Lamivudine SAMP8 چوہوں میں علمی کمی کو بہتر بناتا ہے: Vivo فارماکولوجیکل ایویلیویشن اور نیٹ ورک فارماکولوجی میں انضمام

خلاصہ

ریورس ٹرانسکرپٹیس انحیبیٹرز جیسے لامیوڈین (3TC) اہم کردار ادا کرتے ہیں۔مخالف عمر، لیکن ان کے اثراتعمر بڑھنے کی وجہ سے نیوروڈیجینریٹی بیماریاںواضح نہیں ہیں، خاص طور پر کے افعال پراعصابی نظام جیسے ادراک. اس مطالعے میں، ہم نے 4 ہفتوں تک گیسٹرک پرفیوژن (100 ملی گرام/کلوگرام) کے ذریعے سنسنی ایکسلریٹڈ ماؤس پروون 8 (SAMP8) چوہوں کو 3TC کا انتظام کیا۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 3TC نے نمایاں طور پر بہتری لائی ہے۔SAMP8 چوہوں کی عمر بڑھنے کی حیثیتخاص طور پر مورس واٹر میز ٹیسٹ کے ذریعے علمی صلاحیت میں کمی کا اندازہ لگایا گیا ہے۔ کے مالیکیولر میکانزم کی مزید تفتیش کے لیےعمر بڑھنے کی کیفیت کو بہتر بناناSAMP8 چوہوں کے 3TC کے ذریعے، qPCR، اور ٹشو سٹیننگ کے طریقے چوہوں کے دماغی ٹشوز (یعنی، ہپپوکیمپس اور کورٹیکس) کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے، جبکہ نیٹ ورک فارماسولوجی تجزیہ کا اطلاق 3TC کے ممکنہ اہداف کی چھان بین کے لیے کیا گیا تھا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ طویل وقفے والے عنصر سے متعلق جینوں کی mRNA کی سطح-1، ٹائپ 1 انٹرفیرون ردعمل، سنسنی سے وابستہ سراو فینوٹائپ، اورایک دماغی مرض کا نام ہےSAMP8 چوہوں کے ہپپوکیمپس اور پرانتستا میں اضافہ کی وجہ سےجوانی، لیکن اس رجحان کو جزوی طور پر 3TC نے تبدیل کر دیا تھا۔ ہسٹولوجیکل مطالعات کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 3TC نے ہپپوکیمپل نیوران کی موت کو کم کیا، جبکہ نیٹ ورک فارماکولوجی تجزیہ کے نتائج نے اشارہ کیا کہ 3TC ایسٹروجن سگنلنگ اور PI3K/Akt اور نیورو ایکٹیو ligand-receptor تعامل وے سگنلنگ سمیت متعدد راستوں کے ذریعے اپنا اثر و رسوخ استعمال کر سکتا ہے۔ جس کی ہم نے ان وٹرو تجربات کے ذریعے تصدیق کی ہے۔ یہ نتائج neurodegenerative بیماریوں کے علاج میں 3TC کے علاج کی صلاحیت کا ثبوت فراہم کرتے ہیں۔

مطلوبہ الفاظعمر بڑھنے, علمی صلاحیت, lamivudine, lاونگ ایک دوسرے سے منسلک عنصر-1, neurodegenerative بیماریوں

چینی جڑی بوٹیاں Cistanche اثر پراینٹی ایجنگ پر ٹرانسکرپٹیس روکنے والے ریورس کریں۔

