Proanthocyanidins کے ذریعے آنتوں کے تحفظ میں انسولین کی حساسیت، لپڈ اور گلوکوز ہومیوسٹاسس میں بہتری کے ساتھ مل کر اینٹی آکسیڈیٹیو اور اینٹی سوزش والی کارروائیاں شامل ہیں حصہ 2

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

مغربی دھبہ کا استعمال کرتے ہوئے ٹین اظہار۔ شکل 6 سے پتہ چلتا ہے کہ Caco-2/15 خلیوں میں Fe/Asc کے اضافے نے دو اہم خامروں کی سطح کو بڑھایا، لیکن PACs نے ان کے Fe/Asc کی حوصلہ افزائی اپ گریجولیشن کا مقابلہ کیا۔

چونکہ انسولین سگنلنگ lipogenesis، FA-oxidation، اور gluconeogenesis کے عمل کو ماڈیول کرتا ہے، اس لیے یہ ضروری تھا کہ MAPKs اور PI3K/Akt پر Fe/Asc اور PACs کے اثر و رسوخ کی چھان بین کی جائے، جو انسولین سگنلنگ کے دو اہم راستے ہیں۔ اس مقصد کے لیے، Caco-2/15 خلیات دوسرے Caco-2/15 سیل سے پہلے انسولین کے ساتھ تیار کیے گئے تھے۔

Figure6.Caco-2/15 خلیوں میں گلوکوجینیسیس پر PACs کے اثرات۔ Proanthocyanidins (PACs, 250 ug/mL) کو Fe/Asc （200μM/2 mM） کے ساتھ 37 ڈگری پر 6 گھنٹے کے لئے علاج سے 24 گھنٹے پہلے اپیکل سیل کے ڈبے میں شامل کیا گیا تھا۔ (A) G6Pase اور (B) PEPCK کے پروٹین اظہار کا اندازہ مغربی بلاٹ کے ذریعہ کیا گیا تھا۔cistanche پاؤڈرنتائج 3 آزاد تجربوں کے ذرائع ± SEM کی نمائندگی کرتے ہیں، ہر ایک سہ رخی میں۔ ایک نمائندہ مغربی دھبہ دکھایا گیا ہے، جو ایک ہی جیل پر اور ایک ہی نمائش پر سہ رخی میں ایک تجربے کی مثال دیتا ہے۔*p<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">cistanche جڑG6Pase گلوکوز-6-فاسفیٹیس، پی ای پی سی کے فاسفونولپائروویٹ کاربوکسی کنیز۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے کے لیے علاج۔ جبکہ Fe/Asc نے p{{0}MAPK پروٹین ایکسپریشن اور فاسفو p38-MAPK/p38-MAPK تناسب بڑھایا، PACs نے ان کارروائیوں کو روکا (تصویر 7A-C) دوسری طرف، جہاں Fe/Asc نے فاسفو اکٹ (pAkt) اور اکٹ/Akt تناسب کے پروٹین ماس کو کم کیا، PACs نے اپنی معمول کی سطح کو برقرار رکھنے کی صلاحیت ظاہر کی۔ اسی طرح کا رجحان PI3K کے لیے نوٹ کیا گیا تھا (تصویر 7D-I. لہذا، یہ مشاہدات انسولین سگنلنگ میں PACs کے سازگار کردار کی حمایت کرتے ہیں۔

