طولانی مدافعتی پروفائلنگ کووڈ میں طویل مدتی مزاحیہ استثنیٰ میں ثالثی کرنے والے غالب ایپیٹوپس کو ظاہر کرتی ہے-19–صحت مند افراد

پس منظر: شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم کورونا وائرس 2 (SARS-CoV-2) ایک انتہائی پیتھوجینک اور متعدی کورونا وائرس ہے جس کی وجہ سے آج تک 5.2 ملین اموات کے ساتھ عالمی وبائی بیماری ہے۔ طویل مدتی استثنیٰ کی سیرولوجک خصوصیات سے متعلق سوالات، خاص طور پر SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد پائیدار اینٹی باڈی ردعمل میں ثالثی کرنے والے غالب ایپیٹوپس، ابھی بھی وضاحت طلب ہیں۔

مقصد: ہمارا مقصد کورونا وائرس بیماری 2019 (COVID-19) کے مریضوں میں مدافعتی ردعمل کی حرکیات اور لمبی عمر کے ساتھ ساتھ SARS-CoV-2 کے خلاف طویل مدتی مزاحیہ استثنیٰ کے لیے ذمہ دار ایپیٹوپس کو الگ کرنا تھا۔

طریقے: ہم نے بیماری شروع ہونے کے 180 سے 220 دنوں تک SARS-CoV-2 کی مدافعتی حرکیات کا اندازہ لگایا جن میں بنیادی طور پر COVID-19 کی اعتدال پسند علامات کا تجربہ ہوا، پھر اس کے لیے ذمہ دار غالب ایپیٹوپس کی پروٹوم وسیع پروفائلنگ کی گئی۔ مستقل مزاحیہ مدافعتی ردعمل۔

نتائج: طولانی تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ SARS-CoV-2 سپائیک پروٹین–مخصوص اینٹی باڈیز اور COVID-19 مریضوں میں اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کے ساتھ ساتھ SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد ابتدائی مراحل میں سائٹوکائن کی پیداوار کو چالو کرنا۔ انتہائی رد عمل والے ایپیٹوپس جو طویل مدتی اینٹی باڈی ردعمل میں ثالثی کرنے کے قابل تھے کو اسپائک اور ORF1ab پروٹین پر واقع دکھایا گیا تھا۔ SARS-CoV-2 سپائیک پروٹین کے کلیدی ایپیٹوپس کو S1 subunit اور S2 subunit کے N-ٹرمینل ڈومین میں میپ کیا گیا تھا، جس میں مقامی انسانی کورونا وائرس کے درمیان ترتیب ہومولوجی کی مختلف ڈگری اور ابتدائی SARS- کے درمیان اعلی ترتیب کی شناخت تھی۔ CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) اور موجودہ گردش کرنے والی مختلف حالتیں۔

cistanche سپلیمنٹ کے فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط کرنے کا طریقہ

نتیجہ: SARS-CoV-2 انفیکشن اسپائیک اور ORF1ab پروٹین پر واقع غالب ایپیٹوپس کو نشانہ بنا کر COVID-19 سے صحت یاب ہونے والے افراد میں مستقل مزاحیہ قوت مدافعت پیدا کرتا ہے جو طویل مدتی مدافعتی ردعمل میں ثالثی کرتے ہیں۔ ہمارے نتائج عقلی ویکسین کے ڈیزائن اور تشخیصی ترقی میں مدد کا راستہ فراہم کرتے ہیں۔ (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

مطلوبہ الفاظ:

SARS-CoV-2، COVID-19، طویل مدتی مدافعتی ردعمل، مزاحیہ استثنیٰ، پروٹوم-وائیڈ پیپٹائڈ مائیکرو رے، غالب نسخہ

سیویئر ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم کورونا وائرس 2 (SARS-CoV- 2)، جو کہ جاری کورونا وائرس بیماری 2019 (COVID-19) وبائی بیماری کا سبب بننے والا پیتھوجین ہے، اس کا تعلق بیٹاکورونا وائرس جینس سے ہے، جس میں 2 دیگر معروف انتہائی پیتھوجینک انسان بھی شامل ہیں۔ کورونا وائرس: شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم (SARS) اور مڈل ایسٹ ریسپریٹری سنڈروم (MERS) کورونا وائرس۔ 1 دسمبر 2019 کے آخر میں پہلے ریکارڈ شدہ کیس کے آغاز کے بعد سے، SARS-CoV-2 انفیکشن کے نتیجے میں 263 ملین سے زیادہ ہو چکے ہیں۔ نومبر 2021 تک دنیا بھر میں تصدیق شدہ کیسز اور 5.2 ملین اموات، 5 براعظموں کے 220 ممالک اور خطوں کو متاثر کرتی ہیں۔ متعدد قسم کی ویکسین کے طریقوں کی دستیابی، بہت سے ممالک اب بھی انفیکشن کی نئی لہروں پر قابو پانے کے لیے جدوجہد کر رہے ہیں، وائرس کی مختلف قسمیں ابھر رہی ہیں جو کہ اینٹی وائرل مدافعتی ردعمل کے لیے بڑھتی ہوئی منتقلی اور مزاحمت کو ظاہر کرتی ہیں۔ اینٹی باڈیز کو بے اثر کرکے ثالثی کا ایک موثر مزاحیہ مدافعتی ردعمل انفیکشن کو روکنے اور وائرل پیتھوجینز کو ختم کرنے کے لیے ایک طاقتور اور ناگزیر انکولی قوت مدافعت کا حامل ہونا چاہیے۔ SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد، بیماری کے آغاز کے 7 سے 14 دنوں میں متاثرہ افراد میں مضبوط سیرو کنورژن کی ایک اعلی شرح (90% سے اوپر) دیکھی گئی۔{24}} مخصوص اینٹیجن IgA، IgG، کی پیداوار اور SARS-CoV-2 کے اسپائیک پروٹین (S) اور نیوکلیو کیپسڈ پروٹین (N) کو پہچاننے والا IgM بیماری کے شدید مرحلے اور صحت یاب ہونے کے ابتدائی مرحلے کے دوران قابل شناخت تھا۔ 4,5,7 اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کی شدت عمر، علامتی انفیکشن، اور بیماری کی شدت سے منسلک ہونا۔ بوڑھے مریض اور شدید COVID-19 علامات ظاہر کرنے والے افراد میں اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کے اعلی درجے کی نشوونما ہوتی ہے۔ کچھ علامتی COVID-19 معاملات میں وقت کے ساتھ اینٹی جینز اور اینٹی باڈی ٹائٹرز کو غیرجانبدار کرنے میں کمی، COVID-19 میں انفیکشن کے بعد 8 سے 12 ماہ تک مجموعی طور پر طویل مدتی مزاحیہ استثنیٰ کی مستقل سطح دیکھی گئی۔ 10-13 مزید برآں، SARS-CoV-2 اینٹیجن مخصوص میموری B خلیات کی تعداد کم از کم 6 سے 12 ماہ تک مستحکم رہی، 12,13 کے ساتھ ساتھ بی سیل کلون کے جاری انتخاب اور جمع ہونے کے ساتھ اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنا، 12,14 SARSCoV-2 انفیکشن کے بعد مستقل مزاحیہ استثنیٰ کو برقرار رکھنے کی نشاندہی کرتا ہے۔

cistanche سپلیمنٹ کے فوائد - قوت مدافعت میں اضافہ

اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنا وائرل انفیکشن کے خلاف میزبان دفاع میں بنیادی کردار ادا کرتا ہے۔ SARS-CoV-2 کے انتہائی طاقتور مونوکلونل اینٹی باڈیز کے ایک پینل کی نشاندہی کی گئی ہے، جو بنیادی طور پر ایس پروٹین کے رسیپٹر بائنڈنگ ڈومین پر واقع ایپیٹوپس کو نشانہ بناتا ہے جو کہ وائرین کی سطح پر ٹرمرز میں جمع ہوتے ہیں اور وائرس کے داخلے کی سہولت فراہم کرتے ہیں۔ اور انجیوٹینسن کو تبدیل کرنے والے انزائم 2 ریسیپٹر کو شامل کرنے پر فیوژن۔ 18 ایس پروٹین کے دیگر علاقے، بشمول S1 سبونیٹ اور S2 سبونائٹ کے N-ٹرمینل ڈومین (NTD) میں بھی امیونوجینک ایپیٹوپس شامل ہیں جو اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کی صلاحیت رکھتے ہیں۔ 19,20 بے اثر کرنے کے علاوہ، SARS-CoV-2 کی اینٹی باڈیز Fc-ثالثی اثر کرنے والے افعال کے ذریعے Vivo میں تحفظ فراہم کر سکتی ہیں، جیسے کہ قدرتی قاتل خلیات کے ذریعے متحرک اینٹی باڈی پر منحصر phagocytosis اور monocytes یا macrophages کے ذریعے اینٹی باڈی پر منحصر سائٹوٹوکسٹی۔ 21,22 وائرل انفیکشن کا مقابلہ کرنے کے علاوہ، قدرتی انفیکشن یا ویکسینیشن کے ذریعے پیدا ہونے والی اینٹی باڈیز وائرس کے روگجنن کو سہولت فراہم کر سکتی ہیں، یا تو سوزش کے عمل میں اضافہ یا اینٹیجن/اینٹی باڈی مدافعتی کمپلیکس کی تشکیل کے ذریعے یا Fc پر منحصر افعال کے ذریعے وائرس کی انفیکشن کو بڑھا کر،23-25 اگرچہ Vivo میں SARS-CoV-2 کے تناظر میں بڑھے ہوئے وائرل انفیکشن کا مشاہدہ نہیں کیا گیا ہے۔ اینٹی باڈی ردعمل کے یہ مختلف کردار SARSCoV-2 ایپیٹوپس کی ایک منظم خصوصیات کے ساتھ ساتھ دیرپا اینٹی باڈیز کی خصوصیات کو غیرجانبدار یا غیر جانبدار کرنے والے ایپیٹوپس کو نشانہ بناتے ہیں۔ SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد حرکیات اور اینٹی باڈی ردعمل کی مدت پر حالیہ پیشرفت کے باوجود، طویل مدتی مزاحیہ مدافعتی ردعمل کو برقرار رکھنے والے ممتاز ایپیٹوپس کے بارے میں طولانی تجزیہ ابھی تک محدود ہے۔ پچھلے مطالعات میں بنیادی طور پر ELISA-based assays، 26,27 فیز- یا بیکٹیریل ڈسپلے پر مبنی اپروچز،28-31 اور مائیکرو رے پر مبنی ٹیکنالوجیز استعمال کرنے والے COVID-19-متاثرہ افراد میں اینٹی باڈی کے ردعمل کے نسخوں کو پروفائل کیا گیا ہے۔ 38} SARS-CoV-2 S پروٹین کے کئی امیونوڈومیننٹ ایپیٹوپس کی نشاندہی کی گئی ہے۔ سب سے زیادہ پائے جانے والے علاقوں کو S2 سبونائٹ کے فیوژن پیپٹائڈ (FP) کے قریب یا پھیلا ہوا نقشہ بنایا گیا تھا، دوسرا ہیپٹاد S2 سبونائٹ کے اندر اور S1 subunit کے C-ٹرمینل ڈومین پر دہرایا جاتا ہے۔26,28-30, 32,33 مزید برآں، سیرولوجک اسکریننگ نے SARS-CoV-2 پروٹوم کے دیگر پروٹینوں پر واقع ایپیٹوپس کا بھی انکشاف کیا، بشمول N پروٹین، جھلی (M) پروٹین، اور ORF1ab، ORF3a، اور ORF7a۔{54}}, 34,35 اگرچہ پچھلے مطالعات نے اینٹی جینک ایپیٹوپس کے بارے میں اہم بصیرت فراہم کی ہے، لیکن ان مطالعات نے بڑی حد تک ابتدائی صحت یابی کے مرحلے میں COVID-19 مریضوں کی ایپیٹوپ پروفائلنگ پر توجہ مرکوز کی ہے۔ پائیدار SARS-CoV-2 میں ثالثی کرنے والے قطعی نسخے – مخصوص اینٹی باڈی ردعمل کے ساتھ ساتھ ایپیٹوپ کی شناخت کی حرکیات کو واضح کرنا باقی ہے۔ یہاں، COVID-19 مریضوں میں مزاحیہ مدافعتی ردعمل کی حرکیات اور لمبی عمر کے بارے میں گہری سمجھ حاصل کرنے کے لیے، خاص طور پر SARS-CoV-2 کے خلاف طویل مدتی استثنیٰ کے لیے ذمہ دار ایپیٹوپس، ہم نے ایک جامع طولانی تجزیہ کیا۔ علامات کے آغاز کے بعد 180 سے 220 دن تک 31 COVID-19 مریضوں میں مدافعتی پروفائلنگ۔ اینٹیجن بائنڈنگ اور نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز کے ساتھ ساتھ سیرم سائٹوکائن لیولز کی تشخیص کی بنیاد پر، ہم نے مزید SARSCoV-2 کے ORF1ab، S، اور N پروٹین پر واقع ایپیٹوپس کے پینل کی نشاندہی کی جو پیپٹائڈ کا استعمال کرتے ہوئے مستقل مزاحیہ مدافعتی ردعمل میں ثالثی کرتا ہے۔ SARS-CoV-2 کے مکمل پروٹوم کو گھیرے ہوئے مائکرو رے۔ ہمارے نتائج وائرل انفیکشن پر قابو پانے کے لیے طویل مدتی استثنیٰ کی خصوصیات پر روشنی ڈالتے ہیں اور ویکسین کے عقلی ڈیزائن اور بہتر سیرولوجک تشخیصی ٹولز کی ترقی سے آگاہ کرنے میں مدد کریں گے۔