1|تعارف

آج تک، عمر بڑھنے اور نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں، جیسےالزائمر (AD) یا پارکنسنز کی بیماریاںبڑھتی عمر سے منسلک، عالمی آبادیاتی تبدیلیوں کی وجہ سے مسلسل بڑھ رہے ہیں۔ 1,2 علمی کمی لمبی اور صحت مند زندگی کے حصول میں ایک سنگین رکاوٹ کی نمائندگی کرتی ہے۔ کئی دہائیوں سے، ایسی ادویات کی تلاش کے لیے کافی کوششیں کی گئی ہیں جن کا استعمال بڑھاپے کے ساتھ علمی انحطاط کے علاج کے لیے کیا جا سکتا ہے۔ سنسنی کا مطالعہ کرنے کا ہدف۔ 4 L1 کا تعلق ~500،{10}} کاپیوں کے ساتھ غیر طویل ٹرمینل ریپیٹ ریٹرو ٹرانسپوزنز کے سب سے زیادہ پائے جانے والے خاندان سے ہے، جو انسانی جینوم کا ~17 فیصد پر مشتمل ہے۔ L1 جین دو کھلے پڑھنے والے فریموں (ORF1 اور ORF2) کے ساتھ ایک اوپیرون پر مشتمل ہوتا ہے، جو دونوں ہی ریٹرو ٹرانسپوزیشن کے لیے ضروری ہوتے ہیں۔ 5–7 ORF1 ایک پروٹین (ORF1p) کو ریورس ٹرانسکرپٹیز سرگرمیوں کے ساتھ انکوڈ کرتا ہے جسے نیوکلیوسائیڈ اینالاگس کے ذریعے روکا جا سکتا ہے، جیسے لامیووڈائن (2'-3'-ڈیوکسی-3'-تھیوسیٹیڈائن، 3TC)۔

ایکٹو L1 کرومیٹن کے باہر cDNA کی ترکیب کر سکتا ہے اور پھر اسے ORF1p کے ذریعے اتپریرک جینوم میں دوبارہ داخل کر سکتا ہے، بالآخر دوسرے جینوں کے اظہار میں تبدیلی لاتا ہے اور نتیجے میں جینومک عدم استحکام سے منسلک بیماریوں کا سبب بنتا ہے۔ ضوابط، جیسے ایپی جینیٹک ترمیم اور میزبان کو محدود کرنے والے عنصر کا ضابطہ۔ 11,12 L1 کی منتقلی عام طور پر صرف جراثیم یا کینسر کے خلیوں میں ہوتی ہے، جبکہ حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ L1 مرکزی اعصابی نظام یا عمر رسیدہ خلیوں میں بھی انتہائی فعال ہے، حالانکہ L1 کے بنیادی عصبی میکانزم غیر واضح ہیں۔ 13 مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ L1 کی نگرانی کے طریقہ کار سے متعلق عوامل (مثال کے طور پر TREX1، RB1 اور FOXA1) خلیے کے سنسنی میں غیر فعال ہیں، جس کے نتیجے میں L1 فعال ہو جاتا ہے۔ TREX1 ایک 3' exonucle ase ہے جو غیر ملکی حملہ آور DNAs کو کم کرتا ہے اور اس کے نقصان کا تعلق cytoplasmic L1 cDNA کے جمع ہونے سے ہے۔ 14 RB1 کو L1 عناصر سمیت دہرائے جانے والے عناصر سے منسلک ہوتے ہوئے دکھایا گیا ہے۔ اور FOXA1 ہے سینسنٹ سیلز13 میں اپ ریگولیٹڈ اور L1 5' UTR کے مرکزی علاقے سے منسلک۔ ایکٹیویٹڈ L1 ٹائپ-I انٹرفیرون (IFN-I) ردعمل کو مزید متحرک کرتا ہے، جو ریورس ٹرانسکرپشن سی ڈی این اے کے ذریعے سوزش پیدا کرتا ہے اور سنسنی سے وابستہ سراو فینوٹائپ (SASP) کو برقرار رکھتا ہے۔ لہٰذا، عمر بڑھنے کی وجہ سے ہونے والی ایسپٹک سوزش میں ایک اہم عنصر کے طور پر، L1 کو عمر بڑھنے سے متعلق بیماریوں کے علاج کے لیے ایک اہم ہدف سمجھا جاتا ہے۔ 3TC کے ساتھ علاج کیے جانے والے بوڑھے چوہوں میں، پٹھوں اور دیگر بافتوں میں L1 کے ایکسٹرا سیلولر ٹرانسکرپشن کو روک کر سوزش کے عوامل کے جمع ہونے میں بہتری آتی ہے۔ حال ہی میں، جینومک cDNA (gencDNA) کی ہزاروں قسمیں AD کے مرنے والے مریضوں کے دماغوں میں پائی گئی ہیں، جس کا نتیجہ جینوم میں خصوصیت والے RNA splicing کی مختلف حالتوں کو دوبارہ داخل کرنے کے نتیجے میں ہے۔ 17 اس رجحان کو AD کی ایک اہم وجہ سمجھا جاتا ہے۔ gencDNAs کی نسل کا سبب بننے والے عوامل میں نقل، DNA کی تباہی، ریورس ٹرانسکرپٹیس اور عمر بڑھنا شامل ہیں۔