بحث

پولیفینول اپنے pleiotropic حیاتیاتی اور دواؤں کے اثرات کے لیے معروف ہیں، جو پودوں سے حاصل کی جانے والی ان دلچسپ قدرتی مصنوعات کی طرف بہت سے سائنسدانوں اور کھانے کی صنعتوں کی کشش کی وضاحت کرتے ہیں۔ PACs مختلف قسم اور کثیر تعداد میں پولی فینول سے الگ ہیں کیونکہ ان کے دائمی عوارض پر فارماسولوجیکل اور علاج کے اثرات 2021 ہیں۔ ان کی قابل تعریف خصوصیات کے باوجود، GI ٹریکٹ پر ان کے اثر و رسوخ کے بارے میں ابھی بھی بہت کچھ نامعلوم ہے، جو توسیع ہاضمہ، امیونولوجک، نیورونل، اور میٹاجینومکس نیٹ ورکس کو تعینات کرتا ہے۔cistanche نینداس وجہ سے، موجودہ تحقیقات میں آنتوں کے OxS، اینٹی آکسیڈینٹ دفاع، سوزش، FA-oxidation، lipogenesis، اور gluconeogenesis میں PACs کے کردار کو واضح کرنے کے لیے کوششیں وقف کی گئی ہیں، جبکہ ایک ہی وقت میں انسولین سگنلنگ جیسے بنیادی میکانزم کو واضح کرنے کی کوشش کی گئی ہے۔ اور نقل کے عوامل کی حیثیت۔

PAC اثرات کی تحقیقات کے لیے، ہم نے Caco-2/15 سیل لائن کا استعمال کیا، ایک مقبول آنتوں کا ماڈل جسے بنیادی طور پر سائنسی کمیونٹی2 کے ذریعے سراہا جاتا ہے، اور خوراک اور ادویات کی انتظامیہ کے ذریعے خوراک اور نقل و حمل کے عمل4 کے لیے تسلیم کیا جاتا ہے۔ نہ صرف Caco-2/15 خلیے بے ساختہ انسانی انٹروسائٹس 3,25 سے ملتے جلتے اور شکلی طور پر مختلف ہوتے ہیں، بلکہ وہ آنتوں کے جذب اور تعامل، غذائیت، زہریلا، فوڈ مائیکرو بائیولوجی، جیو دستیابی ٹیسٹ، اور اسکریننگ کی موثر تلاش کے لیے بھی کام کرتے ہیں۔ دریافت پروگرام 2²627 میں منشیات کی پارگمیتا۔ جیسا کہ مختلف عنوانات سے متعلق ہماری پچھلی رپورٹس میں28-3】، Caco-2/15 سیل لائن نے موجودہ مطالعہ میں متنوع میٹابولک راستوں کو منظم کرنے کے لیے PACs کی صلاحیت کو کھولنے میں اہم کردار ادا کیا ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ، اس مطالعے میں، خلیات غیر محفوظ فلٹرز پر بوئے گئے تھے، جس سے دوئبرووی آنتوں کے اپکلا کے دونوں اطراف تک رسائی کی اجازت دی گئی تھی: بالترتیب آنتوں کے لیمن یا سیروسل سرکولیشن سے مطابقت رکھنے والے apical اور basolateral compartments، اس کے علاوہ، ہم نے Caco کو پہلے سے انکیوبیٹ کیا تھا{{14} Fe/Asc کے ساتھ 15 خلیات، کیونکہ یہ نظام مضبوط آکس ایس اور سوزش پیدا کرنے کے لیے ہماری لیبارٹری میں انتہائی متعلقہ تھا، جس کے نتیجے میں اثر کرنے والوں کے ایک بڑے سپیکٹرم نے چیلنج کیا،1932-3 قابل ذکر، Fe/Asc ایک مضبوط آکسیجن کے طور پر -بنیاد پیدا کرنے والا نظام حیاتیاتی میکرو مالیکیولز کو آکسیڈیٹیو نقصان پہنچاتا ہے، انٹرا سیلولر ریڈوکس ماحول کو تبدیل کرتا ہے اور متعدد پیتھولوجیکل حالتوں میں شامل ہوتا ہے 2.35,56۔ ہماری دریافتیں کمزور اینٹی آکسیڈنٹ اور ڈیفنس کے ساتھ لپڈ پیرو آکسیڈیشن (اعلی ایم ڈی اے کی سطح) کی نمایاں بلندی کو ظاہر کرتی ہیں۔ SOD2 پروٹین اظہار)۔cistanche tubulosa فوائدمزید برآں، لپڈ پیرو آکسائیڈز پیدا کرنے کی صلاحیت کی وجہ سے، Fe/Asc کمپلیکس سوزش کو فروغ دیتا ہے جیسا کہ TNFa، COX2، اور NF-is کے بڑھتے ہوئے اظہار سے ظاہر ہوتا ہے۔ اجتماعی طور پر، موجودہ نتائج Fe/Asc کے جواب میں بنیاد پرست اور اشتعال انگیز نسل کی توثیق کرتے ہیں۔