طریقے

مطالعہ کے شرکاء اور نمونے جمع کرنا

طولانی طور پر SARS-CoV-2–ڈائریکٹڈ مدافعتی ردعمل کے حرکیات کا جائزہ لینے کے لیے، 31 SARS-CoV-2–متاثرہ افراد سے 101 سیرم کے نمونے اکٹھے کیے گئے تھے جنہیں نانٹونگ یونیورسٹی (نانٹونگ) سے منسلک تیسرے ہسپتال میں داخل کیا گیا تھا۔ ، چین) جنوری اور مارچ 2020 کے درمیان۔ تمام مریضوں کی تصدیق شدہ SARS-CoV-2 انفیکشن کی ریورس ٹرانسکرپشن مقداری PCR ٹیسٹنگ کے ذریعے تشخیص کی گئی تھی۔ عوامی جمہوریہ چین کے قومی صحت کمیشن کے ذریعہ جاری کردہ نوول کورونا وائرس نمونیا کے تشخیص اور علاج کے پروٹوکول کے ورژن 7 کے مطابق بیماری کی شدت کو ہلکے سے اعتدال پسند (غیر معمولی) یا شدید COVID-19 کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔ 36 مریضوں کی پیروی کی گئی۔ شدید انفیکشن سے صحت یاب ہونے کے بعد 4 سے 8 ماہ تک طول بلد تک۔ 31 مطالعہ کے شرکاء میں سے 20 مریضوں کے لیے علامات کے آغاز کے بعد 4 سے 219 دنوں کے دوران خون کے نمونے ایک طولانی انداز میں جمع کیے گئے تھے (میڈین 4.5 نمونے فی فرد، 2 سے 8 کے درمیان)، جب کہ ہر ایک کے لیے سنگل ٹائم پوائنٹ کے نمونے لیے گئے تھے۔ دیگر 11 افراد جو دیر سے ٹھیک ہونے والے بیماری کے مرحلے میں تھے (بیماری شروع ہونے کے بعد 122 سے 214 دن)۔ اس کے مطابق، عمر سے سیرا (n 5 20) اور جنس سے مماثل صحت مند عطیہ دہندگان کو بھی کنٹرول گروپ کے طور پر شامل کیا گیا تھا۔ مطالعہ کے کسی بھی شریک کو SARS یا MERS سے پہلے کا کوئی دستاویزی انفیکشن نہیں تھا۔

اس مطالعہ کو نانٹونگ یونیورسٹی (منظوری EL2020006) سے وابستہ نانٹونگ تھرڈ ہسپتال کی اخلاقی کمیٹی نے منظور کیا تھا۔ مطالعہ کے ہر شرکاء سے تحریری باخبر رضامندی حاصل کی گئی تھی۔ سیرم کو سیرم جیل ٹیوبوں میں پردیی خون سے سینٹرفیوگریشن کے ذریعے الگ کیا گیا تھا، ایلی کوٹس میں بنایا گیا تھا، اور استعمال سے پہلے 2808C پر محفوظ کیا گیا تھا۔

سیل لائنز

HEK293T اور Huh7 خلیات کو Dulbecco-modified Eagle میڈیم (Gibco؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، والتھم، ماس) میں 10% ہیٹ ان ایکٹیویٹڈ فیٹل بوائن سیرم (Gibco)، 100 U/mL پینسلن (Gibco/10mg)، اور ضم کیا گیا تھا۔ mL streptomycin (Gibco) 378C پر 5% CO2 کے ساتھ۔

مردوں کے لئے cistanche فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط

Cistanche Enhance Immunity مصنوعات دیکھنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید پوچھیں】 ای میل:cindy.xue@wecistanche.com / واٹس ایپ: 0086 18599088692 / وی چیٹ: 18599088692

ELISA کے ذریعے IgG اینٹی باڈی کا پتہ لگانا

انسانی سیرم کے نمونوں میں اینٹیجن بائنڈنگ IgG اینٹی باڈیز کی سطح کا تعین ELISA کے ذریعے کیا گیا تھا۔ چھیانوے-کنویں ELISA پلیٹس (کارننگ، کارننگ، NY) کو SARS-CoV-2 نیوکلیو کیپسڈ پروٹین (سائنو بائیولوجیکل، بیجنگ، چین، کیٹلاگ نمبر 40588-V08B کے ساتھ پری کوٹ کیا گیا تھا۔ ، 50 این جی فی کنواں) یا اسپائک پروٹین (سائنو بائیولوجیکل، 40589-V08B1، 100 این جی فی کنواں)، SARS-CoV اسپائک پروٹین (سائنو بائیولوجیکل، 40634-V08B، 100 این جی فی کنواں) اچھی طرح سے)، یا MERS-CoV سپائیک پروٹین (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng فی کنواں) رات بھر 48C پر۔ فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں 0.05% Tween 20 (PBS-T) پر مشتمل 5% نان فیٹ دودھ کے ساتھ 378C پر 2 گھنٹے کے لیے بلاک کرنے کے بعد، 1 کے ابتدائی کم ہونے پر سیریلی طور پر پتلا شدہ حرارت سے غیر فعال سیرم کے نمونوں کو گنا :200 کو 378C پر 2 گھنٹے کے لیے پری لیپت پلیٹوں میں شامل کیا گیا۔ PBS-T کے ساتھ ہر قدم کے درمیان کنویں 3 بار دھوئے گئے۔ ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز کے ساتھ انکیوبیشن کے ذریعے رد عمل کا تصور کیا گیا تھا – کنجوگیٹڈ اینٹی ہیومن آئی جی جی اینٹی باڈی (ابکم، کیمبرج، یونائیٹڈ کنگڈم، 1:100،000 ڈائلیشن) 1 گھنٹے کے لیے 378C پر، اس کے بعد ٹیٹرامیتھائل بینزائڈائن سبسٹریٹ (ٹیٹرامیتھائل بینزائڈائن سبسٹریٹ، کاربائل، لائف) شامل کیا گیا۔ ، کیلیف)۔ ترقی پذیر رد عمل کو 2 mol H2SO4 کے ساتھ روک دیا گیا، اور جاذبیت کو 450 nm پر ماپا گیا جس کی اصلاح طول موج 630 nm (OD450 2 OD630) پر رکھی گئی۔ بائنڈنگ اینٹی باڈیز کے اینڈ پوائنٹ ٹائٹر کا حساب لگانے کے لیے، وکر کے لکیری حصے (y 5 kx 1 b) کے اندر درست نظری کثافت (OD) اقدار (OD450 2 OD630) کے مقابلے میں سیرم ڈائی لیشنز کے لاگ 10 کو پلاٹ کرکے ڈیٹا کو لکیری بنایا گیا تھا۔ , r2 > 0.99)، اور سیرم کی کمزوری جس پر ایڈجسٹ شدہ OD ویلیو (OD450 2 OD630) 5 0 کو اینڈ پوائنٹ ٹائٹر دینے کے لیے شمار کیا گیا تھا۔ پیپٹائڈ امیونائزڈ چوہوں میں اینٹیجن سے متعلق مخصوص IgG اینٹی باڈیز کا اندازہ پیپٹائڈ پر مبنی ELISA کے ذریعے کیا گیا۔ مختصراً، 96-کنویں ELISA پلیٹس (تھرمو فشر سائنٹیفک) کو رات بھر 48C پر کاربونیٹ بفر (pH 9.6) میں 4 مخلوط پیپٹائڈس (پیپٹائڈس 318، 356، 510، اور 530) کے 1 ملی گرام فی کنویں کے ساتھ لیپت کیا گیا۔ 5% نان فیٹ دودھ پر مشتمل PBS-T کے ساتھ بلاک کرنے کے بعد، کنوؤں کو سیرم کے نمونوں کے ساتھ 1:40 پر 1 گھنٹے کے لیے 378C پر گھلایا گیا تھا۔ اس کے بعد، پلیٹوں کو دھویا گیا اور ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز – کنجوگیٹڈ اینٹی ماؤس آئی جی جی اینٹی باڈی (ابکم) سے لگایا گیا۔ tetramethylbenzidine substrate (Life Technologies) کے ساتھ رد عمل کا تصور کیا گیا، اور 2 mol H2SO4 کے ساتھ رد عمل کو روکنے کے بعد 450 nm پر جاذبیت کی پیمائش کی گئی۔

سیڈو وائرس کی پیداوار اور ٹائٹریشن

SARS-CoV-2 (NC_045512) یا SARS-CoV (AY291315.1) اسپائک پروٹین کو C-ٹرمینل 19 aa ڈیلیٹ کرنے کے ساتھ کوڈن آپٹمائزڈ جین انکوڈنگ، یا MERS-CoV (JX{{10) }}) سی ٹرمینل 16 aa کے ساتھ کٹے ہوئے اسپائک پروٹین کو بالترتیب pcDNA3.1(1) ویکٹر میں کلون کیا گیا تھا۔ 100 ملی میٹر ٹشو کلچر ڈش میں کلچر کیے گئے HEK 293T خلیات کو 1mg پلاسمڈ انکوڈنگ اسپائک پروٹین اور 15 mg env-deficient، luciferase-expressing backbone (pNL4-3.luc.RE) کے ساتھ پولی ایتھائیلینیمینس (pNL4-3.luc.RE) کے ساتھ کوٹرانفیکٹ کیا گیا تھا۔ وارنگٹن، پا)۔ سیوڈو وائرس پر مشتمل سیل کلچر سپرنٹینٹس کو منتقلی کے 48 گھنٹے بعد جمع کیا گیا، فلٹر کیا گیا اور 2808C پر ایلی کوٹس میں محفوظ کیا گیا۔ وائرس ٹائٹرز کے تعین کے لیے (50% ٹشو کلچر متعدی خوراک)، سیوڈوائرس کے سیریل ڈائیوشنز کو 1 3 104 Huh7 سیلوں میں شامل کیا گیا تھا جو کہ 96-کنویں پلیٹوں میں پیش کیے گئے تھے۔ انفیکشن کے 12 گھنٹے کے بعد، وائرس پر مشتمل میڈیم کی جگہ ایک تازہ گروتھ میڈیم لے لیا گیا، اور خلیات کو اضافی 48 گھنٹوں کے لیے کلچر کیا گیا۔ سیل لیسز کی لوسیفریز سرگرمی کو سٹیڈی-گلو لوسیفریز آسے سسٹم (پرومیگا، میڈیسن، وِسک) کے ساتھ مائکروپلیٹ ریڈر (بائیو ٹیک انسٹرومینٹس، ونوسکی، وی ٹی) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا تھا، اور اوسط پس منظر کی قیمت سے 10 گنا زیادہ رشتہ دار luminescence یونٹس پیدا کرنے والے کنوؤں کو سمجھا جاتا تھا۔ مثبت

سیڈوویروس کی غیر جانبداری پرکھ

COVID-19 مریضوں یا صحت مند عطیہ دہندگان سے گرمی سے غیر فعال سیرم کے نمونے 378C پر 1 گھنٹے کے لیے 50% ٹشو کلچر کی متعدی خوراک پر 2-سلسلہ طور پر پتلا اور 200 سیوڈو وائرس کے ساتھ انکیوبیٹ کیے گئے تھے۔ اس کے بعد یہ مرکب Huh7 سیلز کو متاثر کرنے کے لیے لگایا گیا جو کہ 96-کنویں پلیٹوں میں نقل میں پیش کیے گئے تھے۔ انفیکشن کے 12 گھنٹے بعد کنوؤں کو تازہ گروتھ میڈیم سے بھر دیا گیا، اور خلیات کی لوسیفریز سرگرمی 48 گھنٹے بعد طے کی گئی۔ SARS-CoV-2 اور SARS-CoV pseudoviruses کے خلاف 50% نیوٹرلائزیشن ٹائٹرز (NT50) کا حساب گراف پیڈ پرزم 8.0 سافٹ ویئر (GraphPad Software, La Jolla, Calif) کا استعمال کرتے ہوئے نان لائنر ریگریشن کے ذریعے کیا گیا تھا۔ اور MERS-CoV pseudovirus کے NT50 کو سیرم کی سب سے زیادہ کمزوری کے طور پر بیان کیا گیا جس کے نتیجے میں سیرم کے نمونے لگائے بغیر وائرس کنٹرول کے مقابلے میں رشتہ دار luminescence یونٹس میں 50% کمی واقع ہوئی۔

پروٹین مائکرو رے پر مبنی سائٹوکائن کا پتہ لگانا

متعدد سائٹوکائنز کی مقداری پیمائش (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 ، IL-13, MCP-1, IFN-g, اور TNF-a) سیرم کے نمونوں میں کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق ملٹی پلیکس ELISA سرنی (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ مختصراً، سائٹوکائن کے مخصوص اینٹی باڈیز کے ساتھ پری کوٹ شدہ شیشے کی سلائیڈوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کے لیے نمونے کے ساتھ مسدود کر دیا گیا، اس کے بعد 60 ملی لیٹر 2- فولڈ ڈیللیٹڈ سیرم کے نمونے یا سائٹوکائن اسٹینڈرڈ ڈیلیوشن شامل کیے گئے۔ 48C پر راتوں رات انکیوبیشن کے بعد، سلائیڈوں کو 5 بار دھویا گیا اور 80 ملی لیٹر بایوٹینیلیٹڈ ڈیٹیکشن اینٹی باڈی کاک ٹیل کے ساتھ داغ دیا گیا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر Cy3 کے مساوی ڈائی کنجوگیٹڈ اسٹریپٹاویڈن 1 گھنٹے کے لیے ڈالا گیا۔ فلوروسینس کی شدت کا پتہ InnoScan 300 مائیکرو رے سکینر (Innopsys, Chicago, Ill) کے ذریعے 532 nm پر کیا گیا، اور ڈیٹا کا تجزیہ Q-Analyzer سافٹ ویئر (RayBiotech) کے ذریعے کیا گیا۔

پیپٹائڈ کی ترکیب اور بوائین سیرم البومین کے ساتھ جوڑ

SARS-CoV-2 پروٹوم کا احاطہ کرنے والے کل 515 پیپٹائڈس (لمبائی میں 15 aa، 11 aa سے اوور لیپنگ) کو GL بائیوکیم (شنگھائی، چین) نے SARS-CoV کے امینو ایسڈ کی ترتیب کی بنیاد پر ترکیب کیا تھا۔ -2 تناؤ ووہان-ہو-1۔ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کراس لنکر سلفو-ایس ایم سی سی (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے پیپٹائڈس کو بوائین سیرم البومین (BSA) کے ساتھ جوڑ دیا گیا تھا۔ مختصراً، سلفو-ایس ایم سی سی کو BSA میں 30- گنا مولر اضافی پر شامل کیا گیا، جس کے بعد PBS میں ڈائیلاسز کیا گیا۔ اس کے بعد، سسٹین پر مشتمل پیپٹائڈ کو 1:1 (wt/wt) کے تناسب میں 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا، اور مفت پیپٹائڈس کو ختم کرنے کے لیے PBS کے ساتھ مزید ڈائلائز کیا گیا۔