مطالعات نے ثابت کیا ہے کہ چینی ہیمسٹر اووری (CHO) سیل لائنوں میں اینڈوجینس ریورس ٹرانسکرپٹیز سرگرمیوں کے ساتھ نیوکلیوسائیڈ ریورس ٹرانسکرپٹیس انابیٹرز کے استعمال سے جینک ڈی این اے کی تشکیل کا عمل روک دیا جاتا ہے۔ ایک طویل عرصے سے شاذ و نادر ہی AD.20 تیار ہوا ہے لہذا، ہم قیاس کرتے ہیں کہ 3TC، ایک ریورس ٹرانسکرپٹیس روکنے والے کے طور پر، عمر بڑھنے کی وجہ سے پیدا ہونے والی علمی خرابی اور نیوروڈیجنریٹیو بیماریوں کے علاج کے لیے ایک ممکنہ دوا ہو سکتی ہے۔ یہ دکھایا گیا تھا کہ سنسنی ایکسلریٹڈ پروون 8 (SAMP8) چوہے، انسانی عمر اور عمر سے متعلق بیماریوں کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک نمونے کے طور پر، نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کے ابتدائی مراحل میں ہونے والی بہت سی خصوصیات کو ظاہر کرتے ہیں، جیسے کہ بڑھتا ہوا آکسیڈیٹیو تناؤ، نیوروئنفلامیشن اور ادراک decline.21 اس تحقیق میں، لہذا، SAMP8 چوہوں کو عمر بڑھنے کی وجہ سے ہونے والی نیوروڈیجنریٹیو بیماریوں کے لیے ایک مثالی جانوروں کے ماڈل کے طور پر منتخب کیا گیا۔ ہم نے قبل از وقت عمر رسیدہ چوہوں پر 3TC کے علمی اثرات اور عمر بڑھنے سے وابستہ مالیکیولر راستوں پر توجہ مرکوز کی، جو بڑھاپے کی وجہ سے نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کے علاج میں ریورس ٹرانسکرپٹیس انحیبیٹرز کے کردار کے ثبوت فراہم کرتے ہیں۔ ہم نے 3TC کے اہداف کی پیشین گوئی کرنے، نیٹ ورکس بنانے اور 3TC سے متعلق حیاتیاتی افعال اور راستوں کا تجزیہ کرنے کے لیے نیٹ ورک فارماسولوجی کا طریقہ مزید لاگو کیا۔

2|تجرباتی سیکشن 2.1 |

جانور تیانجن یونیورسٹی آف ٹریڈیشنل چائنیز میڈیسن کی طرف سے فراہم کردہ 44-ہفتہ پرانے نر SAMP8 اور cognate normal sensence-accelerated mouse-R1 (SAMR1) چوہوں کو ایک 1-ہفتے کے موافقت کی مدت کے بعد استعمال کیا گیا۔ جانوروں کے تجرباتی پروٹوکول کی منظوری شیڈونگ پراونشل ہسپتال کی اینیمل ایتھکس کمیٹی نے دی تھی اور اسے نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ (NIH) گائیڈ برائے لیبارٹری جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کی بنیاد پر انجام دیا گیا تھا۔ چوہوں کو آٹوکلیوڈ پنجروں میں رکھا گیا تھا اور انہیں جراثیم سے پاک کھانا اور پانی دیا گیا تھا۔ چوہوں کے جسمانی وزن کو ہر روز ریکارڈ کیا جاتا تھا۔ اس مطالعے میں کیے گئے تجربات کا فلو چارٹ شکل 1A میں دیا گیا ہے۔ تجربات کی تکمیل کے بعد، چوہوں کو ڈائیتھائل ایتھر سانس کے ذریعے ایتھانائز کیا گیا۔

