

CCK-8 پرکھ اور Hoechst 33342 سٹیننگ کے ذریعے حاصل کردہ نتائج سے ہم آہنگ، فلو سائٹومیٹری پرکھ نے ظاہر کیا کہ EA.hy926 خلیوں میں مرکبات 1، 2، اور 3 حوصلہ افزائی شدہ اپوپٹوس۔ مجموعی طور پر، یہ مشاہدات بتاتے ہیں کہ مرکبات 1–3 کے ساتھ علاج کے بعد MTT پرکھ کے ساتھ مشاہدہ کیا گیا EA.hy926 سیل کی عملداری میں اضافہ غلط مثبت نتیجہ کی نمائندگی کرتا ہے۔

بحث

1983 میں، Mosmann نے سیل کے پھیلاؤ اور cytotoxicity [8] کی پیمائش کے لیے رنگین میٹرک MTT مائکروپلیٹ پرکھ تیار کی۔ یہ سادہ پرکھ، اور اس میں تبدیلیاں، اب پوری دنیا میں سیل بائیولوجی لیبارٹریوں میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی ہیں۔ ممالیہ کے خلیوں میں فرکشنیشن اسٹڈیز نے اشارہ کیا کہ کم ہوا پائریڈائن نیوکلیوٹائڈ کوفیکٹر، NADH، زیادہ تر MTT کی کمی کے لیے ذمہ دار ہے۔ پورے خلیات کا استعمال کرتے ہوئے مطالعہ کی طرف سے اس کی حمایت کی گئی تھی [9]. اس لیے ایم ٹی ٹی کی کمی کا تعلق میٹابولک طور پر فعال خلیات سے ہے اور یہ نہ صرف مائٹوکونڈریل سانس کے ساتھ ہے بلکہ سائٹوپلازم اور نان مائٹوکونڈریل جھلیوں کے ساتھ بھی ہے جس میں اینڈوسوم/لائسوسوم کمپارٹمنٹ اور پلازما میمبرین شامل ہیں [10]۔ MTT مالیکیول پر خالص مثبت چارج پلازما میمبرین پوٹینشل کے ذریعے سیلولر اپٹیک کا بنیادی عنصر ہے۔

خاص طور پر، ایم ٹی ٹی پرکھ کبھی کبھار درست طور پر اس حقیقی اثر کی عکاسی نہیں کر سکتی ہے جو ایک ٹیسٹ شدہ مرکب مخصوص خلیوں پر ہوتا ہے۔ تاہم، کیمیاوی ڈھانچے یا گروہ جو MTT پرکھ میں متضاد نتائج کا سبب بن سکتے ہیں ان کی شناخت نہیں کی گئی ہے۔ حالیہ مطالعات نے ثابت کیا ہے کہ MTT پرکھ سبز چائے میں سب سے زیادہ پائے جانے والے پولی فینول (−)-epigallocatechin-3-gallate کے انسداد پھیلانے والے اثر کو کم کر سکتا ہے [11]۔ ٹیومر کیمو حساسیت کا پتہ لگانے کے لیے ایم ٹی ٹی پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے مطالعات میں، کینسر مخالف کیموتھراپیٹک ایجنٹس، جیسے ایپیروبیسن، پیلیٹیکسیل، ڈوسیٹیکسل، اور امیٹینیب میسیلیٹ (گلیویک)، نے خلیوں کی قابل عملیت میں اضافہ ظاہر کیا [12,13]۔ مزید برآں، متعدد مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ بعض پودوں کے عرق اور ریڈوکس ایکٹیو پولیفینول MTT پرکھ میں مداخلت کر سکتے ہیں کیونکہ وہ خلیوں کی غیر موجودگی میں MTT ٹیٹرازولیم نمک کو براہ راست کم کر دیتے ہیں [14]۔

