میٹفارمین اے ایم پی کے/ بی ڈی این ایف/ پی آئی 3 کے پاتھ وے کو ایکٹیویشن کے ذریعے بڑھاپے میں اعصابی کمزوری کو دور کرتا ہے حصہ 1

عمر سے متعلق اعصابی کمزوری کو کم کرنا ایک چیلنج رہا ہے۔ ہم نے d-galactose-حوصلہ افزائی عمر بڑھنے میں میٹفارمین کے علاج کے اثرات کا جائزہ لیا۔ مزید برآں، ہم نے ممکنہ مالیکیولر میکانزم کا مطالعہ کیا جو میٹفارمین کے عمر مخالف اثرات کے لیے ذمہ دار ہو سکتے ہیں۔ تیس نر چوہوں کو یکساں طور پر 1—کنٹرول گروپ میں تقسیم کیا گیا تھا، جنھیں نمکین محلول ملا تھا، 2—ڈی-گیلیکٹوز (D-gal) گروپ، جس نے آٹھ ہفتوں تک گیسٹرک لاویج کے ذریعے ڈی-گیلیکٹوز (100 ملی گرام/کلوگرام/دن) حاصل کیا تھا، اور 3—d-galactose plus Metformin (D-gal plus Met) علاج شدہ گروپ، جس نے d-galactose plus metformin (200 mg/kg/day) آٹھ ہفتوں تک گیسٹرک لیویج کے ذریعے حاصل کیا۔ ایک اعصابی تشخیص کیا گیا تھا۔ سوزش، آکسیڈیٹیو تناؤ، اور BDNF بائیو مارکر کی پیمائش کی گئی۔ AMPK اور PI3K جین اظہار کا اندازہ کیا گیا۔ ہپپوکیمپل ٹشوز کو ہسٹوپیتھولوجیکل اور امیونو ہسٹو کیمیکل اسٹڈیز کے لیے الگ کیا گیا تھا۔ D-gal کے نتیجے میں اعصابی نقائص، اشتعال انگیز بائیو مارکرز کی بلندی، آکسیڈیٹیو تناؤ کے مارکر میں تبدیلی، BDNF میں کمی، اور Caspase-3 کے بڑھتے ہوئے اظہار کے ساتھ Synaptophysin اور Bcl2 کے اظہار میں کمی، اور AMPK اور PI3K جینز کے نیچے ریگولیشن کا نتیجہ ہوا۔ ہپپوکیمپس میں نیوروڈیجینریٹو تبدیلیاں موجود تھیں۔ میٹفارمین نے نمایاں طور پر ڈی-گل کی حوصلہ افزائی نیوروڈیجینریٹو تبدیلیوں کو بحال کیا۔ ہم نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ میٹفارمین نیوروئنفلامیشن کو کم کرنے، آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کرنے، اپوپٹوسس میں کمی کے ساتھ ساتھ synaptic پلاسٹکٹی کو فروغ دینے کے ذریعے عمر کی حوصلہ افزائی کے اعصابی خسارے کو دور کر سکتا ہے۔ یہ میکانزم AMPK/BDNF/PI3K پاتھ وے کو چالو کرنے کے ذریعے ثالثی کر سکتے ہیں۔

سیستانچ کا گلائکوسائیڈ دل اور جگر کے بافتوں میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بھی بڑھا سکتا ہے، اور ہر ٹشو میں لیپوفسن اور ایم ڈی اے کے مواد کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے، مختلف رد عمل آکسیجن ریڈیکلز (OH-، H₂O₂، وغیرہ) کو مؤثر طریقے سے ختم کر سکتا ہے اور DNA کو پہنچنے والے نقصان سے بچا سکتا ہے۔ OH ریڈیکلز کے ذریعے۔ Cistanche phenylethanoid glycosides میں آزاد ریڈیکلز کو صاف کرنے کی مضبوط صلاحیت ہوتی ہے، وٹامن C سے زیادہ کم کرنے کی صلاحیت، سپرم معطلی میں SOD کی سرگرمی کو بہتر بناتی ہے، MDA کے مواد کو کم کرتی ہے، اور سپرم کی جھلی کے کام پر ایک خاص حفاظتی اثر رکھتی ہے۔ Cistanche polysaccharides D-galactose کی وجہ سے تجرباتی طور پر حساس چوہوں کے erythrocytes اور پھیپھڑوں کے ٹشوز میں SOD اور GSH-Px کی سرگرمی کو بڑھا سکتے ہیں، نیز پھیپھڑوں اور پلازما میں MDA اور کولیجن کے مواد کو کم کر سکتے ہیں، اور elastin کے مواد کو بڑھا سکتے ہیں۔ ڈی پی پی ایچ پر اچھا اثر ڈالتا ہے، سینسنٹ چوہوں میں ہائپوکسیا کے وقت کو طول دیتا ہے، سیرم میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بہتر بناتا ہے، اور تجرباتی طور پر سنسنی والے چوہوں میں پھیپھڑوں کے جسمانی انحطاط میں تاخیر کرتا ہے، سیلولر مورفولوجیکل انحطاط کے ساتھ، تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ Cistanche میں اینٹی آکسیڈنٹ کی اچھی صلاحیت ہے۔ اور جلد کی بڑھتی ہوئی بیماریوں کو روکنے اور علاج کرنے کے لیے ایک دوا بننے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، Cistanche میں echinacoside میں DPPH فری ریڈیکلز کو ختم کرنے کی قابل ذکر صلاحیت ہے اور یہ رد عمل آکسیجن کی انواع کو ختم کر سکتا ہے، آزاد ریڈیکل-حوصلہ افزائی کولیجن کے انحطاط کو روک سکتا ہے، اور تھامین فری ریڈیکل ایون کے نقصان پر بھی اچھا مرمتی اثر رکھتا ہے۔