2.2|3TC کی تیاری اور علاج

ہر تجربے کے دن دوائیں تازہ تیار کی گئیں۔ MCE (شنگھائی، چین) سے خریدی گئی 3TC کو DMSO میں 2 mmol/L کے آخری ارتکاز میں تحلیل کر دیا گیا۔ اس کے بعد اسٹاک سلوشن کو پینے کے پانی کا استعمال کرتے ہوئے کام کرنے والے ارتکاز میں پتلا کیا گیا جس میں DMSO کی آخری ارتکاز 0.1 فیصد سے کم تھی۔ چوہوں کے تین گروپ قائم کیے گئے تھے: ایک کنٹرول گروپ جس کا گاڑیوں کے محلول (پینے کے پانی) سے علاج کیا گیا، ایک ٹیسٹ گروپ جس کا علاج 3TC سے کیا گیا، اور SAMR1 گروپ جس نے گاڑی حاصل کی جسے بڑھاپے کے لیے دوسرے کنٹرول گروپ کے طور پر استعمال کیا گیا۔ ٹیسٹ گروپ کو زبانی طور پر 100 mg/kg فی دن کی خوراک پر 3TC موصول ہوا۔ تمام چوہوں کو انٹرا گیسٹرک انتظامیہ نے 4 ہفتوں تک کھلایا (شکل 1B)۔

تصویر 1 تجرباتی ڈیزائن اور 3TC کے اثرات عمر بڑھنے اور سنسنی کی درجہ بندی کے اسکور کی وجہ سے نسبتاً وزن میں کمی کو بہتر بنانے پر۔ (A) SAMP8 چوہوں کی علمی صلاحیت پر 3TC کے اثر کا مطالعہ کرنے کے لیے فارماسولوجیکل تجربات کا فلو چارٹ۔ (B) جانوروں کے تجرباتی نظام الاوقات کی منصوبہ بندی کی پیشکش۔ (C) فارمماپر کا استعمال کرتے ہوئے منشیات کے ہدف کے تعاملات کی پیش گوئی کرنے کے لیے تصوراتی ورک فلو، بائیں سے دائیں، 3TC کا سالماتی ڈھانچہ، 3TC کا 3D ساختی خاکہ اور فارماکوفور ماڈل کی پیشن گوئی 3TC کے ساتھ ایسٹروجن ریسیپٹر کے ساتھ سب سے زیادہ نارملائزڈ ہے۔ فٹ سکور. (D) چوہوں کے ہر گروپ میں جسمانی وزن کا نمو۔ (E) 3TC کے علاج سے پہلے اور بعد میں گریڈنگ سکور میں تبدیلی۔ SAMR1 پلس وہیکل: 44-ہفتہ پرانی SAMR1 چوہوں والی گاڑی کا 4 ہفتوں تک علاج کیا گیا۔ SAMP8 پلس وہیکل: 44-ہفتہ پرانی SAMP8 چوہوں والی گاڑی کا 4 ہفتوں تک علاج کیا گیا۔ SAMP8 پلس 3TC: 44-ہفتہ پرانے SAMP8 چوہوں کا 3TC-4 ہفتوں تک علاج کیا گیا۔ طالب علم کا ٹی ٹیسٹ: *p < 0۔{33}}5، **p < 0.01 اور ***p <0.001۔ ns: کوئی شماریاتی اہمیت نہیں۔ سیاہ ستارے SAMR1 پلس گاڑیوں کے گروپ کے ساتھ موازنہ کی نمائندگی کرتے ہیں۔ سرخ ستارے SAMP8 پلس گاڑیوں کے گروپ کے ساتھ موازنہ کی نمائندگی کرتے ہیں۔ نیلی لکیر SAMP8 پلس 3TC گروپ کو 44 اور 48 ہفتوں کی عمر میں نشان زد کرتی ہے۔