پیپٹائڈ مائکرو رے فیبریکیشن

پیپٹائڈ مائیکرو رے تیار کرنے کے لیے، SARS-CoV-2 کے پیپٹائڈس، نیز منفی کنٹرول (BSA) اور مثبت کنٹرول (انسان مخالف IgG اور اینٹی ہیومن IgM اینٹی باڈیز؛ سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، مو) ، سپر میراتھن پرنٹر (Arrayjet, Edinburgh, Scotland, United Kingdom) کا استعمال کرتے ہوئے PATH سبسٹریٹ سلائیڈز (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) پر ٹرپلیکیٹ میں متحرک کیا گیا تھا۔ پھر پیپٹائڈ مائیکرو رے کو مزید استعمال کے لیے 2808C پر محفوظ کیا گیا۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

مائیکرو رے پر مبنی ایپیٹوپ میپنگ

مائیکرو رے پر مبنی سیرم تجزیہ لی ایٹ ال، 37 کے طور پر معمولی ترمیم کے ساتھ کیا گیا تھا۔ یکساں ذیلی ریزوں کے لیے انفرادی چیمبر بنانے کے لیے، ہر پیپٹائڈ مائیکرو رے سلائیڈ پر ایک 14- چیمبر ربڑ کی گسکیٹ نصب کی گئی تھی۔ استعمال سے پہلے سلائیڈ کی صفوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر گرم کیا گیا، پھر PBS-T میں 3٪ BSA کے ساتھ 3 گھنٹے کے لیے بلاک کر دیا گیا۔ زیادہ تر نمونوں کے لیے کووڈ-19 مریضوں کے سیرم کے نمونے یا 20 صحت مند عطیہ دہندگان (کنٹرول گروپ) کے پولڈ سیرا کو PBS-T میں 1:200 پر گھٹا دیا گیا اور پھر ہر ذیلی جگہ کے ساتھ 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ 48C صفوں کو PBS-T سے دھویا گیا، اور Cy3-کنججیٹڈ بکری اینٹی ہیومن IgG اور Alexa Fluor 647– conjugated گدھا اینٹی ہیومن IgM (جیکسن امیونو ریسرچ لیبارٹریز، ویسٹ گروو، پا) کے ساتھ 1:1000 ڈائلیشن پر لگایا گیا۔ ہر ایک کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لئے۔ انکیوبیشن کے بعد، صفوں کو PBS-T سے دھویا گیا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر سینٹرفیوگریشن کے ذریعے مکمل طور پر خشک کر دیا گیا۔ اس کے بعد، لکس اسکین 10K-A مائیکرو رے اسکینر (کیپٹل بیو، بیجنگ، چائنا) کا استعمال کرتے ہوئے صفوں کو اسکین کیا گیا، اور FL فلوروسینس کی شدت کا ڈیٹا GenePix Pro 6.0 سافٹ ویئر (Molecular Devices، Sunnyvale، Calif) کے ذریعے حاصل اور تجزیہ کیا گیا۔

تصویر 1. COVID-19 مریضوں میں اینٹی باڈی ردعمل کی طولانی حرکیات۔ مطالعہ کے ڈیزائن کا ایک منصوبہ بندی۔ مطالعہ میں کل 31 SARS–CoV–2–متاثرہ افراد اور 20 صحت مند عطیہ دہندگان کا اندراج کیا گیا تھا۔ سیرم کے نمونوں کا مجموعہ 31 SARS-CoV-2–متاثرہ افراد میں سے 20 مریضوں کے لیے ایک سے زیادہ ٹائم پوائنٹس پر طولانی طور پر انجام دیا گیا، جب کہ دوسرے 11 مریضوں کے لیے ایک ہی وقت میں نمونے لیے گئے۔ مختلف اسیسز میں استعمال ہونے والے شرکاء اور سیرم کے نمونے درج ہیں۔ B اور C، 31 COVID-19 مریضوں کے کل 101 سیرم کے نمونے ELISA کے ذریعے مختلف وقت کے مقامات پر SARS-CoV-2 N پروٹین (B) اور S پروٹین (C) بائنڈنگ IgG اینٹی باڈیز کے لیے ٹیسٹ کیے گئے۔ علامات کے آغاز کے بعد (دن 1-30، n 5 37؛ دن 31-61، n 5 18؛ دن 100-150، n 5 21؛ دن {{21} }}، n 5 25)۔ 20 صحت مند عطیہ دہندگان کے سیرم کے نمونے کنٹرول گروپ کے طور پر شامل کیے گئے تھے۔ وقت کے ساتھ ساتھ SARS-CoV-2 سیوڈو وائرس کے خلاف D, NT50 کا حساب نان لائنر ریگریشن کے ذریعے کیا گیا۔ ای، بیماری شروع ہونے کے بعد بتائے گئے وقت کے پوائنٹس پر COVID-19 مریضوں میں سیرم کو بے اثر کرنے والی سرگرمی کی تقسیم۔ 20 سے کم NT50 ٹائٹر والے نمونوں کو غیر جانبدار کرنے کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔

پیپٹائڈ مائکرو رے ڈیٹا کا تجزیہ

IgG اور IgM ڈیٹا کا بالترتیب تجزیہ کیا گیا۔ ہر جگہ کے سگنل کی شدت کو پیش منظر کے مائنس پس منظر کے طور پر بیان کیا گیا تھا اور ہر پیپٹائڈ کے لئے تین جگہوں کی اوسط کی گئی تھی۔ COVID-19 نمونوں کے مثبت پیپٹائڈ رسپانس کی کٹ آف ویلیو صحت مند عطیہ دہندگان کے کنٹرول کی سگنل کی شدت سے دوگنا مقرر کی گئی تھی۔ تمام 3 نمونے لینے کے وقت پوائنٹس (دن 10-60، 100-150، اور 180-220 بیماری شروع ہونے کے بعد ٹیسٹ کیے گئے نمونوں میں 80٪ سے زیادہ مثبت شرح کے ساتھ پیپٹائڈس کو غالب اور مستقل پیپٹائڈس اور پیپٹائڈس کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔ تمام 3- ٹائم پوائنٹس پر 60% سے زیادہ مثبت ردعمل کی فریکوئنسی کو زیر اثر اور مستقل سمجھا جاتا تھا۔ 3 سیمپلنگ ٹائم پوائنٹ گروپس میں ہر پیپٹائڈ کی اوسط سگنل کی شدت کا حساب لگایا گیا تھا۔ اعلی سگنل کی شدت دکھانے والے پیپٹائڈس (تمام ٹیسٹ شدہ نمونوں کے سگنل کی شدت کے اوسط 1 SD سے اوپر) کو بھی منتخب کیا گیا تھا۔ ڈیٹا پروسیسنگ اور تجزیہ R v3.6.3 سافٹ ویئر (https://www.r-project.org/) کے ذریعہ انجام دیا گیا تھا، اور مختلف نمونے لینے کے ٹائم پوائنٹ گروپس کے درمیان اہم سگنل کی شدت کی تبدیلیوں کا جائزہ لیما کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔ P <.05 کے ساتھ اختلافات کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔

ماؤس حفاظتی ٹیکوں

6 سے 8 ہفتوں کی عمر کے خواتین BALB/c چوہوں کو بیجنگ وائٹل اسٹار بائیو ٹیکنالوجی (بیجنگ، چین) سے خریدا گیا تھا۔ تمام چوہوں کو مخصوص روگزن سے پاک سہولیات میں رکھا گیا تھا، اور جانوروں کے مطالعے کو تیانجن میڈیکل یونیورسٹی (تیانجن، چین) کی ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی نے منظور کیا تھا۔ امیونائزیشن کے لیے، چوہوں کے گروپوں (n 5 5) کو ہر پیپٹائڈ کی 25 ملی گرام فی خوراک (بالترتیب پیپٹائڈس 318، 356، 510، اور 530) کے ساتھ 50 ملی گرام پھٹکڑی (انویووجن، سان ڈیاگو، کیلیف) کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ اور 10 ملی گرام سی پی جی ایڈجیوینٹس، اور 50 ملی گرام فی خوراک پیپٹائڈس کے ساتھ دو بار بڑھایا گیا جو کہ 2-ہفتے کے وقفوں پر معاونین کی موجودگی میں۔ صرف معاونین کے ساتھ ویکسینیشن منفی کنٹرول کے طور پر کام کرتی ہے۔ دوسرے اور تیسرے حفاظتی ٹیکوں کے بعد دن 10 یا دن 14 کو حفاظتی ٹیکوں والے چوہوں سے سیرا جمع کیا گیا تھا۔

شماریاتی اور ساختی تجزیہ

تمام گراف گراف پیڈ پرزم کے ذریعہ تیار کیے گئے تھے۔ انجیر 1، 2 اور 4 میں گروپوں کے درمیان شماریاتی موازنہ 1-طریقے سے ANOVA کے ساتھ Tukey متعدد موازنہ کے ذریعے انجام دیا گیا۔ www.jacionline.org پر دستیاب آن لائن ریپوزٹری میں تصویر 1 Fig E9 اور Fig E10 میں دکھائے گئے ارتباط کا تعین پیئرسن کے ارتباط کے تجزیہ سے کیا گیا تھا۔ P <.05 کے ساتھ اختلافات کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔ SARS-CoV-2 سپائیک پروٹین (پروٹین ڈیٹا بینک [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX اور PDB ID: 6ZGI) کے ڈھانچے اور SARS-CoV{{ کا ڈائمرائزیشن ڈومین 13} nucleocapsid پروٹین (PDB ID: 6YUN) کو سپائیک پروٹین پر واقع شناخت شدہ ایپیٹوپس کی ساختی تفصیلات اور نیوکلیو کیپسڈ پروٹین کے ڈائمرائزیشن ڈومین کو الگ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ MEGA v10.1.6 سافٹ ویئر میں کلسٹل ڈبلیو الگورتھم کے ذریعہ مختلف انسانی کورونا وائرس کے درمیان ترتیب کی سیدھ اور ہومولوجی تجزیہ کیا گیا۔

نتائج

SARS-CoV-2 انفیکشن مستقل اینٹیجن مخصوص پابند اور اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کا باعث بنتا ہے

SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد اینٹی باڈی ردعمل کا طولانی طور پر جائزہ لینے کے لیے، PCR سے تصدیق شدہ SARS-CoV-2 انفیکشن والے 31 افراد سے 101 سیرم کے نمونے جمع کیے گئے تھے (تصویر 1، A)۔ مطالعہ کے شرکاء میں معتدل COVID-19 والے 26 مریض، 1 غیر علامتی پریزنٹیشن کے ساتھ، 2 ہلکی بیماری کے ساتھ، اور 2 شدید علامات کے ساتھ (www.jacionline.org پر دستیاب آن لائن ریپوزٹری میں ٹیبل E1 دیکھیں)۔ اس مطالعہ میں داخل ہونے والے مریضوں کی عمریں 17 سے 66 سال تک تھیں (درمیانی عمر، 45 سال)، مردوں (51.6%) اور خواتین (48.4%) مضامین کی تقریباً مساوی تقسیم کے ساتھ۔ مطالعہ کے شرکاء میں سب سے زیادہ عام علامات میں بخار (83.9%)، کھانسی (67.7%)، مائالجیا (22.6%)، اور سردی لگنا (22.6%) شامل ہیں، جن کی بیماری کی درمیانی مدت 15 دن تھی۔ 20 COVID-19 مریضوں سے کل 90 سیرم کے نمونے ہسپتال میں داخل ہونے اور صحت یابی کے بعد ڈسچارج کے دوران علامات کے آغاز کے 219 دنوں تک کے متعدد اوقات میں جمع کیے گئے تھے (تصویر 1، A، اور آن لائن ریپوزٹری میں ٹیبل E2 دیکھیں)۔ دوسرے 11 شرکاء سے نمونے لینے کا کام دیر سے صحت یاب ہونے کے دوران ایک ہی وقت میں کیا گیا تھا (علامت کے آغاز کے بعد 122 سے 214 دن)۔ مزید برآں، مماثل عمر اور جنس کی تقسیم کے ساتھ 20 صحت مند عطیہ دہندگان کے نمونے بطور کنٹرول گروپ (ٹیبل E1) شامل کیے گئے تھے۔ سیرم کے نمونوں میں اینٹیجن مخصوص IgG اینٹی باڈیز کی مقدار ELISA نے SARS-CoV-2 N پروٹین یا S پروٹین کے ساتھ پری کوٹیڈ کی تھی۔ صحت مند عطیہ دہندگان کے مقابلے میں، COVID-19 مریضوں میں اینٹی این اور اینٹی ایس آئی جی جی اینٹی باڈیز علامات کے شروع ہونے کے 30 دنوں کے اندر تیار کی گئیں، جن کا جیومیٹرک اوسط اختتامی نقطہ ٹائٹر 4.10 (لاگ10 اینٹی این آئی جی جی) اور 4.20 (لاگ 10 اینٹی ایس آئی جی جی) (تصویر 1، بی اور سی؛ اور www. jacionline.org پر آن لائن ریپوزٹری میں ٹیبل E3 دیکھیں؛ تصویر E1، A اور B؛ اور Fig E2)، پچھلے مشاہدات سے اتفاق کرتے ہوئے جو کہ سیرو کنورژن SARS-CoV-2 انفیکشن کے 1 سے 2 ہفتوں بعد ہوتا ہے۔ 5,38 اس کے بعد، اینٹیجن بائنڈنگ اینٹی باڈی ٹائٹرز وقت کے ساتھ ساتھ مختلف ڈگریوں تک کم ہو گئے۔ COVID-19 مریضوں میں اینٹی این آئی جی جی اینٹی باڈی کی سطح میں تیزی سے اور ڈرامائی طور پر کمی دیکھی گئی، جبکہ صحت مند عطیہ دہندگان کے مقابلے میں بیماری شروع ہونے کے بعد 180 سے 220 دنوں تک اینٹی ایس آئی جی جی ٹائٹرز کی اعلی سطح کو برقرار رکھا گیا (تصویر 1، بی) ، اور سی)۔ ارتباط کے تجزیے سے لاگ 10 اینٹی این آئی جی جی ٹائٹرز اور اینٹی ایس آئی جی جی ٹائٹرز (r 5 0.50 اور P <.001؛ تصویر 1، F) کے درمیان ایک اہم ارتباط کا انکشاف ہوا۔ بائنڈنگ اینٹی باڈیز کی مقدار درست کرنے کے علاوہ، COVID-19 والے افراد میں فنکشنل نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز کی حرکیات کا مزید تعین pseudotyped SARS-CoV-2 کے ذریعے کیا گیا۔ 95% سے زیادہ مریضوں کے سیرم کے نمونے (35/37) جو علامات شروع ہونے کے بعد 4 سے 30 دنوں کے درمیان جمع کیے گئے تھے ان میں SARS-CoV-2 کے خلاف مضبوط غیرجانبدار سرگرمیاں تھیں، اور نمونوں کا ایک بڑا حصہ اعتدال پسند (NT50 80-320) کی نمائش کرتا تھا۔ ) سے مضبوط (NT50 > 320) کو بے اثر کرنے والی سرگرمی (تصویر 1، D اور E)۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ 2 نمونے بغیر یا کم نیوٹرلائزنگ ٹائٹرز کے ساتھ (NT50 کم از کم 1:20 کے سیرم ڈیلیشن پر) وائرل انفیکشن کے ابتدائی دور میں (علامت شروع ہونے کے بعد دن 4 اور 11 دن) میں طاقتور نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز (تصویر 1) کو نکالنے سے پہلے جمع کیے گئے تھے۔ 1، D، اور تصویر E1، C)۔ وقت کے ساتھ ساتھ SARS-CoV{103}} کے مریضوں میں اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کے کم ہونے کے باوجود، زیادہ تر مریضوں کے سیرم کے نمونے (24/25) جو علامات شروع ہونے کے 180 سے 220 دنوں کے دوران حاصل کیے گئے تھے، SARS- کے خلاف غیرجانبدار ہونے کے لیے مثبتیت برقرار رکھتے ہیں۔ CoV-2، 2۔{112}}جیومیٹرک مطلب NT50 ٹائٹرز میں گنا کمی (تصویر 1، D اور E؛ ٹیبل E3؛ تصویر E3)۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، اینٹی این آئی جی جی اینٹی باڈیز کے مقابلے میں، SARS-CoV-2 S بائنڈنگ IgG ٹائٹرز اور اینٹی باڈی ٹائٹرز کو نیوٹرلائز کرنے کے درمیان ایک مضبوط تعلق کی نشاندہی کی گئی تھی (r 5 0.61 اور P <.001؛ تصویر 1 , G اور H)، ان نتائج سے مطابقت رکھتا ہے کہ SARS-CoV-2 S پروٹین اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کا بڑا ہدف ہے۔ SARS-CoV-2 کا S پروٹین انتہائی وائرل SARS-CoV (76% تسلسل شناخت) کے ساتھ اعلی ترتیب کی مماثلت رکھتا ہے اور MERS-CoV (34% تسلسل شناخت) سے کم ترتیب کی ہم آہنگی کو ظاہر کرتا ہے۔ کورونا وائرس کے درمیان سیرولوجک کراس ری ایکٹیویٹی کی اطلاع دی گئی ہے؛ 8,10,28,29 تاہم، SARS-CoV کے خلاف اینٹی باڈیز کے کراس ری ایکٹیویٹی کے طول بلد فالو اپ تشخیص کا ڈیٹا دوسرے کورونا وائرس کی طرف محدود ہے۔ ہم نے SARS-CoV-2–متاثرہ افراد سے طولانی سیرا میں کراس بائنڈنگ اور کراس نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز کا تعین کیا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 80% سے زیادہ مریضوں کے سیرم کے نمونے SARS-CoV اور/یا MERS-CoV کے S پروٹین سے منسلک ہوتے ہیں، علامات کے آغاز کے بعد 1 ماہ کے اندر، 27% نمونے ڈبل کراس ری ایکٹیویٹی کی نمائش کرتے ہیں (تصویر 1، I)۔ SARS-CoV S پروٹین کے رد عمل میں MERS-CoV (35%) کے مقابلے میں ایک بڑا تناسب (73%) تھا جو ابتدائی مدت میں ٹیسٹ کیے گئے نمونوں میں (1-30 دن بیماری شروع ہونے کے بعد) (تصویر 1، I)۔ ڈبل کراس بائنڈنگ اور SARS-CoV کراس بائنڈنگ اینٹی باڈیز نے وقت کے ساتھ ساتھ بتدریج کمی کا مظاہرہ کیا، بیماری کے آغاز کے 180 سے 220 دنوں میں صرف 8% ڈبل کراس بائنڈنگ اور 20% SARS-CoV سنگل کراس بائنڈنگ نمونے (تصویر 1) , I؛ www.jacionline.org پر دستیاب آن لائن ریپوزٹری میں، تصویر E4، A؛ تصویر E5، A؛ اور تصویر E6 اس مضمون کے آن لائن ریپوزٹری میں www.jacionline.org پر دیکھیں)۔ حیرت انگیز طور پر، MERS-CoV S پروٹین – رد عمل والے اینٹی باڈیز کی مثبتیت وقت کے ساتھ نسبتاً مستحکم رہی (تصویر 1، I)۔ کراس بائنڈنگ کی اعلی صلاحیت سے مختلف، مریضوں کے سیرم کے نمونوں کی صرف ایک چھوٹی سی تعداد میں SARS-CoV اور/یا MERS-CoV سیوڈو وائرس کو کراس نیوٹرلائز کیا گیا ہے (تصویر 1، I؛ تصویر E4، B؛ تصویر E5، B؛ اور تصویر E7 میں دیکھیں۔ آن لائن ذخیرہ)۔ علامت کے آغاز کے بعد 1 سے 30 دنوں میں اکٹھے کیے گئے نمونوں میں سے تقریباً 27 فیصد نے کراس نیوٹرلائزنگ سرگرمی پیش کی، اور یہ تعداد 180 سے 220 دنوں میں 20 فیصد رہ گئی، SARS-CoV کراس نیوٹرلائزنگ سرگرمی میں مزید ڈرامائی تبدیلیوں کے ساتھ (تصویر 1، I۔ )۔ بیماری شروع ہونے کے بعد 30 دنوں کے اندر MERS-CoV کے مقابلے میں نمونوں کا ایک اعلی تناسب SARSCoV کو غیرجانبدار کر دیتا ہے۔ یہ بات قابل غور ہے کہ SARS-CoV اور MERS-CoV کراس نیوٹرلائزیشن کو ظاہر کرنے والے نمونوں کے یکساں تناسب کے باوجود، MERS-CoV کے لیے NT50 قدریں سیرم کے نمونوں میں SARSCoV کے مقابلے بہت کم تھیں جو کراس نیوٹرلائزیشن کے لیے مثبت تھے (تصویر E4، B؛ تصویر E5، B؛ تصویر E7)۔

cistanche پلانٹ میں مدافعتی نظام میں اضافہ

SARS-CoV-2 انفیکشن سائٹوکائن کی پیداوار کو چالو کرنے کے نتیجے میں

SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد امیونولوجک تبدیلیوں کو جامع طور پر نمایاں کرنے کے لیے، ہم نے COVID-19 مریضوں کے سیرا میں سائٹوکائن کی سطح میں حرکیات میں تبدیلیوں کا مزید جائزہ لیا۔ 55 طول بلد سیرم کے نمونے جو علامات کے آغاز کے پہلے 2 مہینوں کے اندر جمع کیے گئے تھے پروٹین پر مبنی مائکرو رے کے ذریعہ سائٹوکائن کی پیداوار کا پتہ لگانے کے لئے استعمال کیے گئے تھے۔ بیماری کے پہلے مہینے کے دوران متعدد سائٹوکائنز کے سیرم کی سطح میں اضافہ دیکھا گیا، بشمول IL-1a (proinflammatory) IL-6 (proin-inflammatory) اور IL-10 (اینٹی انفلامیٹری) )، جو شدید COVID{11}} معاملات میں سائٹوکائن ریلیز سنڈروم سے منسلک ہیں، 39,40 کے ساتھ ساتھ IFN-g (TH1 قسم) اور IL-4 (TH2 قسم) (تصویر 2، A، اور www. jacionline.org پر دستیاب آن لائن ریپوزٹری میں Fig E8)۔ خاص طور پر، IL-6، IL-10، اور IFN-g کے سیرم کی سطح مریضوں میں علامات کے شروع ہونے کے بعد 15 دنوں کے اندر بڑھ گئی اور بعد کے مراحل میں کم ہو گئی، جبکہ IL-1 کی رہائی بیماری کے آغاز سے 16 سے 30 دنوں کے دوران a اور IL-4 میں نمایاں اضافہ دیکھا گیا، اور اس کے بعد تیزی سے معمول پر آ گیا (تصویر 2، اے)۔ ارتباط کے تجزیے نے SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد اینٹیجن مخصوص اینٹی باڈی ردعمل اور سائٹوکائن کی پیداوار کے درمیان ایک کمزور یا کوئی خطی تعلق ظاہر نہیں کیا، حالانکہ IL-10 اور SARS-CoV{{ کی سطحوں کے درمیان شماریاتی اہمیت دیکھی گئی تھی۔ 34}} N پروٹین بائنڈنگ اینٹی باڈی (r 5 0.321 اور P <.05)، IL-1b کی پیداوار اور S پروٹین بائنڈنگ اینٹی باڈی (r 5 20.335 اور P) کے درمیان<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

پروٹوم وائڈ ایپیٹوپ میپنگ غالب ایپیٹوپس کی نشاندہی کرتی ہے جو COVID-19 مریضوں میں مستقل مزاحیہ مدافعتی ردعمل میں ثالثی کرتی ہے

وقت کے ساتھ ساتھ SARS-CoV-2 کے لیے مزاحیہ استثنیٰ کی امتیازی خصوصیات کو بہتر طور پر نمایاں کرنے کے لیے، ہم نے پیپٹائڈ پر مبنی مائیکرو رے کا استعمال کرتے ہوئے ایک پروٹوم وسیع ایپیٹوپ میپنگ کا اطلاق کیا۔ SARS-CoV-2 پروٹوم کا احاطہ کرنے والی ایک پیپٹائڈ لائبریری تیار کی گئی تھی اور اسے سلائیڈوں پر متحرک کیا گیا تھا، جس میں ہر پیپٹائڈ کی لمبائی 15 aa تھی جس میں 11 aa اوورلیپ تھا۔ 19 مریضوں کے کل 51 طول بلد سیرم کے نمونے جن میں یا تو غیر علامتی (n 5 1) یا ہلکے (n 5 2) سے اعتدال پسند (n 5 15) یا شدید (n 5 1) ) SARS-CoV-2 انفیکشنز کا تجربہ کیا گیا (ٹیبل I)۔ نمونے لینے کے نسبتاً متوازن نمبرز، وقفوں اور ٹائم پوائنٹس کو حاصل کرنے کے لیے، علامات کے آغاز کے بعد 16 سے 219 دنوں کے درمیان ہر COVID-19 شریک سے نمونے ترتیب وار 2 یا 3 ٹائم پوائنٹس پر جمع کیے گئے۔ مریضوں کی اکثریت (18/19) وائرل انفیکشن کے بعد غیر جانبدار اینٹی باڈیز تیار کرتی ہے، سوائے اسیمپٹومیٹک انفیکشن والے واحد فرد کے (ٹیبل I)۔ نمونے لینے کے مختلف اوقات کے مطابق، نمونوں کو 3 گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: دن 10-60 (n 5 18)، دن 100-150 (n 5 18)، اور دن {{28} }} (n 5 15)۔ COVID{31} کے مریضوں میں وائرس ایپیٹوپ پرو فائلز کا طولانی تشخیص سیرم IgG اور IgM دونوں اینٹی باڈیز کے لیے کیا گیا، جس میں 20 صحت مند عطیہ دہندگان کے پولڈ سیرا کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ SARS-CoV-2 proteome microarray کا استعمال کرتے ہوئے، پیپٹائڈ بائنڈنگ اینٹی باڈی ردعمل کے حرکیات کا تعین اور تجزیہ کیا گیا (1) پابند سگنل کی شدت، اور (2) ہر پیپٹائڈ کے لیے مثبت رد عمل والے نمونوں کی فیصد (مثبت شرح) . مثبت پیپٹائڈ بائنڈنگ رسپانس کے لیے کٹ آف ویلیو کی بنیاد پر، جو منفی کنٹرول کے سگنل کی شدت سے دوگنا مقرر کیا گیا تھا، ہم نے IgG کے لیے کل 460 مثبت پیپٹائڈس اور IgM کے لیے 479 مثبت پیپٹائڈس کی نشاندہی کی جو کم از کم 1 مریض کے ساتھ ری ایکٹیو تھے۔ سیرم نمونہ. مثبت پیپٹائڈ نمبرز اور SARS-CoV-2 کے مختلف اوپن ریڈنگ فریموں (ORFs) میں ردعمل کی تقسیم مختلف نمونے لینے والے گروپوں کے درمیان نسبتاً مستحکم تھی، وقت کے ساتھ ساتھ مثبت پیپٹائڈ نمبروں میں معمولی کمی کے رجحان کے ساتھ (تصویر 3، اے)۔ سب سے زیادہ رد عمل کی شناخت پولی پروٹین ORF1ab میں کی گئی تھی، جو کہ سب سے بڑا ORF ہے، جو پورے جینوم کے دو تہائی سے زیادہ پر محیط ہے (تصویر 3، اے)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد مثبت پیپٹائڈ بائنڈنگ ردعمل اور سیرم سائٹوکائن کی سطح کے درمیان اعتدال سے مضبوط تعلق کا مشاہدہ کیا (بیماری شروع ہونے کے بعد 10-60 دن؛ آن لائن ریپوزٹری میں تصویر E10 دیکھیں۔ www. jacionline.org)۔ IgM کے لیے مثبت بائنڈنگ پیپٹائڈس کی تعداد IL-6 اور IL-10 کے سیرم لیولز سے وابستہ دکھائی گئی تھی۔ اسی طرح، کل رد عمل والے پیپٹائڈس کی اوسط سگنل کی شدت اور IgM کے لیے ORF1ab بائنڈنگ پیپٹائڈس نے سیرم کے نمونوں میں IL-6 اور IFN-g کی پیداوار کے ساتھ مثبت وابستگی پیش کی۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد سائٹوکائن کی سطح میں تبدیلیاں اینٹیجن مخصوص مزاحیہ ردعمل کے ذریعے پہچانے جانے والے ایپیٹوپس کی وسعت اور وسعت کو متاثر کر سکتی ہیں۔ مثبت ایپیٹوپس کی شناخت کی بنیاد پر، ہم نے مزید عام ایپیٹوپس کو منتخب کیا جو 3 نمونے لینے والے گروپوں میں سے ہر ایک کے درمیان 80% سے زیادہ COVID-19 نمونوں میں مستقل طور پر رد عمل کا اظہار کرتے ہیں (جسے غالب اور مستقل ایپیٹوپس کہا جاتا ہے)۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ طویل مدتی مزاحیہ مدافعتی ردعمل میں ثالثی کرنے کے قابل یہ انتہائی غالب ایپیٹوپس SARS-CoV-2 ORF1ab پولی پروٹین اور S پروٹین میں موجود تھے، جس میں زیادہ ایپیٹوپس IgM اینٹی باڈیز (n 5 33) کے ذریعے پہچانے گئے تھے۔ IgG اینٹی باڈیز (n 5 10) (تصویر 3، B، اور جدول II؛ www.jacionline.org پر آن لائن ریپوزٹری میں تصویر E11 اور تصویر E12 دیکھیں)۔ ORF1ab پولی پروٹین میں طویل مدتی ردعمل میں ثالثی کرنے والے غالب ایپیٹوپس کی زیادہ سے زیادہ تعداد موجود تھی، اور ایپیٹوپس کو غیر ساختی پروٹین (nbsp) 2-5، nbsp 8-10، nbsp 12-14، کے علاقوں میں وسیع پیمانے پر تقسیم کیا گیا تھا۔ اور nbsp 16 (ٹیبل II)۔ خاص طور پر، ہم نے ایک امیونوڈومیننٹ ایپیٹوپ، 2073 (ORF1ab، aa 5801-5815) کی نشاندہی کی، جسے IgG اور IgM اینٹی باڈیز کے ذریعے 100% COVID-19 مریضوں سے پہچانا جا سکتا ہے، سیرم سیمپلنگ ٹائم پوائنٹس سے قطع نظر (تصویر 1) 3، B، اور جدول II؛ آن لائن ریپوزٹری میں تصویر E13 اور Fig E14 دیکھیں)۔ یہ انتہائی رد عمل والا پیپٹائڈ ORF1ab پولی پروٹین کے ہیلیکیس (nsp 13) علاقے میں واقع ہے، جو SARS-CoV-2 کی نقل کے دوران ڈبل پھنسے ہوئے RNA ٹیمپلیٹس کو کھولنے کے لیے ضروری ہے۔ IgG اینٹی باڈیز کے ذریعہ پہچانی جانے والی سب سے زیادہ اوسط سگنل کی شدت کے ساتھ، نمبر 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) اور نمبر 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815)، دونوں nsp 13 پر واقع ہیں۔ IgM ردعمل کے لیے، پیپٹائڈ 685 (ORF1ab, aa 249-263) nsp 2 پر اور peptide 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) nsp 13 پر سب سے مضبوط پابند ہونے والی شدتیں پیش کیں (تصویر 3، B)۔ مختلف پیپٹائڈس (تصویر 3، بی) کے لیے بیس لائن سگنلز (صحت مند عطیہ دہندگان سے پولڈ سیرا) میں فرق کو مدنظر رکھتے ہوئے، ہم نے صحت مند کنٹرول گروپ کے نسبت ہر کلیدی پیپٹائڈ کے حوالے سے سگنل کی شدت کی گنا تبدیلیوں کا حساب لگایا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ پیپٹائڈ 2073 (آئی جی جی بائنڈنگ) اور پیپٹائڈ 1985 (آئی جی ایم بائنڈنگ) جو این ایس پی 13 ریجن پر واقع ہے، 180 سے 220 دنوں تک جمع کیے گئے مریض سیرا کے درمیان سب سے اوپر پیپٹائڈ بائنڈنگ کی شدت (فولڈ تبدیلی) کو برقرار رکھتے ہیں (تصویر E13 اور تصویر E14)۔