مائکروپلیٹ ریڈر میں سپیکٹرو فوٹومیٹرک تجزیہ سے پہلے ایم ٹی ٹی فارمازان کرسٹل کو حل کرنے کی ضرورت اور رد عمل کی موروثی اختتامی نوعیت ایم ٹی ٹی پرکھ کے استعمال کو بعض ایپلی کیشنز تک محدود کرتی ہے۔ اس کے نتیجے میں ٹیٹرازولیم اینالاگ کی نشوونما ہوئی جس میں فینائل موئیٹیز کو منفی چارج شدہ سلفونیٹ گروپس، جیسے 2،3-bis-(2-میتھوکسی-4-نائٹرو- 5- سے سجایا گیا تھا۔ سلفوفینائل)-2H-tetrazolium-5-carboxamide (XTT), ایک منفی چارج شدہ اندرونی نمک [15] اور 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), ایک کمزور تیزابیت والا اندرونی نمک MTT سے گہرا تعلق ہے [16] . ان ترامیم کے نتیجے میں ثقافتی درمیانے گھلنشیل فارمازان مصنوعات کی پیداوار ہوئی جس نے مقدار سے پہلے حل پذیری کے مرحلے کی ضرورت کو ختم کردیا۔ اسی طرح، جیسا کہ ان مالیکیولز پر بڑھے ہوئے منفی چارج نے خلیے کی جھلیوں میں حرکت کرنے کی ان کی صلاحیت کو کم کر دیا [17]، انٹرمیڈیٹ الیکٹران قبول کرنے والے (IEA)، جیسے 1-میتھوکسی-5-میتھائل فینازینیم میتھائل سلفیٹ ({{25) }}میتھوکسی پی ایم ایس) ٹیٹرازول ڈائی میں کمی یا کمی کی شرح کو بڑھانے کے لیے درکار تھی۔

ابھی حال ہی میں، پانی میں حل پذیر ٹیٹرازولیم نمکیات کی ایک نئی نسل تیار کی گئی ہے جس کا WST-1 پروٹو ٹائپ ہے [18]۔ ڈبلیو ایس ٹی-1، ایک منفی چارج شدہ ڈسلفونیٹڈ اندرونی نمک جس میں آئوڈین کی باقیات ہوتی ہیں، اس کی لازمی IEA، 1-میتھوکسی PMS کی موجودگی میں XTT اور MTS سے زیادہ مستحکم ہے۔ اس کی وجہ سے WST-1/1-میتھوکسی PMS کی ایک آسان سنگل ریجنٹ سیل پھیلاؤ کٹ کے طور پر مارکیٹنگ ہوئی۔ WST سیریز میں کئی دوسرے ٹیٹرازولیم نمکیات تیار کیے گئے ہیں، جن میں سے سب سے زیادہ مفید شاید WST-8 [19]۔ ایسا لگتا ہے کہ WST-8 میں سیلولر کمی کی خصوصیات WST-1 سے بہت ملتی جلتی ہیں اور اسے CCK-8 پرکھ کے طور پر آزادانہ طور پر مارکیٹ کیا جا رہا ہے۔ WST-8 خلیہ ناقابل تسخیر ہے اور اس وجہ سے خلوی طور پر کم کیا جاتا ہے، انٹرا سیلولر NADH سے WST-8 تک الیکٹران کی نقل و حمل کے ذریعے پلازما جھلی میں 1-میتھوکسی PMS کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہے۔ اگرچہ MTT اور WST-8/1-میتھوکسی PMS میں کمی انٹرا سیلولر NADH کے ذریعے چلتی ہے، NADH کا ماخذ ان دو طریقوں میں مختلف دکھائی دیتا ہے۔ WST-8/1-میتھوکسی پی ایم ایس کی کمی میلے/ایسپارٹیٹ شٹل پر زیادہ انحصار کرتی ہے جو مائٹوکونڈریل ٹرائکاربو آکسیلک ایسڈ سائیکل-NADH کو ایکسٹرا مائٹوکونڈریل اسپیس [20] سے جوڑتی ہے۔

ابتدائی تجربات میں، ہم نے تصدیق کی کہ مرکبات 1، 2، 3، اور 4 ایم ٹی ٹی ٹیٹرازولیم نمک کو براہ راست کم نہیں کرسکتے ہیں (نہیں دکھایا گیا)۔ موجودہ مطالعہ میں، MTT یا CCK-8 محلول کو شامل کرنے سے پہلے، مائکرو پلیٹس کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) کے ساتھ احتیاط سے دھو کر ری ایجنٹ کے ساتھ مرکبات کے براہ راست اثر کو ختم کر دیا گیا، جیسا کہ مینوفیکچرر کے پروٹوکول میں اشارہ کیا گیا ہے۔ اس کے باوجود، دو طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ نتائج اب بھی متضاد تھے (شکل 2)۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، 1، 2 اور 3 مرکبات کے ساتھ خلیوں کے انکیوبیشن نے کنٹرول گروپ (شکل 3) کے مقابلے میں ٹیٹرازولیم نمک کی جامنی شکل میں کمی کو بڑھا دیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ ایک مخصوص مرکب کی موجودگی میں ٹیٹرازولیم نمک کی محض کمی۔ ایم ٹی ٹی پرکھ میں مداخلت کرنے کی کمپاؤنڈ کی صلاحیت کا فیصلہ کرنے کے لیے کافی نہیں ہے۔

اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا مرکبات 1، 2، 3، اور 4 EA.hy926 خلیوں میں apoptosis پیدا کر سکتے ہیں، سیلولر مورفولوجیکل تبدیلیاں اور فاسفیٹائڈیلسرین ایکسٹرنلائزیشن کا جائزہ لیا گیا۔ CCK-8 پرکھ کے ساتھ مشاہدہ کردہ سیلولر قابل عملیت میں مسلسل کمی کے ساتھ، annexin V-FITC/PI کا استعمال کرتے ہوئے Hoechst سٹیننگ اور فلو cytometry تجزیہ کے نتائج نے تجویز کیا کہ مرکب 1، 2، اور 3 علاج کے بعد نمو کی روک تھام کا مشاہدہ کیا گیا تھا۔ کم از کم جزوی طور پر، EA.hy926 سیل اپوپٹوسس کی وجہ سے۔ ہمارے نتائج نے اس خیال کی بھی تائید کی کہ دونوں مرکبات 1 اور 2 میں موجود کیفیوائل گروپ MTT پرکھ کے ساتھ حاصل ہونے والے متضاد نتائج کے لیے ذمہ دار تھا۔

ہمارے نتائج کی طرح، Rottlerin، ایک طاقتور بڑے کنڈکٹنس پوٹاشیم چینل اوپنر، نے وٹرو میں MTT کی طرف رد عمل کا مظاہرہ نہیں کیا۔ تاہم، اس نے خلیوں کے اندر فارمازان کرسٹل کی تشکیل کو مضبوطی سے بڑھایا، جس کا نتیجہ NF-κB کے روٹلرین کی روک تھام اور ڈی این اے میں [3 H]-thymidine کے شامل ہونے کے تجزیہ سے مشاہدہ کردہ سیل کے پھیلاؤ کے ساتھ واضح تنازعہ میں تھا۔ وہ طریقہ کار جس کے ذریعے Rottlerin نے MTT میں کمی کو بڑھایا اس کی وجہ اس کے mitochondrial uncoupling effect [22] سے ہے۔ Rottlerin میں cinnamoyl acid کا متبادل گروپ ہوتا ہے۔ cinnamoyl acid کے مقابلے میں، مرکب 3 میں دو اضافی ہائیڈروکسیل باقیات ہیں، جو C-3 اور C-4 پر واقع ہیں۔ لہذا، ہم قیاس کرتے ہیں کہ جس طریقہ کار کے ذریعے مرکبات 1 اور 2 MTT پرکھ میں متضاد نتائج کا باعث بنتے ہیں وہ ان کے mitochondrial uncoupling اثرات سے بھی وابستہ ہو سکتے ہیں۔ اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، مرکبات 1، 2، اور ایک کیمیکل انکپلر، جیسے ٹرائی فلورو کاربونیلسیانائیڈ فینیل ہائیڈرازون (FCCP) کے درمیان تقابلی مطالعات کی ضرورت ہے۔

تجرباتی جگہ

ریجنٹس اور کیمیکل

کمپاؤنڈ 3 (کیفیک ایسڈ – پاؤڈر، طہارت=98.6 فیصد) چینگڈو پش بائیو ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (چینگڈو، چین) سے خریدا گیا تھا۔ کمپاؤنڈ 4 (3,4-dihydroxylphenylethanol– oil, pureity=98.5 فیصد ) Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China) سے حاصل کیا گیا تھا۔ MTT اور dimethyl سلفوکسائڈ (DMSO) سگما-الڈرچ (سینٹ لوئس، MO، USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ CCK{11}} پرکھ Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan) سے خریدی گئی تھی۔ Hoechst 33342 اور annexin V-FITC/PI apoptosis کا پتہ لگانے والی کٹس Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen، China) سے خریدی گئی تھیں۔

پلانٹ کا مواد

C. tubulosa کے تنوں کو یوٹیان پریفیکچر، سنکیانگ اویگور خود مختار علاقہ، چین سے جمع کیا گیا تھا۔ واؤچر کے نمونے ہائی ایلٹیٹیوڈ میڈیسن کی کلیدی لیبارٹری، تھرڈ ملٹری میڈیکل یونیورسٹی (چونگ کنگ، چائنا) میں جمع کیے گئے تھے اور چینگڈو یونیورسٹی آف ٹریڈیشنل چائنیز میڈیسن (چینگڈو، چین) سے یی ژانگ نے تصدیق کی تھی۔