2.3|گریڈنگ سکور سسٹم

چوہوں میں سنسنی کی ڈگری کا اندازہ پہلے بیان کردہ گریڈنگ سکور سسٹم کے ذریعے کیا گیا۔ . ہر زمرے کے اسکورز کا اندازہ الگ سے چار تجربہ کار تجربہ کاروں نے کیا جو علاج کے حالات سے نابینا تھے (ضمنی جدول S1)۔

.2.4|مورس واٹر بھولبلییا ٹیسٹ

مورس واٹر میز اسٹڈیز مورس کے پروٹوکول کے مطابق انجام دی گئیں، جس میں ایک اورینٹیشن نیویگیشن تجربہ اور پروب ٹرائلز شامل ہیں۔ 23 واٹر میز ایک سرکلر پول تھا (120 سینٹی میٹر قطر میں 10 سینٹی میٹر کے پلیٹ فارم سے لیس تھا) اور 25 پر پانی سے بھرا ہوا تھا۔ ± 1 ڈگری چوہوں کو ایک منٹ میں پانی کی سطح کے نیچے پلیٹ فارم تلاش کرنے کی تربیت دی گئی۔ اگر ماؤس کو 60 سیکنڈ کے اندر پلیٹ فارم نہیں ملا، تو اسے پلیٹ فارم تک لے جایا گیا اور اسے 20 سیکنڈ تک وہاں رہنے کی اجازت دی گئی۔ چوہوں میں سے ہر ایک کو دن میں پانچ بار تربیت دی جاتی تھی اور ہر ایک کو 15 منٹ تک ایک دوسرے سے الگ کیا جاتا تھا۔ ہر آزمائش میں، ابتدائی پوزیشن مختلف تھی، ایک چھدم ترتیب میں۔ ٹیسٹ کے چھٹے دن، پلیٹ فارم کو ہٹا دیا گیا اور جانور بھولبلییا کے کواڈرینٹ کے مخالف نقطہ سے پانی کی بھولبلییا میں داخل ہوا جہاں پلیٹ فارم تربیت کے دوران ہوا کرتا تھا اور اسے 60 سیکنڈ تک بھولبلییا کو تلاش کرنے کی اجازت دی گئی۔ تیراکی کا راستہ اور بھولبلییا کی تلاش میں چوہوں نے جتنا وقت گزارا اسے ویڈیو کیمرے کے ذریعے ریکارڈ کیا گیا اور EthoVision XT (Noldus Software) کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔ ہر گروپ میں کم از کم آٹھ جانور شامل تھے۔

2.5|آر این اے نکالنا اور مقداری پی سی آر

کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق TRIzol Reagent (Invitrogen) کا استعمال کرتے ہوئے علاج کے بعد کل RNA چوہوں کے ہپپوکیمپل اور کارٹیکل ٹشوز سے نکالا گیا تھا۔ سی ڈی این اے ریورس ٹرانسکرپشن کٹ (ٹاکارہ) کا استعمال کرتے ہوئے سی ڈی این اے بنانے کے لیے ہر آر این اے نمونہ (1 یو جی) کو الٹا نقل کیا گیا تھا اور پھر تاکارا ٹاک کٹ (ٹاکارا) کا استعمال کرتے ہوئے پی سی آر کو بڑھا دیا گیا تھا۔ پرائمر سیٹ کو ضمنی جدول S2 میں بیان کیا گیا ہے۔