PACs کی موجودگی نے Fe/Asc ثالثی لپڈ پیرو آکسیڈیشن کا مقابلہ کیا۔ جیسا کہ اینٹی آکسیڈینٹ دفاع کی ناکامی OCS کی شمولیت کی وضاحت کر سکتی ہے، ہم نے endogenous antioxidant enzymes پر اس کے عمل کی جانچ کی۔ درحقیقت، PACs Fe/Asc-ثالثی SOD2 اور GPx کمی کو بحال کرنے میں کامیاب تھے۔ Fe/Asc کے ذریعے OxS کے بڑھنے اور PACs کے ذریعے تخفیف کے طریقہ کار کو بیان کرنے کے لیے، ہم نے Keap1-NRF2-اینٹی آکسیڈینٹ رسپانس عنصر (ARE) سگنلنگ پاتھ وے کا اندازہ کیا، جسے سب سے زیادہ طاقتور اینڈوجینس اینٹی آکسیڈینٹ سمجھا جاتا ہے۔ ریگولیٹر 37۔چائےNRF2 ایک سیلولر OCS سینسر ہے جس کا کام ریڈوکس ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنا ہے۔ عام حالات میں۔ NRF2 کو اس کے منفی پابند ریگولیٹر Keap18 کے ذریعہ پروٹیزومل انحطاط کے لئے مسلسل ہر جگہ اور نشانہ بنایا جاتا ہے۔ اینڈوجینس اور خارجی اثر کرنے والوں کی موجودگی میں، کیپل کو غیر فعال اور گھٹایا جاتا ہے، اس طرح Keapl-NRF2 کے تعامل میں خلل پڑتا ہے اور NRF2 کو جاری کرتا ہے، جو سیل نیوکلئس میں منتقل ہوتا ہے، پروموٹرز سے منسلک ہوتا ہے۔

تصویر 7. کاکو-2/15 سیل لائن میں انسولین کی حساسیت پر PACs کے اثرات۔ Proanthocyanidins (PACs, 250 ug/mL) کو Fe/Asc（200μM/2 mM） کے ساتھ 37 ڈگری پر 6 گھنٹے کے لئے علاج سے 24 گھنٹے پہلے اپیکل سیل کے ڈبے میں شامل کیا گیا تھا۔ Fe/Asc مرکب کے ساتھ 6h-انکیوبیشن کے اختتام سے دو گھنٹے پہلے، انسولین کی حساسیت کا اندازہ کرنے کے لیے انسولین (100 nM) شامل کی گئی۔ (A) p38-MAPK، (B) فاسفور p38-MAPK، (D) اکٹ، (E) فاسفو اکٹ، (G) PI3k، اور (H) فاسفو PI3k کا پروٹین ایکسپریشن تھا مغربی دھبے سے جانچا گیا۔ تناسب(C) فاسفو p38-MAPK/p38-MAPK,(F)phospho Akt/Akt، اور (Dphospho PI3k/PI3k کا پھر حساب لگایا گیا۔ نتائج 3 آزاد تجربوں کے ±SEM کی نمائندگی کرتے ہیں۔ ہر ایک ڈپلیکیٹ میں۔ ایک نمائندہ مغربی دھبہ دکھایا گیا ہے، جو ایک ہی جیل پر اور ایک ہی نمائش کے ساتھ سہ رخی میں ایک تجربے کی مثال دیتا ہے۔*p<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE، اور اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کی نقل کو تیز کرتا ہے۔ ہمارے اعداد و شمار کے مطابق، PACs کے ساتھ Caco-2/15 خلیوں کے علاج نے Keapl کو دبایا اور NRF2 کو نیوکلئس میں منتقل ہونے کی اجازت دی جس سے اینٹی آکسیڈینٹ جینز کے فروغ دینے والے علاقے میں ARE (بنیادی ترتیب: 5'TGACnnnGC3') کا پابند ہو گیا۔ (SOD2 اور GPx)، جس کے نتیجے میں ان کی نقل کی حوصلہ افزائی اور مربوط اپ-ریگولیشن۔ ان اعداد و شمار کے مطابق، فینولک ریسویراٹرول کمپاؤنڈ نے NRF2 کے اظہار کو فروغ دینے اور Keap12 کے اظہار کو کم کرتے ہوئے H, O، علاج شدہ رمیٹی سندشوت فبروبلاسٹ نما سائنو سائیٹس میں OxS کو روکا۔ مزید برآں، کنزاکی ایٹ ال کے مطابق، اینٹی آکسیڈینٹ اور سائٹو پروٹیکٹیو انزائمز کی ایکٹیویشن NRF2/Keapl ratio1 کے ساتھ منسلک ہو سکتی ہے۔