تصویر 2. COVID-19 مریضوں میں سائٹوکائن کی پیداوار کے حرکیات۔ A، شدید مرحلے اور صحت یاب ہونے کے ابتدائی مرحلے کے دوران 16 کووڈ-19 مریضوں سے جمع کیے گئے 55 سیرم کے نمونوں میں سائٹوکائن کی پیداوار کی سطح کا پتہ پروٹین-مائکرو رے پر مبنی ELISA (دن 1-15، n 5 11؛ دن 16-30، n 5 26؛ دن 31-61، n 5 18؛ صحت مند عطیہ دہندگان، n 5 20)۔ ہر ڈاٹ سیرم کے انفرادی نمونے کی نمائندگی کرتا ہے۔ نقطے والی لکیریں پتہ لگانے کی حد کو ظاہر کرتی ہیں۔ شماریاتی اہمیت کا تعین 1-طریقے سے ANOVA کے ساتھ Tukey متعدد موازنہ کے ذریعے کیا گیا۔ *P <.05، **P <.01، اور ****P <.0001۔ B، صحت مند عطیہ دہندگان کے 20 نمونوں کی اوسط قدروں کے مقابلے (A) میں دکھائے گئے COVID-19 مریضوں میں ہر سائٹوکائن کی پیداوار کی سطح کی تہہ میں تبدیلی۔ ہر کالم علامات کے آغاز کے بعد اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس سے جمع کیے گئے ایک الگ سیرم کے نمونے کی نشاندہی کرتا ہے۔ ہر قطار 1 انفرادی سائٹوکائن ٹیسٹ کی نمائندگی کرتی ہے۔

جدول I. ایپیٹوپ میپنگ میں COVID-19 مریضوں اور نمونے کے ساتھی کی خصوصیات

تصویر 3. IgM اور IgG غالب ایپیٹوپس کی شناخت جو SARS-CoV-2–متاثرہ افراد میں طویل مدتی اینٹی باڈی ردعمل میں حصہ ڈالتے ہیں۔ SARS-CoV-2 کے پروٹوم کو ڈھکنے والے پیپٹائڈ مائکرو رے کا استعمال کرتے ہوئے COVID-19 والے 19 افراد میں ایپیٹوپس کی سیرم کی شناخت کا طولانی تجزیہ۔ مریض کے نمونوں (n 5 51) ​​میں پیپٹائڈ بائنڈنگ کے مثبت ردعمل کے لیے کٹ آف ویلیو 20 صحت مند عطیہ دہندگان سے پولڈ سیرا کی سگنل کی شدت سے دوگنا مقرر کی گئی تھی۔ A، پیپٹائڈس کی گنتی اور مثبت بائنڈنگ پیپٹائڈس کی تقسیم جو 1 یا اس سے زیادہ نمونوں میں قابل شناخت تھے جو 10-60 دن (n 5 18)، 100-150 دن (n 5 18) میں جمع کیے گئے تھے۔ اور 180- 220 دن (n 5 15) بیماری شروع ہونے کے بعد۔ نمبر ہر ORF سے کل شناخت شدہ IgG اور IgM ایپیٹوپس کی نشاندہی کرتے ہیں۔ B، غالب اور مستقل IgG اور IgM ایپیٹوپس (x-axis) کی سگنل کی شدت جو نمونے لینے کے تمام 3 پوائنٹس کے اندر 80% سے زیادہ نمونوں میں پائیدار رد عمل کا مظاہرہ کرتی تھی۔ ہر ڈاٹ صحت مند عطیہ دہندگان (سب سے اوپر) کے پولڈ سیرا کی نشاندہی کرتا ہے یا علامت کے آغاز کے بعد اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس سے جمع کردہ ایک الگ مریض سیرم کا نمونہ۔ ای، لفافہ پروٹین۔

TABLE II. Epitopes with >تمام 3 سیمپلنگ ٹائم پوائنٹس پر 80% مثبت شرح

SARS-CoV-2 S پروٹین کے غالب اور مستقل ایپیٹوپس NTD اور S2 ذیلی یونٹس میں واقع ہیں۔

SARSCoV-2 S پروٹین سے کل 4 غالب اور مستقل ایپیٹوپس کی شناخت کی گئی تھی: پیپٹائڈ 318 (S, aa 45-59) اور پیپٹائڈ 356 (S, aa 197-211)، جو واقع ہیں۔ NTD علاقے کے اندر؛ پیپٹائڈ 510 (S, aa 813-827)، جو S2 کی کلیویج سائٹ اور S2 subunit کے FP کے حصوں کا احاطہ کرتا ہے، اور پیپٹائڈ 530 (S, aa 893-907)، جو مربوط ہونے والے علاقے میں واقع ہے۔ FP اور S2 subunit کے پہلے ہیپٹاد ریپیٹ ریجن کے درمیان (تصویر 3، B، اور جدول II)۔ ایس پروٹین کے ان کلیدی پیپٹائڈس میں سے جنہیں ہم نے منتخب کیا، پیپٹائڈ 318، جو ایس پروٹین کے این ٹی ڈی میں واقع ہے، سب سے زیادہ مضبوط پابند کی شدت کے حامل تھے (کنٹرول کے مقابلے میں فولڈ تبدیلی؛ تصویر E13 اور تصویر E14)۔ ساختی تجزیوں سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ یہ ایپیٹوپس مونومیرک ایس پروٹین کی سطح پر پوری طرح سے ظاہر ہوتے ہیں۔ تاہم، پیپٹائڈس 318، 356، اور 530 کے لیے ایپیٹوپس کی کچھ باقیات ٹرامرک ایس پروٹین (تصویر 4، اے اور بی) کی سطح کے نیچے چھپائی گئی ہیں، یہ تجویز کرتی ہے کہ ایس مونومر اور ٹرائمر دونوں ڈھانچے کو میزبان مدافعتی نظام کے ذریعے مؤثر طریقے سے پہچانا جاتا ہے۔ حالات مخصوص ہونے کے لیے، پیپٹائڈ 318 کے 2 لوپ سیگمنٹس (aa 45-46 اور aa 56-59) trimeric S پروٹین پر ظاہر ہوتے ہیں، جس کے اندر مرکزی b-strand دفن ہوتا ہے۔ اور پیپٹائڈ 356 کی زیادہ تر باقیات سطح پر قابل رسائی ہیں، بشمول ایک کور بی اسٹرینڈ (aa 203-209) اور ایک لوپ سیگمنٹ (aa 210-211)۔ پیپٹائڈ 510 میں S2 کی کلیویج سائٹ اور FP کا ایک مرکزی ہیلکس ہوتا ہے، یہ دونوں مکمل طور پر S پروٹین کی سطح پر پیش کیے جاتے ہیں۔ پیپٹائڈ 530 کی باقیات زیادہ تر خفیہ ہیں، لوپ کا صرف ایک چھوٹا سا حصہ (aa 893-895) trimeric S پروٹین (تصویر 4, C) پر ظاہر ہوتا ہے۔ 7 عام انسانی کورونا وائرس کے درمیان ترتیب ہومولوجی تجزیہ سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ S2 سبونائٹ (پیپٹائڈس 510 اور 530) میں واقع 2 ایپیٹوپس دوسرے کورونا وائرس کے ساتھ اعلی ترتیب کی شناخت کا اشتراک کرتے ہیں، جو انسانی کورونا وائرس کے درمیان ان ایپیٹوپس کو نشانہ بناتے ہوئے سیرولوجک کراس ری ایکٹیویٹی کا مشورہ دیتے ہیں (تصویر 4، ڈی)۔ پیپٹائڈ 318 کی ترتیب نے SARSCoV کے ساتھ اعلی مماثلت کی نمائش کی، جب کہ پیپٹائڈ 356 کے لیے ترتیب ہومولوجی کی ایک نچلی سطح کو کورونا وائرس کے درمیان دکھایا گیا تھا، جو اس خطے کو نشانہ بنانے والے SARS-CoV-2–مخصوص اینٹی باڈی ردعمل کی تجویز کرتا ہے (تصویر 4، D)۔ عالمی سطح پر نئی ابھرتی ہوئی اور گردش کرنے والی SARS-CoV-2 مختلف حالتوں پر غور کرتے ہوئے، ہم نے ابتدائی SARS-CoV-2 تناؤ (ووہان-ہُو{{52}) کے درمیان ایس پروٹین کے کلیدی ایپیٹوپس کے حوالے سے ترتیب کی ترتیب کو مزید انجام دیا۔ }) اور تشویش کی 5 قسمیں (الفا، بیٹا، گاما، ڈیلٹا، اور اومیکرون)، نیز دلچسپی کی 2 اقسام (Lambda اور Mu)، ورلڈ ہیلتھ آرگنائزیشن کی مختلف قسم کے وائرسوں کی درجہ بندی کے مطابق (30 نومبر 2021 کو اپ ڈیٹ کیا گیا) )۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ان غالب اور مستقل ایپیٹوپس کے سلسلے تقریباً ایک جیسے ہیں جن کا تجزیہ کیا گیا ہے، سوائے ایک واحد N211I اتپریورتن کے جو نئے Omicron ویرینٹ (تصویر 4، E) میں شناخت کی گئی ہے۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ ابتدائی SARS-CoV-2 تناؤ سے پیدا ہونے والی اینٹی باڈیز موجودہ گردش کرنے والی مختلف حالتوں کو مستقل طور پر پہچان سکتی ہیں اور یہ غالب ایپیٹوپس SARS-CoV-2 کے انفیکشن پر طویل مدتی اینٹی باڈی ردعمل میں ثالثی کرنے کے قابل ہو سکتے ہیں۔ متغیرات ایس پروٹین پر شناخت شدہ ایپیٹوپس کی امیونولوجک خصوصیات کا مزید تعین کرنے کے لیے، اور پیپٹائڈ ویکسین کے امیدواروں کے طور پر ان S-پروٹین ایپیٹوپس کی ممکنہ قدر کی مزید چھان بین کرنے کے لیے، ہم نے منتخب پیپٹائڈز کا استعمال کرتے ہوئے ماؤس امیونائزیشن کا مطالعہ کیا۔ BALB/c چوہوں کو ہر پیپٹائڈ کے ساتھ پھٹکڑی اور CpG ملحقین (تصویر 4، F) کی موجودگی میں 3 بار ٹیکہ لگایا گیا تھا۔ منتخب کردہ 4 پیپٹائڈز میں سے، پیپٹائڈ 356 کے ساتھ ویکسینیشن نے دوسری اور تیسری خوراک کے بعد اینٹیجن سے متعلق مخصوص اینٹی باڈیز کو نکالا (تصویر 4، جی)۔ سیرم نیوٹرلائزیشن پرکھ کے نتائج سے یہ بات سامنے آئی کہ لکیری پیپٹائڈس کے ساتھ حفاظتی ٹیکوں نے SARS-CoV-2 (تصویر 4, H) کے خلاف اینٹی باڈیز کو غیرجانبدار کرنے کی اہم سطح پیدا نہیں کی، یہ تجویز کرتا ہے کہ یہ لکیری پیپٹائڈز مضبوط غیرجانبدار اینٹی باڈی ردعمل پیدا کرنے میں خراب کارکردگی کا مظاہرہ کرتے ہیں۔