2.6|ٹشو کی تیاری

جانوروں کو ڈائیتھائل ایتھر کے ساتھ اینستھیٹائز کیا گیا تھا، اور ان کے دماغوں کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) اور 4 فیصد پیرافارمیلڈہائڈ محلول کے ساتھ ٹرانسکارڈیل پرفیوژن کے بعد جمع کیا گیا تھا۔ دماغ کے ؤتکوں کو ہٹا دیا گیا تھا اور پیرافارمیلڈہائڈ میں 2 دن سے زیادہ کے لئے طے کیا گیا تھا۔ فکسڈ دماغوں کو پیرافین میں 5 μm کی موٹائی پر ہپپوکیمپل ٹشو کے ساتھ سرایت کیا گیا تھا۔

2.7|ہیماتوکسیلین اور eosin (H&E) کے داغ

ہیماتوکسیلین اور eosin (H&E) داغ لگانے کے طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے دماغی شکل کا تجزیہ کیا گیا۔ ہپپوکیمپل ٹشوز کے پیرافین سیکشنز کو ارتکاز کی ایک سیریز کے الکحل کے میلان کے ساتھ ڈی ویکسڈ اور ڈی ہائیڈریٹ کیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق ایچ ای سٹیننگ کٹ (سولربیو) کا استعمال کرتے ہوئے ایچ ای سٹیننگ کی گئی تھی۔ ایتھنول اور زائلین میں ڈوبے جانے کے بعد، حصوں کو رال کے ساتھ نصب کیا گیا اور ہلکے خوردبین (اولمپس) کے تحت مشاہدہ کیا گیا۔

2.8|نسل کا داغ لگانا

ہپپوکیمپل ٹشوز کے حصوں پر نیورونل چوٹ کا پتہ لگانے کے لیے نسل سٹیننگ (بیونٹیان) کا طریقہ استعمال کیا گیا تھا۔ حصوں کو 30 منٹ کے لئے نسل داغ کے ساتھ لگایا گیا تھا اور 95 فیصد ایتھنول سے دھویا گیا تھا۔ داغدار خلیوں کو ہلکے خوردبین (اولمپس) کے نیچے شمار کیا گیا اور ان کی تصویر کشی کی گئی۔ سیلز کو ہپپوکیمپل ٹشو کی ہر سلائیڈ میں تین تصادفی طور پر منتخب غیر اوورلیپنگ فیلڈز پر شمار کیا گیا تھا جس میں بقا کے اشاریہ کو زندہ رہنے والے نیوران کی تعداد / نیوران کی کل تعداد کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔

2.9|TUNEL داغ

ہپپوکیمپل ٹشوز کے حصوں کو 15 منٹ تک پروٹیناس کے حل کے ساتھ انکیوبیشن کیا گیا تھا جس کے بعد ٹونیل ری ایکشن مکسچر (بیو ٹائم) کے ساتھ انکیوبیشن کیا گیا تھا۔ پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھونے کے بعد، حصوں کو ایک بڑھتے ہوئے محلول کے ساتھ نصب کیا گیا تھا جس میں نیوکلیئر ڈائی DAPI تھا اور روایتی فلوروسینس مائکروسکوپ یا کنفوکل لیزر فلوروسینس مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے مشاہدہ کیا گیا تھا۔

2.10|3TC کے ٹارگٹ ڈیٹا بیس کی تعمیر

3TC کا ہدف ڈیٹا بیس دو ڈیٹا بیس کی بنیاد پر بنایا گیا تھا۔ سب سے پہلے، فارمماپر ڈیٹا بیس (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html) پر مبنی ریورس فارماکوڈینامک جین میپ کا استعمال کرتے ہوئے 3TC کے ممکنہ اہداف کی نشاندہی کی گئی۔ تمام کیمیائی اجزاء کو Chembiodraw کے ذریعے '.mol2' کی شکل میں تبدیل کیا گیا اور فارمماپر ڈیٹا بیس (شکل 1C) پر اپ لوڈ کیا گیا۔ 4 سے بڑے نارملائزڈ فٹ سکور والے مالیکیولز۔{7}} کو 3TC کے ممکنہ اہداف کے طور پر شناخت کیا گیا۔ دوسرا، ChEMBL ڈیٹا بیس (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/) کو اہداف یا مرکبات کی حیاتیاتی سرگرمیوں کے بارے میں استفسار کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہومو سیپینز سے اخذ کردہ پروٹین کی تصدیق 3TC کے ممکنہ اہداف کے طور پر کی گئی تھی۔