پودوں کے مواد کو نکالنا اور الگ کرنا

ہوا سے خشک C. tubulosa (0.6 kg) تنوں کو 70 ڈگری پر 2 گھنٹے کے لیے 50 فیصد ایتھنول کے ساتھ پاؤڈر اور نکالا گیا۔ کم دباؤ کے تحت سالوینٹس کو ہٹانے کے بعد، ایتھانولک ایکسٹریکٹ (212.5 جی) کو پانی (2 L) میں تحلیل اور معطل کر دیا گیا اور n-butanol (2 L × 3) کے ساتھ نکالا گیا۔ n-butanolic اقتباس (110 g) کو پولیامائڈ کالم پر کرومیٹوگراف کیا گیا تھا اور اسے ایتھنول/پانی (0:100، 5:95، 15:85، 30:70، 50:50) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا جس سے پانچ حصے (A–E) تیار کیے گئے تھے۔ . فریکشن B (65 جی) کو ODS کالم پر الگ کیا گیا تھا۔ ایتھنول کے ساتھ اخراج: پانی (1:9) الگ شدہ مرکب 1 (3 جی)۔ فریکشن D (10.5 جی) کو ODS کالم پر تقسیم کیا گیا تھا۔ ایتھنول/پانی کے ساتھ اخراج (1:4) الگ شدہ مرکب 2 (1 جی)۔

NMR سپیکٹرا کو CD3OD میں Bruker Avance 600 سپیکٹرومیٹر پر Tetramethylsilane (TMS) کے ساتھ اندرونی معیار کے طور پر ریکارڈ کیا گیا تھا۔ ماس سپیکٹرا بائیوٹوف-کیو ماس سپیکٹرومیٹر پر کیا گیا تھا۔

سیل کلچر

EA.hy926 سیل لائنیں امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (ماناساس، VA، USA) سے حاصل کی گئیں۔ سیلز کو RPMI 1640 میڈیم میں کلچر کیا گیا، 10 فیصد (v/v) فیٹل بوائین سیرم اور 1 فیصد (v/v) پینسلین-اسٹریپٹومائسن کے ساتھ ایک مرطوب ماحول میں 5 فیصد CO2 کے ساتھ 37 ڈگری پر۔

سیل وابستگی

سیل کی قابل عملیت کا اندازہ MTT اور CCK{{0}} اسسیس کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ مرکبات 1 اور 2، اور ان کے aglycones، caffeic acid (3) اور 3،4-dihydroxylphenylethanol (4) کو کلچر میڈیا میں حتمی DMSO ارتکاز <0.1 فیصد="" (v/v)="" تک="" dmso="" میں="" تحلیل="" کر="" دیا="">

EA.hy926 سیلز کو 96-کنویں پلیٹوں پر 4 × 103 سیلز/کنویں پر سیڈ کیا گیا تھا۔ 24 گھنٹے تک انکیوبیشن کے بعد، خلیوں کا علاج 24 گھنٹے کے لیے 6.25–50 μM مرکب 1، 2، 3، یا 4 سے کیا گیا۔ کلچر میڈیم کو ہٹا دیا گیا تھا اور خلیوں کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) سے دو بار دھویا گیا تھا۔ ایلی کوٹس (10 μL) اسٹاک MTT محلول (5 mg·mL−1 ) ہر ایک کنویں میں شامل کیا گیا تھا جس میں 100 μL درمیانے درجے کا ہوتا تھا اور 4 گھنٹے کے لیے خلیوں کے ساتھ لگایا جاتا تھا۔ انکیوبیشن کے بعد، میڈیم کو ہٹا دیا گیا اور فارمازان کرسٹل کو گھلنشیل کرنے کے لیے ہر کنویں میں DMSO کے 150 μL ایلی کوٹس شامل کیے گئے۔ مائکروپلیٹ ریڈر (Bio-Tek Synergy HT، Winooski، VT، USA) کا استعمال کرتے ہوئے جذب کو 490 nm پر ماپا گیا۔ سیل کی قابل عملیت کا اظہار ایم ٹی ٹی کمی کے فیصد کے طور پر کیا گیا تھا، جو کنٹرول سیل کے جذب کو 100 فیصد قدر تفویض کرتا ہے۔ تمام تجربات تین بار کیے گئے اور اوسط ± معیاری انحراف (SD) کے طور پر پیش کیے گئے۔