SARS-CoV-2 کے N پروٹین میں وائرل انفیکشن کے بعد پائیدار اینٹی باڈی ردعمل میں ثالثی کرنے والے سب سے زیادہ رد عمل والے ایپیٹوپس کی کمی ہے

متعدد مطالعات نے SARS-CoV-2 N پروٹین کی طاقتور اینٹی جینیسیٹی کو واضح کیا ہے۔ (تمام 3 سیمپلنگ ٹائم پوائنٹس پر 80% مثبت شرح سے اوپر)۔ COVID-19 والے افراد میں N پروٹین کے ایپیٹوپ پروفائلز کی طولانی تشخیص کے لیے، ہم نے ایپیٹوپ اسکریننگ کا دوسرا دور انجام دیا جو کہ ذیلی ایپیٹوپس کے انتخاب کے لیے پیپٹائڈ مائیکرو رے سے حاصل کردہ ڈیٹا پر مبنی تھا جو مستقل طور پر مثبت رد عمل کا حامل رہا۔ 60% سے زیادہ COVID-19 نمونوں میں ہر 3 سیمپلنگ ٹائم پوائنٹس میں سے ہر ایک کے لیے (سب ڈومیننٹ اور پرسسٹنٹ ایپیٹوپس کہا جاتا ہے)۔ SARS-CoV-2 N پروٹین کے کل 4 ذیلی اور مستقل ایپیٹوپس کی نشاندہی کی گئی، جن میں سے پیپٹائڈ 2455 (N, aa 213-227) نے COVID میں IgG اور IgM دونوں اینٹی باڈیز کے لیے رد عمل پیش کیا{16} }} مریض، سگنل کی شدت کی نسبتاً زیادہ سطح کے ساتھ (تصویر 5، A اور B، اور www.jacionline.org پر آن لائن ریپوزٹری میں ٹیبل E4 دیکھیں)۔ 2 اوور لیپنگ پیپٹائڈس، پیپٹائڈ 2455 (N, aa 213-227) اور پیپٹائڈ 2456 (N, aa 217-231)، N-ٹرمینل RNA بائنڈنگ ڈومین کے درمیان Ser/Arg سے بھرپور لنکر ریجن میں واقع ہیں۔ اور N پروٹین کا سی ٹرمینل ڈائمرائزیشن ڈومین۔ پیپٹائڈ 2482 (N, aa 321-335) اور پیپٹائڈ 2491 (N, aa 357-371) مکمل یا جزوی طور پر N پروٹین (ٹیبل E4) کے ڈائمرائزیشن ڈومین کے اندر واقع ہیں۔ N پروٹین کی برقرار تشکیل کے حوالے سے 3-D ڈھانچے کی کمی کی وجہ سے، ہم نے C-ٹرمینل dimerization ڈومین کے dimeric ڈھانچے پر صرف 2 شناخت شدہ ایپیٹوپس کے ساختی تجزیے کیے ہیں۔ پیپٹائڈ 2482 کی باقیات 2 بی اسٹرینڈز بناتی ہیں جو ڈائمرائزیشن انٹرفیس میں متوازی طریقے سے ترتیب دی جاتی ہیں، جب کہ پیپٹائڈ 2491 کا aa 357-364 ہیلکس پر مبنی ڈھانچے بناتا ہے جو ڈائمر کے مخالف سروں پر واقع ہوتے ہیں (تصویر 5، سی) . ابتدائی SARS-CoV-2 (سٹرین ووہان-Hu-1) اور 7 ابھرتی ہوئی مختلف حالتوں کے درمیان ترتیب کی ترتیب نے مزید انکشاف کیا کہ N پروٹین میں ان ذیلی اور مستقل ایپیٹوپس کی ترتیب موجودہ گردش کرنے والی مختلف حالتوں میں تقریباً ایک جیسی ہے۔ پیپٹائڈ 2455 کا واحد G215C متبادل ڈیلٹا ویرینٹ میں پایا جاتا ہے اور پیپٹائڈ 2455 کی واحد G214C میوٹیشن لیمبڈا ویرینٹ میں شناخت کی گئی ہے، یہ تجویز کرتی ہے کہ ان پیپٹائڈز کو نشانہ بنانے والے اینٹی باڈیز ممکنہ طور پر ابھرتی ہوئی SARS-CoV-2 مختلف حالتوں کے اینٹیجن کو پہچانتی ہیں۔ )۔

تصویر 4. پائیدار مزاحیہ مدافعتی ردعمل میں ثالثی کے لحاظ سے SARS-CoV-2 سپائیک پروٹین کے غالب ایپیٹوپس۔ A اور B، monomeric (A) اور trimeric (B) S پروٹین (PDB ID: 6VXX) کے 3-D ڈھانچے پر غالب اور مستقل ایپیٹوپس کے مقامات۔ Epitopes سبز (peptide 356, aa 197-211), سرخ (peptide 318, aa 45-59), نیلے (peptide 510, aa 813-827), اور جامنی (peptide 530, aa) میں نمایاں ہوتے ہیں۔ 893-907) بالترتیب۔ بند شکل میں تین S monomers کو بالترتیب سرمئی، گلابی اور سیان میں دکھایا گیا ہے۔ C، S trimer (PDB ID: 6VXX) کی بند حالت پر SARS-CoV-2 S پروٹین میں غالب ایپیٹوپس کی ساخت کا تفصیلی تجزیہ۔ ڈی، عام انسانی کورونا وائرس کے درمیان شناخت شدہ ایپیٹوپس کی ترتیب کی سیدھ۔ ایپیٹوپ کی باقیات جو SARS-CoV-2 اور دوسرے انسانی کورونا وائرس کے درمیان محفوظ ہیں وہ خاکستری رنگ میں چھائے ہوئے ہیں۔ E، ابتدائی SARS-CoV-2 (سٹرین ووہان-ہو-1) اور 7 ابھرتی ہوئی اقسام کا ایپیٹوپ کنزرویشن تجزیہ۔ سیاہ نقطے ووہان-ہو-1 تناؤ اور اشارے کے درمیان ایک جیسی باقیات کی نمائندگی کرتے ہیں۔

تصویر 5. SARS-CoV-2 نیوکلیو کیپسڈ پروٹین میں واقع ذیلی ایپیٹوپس اینٹی باڈی کے مستقل ردعمل میں ثالثی کرنے کی صلاحیت رکھتے ہیں۔ A, IgG، اور IgM شناختی تعدد ذیلی پیپٹائڈس (60% سے زیادہ نمونوں میں پائیدار رد عمل) کے مریض کے سیرم کے نمونوں میں جو بیماری شروع ہونے کے بعد متعدد اوقات میں جمع کیے جاتے ہیں۔ B، وقت کے ساتھ ساتھ شناخت شدہ ذیلی ایپیٹوپس کے سگنل کی شدت کے حرکیات۔ ہر ڈاٹ ایک الگ مریض کے سیرم کے نمونے کی نمائندگی کرتا ہے جو COVID-19 مریضوں سے علامات کے آغاز کے بعد بتائے گئے وقت پر حاصل کیا جاتا ہے۔ نقطے والی افقی لکیریں ہر پیپٹائڈ کے لیے مثبت ردعمل کی کٹ آف اقدار کی نشاندہی کرتی ہیں۔ C، N پروٹین (PDB ID: 6YUN) کے C-ٹرمینل ڈائمرائزیشن ڈومین پر ایپیٹوپس کا تفصیلی ڈھانچہ تجزیہ۔ ایپیٹوپس پر نیلے رنگ (پیپٹائڈ 2482، اے اے 321-335) ​​اور براؤن (پیپٹائڈ 2491، اے اے 357-364) کا لیبل لگایا گیا ہے۔ 2 مونومیرک ڈھانچے کو بالترتیب سرمئی اور سیان میں دکھایا گیا ہے۔ D، ابتدائی SARS-CoV-2 (سٹرین ووہان-Hu-1) اور 7 ابھرتی ہوئی مختلف حالتوں کے درمیان شناخت شدہ N-پروٹین ایپیٹوپس کی ترتیب سیدھ کا تجزیہ۔ سیاہ نقطے ووہان-ہو-1 تناؤ اور اشارہ کردہ مختلف قسم کے درمیان ایک جیسی ترتیب کو ظاہر کرتے ہیں۔ امینو ایسڈ کی ترتیب میں تبدیلیوں کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے۔

تصویر 6. لائنر ایپیٹوپس زیادہ پابند ہونے والی شدت کے ساتھ اور وقت کے ساتھ ساتھ گرتی ہوئی رد عمل کی تعدد، جو SARS-CoV-2–متاثرہ افراد کے ذریعہ پہچانی جاتی ہے۔ A اور B، ہائی بائنڈنگ سگنل کی شدت کو ظاہر کرنے والے شناخت شدہ پیپٹائڈس کا طولانی تجزیہ اور تقسیم (اوپر کا مطلب تمام ٹیسٹ شدہ نمونوں کے سگنل کی شدت کا 1 SD ہے) لیکن وقت کے ساتھ ساتھ مثبت شرح میں کمی۔ ایپیٹوپس کی شناخت کی فریکوئنسی (A) اور سگنل کی شدت (B) کو علامت کے آغاز کے بعد 3 نمونے لینے کے ٹائم پوائنٹس کے ساتھ پلاٹ کیا گیا تھا۔ (B) میں ہر نقطے کا مطلب ہے علامات کے آغاز کے بعد اشارہ کردہ وقت کے پوائنٹس پر جمع کیے گئے مریض کے سیرم کے انفرادی نمونے؛ نقطے والی افقی لکیریں ہر پیپٹائڈ کے لیے مثبتیت کی کٹ آف اقدار کی نشاندہی کرتی ہیں۔ شماریاتی اہمیت کا تجزیہ R v3.6.3 سافٹ ویئر کے Limma کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔ *P <.05 اور **P <.01۔ C، SARS-CoV-2 S پروٹین کی ساخت (PDB ID: 6ZGI) پر 2 ملحقہ ایپیٹوپس، پیپٹائڈ 510 (غالب اور مستقل) اور پیپٹائڈ 511 (زیادہ سگنل کی شدت اور وقت کے ساتھ مثبتیت میں کمی) کے مقام اور ترتیب کا موازنہ . 2 ایپیٹوپس کے درمیان اوور لیپنگ والے علاقوں کو سبز رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے۔ منفرد ترتیبوں پر سرخ اور نیلے رنگ کا لیبل لگا ہوا ہے۔

طولانی سیرولوجک تجزیہ اعلی سگنل کی شدت کے ساتھ ایپیٹوپس کی شناخت کرتا ہے لیکن وقت کے ساتھ رد عمل میں کمی

منتخب انتہائی رد عمل والے ایپیٹوپس کے علاوہ جو اوپر مذکور پائیدار مزاحیہ مدافعتی ردعمل کے لیے ذمہ دار ہیں، ہم نے مزید 9 مثبت پیپٹائڈس کے پینل کی نشاندہی کی اور اس کی خصوصیت کی جس میں مضبوط پابندی کی شدت (تمام آزمائشی نمونوں کے سگنل کی شدت کے اوسط 1 SD سے اوپر) ظاہر ہوئی۔ وقت کے ساتھ ساتھ COVID-19 مریضوں کے سیرم کے نمونوں میں رد عمل میں کمی کا رجحان (مثبت شرح 20% سے زیادہ)، مزاحیہ مدافعتی ردعمل میں کمی کے عمومی رجحان کے مطابق۔ یہ ایپیٹوپس 3 غالب اینٹیجنز کے اندر موجود ہیں: ORF1ab، S، اور N پروٹین (تصویر 6، A؛ اور www.jacionline.org پر آن لائن ریپوزٹری میں ٹیبل E5 دیکھیں)۔ مزید برآں، ORF1ab (peptides 784-IgG، 1617-IgM، اور 1986-IgM) اور N (peptide 2457-IgG) پروٹین سے 4 پیپٹائڈس کی سگنل کی شدت میں نمایاں کمی دیکھی گئی۔ نمونے لینے کے وقت کے ابتدائی دور کے نمونوں کے درمیان (بیماری شروع ہونے کے بعد کے دن 10-60) اور نمونے لینے کے وقت کے بعد کے مرحلے (علامت کے آغاز کے بعد دن 100-150 یا دن 180-220) (تصویر 6) ، بی)۔ خاص طور پر، ایک دوسرے کے ساتھ بڑے پیمانے پر اوورلیپ ہونے کے باوجود، ایس پروٹین پیپٹائڈ 510 کے 2 پیپٹائڈز (غالب اور مستقل؛ تصویر 3، بی) اور پیپٹائڈ 511 (زیادہ سگنل کی شدت اور وقت کے ساتھ ساتھ مثبت شرح میں کمی؛ تصویر 6، اے) نے مختلف نمونوں کی نمائش کی۔ وقت کے ساتھ مریض کے سیرم کے نمونوں میں رد عمل۔ ترتیب اور مقام کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ پیپٹائڈ 510 میں S2 کی کلیویج سائٹ اور 813-SKRS-816 کے اضافی امینو ایسڈ شامل ہیں، جب کہ پیپٹائڈ 511 مکمل طور پر توسیع شدہ 828-LADA{{29} کے ساتھ FP کے اندر ہے۔ }} باقیات جو مکمل طور پر trimeric S پروٹین کی سطح پر ظاہر ہوتے ہیں (تصویر 6، C)۔ ان نتائج نے ایپیٹوپس کی نئی خصوصیات کا انکشاف کیا جو بالآخر SARS-CoV-2 کے خلاف دیرپا اور مضبوط مزاحیہ قوت مدافعت میں حصہ ڈال سکتے ہیں۔

بحث

SARS-CoV-2 انفیکشن کے لیے طویل مدتی مدافعتی ردعمل کی ایک منظم خصوصیت بہتر تشخیص، مؤثر علاج کی مداخلتوں، اور ویکسین کی ترقی کے لیے اہم ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نے 180 سے 220 دنوں کے فالو اپ میں COVID-19 مریضوں کا ایک جامع طولانی تجزیہ کیا، جس میں مسلسل مزاحیہ مدافعتی ردعمل اور وائرل انفیکشن کے بعد فعال سائٹوکائن کی پیداوار دکھائی گئی۔