جیسا کہ OCS کی بہتری سے توقع کی جاتی ہے، PACs نے سوزش کو نمایاں طور پر کم کیا جیسا کہ TNFa اور COX2 کی کمی سے ظاہر ہوتا ہے۔ چونکہ NF-KB proinflammatory cytokines کا کلیدی ریگولیٹر ہے، ہم نے PACs پر اس کے ردعمل کا جائزہ لیا۔ اشتعال انگیز ایجنٹوں کے رجحان کے مطابق، PACs نے Fe/Asc-ثالثی والے NF-KB انڈکشن کو منسوخ کر دیا اور NF-KB/IikB تناسب کو کم کر دیا۔ اس طرح، ہم معقول طور پر یہ فرض کر سکتے ہیں کہ PACs سوزش کے خلاف حفاظت میں مدد کرتے ہیں جو NF-kB کے کنٹرول کے ذریعے آنتوں کے خلیوں کے افعال کو خطرے میں ڈالتا ہے، جو سوزش کے ردعمل کے ماسٹر ریگولیٹر ہے۔ یہ بات قابل ذکر ہے کہ PACs سیلولر اینٹی آکسیڈینٹ دفاعی میکانزم کو تحریک دے کر سوزش سے بچا سکتے ہیں کیونکہ ریڈوکس عدم توازن اور سوزش 2 کے بائیو مارکر کے درمیان قریبی تعلق موجود ہے۔

موجودہ مطالعہ کا مقصد آنتوں کے لپڈ ہومیوسٹاسس پر پی اے سی کے اثرات کی تحقیقات کرنا ہے۔ ہمارے دلچسپ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ PACs نے ایک طرف CPTla کو اپ گریڈ کیا، اور FAS کو کم کیا، جو بالترتیب FA-oxidation اور lipogenesis کے بائیو مارکر کی نمائندگی کرتا ہے۔ لہذا، یہ انزائمز PACs کے ممکنہ اہداف ہیں، جو لپڈ کے جمع ہونے کو روکنے کے لیے پولی فینولک صلاحیت کی نشاندہی کرتا ہے، جسے بہت سے ٹشوز*3 میں آکس سینڈ کی سوزش کا پیتھولوجیکل مظہر سمجھا جاتا ہے۔ مالیکیولر میکانزم کا تعلق شاید پی پی اے آر کی اپ گریجولیشن اور ایس آر ای بی پی ایل سی کی کمی سے ہے، دو ٹرانسکرپشن عوامل جو لپڈ میٹابولزم کو منظم کرتے ہیں۔ FAS lipogenesis میں مرکزی انزائم ہے، جو malonyl-CoA کو FAs45 میں تبدیل کرنے کے لیے ذمہ دار ہے۔ اس کی طرف، ACC FAS کے لیے ایک ضروری سبسٹریٹ malonyl-CoA کی تشکیل کو متحرک کرتا ہے۔ ہمارے نتائج کے مطابق، سولانم نگرم پولیفینول بھی ایف اے ایس اور ایس آر ای بی پی کو کم کرتے ہوئے پائے گئے، جبکہ اولیک ایسڈ سے علاج شدہ ہیپاٹوسائٹس میں سی پی ٹیلا اور پی پی اے آر کو بڑھاتے ہوئے"6۔