2.11|ہدف پروٹین کے تعامل کا تجزیہ اور نیٹ ورک کی تعمیر

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 کو ڈپلیکیٹس کو ختم کرنے کے بعد ڈیزائن کردہ ترتیب میں منتخب کیا گیا تھا۔

3TC کے مالیکیولر میکانزم کی جامع تحقیقات کے لیے، PPI نیٹ ورکس کو Cytoscape سافٹ ویئر ورژن 3.6 کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا۔{3}}.(http://www.cytoscape.org/)۔ نوڈس کا ڈگری تجزیہ Centiscape 2.2 (http://apps.cytoscape.org/apps/centiscape) کے ساتھ کیا گیا تاکہ نیٹ ورکس میں ہب جینز کی اسکریننگ کی جا سکے جس میں قربت کی مرکزیت کی قدر، درمیانی مرکزیت کی قدر اور ڈگری مرکزیت کی قدر کو {{6 پر سیٹ کیا گیا تھا۔ بالترتیب 2، 450 اور 50۔

2.12|3TC کے لیے سگنلنگ راستوں کی افزودگی اور اسکریننگ

حیاتیاتی عمل، سیلولر اجزاء اور ممکنہ اہداف کے مالیکیولر افعال کے ساتھ جین اونٹولوجی (GO) افزودگی کا تجزیہ DAVID بائیو انفارمیٹکس ڈیٹا بیس (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp) کی بنیاد پر حیاتیاتی فنکشن تشریح کے لیے کیا گیا تھا۔ آن لائن KEGG آٹومیٹک اینوٹیشن سرور (http://www.genome.jp/ kegg/) کا استعمال کرتے ہوئے کیوٹو انسائیکلوپیڈیا آف جینز اینڈ جینومز (KEGG) ڈیٹا بیس کی بنیاد پر KEGG میٹابولک پاتھ ویز کی تشریح کی گئی تھی۔

2.13|پیش گوئی شدہ اہداف سے 3TC کا پابند ہونا

کمپاؤنڈ 3TC کی SDF ساخت کی فائلیں Pubchem ویب سائٹ (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) سے حاصل کی گئیں۔ SDF فائل کو OpenBabel2.3.2 سافٹ ویئر کے ذریعے PDB فائل میں تبدیل کیا گیا تھا، اور ریسیپٹر پروٹین ADRB2 (PDBID:3KJ6)، AKT1 (PDBID:4EKL) اور EGFR (PDBID:6S9C) پروٹین ڈیٹا بینک ڈیٹا بیس (bwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwww. .org)۔ PYMOL2.3.4 سافٹ ویئر کا استعمال ریسیپٹر پروٹینز سے پانی اور ligands کو ہٹانے کے لیے کیا گیا تھا۔ ڈاکنگ کا مطالعہ AutoDock Vina (1.1.2) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، جو Scripps کے ذریعہ تیار کردہ ایک اوپن سورس مالیکیولر ڈاکنگ سافٹ ویئر ہے۔ ٹولز سافٹ ویئر کا استعمال چار ریسیپٹر پروٹینز کو تبدیل کرنے کے لیے کیا گیا تھا، اور گرڈ پروگرام کے تحت گرڈ باکس کمانڈ کو ہر ریسیپٹر پروٹین کا تجزیہ کرنے کے لیے گرڈ آپشن ٹول کو کھولنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ جالی کی جگہ 1 پر سیٹ کی گئی تھی، اور جیب کا مرکز بائنڈنگ سائٹ کے مرکز کے طور پر سیٹ کیا گیا تھا۔