CCK-8 پرکھ معمولی ترمیم کے ساتھ ادب کے بعد انجام دیا گیا تھا [23]۔ خاص طور پر، خلیات کو 24 گھنٹے کے لیے 6.25–50 μM مرکبات 1، 2، 3، یا 4 کے ساتھ علاج کیا گیا اور 10 μL CCK-8 محلول اور 100 μL کلچر میڈیا کے اضافے سے پہلے PBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ مائکروپلیٹ کو 2 گھنٹے کے لئے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کرنے کے بعد، مائکروپلیٹ ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے جذب کو 450 nm پر ماپا گیا۔ سیل کی عملداری کو کنٹرول سیلز (100 فیصد) کے مقابلے میں قابل عمل خلیوں کی فیصد کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ تمام تجربات تین بار کیے گئے اور اوسط ± SD کے طور پر ظاہر کیے گئے۔

ہوچسٹ 33342 سٹیننگ کے ذریعہ اپوپٹوس کی تشخیص

اپوپٹوٹک مورفولوجیکل تبدیلیاں ہوچسٹ 33342 داغ کے ذریعہ دیکھی گئیں۔ مختصراً، EA.hy926 خلیوں کو 48-کنویں کی پلیٹوں (2 × 104 خلیات/کنویں) پر سیڈ کیا گیا اور 50 μM کمپاؤنڈ 1، 2، 3، یا 4 کے ساتھ 48 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر علاج کیا گیا، PBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لیے 4 فیصد (v/v) paraformaldehyde کے ساتھ طے کریں۔ PBS کے ساتھ دو بار کلی کرنے کے بعد، خلیات کو کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے Hoechst 33342 (10 ug·mL−1 ) سے داغ دیا گیا اور PBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ فلوروسینس مائکروسکوپ (اولمپس، ٹوکیو، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے ہوچسٹ داغ والے نیوکلی کو تصور کیا گیا تھا۔

فلو سائٹومیٹری کے ذریعہ اپوپٹوس تجزیہ

اپوپٹوٹک خلیوں کا پتہ انیکسن V-FITC/PI ڈبل سٹیننگ اور فلو سائٹوومیٹری تجزیہ کے ذریعہ پایا گیا۔ مختصراً، 48 گھنٹے کے لیے 50 μM کمپاؤنڈ 1، 2، 3، یا 4 کے ساتھ علاج کے بعد، خلیات کی کٹائی کی گئی اور PBS میں 1 × 105 خلیات·mL−1 پر دوبارہ معطل کر دی گئی۔ 25 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے 500 × g پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، annexin V-FITC بائنڈنگ بفر کا 195 μL اور annexin V-FITC کا 5 μL شامل کیا گیا۔ ہلکے بھنور کے اختلاط کے بعد، مرکب کو اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ 25 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے 500×g پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، FITC-conjugated annexin V بائنڈنگ بفر کے 190 μL اور 10 μL PI شامل کیے گئے۔ ہلکے بھنور کے اختلاط کے بعد، 30 منٹ کے اندر FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں کا تجزیہ کیا گیا۔

شماریاتی تجزیہ

تمام تجرباتی اعداد و شمار کو اوسط ± SD کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ تجرباتی نمونوں اور متعلقہ کنٹرول کے درمیان فرق کی اہمیت کا اندازہ SPSS سافٹ ویئر (ورژن 11.5) کا استعمال کرتے ہوئے تغیر (ANOVA) کے یک طرفہ تجزیہ سے لگایا گیا۔ شماریاتی اہمیت p < 0.05="" پر="" سیٹ="" کی="" گئی="">

نتائج

ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ ایم ٹی ٹی پرکھ میں مشاہدہ کیے گئے قابل عمل خلیوں کی تعداد کا زیادہ تخمینہ کچھ مرکبات کی سائٹوٹوکسائٹی کو ماسک کر سکتا ہے۔ اس لیے، منشیات کی جانچ کے عمل کے دوران، ہم خلیے کی قابل عملیت (جیسے CCK-8 اور 3 H-TdR assays) میں مخصوص مرکب کے اثر کا تعین کرنے کے لیے مختلف طریقے استعمال کرنے کی تجویز کرتے ہیں تاکہ گمراہ کن نتائج پیدا نہ ہوں۔