پولیفینول کے عمل کا طریقہ کار عام طور پر AMPKa فاسفوریلیشن 7 کو چالو کرنے کے ساتھ منسلک ہوتا ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ، ہمارے مطالعے میں فاسفوریلیٹڈ AMPKa کو Fe/Asc کے ذریعے کم کیا گیا تھا، لیکن PACs کے ذریعے حوصلہ افزائی کی گئی تھی، جو کہ فاسفو ACC کی تنزلی کی وضاحت کرتا ہے، جس کے نتیجے میں lipogenesis کو روکا جاتا ہے اور توانائی کی میٹابولزم میں اضافہ ہوتا ہے۔ تاہم، AMPKa کے پروٹین ایکسپریشن کو Caco2/15 سیلوں میں Fe/Asc-حوصلہ افزائی OxS کے ذریعے بڑھایا گیا۔ اس کے مطابق، ROS اور OxS مختلف upstream kinases8 کے ذریعے AMPKa کو آمادہ کر سکتے ہیں۔

OCS اور سوزش مضبوطی سے انسولین کے خلاف مزاحمت اور اضافی میٹابولک عوارض 9,50 کی حوصلہ افزائی کرتی ہے، جس نے ہمیں انسولین سگنلنگ پاتھ وے سے متعلق کچھ اہم پروٹینوں کو ریگولیٹ کرنے کے لیے Pac کی صلاحیت کا اندازہ لگانے پر آمادہ کیا۔ ہم نے سب سے پہلے p38-MAPK پر توجہ مرکوز کی جس کا اظہار انسولین ریسیپٹر سگنلنگ کیسکیڈ میں مداخلت کرتے ہوئے OxS کے ذریعہ اپ گریڈ پایا گیا تھا۔ p38-MAPKphosphorylation اور فاسفو p38-MAPK/p{{5}MAPK تناسب کے دونوں تجزیہ سے Fe/Asc کے ردعمل میں نمایاں اضافہ ہوا، جو Caco میں خراب IS کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے {6}/15 سیلز۔ توثیق pAkt اور PI3K کی کمی سے حاصل کی گئی۔ اس کے برعکس، PACs نے رجحان کو تبدیل کر دیا کیونکہ انہوں نے PI3K/Akt سگنلنگ پاتھ وے کو بڑھاتے ہوئے p38-MAPK فاسفوریلیشن اور فاسفو p38-MAPK/p38-MAPK تناسب کو کم کرنے کی صلاحیت ظاہر کی، جو گلوکوز کی نقل و حمل، پروٹین کی ترکیب، سیلولر پھیلاؤ، سیل کی بقا، اور گلوکونیوجینیسیس کو منظم کرکے انسولین کے اہم حیاتیاتی افعال میں ثالثی کے لیے جانا جاتا ہے۔ OxS اور دائمی سوزش کی وجہ سے IS میں خرابی گلوکونیوجینیسیس کے عمل 3,54 کو بھی متاثر کر سکتی ہے۔ ڈی نوو گلوکوز سنتھیسز (PEPCK، G6Pase) میں شامل دو پرنسپل انزائمز کے تجزیے سے Fe/Asc کے ردعمل میں نمایاں اضافہ کا انکشاف ہوا ہے جبکہ PACs انتظامیہ نے انہیں Caco2/15 خلیوں میں معمول کی سطح پر واپس لایا ہے۔

آخر میں، سائنسی لٹریچر میں متعدد مطالعات بالواسطہ ثبوت کے ذریعہ فینولک مرکبات کے خاص فینولک مالیکیول یا کئی پولی فینولز کے مرکب کے طور پر صحت کے اہم اثرات کو ظاہر کرتے ہیں۔ موجودہ کام OxS، سوزش، اور متعلقہ میٹابولک عوارض کو روک کر آنتوں کے ہومیوسٹاسس میں PACs (پیچیدہ flavanols) کے اہم اثر کی نشاندہی کرتا ہے۔ چونکہ PACs مکمل طور پر چھوٹی آنت کے ذریعے جذب نہیں ہو سکتے، اس لیے چھوٹی آنت میں ان کے صحت مند اثرات میں شامل میکانزم کی چھان بین کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے۔