2.14|سیل کلچر اور علاج

ماؤس ہپپوکیمپل نیورونل سیل لائنیں HT22 شنگھائی سیل بائیو ٹیکنالوجی کمپنی سے خریدی گئیں۔ DMEM میں HT22 خلیات کو 10 فیصد فیٹل بوائن سیرم (FBS) کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔ تجرباتی علاج سے 1 دن پہلے خلیات کو 6-کنویں پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا تھا۔ خلیوں کی سنسنی فارملڈہائڈ (FA) کے ذریعہ ہوئی تھی، جسے سگما-الڈرچ سے خریدا گیا تھا، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ 24 HT22 خلیوں کو تین گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا، بشمول FA گروپ کو 24 گھنٹے کے لیے 30 μmol/L FA کے ساتھ علاج کیا گیا، FA/3TC گروپ کے ساتھ 30 µmol/L FA اور 50 µmol/L 3TC دونوں کے ساتھ علاج کیا گیا، اور کنٹرول گروپ کو FA یا 3TC کے بغیر کلچر کیا گیا۔

2.15|امیونو فلوروسینس اور مائکروسکوپی

میڈیم کو ہٹا دیا گیا تھا، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے 2 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ سلوشن کا استعمال کرتے ہوئے خلیات کو ٹھیک کیا گیا تھا۔ امیونو فلوروسینس تجربہ کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا۔ 25 اس تحقیق میں استعمال ہونے والی اینٹی باڈیز میں اینٹی لائن-1 ORF1p اینٹی باڈی (1:1000؛ سگما-الڈرچ) الیکسا فلور 594 سیکنڈری اینٹی باڈی (1:1000؛ انویٹروجن) کے ساتھ شامل تھی۔ . خلیات کو DAPI (1:500 dilution؛ Thermo Fisher Scientific) کے ساتھ 1 منٹ تک نیوکلی کا لیبل لگانے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اینٹی فلوروسینس بجھانے والے ماونٹنگ ایجنٹ کو شامل کرنے کے بعد، خلیات کو کنفوکل مائکروسکوپ (نیکون) کا استعمال کرتے ہوئے دیکھا گیا۔ 2.16|مغربی دھبے کا تجزیہ

EGFR، p-AKT1 (Active Akt1: phosphorylated at S473) اور ADRB2 کے تاثرات مغربی بلاٹ تجزیہ سے ماپا گیا۔ مختلف علاج کے بعد خلیوں سے کل پروٹین اکٹھا کیا گیا۔ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے ویسٹرن بلاٹ انجام دیا گیا تھا۔ 26 اس تحقیق میں استعمال ہونے والی اینٹی باڈیز میں ایک اینٹی EGFR اینٹی باڈی (1:500؛ سگما-الڈرچ)، ایک اینٹی pAKT1 اینٹی باڈی (1:1000؛ سگما-الڈرچ) شامل تھی۔ اور ایک اینٹی ADRB2 اینٹی باڈی (1:200؛ سگما-الڈرچ) اینٹی خرگوش سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ (1:1,000؛ انویٹروجن)۔ دھونے کے بعد، ای سی ایل ویسٹرن بلوٹنگ کا پتہ لگانے کے نظام (ایمرشام، آئلسبری، یو کے) کے ساتھ دھبے تیار کیے گئے تھے۔

2.17|ڈیٹا تجزیہ اور شماریات

ہر تجربہ کو کم از کم تین بار دہرایا گیا اور اسی طرح کے نتائج دکھانے والے ٹرائلز کے ساتھ درست سمجھا گیا۔ نتائج کو اوسط ± معیاری انحراف (SD) کے طور پر پیش کیا گیا تھا۔ اہم فرق کا تعین P < 0.05 کے ساتھ طالب علم کے ٹی ٹیسٹ سے کیا گیا تھا۔

مزید کے لیے پوچھیں:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: علاوہ 86 15292862950