اہم بات یہ ہے کہ، SARS-CoV-2 کے پروٹوم پر پھیلے ہوئے پیپٹائڈ پر مبنی مائیکرو رے کا فائدہ اٹھاتے ہوئے، ہم نے ایپیٹوپ کی شناخت کے حرکیات کا مزید انکشاف کیا اور غالب ایپیٹوپس کے ایک پینل کی نشاندہی کی جو طویل مدتی مزاحیہ استثنیٰ میں ثالثی کرنے کے قابل ہے۔ SARS-CoV-2 انفیکشن کے بعد مزاحیہ مدافعتی ردعمل کی لمبی عمر کے بارے میں جو نتائج ہم یہاں رپورٹ کرتے ہیں وہ کچھ پہلے شائع شدہ ڈیٹا 5,10,12,13,42 کی تصدیق کرتے ہیں لیکن طولانی سیرم کے نمونوں کا استعمال کرتے ہوئے گہری سیرولوجک پروفائلنگ اور ایپیٹوپ اسکریننگ کرکے ان میں توسیع کرتے ہیں۔ پروٹوم وائیڈ مائکرو رے اپروچ کے ذریعے COVID{11}} والے افراد سے۔ اس مطالعہ میں، ہم نے SARS-CoV-2 پروٹین کے اندر 4 غالب ایپیٹوپس (پیپٹائڈس 318، 356، 510، اور 530) کی نشاندہی کی جو 80% سے زیادہ COVID{21}} مریضوں کے ساتھ مسلسل رد عمل ظاہر کرنے کے قابل تھے۔ علامات کے آغاز کے 180 سے 220 دن تک نمونوں کی جانچ کی گئی۔ Peptide 510 (S, aa 813-827), S2 کلیویج سائٹ اور S2 subunit کے FP پر مشتمل ہے، عام طور پر دوسرے گروپوں کے پچھلے مطالعات میں شناخت کیا گیا ہے۔ اس خطے کو نشانہ بنانا SARS-CoV-226,33 کے خلاف محدود نیوٹرلائزیشن کی طاقت کو ظاہر کر سکتا ہے حالانکہ S پروٹین کی سطح پر بہت زیادہ بے نقاب ہونے کے باوجود (تصویر 4، AC)۔ پیپٹائڈ 530 (S, aa 893-907) کی صورت میں، جو FP اور S2 subunit کے پہلے ہیپٹاڈ ریپیٹ ریجن کے درمیان واقع ہے، باقیات عام طور پر S پروٹین کے ٹرائیمرک ڈھانچے کے اندر دفن ہوتے ہیں، جو اسے بناتا ہے۔ SARS-CoV-2 (تصویر 4، AC) کے خلاف مضبوط غیر جانبدار اینٹی باڈیز کے ذریعے رسائی مشکل ہے۔ مزید برآں، 2 S1-NTD-ڈائریکٹڈ پیپٹائڈس جو SARS-CoV-2 کے طویل مدتی اینٹی باڈی ردعمل میں ثالثی کر سکتے ہیں بھی منتخب کیے گئے۔ پیپٹائڈ کی ترتیب اور مقام کے حوالے سے تجزیوں سے پتہ چلتا ہے کہ ان 2 پیپٹائڈس کی باقیات — پیپٹائڈ 318 (S, aa 45-59) اور پیپٹائڈ 356 (S, aa 197-211) — شناخت شدہ رپورٹ شدہ ایپیٹوپس کے قریب ہیں۔ انفیکشن بڑھانے والے اینٹی باڈیز 23,25 کے ذریعے لیکن S1 سبونائٹ کے NTD کو نشانہ بنانے والے انتہائی طاقتور نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز کے کلیدی مقامات کے علاوہ، 16,19,43 ان 2 شناخت شدہ پیپٹائڈس کی طرف اینٹی باڈیز کو غیر نیوٹرلائز کرنے سے ایپیٹوپ کی شناخت کے امکان کی تجویز کرتے ہیں۔ اوپر بیان کردہ تفصیلات کے علاوہ، منتخب پیپٹائڈس کے ساتھ ماؤس کے حفاظتی ٹیکوں نے مزید ان غیر رسیپٹر بائنڈنگ ڈومین لکیری پیپٹائڈس کی مضبوط غیرجانبدار اینٹی باڈی ردعمل (تصویر 4، جی) کو دلانے میں کم افادیت کی نشاندہی کی۔ اجتماعی طور پر، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ SARS-CoV-2 انفیکشن پر طویل مدتی مزاحیہ مدافعتی ردعمل میں ثالثی کرنے والے غالب لکیری ایپیٹوپس ممکنہ طور پر بغیر یا محدود بے اثر کرنے کی طاقت کے ساتھ اینٹی باڈیز پیدا کرتے ہیں۔ SARS-CoV-2 اینٹی باڈیز، خاص طور پر ایس پروٹین کے ذریعے ہدایت یافتہ ایپیٹوپس کی مکمل تفہیم، اینٹی باڈیز کے فنکشنل ڈسیکشن کے بارے میں نئی ​​بصیرت فراہم کرتی ہے، جو مزید اختراعی اور عقلی ویکسین ڈیزائن میں سہولت فراہم کرتی ہے۔ اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنا وائرل انفیکشن کو ختم کرنے کے لیے تحفظ فراہم کرتا ہے، جب کہ غیر جانبدار اینٹی باڈیز وائرس کی صفائی کے دوران فائدہ مند، غیر جانبدار یا نقصان دہ کردار ادا کر سکتی ہیں۔ اینٹی باڈی پر منحصر phagocytosis اور اینٹی باڈی پر منحصر cytotoxicity کے تناظر میں Nonneutralizing antibodies Vivo میں Fc-ثالثی اثر کرنے والے افعال کی ایک حد کے ذریعے اضافی تحفظ فراہم کرتے ہیں۔ اس کے برعکس، کچھ مطالعات نے کورونا وائرس کے انفیکشن میں اینٹی باڈیز کو غیر جانبدار کرنے کے روگجنک کردار کا امکان تجویز کیا ہے۔ SARS-CoV اور MERS-CoV کے لیے متعدد قسم کے ویکسین کے امیدواروں کا استعمال کرتے ہوئے پچھلی مطالعات میں وائرس کے چیلنج کے بعد ویکسین لگائے گئے چھوٹے جانوروں اور غیر انسانی پریمیٹ میں امیونو پیتھولوجی میں اضافہ دیکھا گیا تھا۔ SARS-CoV-2 S پروٹین کے NTD کو نشانہ بنانے والی اینٹی باڈیز Fcg ریسیپٹر – آزاد میکانزم کے ذریعے وٹرو میں وائرل انفیکشن کو بڑھانے کی صلاحیت رکھتی تھیں، 23,25 اگرچہ جانوروں کے ماڈلز میں غیر فعال طور پر زیر انتظام انفیکشن بڑھانے والے اینٹی باڈیز کو SARS کے خلاف حفاظتی دکھایا گیا ہے۔ Vivo میں CoV-2 انفیکشن۔ کورونا وائرس کے انفیکشن کے دوران اینٹی باڈیز کے متنازعہ کرداروں پر غور کرتے ہوئے، Vivo میں وائرل انفیکشن کا مقابلہ کرنے میں ان غالب اور مستقل ایپیٹوپس کو پہچاننے میں اینٹی باڈیز کے ممکنہ کردار کی توثیق کرنے کے لیے مزید تحقیقات کی ضرورت ہے۔ SARS-CoV-2 کے لیے عقلی ویکسین کے ڈیزائن کے اگلے مرحلے کا تصور انتہائی طاقتور نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز اور حفاظتی نان نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز کے ذریعے کیا جا سکتا ہے، اس کے ساتھ انفیکشن بڑھانے والے ایپیٹوپس یا امیونوڈومیننٹ ایپیٹوپس کی پیش کش کو کم کیا جا سکتا ہے۔ فائدہ مند اثرات. اگرچہ پچھلے کئی مطالعات میں صرف SARS-CoV{91}} کے ایس پروٹین پر توجہ مرکوز کی گئی ہے جس کا مقصد نیوٹرلائزیشن کے حوالے سے اینٹی باڈی کے افعال کی وضاحت کرنا ہے، ہم نے ایک جامع پروٹوم وسیع ایپیٹوپ میپنگ کی اور ORF1ab پولی پروٹین کے اندر ایپیٹوپس کے ایک پینل کی نشاندہی کی۔ وقت کے ساتھ مریض کے سیرم کے نمونوں کے ایک اعلی تناسب سے مستقل طور پر پہچانا جاتا تھا۔ اگرچہ متعدد غیر ساختی پروٹینوں پر تقسیم کیے گئے یہ ORF1ab-ڈائریکٹڈ پیپٹائڈس SARS-CoV-2 وائرس کو نشانہ بنانے والے فعال اینٹی باڈیز کو نہیں نکال سکتے ہیں، لیکن وہ قدرتی انفیکشن کو ویکسینیشن سے الگ کرنے میں مدد کے لیے ایک تشخیصی ٹول کے طور پر لاگو ہو سکتے ہیں۔ دنیا بھر میں ویکسین وصول کرنے والوں کی بڑھتی ہوئی تعداد کے ساتھ، S پروٹین اور N پروٹین پر مبنی موجودہ سیرولوجک ٹیسٹوں کو SARS-CoV-2 انفیکشن کا پتہ لگانے کے لیے مالیکیولر ٹیسٹوں میں مدد کے لیے ایک مؤثر طریقہ کار کے طور پر چیلنجز کا سامنا ہے۔ وائرل انفیکشن کے بعد مدافعتی حیثیت کا تعین. COVID سے متاثرہ افراد میں ORF1ab کے اندر سب سے زیادہ عام اور مستقل طور پر رد عمل کرنے والے پیپٹائڈس کا فائدہ اٹھاتے ہوئے، قدرتی انفیکشن کی سیرولوجک تشخیص کی جائے گی جس میں ریسیپٹر بائنڈنگ ڈومین کی بنیاد پر ایس پروٹین شامل ہیں، ویکسینیشن کی حیثیت کو مدنظر رکھا جائے گا۔ پر مبنی، اور غیر فعال وائرس پر مبنی ویکسین کے طریقے۔ SARSCoV-2-متاثرہ افراد اور ویکسین وصول کرنے والے دونوں پر مشتمل بڑے گروہوں میں شناخت شدہ ORF1ab پیپٹائڈس کی رد عمل، حساسیت، اور مخصوصیت کا جائزہ لینے کے لیے مستقبل کے مطالعے کی ضرورت ہے۔ مزید برآں، ایک سے زیادہ پیپٹائڈ کے امتزاج کی حکمت عملیوں کے ذریعے پتہ لگانے کی کارکردگی کی مزید جانچ کی ضرورت ہوگی تاکہ پوری لمبائی والے پروٹین کے مقابلے پیپٹائڈس کی کم حساسیت اور عام انسانی کورونا وائرس کے درمیان ممکنہ کراس ری ایکٹیویٹی پر قابو پایا جاسکے۔ ہمارے مطالعے کی بڑی حدیں نسبتاً کم نمونے ہیں جو ایک چھوٹے سے مریض کے گروپ سے حاصل کیے گئے ہیں، اور زیادہ تر شرکاء کو غیر خطرناک COVID{106} بیماریوں کا سامنا ہے۔ یہ مثبت ردعمل کی فریکوئنسی اور مدافعتی ردعمل کی شدت کے حوالے سے ہمارے کچھ نتائج کو محدود کر سکتے ہیں، جو بیماری کی شدت کے مطابق مختلف ہو سکتے ہیں۔ بہر حال، اس مطالعے میں پیش کردہ ڈیٹا SARS-CoV{108}} انفیکشن کے بعد وقت کے ساتھ مدافعتی ردعمل کے حرکیات اور کووڈ سے متاثرہ افراد میں پائیدار مزاحیہ استثنیٰ میں ثالثی کرنے کے قابل غالب ایپیٹوپس کی خصوصیات کے بارے میں قیمتی بصیرت فراہم کرتا ہے۔ ایک ساتھ، یہ نتائج وائرل انفیکشن کی وجہ سے قدرتی استثنیٰ کی لمبی عمر کے بارے میں گہری تفہیم پیش کرتے ہیں اور ویکسینیشن کی اختراعی حکمت عملیوں اور بہتر تشخیصی طریقوں پر وسیع مضمرات رکھتے ہیں۔

حوالہ جات

1. Lu R، Zhao X، Li J، Niu P، Yang B، Wu H، et al. 2019 ناول کورونا وائرس کی جینومک خصوصیات اور وبائی امراض: وائرس کی ابتدا اور رسیپٹر بائنڈنگ کے مضمرات۔ لینسیٹ 2020؛ 395:565-74۔

2. ورلڈ ہیلتھ آرگنائزیشن (WHO)۔ ڈبلیو ایچ او کورونا وائرس (COVID-19) ڈیش بورڈ، 2021۔ یہاں دستیاب ہے: https://COVID19.who.int/۔ 30 نومبر 2021 کو رسائی ہوئی۔

3. وو زیڈ، میک گوگن جے ایم۔ چین میں کورونا وائرس بیماری 2019 (COVID-19) کے پھیلنے کی خصوصیات اور اس سے اہم سبق: چینی مرکز برائے امراض قابو پانے اور روک تھام سے 72314 کیسز کی رپورٹ کا خلاصہ۔ جامعہ 2020؛ 323:1239-42۔

4. Rydyznski Moderbacher C، Ramirez SI، Dan JM، Grifoni A، Hastie KM، Weiskopf D، et al. شدید COVID-19 میں SARS-CoV-2 اور عمر اور بیماری کی شدت کے ساتھ وابستگی کے لیے اینٹیجن کے لیے مخصوص انکولی قوت مدافعت۔ سیل 2020؛ 183:996-1012.e19۔

5. وو جے، لیانگ بی، چن سی، وانگ ایچ، فینگ وائی، شین ایس، وغیرہ۔ SARS-CoV-2 انفیکشن علامتی COVID-19 کے بعد صحت یاب ہونے والے مریضوں میں مستقل مزاحیہ مدافعتی ردعمل پیدا کرتا ہے۔ نیٹ کمیون 2021؛ 12:1813۔

6. لانگ کیو ایکس، لیو بی زیڈ، ڈینگ ایچ جے، وو جی سی، ڈینگ کے، چن وائی کے، وغیرہ۔ COVID-19 کے مریضوں میں SARS-CoV-2 پر اینٹی باڈی ردعمل۔ نیٹ میڈ 2020؛ 26:845-8۔