مواد اور طریقے

آنتوں کا کاکو-2/15 سیل کلچر اور علاج۔ تمام تجربات کے لیے، ہم نے انسانی اپیتھیلیئل کولوریکٹل اڈینو کارسینوما Caco-2/15 سیل لائن کا استعمال کیا، جو پیرنٹ Caco-2 سیلز کا ایک مستحکم کلون ہے (امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن، Rockville، Md.، USA)، جو ڈاکٹر JF Beaulieu (محکمہ سیلولر بیالوجی، فیکلٹی آف میڈیسن، Université de Sherbrooke، Sherbrooke، Québec، کینیڈا) سے حاصل کیا گیا تھا۔ Caco-2/15 سیل لائن میں وٹرو میں پولرائزڈ بالغ انٹروسائٹس میں فرق کرنے اور ایک ناقابل تسخیر مون-اوور بنانے کی منفرد خاصیت ہے۔ Caco-2/15 سیلز کو کلچر کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے323455 اور سیل کی سالمیت، OCS، اور سوزش17,19، اور IS56 کے مطالعہ کے لیے استعمال کیا گیا۔

امیونوبلوٹنگ کے ذریعہ پروٹین کے اظہار کا تجزیہ۔ مختلف علاج کے ساتھ انکیوبیشن کے بعد، Caco-2/15 خلیات کو برف کے ٹھنڈے بفر میں لیس کیا گیا جس میں 20 mM Tris-HCl(pH 7.4)، 150 mM NaCl، 1 mM Na2E-DTA، 1 mM EGTA، 1 فیصد NP شامل تھے۔ -40، 1 فیصد ڈیوکسیکولیٹ، 2.5 ایم ایم سوڈیم پائرو فاسفیٹ، 1 ایم ایم Na2VO4، 1 ug/mL لیوپیپٹن، اور 1 mM PMSF۔ ہر نمونے کی پروٹین کی حراستی کا تعین بریڈ فورڈ طریقہ (Bio-Rad) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ اس کے بعد SDS اور ß-mercaptoethanol پر مشتمل نمونے کے بفر میں پروٹینوں کو 5 منٹ کے لیے ڈینیچر کیا گیا۔ 15 ug کل پروٹین پر مشتمل ہوموجنیٹس کو پروٹین مالیکیولر وزن کے مطابق 10 فیصد SDS-polyacrylamide جیل پر الگ کیا گیا تھا اور نائٹروسیلوز جھلیوں پر الیکٹرو بلوٹ کیا گیا تھا۔ چکنائی سے پاک دودھ کو راتوں رات 4 ڈگری پر بنیادی اینٹی باڈیز شامل کرنے سے پہلے جھلیوں کی غیر مخصوص جگہوں کو روکنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔ اینٹی باڈیز کے کمزور ہونے کی اطلاع ضمنی معلومات اور ہماری حالیہ اشاعت میں دی گئی ہے۔ ایک ChemiDoc MP امیجنگ سسٹم (Bio-Rad) کا استعمال کرتے ہوئے رد عمل والے بینڈ پکڑے گئے تھے۔ تمام اعداد و شمار کو ایک ہی نمونے میں ہدف پروٹین کے -ایکٹین کے تناسب کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔

شماریاتی تجزیہ. تمام اقدار کا اظہار کم از کم تین مختلف تجربات کے اوسط ± SEM کے طور پر کیا جاتا ہے۔ ڈیٹا کا تجزیہ یک طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا گیا جس کے بعد PRISM 7 کا استعمال کرتے ہوئے Tukey کے متعدد موازنہ ٹیسٹ ہوئے۔{2}}(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)۔ P میں اختلافات کو اہم سمجھا جاتا تھا۔<>

یہ مضمون Scientifc رپورٹس سے ماخوذ ہے۔ (2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5