7. Sterlin D، Mathian A، Miyara M، Mohr A، Anna F، Claer L، et al. IgA SARS-CoV-2 پر ابتدائی غیرجانبدار اینٹی باڈی ردعمل پر حاوی ہے۔ سائنس ٹرانسل میڈ 2021؛ 13: eabd2223۔

8. Zhang J، Wu Q، Liu Z، Wang Q، Wu J، Hu Y، et al. اسپائک مخصوص گردش کرنے والا ٹی فولیکولر ہیلپر سیل اور کووڈ-19 میں اینٹی باڈی کے کراس غیرجانبدار ردعمل – صحت یاب افراد۔ نیٹ مائکروبیول 2021؛6:51-8۔

9. وانگ پی، لیو ایل، نیر ایم ایس، ین ایم ٹی، لوو وائی، وانگ کیو، وغیرہ۔ SARS-CoV-2 کو بے اثر کرنے والے اینٹی باڈی ردعمل شدید بیماری والے مریضوں میں زیادہ مضبوط ہوتے ہیں۔ ایمرج مائکروبس انفیکٹ 2020؛ 9:2091-3۔

10. Vanshylla K، Di Cristanziano V، Kleipass F، Dewald F، Schommers P، Gieselmann L، et al. انسانوں میں SARSCoV-2 انفیکشن کے خلاف اینٹی باڈی کے غیرجانبدار ردعمل کے حرکیات اور ارتباط۔ سیل ہوسٹ مائکروب 2021؛ 29:917-29.e4۔

11. Xiang T، Liang B، Fang Y، Lu S، Li S، Wang H، et al. SARS-CoV کے خلاف اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کی سطح میں کمی-2 کووڈ-19 مریضوں میں ایک سال کے بعد علامات کے آغاز کے بعد۔ فرنٹ امیونول 2021؛ 12:708523۔

12. Wang Z، Muecksch F، Schaefer-Babajew D، Finkin S، Viant C، Gaebler C، et al. انفیکشن کے ایک سال بعد SARS-CoV-2 کے خلاف قدرتی طور پر بڑھا ہوا غیر جانبداری کی وسعت۔ فطرت 2021؛595:426-31۔

13. Dan JM، Mateus J، Kato Y، Hastie KM، Yu ED، Faliti CE، et al. SARS-CoV-2 کی امیونولوجیکل میموری کا اندازہ انفیکشن کے بعد 8 ماہ تک ہوتا ہے۔ سائنس 2021؛ 371: eabf4063۔

14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. اینٹی SARS-CoV-2 میموری B سیل ردعمل کی پختگی اور استقامت۔ سیل 2021; 184:1201-13.e14۔ 15. Ju B، Zhang Q، Ge J، Wang R، Sun J، Ge X، et al. SARS-CoV-2 انفیکشن کے ذریعے حاصل کردہ انسانی بے اثر اینٹی باڈیز۔ فطرت 2020؛584:115-9۔

16. لیو ایل، وانگ پی، نیر ایم ایس، یو جے، ریپ ایم، وانگ کیو، وغیرہ۔ SARS-CoV-2 اسپائیک پر متعدد ایپیٹوپس کے خلاف طاقتور بے اثر اینٹی باڈیز۔ فطرت 2020؛584:450-6۔

17. Zost SJ، Gilchuk P، Case JB، Binshtein E، Chen RE، Nkolola JP، et al. SARS-CoV-2 کے خلاف ممکنہ طور پر غیر جانبدار اور حفاظتی انسانی اینٹی باڈیز۔ فطرت 2020; 584:443-9۔

18. Xu C، Wang Y، Liu C، Zhang C، Han W، Hong X، et al. SARS-CoV-2 trimeric spike glycoprotein کی تشکیلاتی حرکیات جو کہ ریسیپٹر ACE2 کے ساتھ کمپلیکس میں cryo-EM کے ذریعے انکشاف کیا گیا ہے۔ Sci Adv 2021؛ 7:eabe5575۔

19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et al. این ٹرمینل ڈومین اینٹی جینک میپنگ SARSCoV-2 کے لیے خطرے کی ایک سائٹ کو ظاہر کرتی ہے۔ سیل 2021؛184:2332-47.e16۔

20. Sauer MM، Tortorici MA، Park YJ، Walls AC، Homad L، Acton OJ، et al. وسیع کورونا وائرس کو نیوٹرلائزیشن کے لیے ساختی بنیاد۔ Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86۔

21. Tortorici MA، Beltramello M، Lempp FA، Pinto D، Dang HV، Rosen LE، et al. الٹرا پوٹینٹ انسانی اینٹی باڈیز متعدد میکانزم کے ذریعے SARS-CoV-2 چیلنج سے حفاظت کرتی ہیں۔ سائنس 2020؛ 370:950-7۔

22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. ایک انسانی مونوکلونل SARS-CoV اینٹی باڈی کے ذریعے SARS-CoV-2 کا کراس نیوٹرلائزیشن۔ فطرت 2020؛583:290-5۔

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, et al. SARS-CoV-2 اسپائک پروٹین پر ایک انفیکشن کو بڑھانے والی سائٹ جو اینٹی باڈیز کے ذریعے نشانہ بنتی ہے۔ سیل 2021; 184:3452-66.e18۔

24. Liu L، Wei Q، Lin Q، Fang J، Wang H، Kwok H، et al. اینٹی سپائیک IgG شدید SARS-CoV انفیکشن کے دوران میکروفیج ردعمل کو سکیونگ کرکے پھیپھڑوں کی شدید چوٹ کا سبب بنتا ہے۔ JCI انسائٹ 2019؛ 4:e123158۔

25. Li D، Edwards RJ، Manne K، Martinez DR، Sch€afer A، Alam SM، et al. SARS-CoV-2 انفیکشن کے وٹرو اور ان ویوو فنکشنز – اینٹی باڈیز کو بڑھانا اور بے اثر کرنا۔ سیل 2021؛184:4203-19.e32۔ 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS, et al. SARS-CoV-2 سپائیک پروٹین پر دو لکیری ایپیٹوپس COVID{10}} کے مریضوں میں اینٹی باڈیز کو بے اثر کرتے ہیں۔ نیٹ کمیون 2020؛ 11:2806۔

27. Zhang BZ، Hu YF، چن LL، Yau T، Tong YG، Hu JC، et al. COVID-19 مریضوں سے SARS-CoV-2 کے اسپائیک پروٹین پر ایپیٹوپس کی کان کنی۔ سیل ریس 2020؛ 30:702-4۔

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL, et al. ایپیٹوپ پروفائلنگ قدرتی انفیکشن میں SARS-CoV-2 کے مدافعتی ردعمل اور مقامی انسانی CoVs کے ساتھ کراس ری ایکٹیویٹی کے پابند دستخطوں کو ظاہر کرتی ہے۔ سیل ریپ 2021؛ 35: 109164۔

29. Shrock E، Fujimura E، Kula T، Timms RT، Lee IH، Leng Y، et al. COVID-19 مریضوں کی وائرل ایپیٹوپ پروفائلنگ کراس ری ایکٹیویٹی اور شدت کے باہمی تعلق کو ظاہر کرتی ہے۔ سائنس 2020؛ 370:eabd4250۔

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, et al. ReScan، ایک ملٹی پلیکس تشخیصی پائپ لائن، SARS-CoV-2- 2 اینٹیجنز کے لیے انسانی سیرا کو پین کرتی ہے۔ سیل ریپ میڈ 2020؛ 1:100123۔

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. اعلی ریزولوشن ایپیٹوپ میپنگ اور SARS-CoV-2 اینٹی باڈیز کی خصوصیت کووڈ-19 والے مضامین کے بڑے گروپوں میں۔ Commun Biol 2021؛ 4:1317۔

32. Li Y، Lai DY، Lei Q، Xu ZW، Wang F، Hou H، et al. SARS-CoV-2 اسپائیک پروٹین سے حاصل کردہ پیپٹائڈس کے لیے IgG ردعمل کا منظم جائزہ COVID-19 مریضوں کی نگرانی کے لیے۔ سیل مول امیونول 2021؛ 18:621-31۔

33. Li Y، Ma ML، Lei Q، Wang F، Hong W، Lai DY، et al. SARS-CoV-2 سپائیک پروٹین کا لکیری ایپیٹوپ لینڈ سکیپ 1,051 COVID-19 مریضوں سے بنایا گیا ہے۔ سیل ریپ 2021؛ 34:108915۔

34. وانگ ایچ، وو ایکس، ژانگ ایکس، ہوو ایکس، لیانگ ٹی، وانگ ڈی، وغیرہ۔ SARS-CoV-2 Proteome Microarray for Mapping CoVID-19 اینٹی باڈی تعاملات امینو ایسڈ ریزولوشن پر۔ ACS سینٹ سائنس 2020؛6:2238-49۔

35. Yi Z، Ling Y، Zhang X، Chen J، Hu K، Wang Y، et al. COVID-19 صحت یاب آبادی میں SARS-CoV-2 کے بی سیل لکیری ایپیٹوپس کی فنکشنل میپنگ۔ ایمرج مائکروبس انفیکٹ 2020؛9:1988-96۔

36. قومی صحت کمیشن اور روایتی چینی طب کی قومی انتظامیہ۔ نوول کورونا وائرس نمونیا کی تشخیص اور علاج کا پروٹوکول (آزمائشی ورژن 7)۔ چن میڈ جے (انگلش) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819۔

37. Li Y، Li CQ، Guo SJ، Guo W، Jiang HW، Li HC، et al. لانگیٹوڈنل سیرم آٹوانٹی باڈی ریپرٹوائر پروفائلنگ پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما میں سرجری سے وابستہ بائیو مارکر کی شناخت کرتی ہے۔ EBioMedicine 2020؛ 53:102674۔

38. Zhao J، Yuan Q، Wang H، Liu W، Liao X، Su Y، et al. نوول کورونا وائرس 2019 کی بیماری والے مریضوں میں SARSCoV-2 پر اینٹی باڈی ردعمل۔ کلین انفیکٹ ڈس 2020؛ 71: 2027-34۔

39. لوکاس سی، وونگ پی، کلین جے، کاسٹرو ٹی بی آر، سلوا جے، سندرم ایم، وغیرہ۔ طولانی تجزیوں سے شدید COVID-19 میں امیونولوجیکل غلط فائرنگ کا پتہ چلتا ہے۔ فطرت 2020؛ 584: 463-9۔

40. مور جے بی، جون سی ایچ۔ شدید COVID-19 میں سائٹوکائن ریلیز سنڈروم۔ سائنس 2020؛ 368:473-4۔

41. چن جے، میلون بی، لیولین ای، گراسو ایم، شیلٹن پی ایم ایم، اولینرس پی ڈی بی، وغیرہ۔ SARS-CoV-2 Replication-Transcription Complex میں Helicase-Polymerase Coupling کے لیے ساختی بنیاد۔ سیل 2020؛ 182:1560-73.e13۔

42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et al. SARS-CoV-2 انفیکشن کے لیے مضبوط بے اثر اینٹی باڈیز مہینوں تک برقرار رہتی ہیں۔ سائنس 2020; 370:1227-30۔

43. چی ایکس، یان آر، ژانگ جے، ژانگ جی، ژانگ وائی، ہاؤ ایم، وغیرہ۔ ایک غیر جانبدار انسانی اینٹی باڈی SARS-CoV-2 کے اسپائیک پروٹین کے N-ٹرمینل ڈومین سے منسلک ہے۔ سائنس 2020؛ 369:650-5۔

44. Tseng CT، Sbrana E، Iwata-Yoshikawa N، Newman PC، Garron T، Atmar RL، et al. SARS کورونا وائرس ویکسین کے ساتھ حفاظتی ٹیکوں سے SARS وائرس کے ساتھ چیلنج پر پلمونری امیونو پیتھولوجی ہوتی ہے۔ PLOS One 2012;7:e35421۔

45. بولس ایم، ڈیمنگ ڈی، لانگ کے، اگنی ہوتھرم ایس، وائٹمور اے، فیرس ایم، وغیرہ۔ ایک ڈبل غیر فعال شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم کورونا وائرس ویکسین چوہوں میں نامکمل تحفظ فراہم کرتی ہے اور چیلنج پر eosinophilic proinflammatory pulmonary ردعمل میں اضافہ کرتی ہے۔ جے ویرول 2011؛ ​​85:12201-15۔

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et al. ترمیم شدہ ویکسینیا وائرس کے ساتھ امیونائزیشن انقرہ کی بنیاد پر شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم کے خلاف ریکومبیننٹ ویکسین فیریٹس میں بڑھے ہوئے ہیپاٹائٹس سے وابستہ ہے۔ جے ویرول 2004؛78:12672-6۔

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, et al. شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم (SARS) سے وابستہ کورونا وائرس (SARS-CoV) نیوکلیو کیپسڈ پروٹین کے ساتھ پہلے سے حفاظتی ٹیکوں سے SARS-CoV سے متاثرہ چوہوں میں شدید نمونیا ہوتا ہے۔ J Immunol 2008;181:6337-48۔

48. Deming D، Sheahan T، Heise M، Yount B، Davis N، Sims A، et al. سنسنی خیز چوہوں میں ویکسین کی افادیت کو دوبارہ پیدا کرنے والے SARS-CoV بیئرنگ ایپیڈیمک اور زونوٹک اسپائک مختلف حالتوں کے ساتھ چیلنج کیا گیا۔ پی ایل او ایس میڈ 2006؛ 3:e525۔

49. Wang Q، Zhang L، Kuwahara K، Li L، Liu Z، Li T، et al. انسانوں میں امیونوڈومیننٹ سارس کورونا وائرس ایپیٹوپس نے غیر انسانی پریمیٹوں میں انفیکشن پر اثرات کو بڑھانے اور بے اثر کرنے والے دونوں اثرات مرتب کیے ہیں۔ ACS Infect Dis 2016;2: 361-76۔

50. اگروال AS، Tao X، Algaissi A، Garron T، Narayanan K، Peng BH، et al. غیر فعال مڈل ایسٹ ریسپائریٹری سنڈروم کورونا وائرس ویکسین کے ساتھ امیونائزیشن لائیو وائرس کے ساتھ چیلنج پر پھیپھڑوں کی امیونو پیتھولوجی کا باعث بنتی ہے۔ ہم ویکسین امیونودر 2016؛12:2351-6۔