ANTI AGING کے بارے میں اردو میں Cistanche پر کلک کریں۔

【مزید معلومات کے لیے: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

مخففات

D-gal d-galactose

آر او ایس ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتی

IL-1 Interleukin-1

IL-1 Interleukin-1

IL-6 Interleukin-6

IL-10 Interleukin-10

TNF- ٹیومر نیکروسس عنصر

BDNF دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک عنصر

AMPK AMP- ایکٹیویٹڈ پروٹین کناز

PI3K/Akt Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B

RT-PCR ریورس ٹرانسکرپٹیز پولیمریز چین ری ایکشن

EPM ایلیویٹڈ پلس بھولبلییا

TL منتقلی میں تاخیر

ایم ڈی اے مالونڈیالڈہائڈ

ایس او ڈی سپر آکسائیڈ کو خارج کرنا

ایم پی ٹی پی مائٹوکونڈریل پارگمیتا عبوری تاکنا

H&E ہیماتوکسیلین اور eosin

iNOS Inducible نائٹرک آکسائیڈ سنتھیس

NF-κB نیوکلیئر فیکٹر-κB

LTP طویل مدتی پوٹینشن

جسمانی افعال، ذہنی چستی اور یادداشت کا مسلسل نقصان جو عمر بڑھنے کے ساتھ ہوتا ہے ایک کثیر جہتی عمل ہے جو نیورونل سیل کی موت 1 سے شروع ہو سکتا ہے۔ بہت سے ممالک میں متوقع عمر 20302 تک 85 سال سے تجاوز کر جائے گی۔ بوڑھوں کے معیار زندگی میں کمی اور اس سے منسلک معاشی اور ذاتی اخراجات کی وجہ سے، عمر سے متعلق علمی خرابیاں ایک اہم سماجی مسئلہ کے طور پر ابھری ہیں۔ اس کے علاوہ، دماغی عمر بڑھنا نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کی نشوونما کا بنیادی سبب ہے جو کثرت سے ناقابل واپسی ترقی کرتی ہیں۔ بڑھاپے سے متعلق اعصابی خرابی4 کے لیے فی الحال چند یا کوئی موثر علاج دستیاب نہیں ہیں۔

d-galactose (D-gal)، ایک مونوساکرائڈ جو دودھ کی مصنوعات میں وافر مقدار میں پایا جاتا ہے، عام طور پر خامروں کے ذریعے گلوکوز میں تبدیل ہوتا ہے۔ تاہم، طویل مدتی نظامی D-gal انتظامیہ صحت کو خاطر خواہ خطرات لاحق ہو سکتی ہے۔ پچھلی تحقیق نے تجویز کیا تھا کہ چوہوں کو مستقل نظامی ڈی گال ڈیلیوری انہیں بڑھاپے اور عمر سے متعلق نیوروڈیجینریٹو عوارض کے ماڈلز میں تبدیل کر سکتی ہے۔ D-gal ایجنگ ماڈل کے قدرتی عمر رسیدہ ماڈل پر کئی فوائد ہیں، بشمول عمر بڑھنے کے عمل پر مکمل توجہ مرکوز کرنے کی صلاحیت۔ قدرتی عمر رسیدہ ماڈل میں، ذیابیطس اور ہائی بلڈ پریشر سمیت عارضے متغیرات کو پیچیدہ بنا رہے ہیں۔

D-gal کے بارے میں خیال کیا جاتا ہے کہ وہ عمر رسیدہ انسانی دماغ میں نظر آنے والی حیاتیاتی کیمیکل بے ضابطگیوں کو پیدا کرتا ہے، جیسے کہ اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کی کم سرگرمی اور کولینرجک نیوران کی توجہ۔ اعلی درجے کی گلائی کیشن اینڈ پروڈکٹس، جو کہ عام عمر بڑھنے اور بہت سی بیماریوں کی پیتھوفیسولوجی دونوں سے منسلک ہیں، پروٹین امینو گروپس کے ساتھ ڈی-گال کے تعامل سے تیار ہوتی ہیں۔ D-gal فراہم کردہ جانوروں نے نیوروئنفلامیشن، مائٹوکونڈریل نقصان، اور ری ایکٹیو آکسیجن اسپیسز (ROS) کی نشوونما سے آکسیڈیٹیو نقصان کے ساتھ ساتھ جدید عادت میں مسائل، مقامی سیکھنے میں کمی، اور علمی افعال8۔

بوڑھوں میں علمی بگاڑ کا ایک اہم عنصر سوزش ہو سکتا ہے۔ انٹرلییوکن کی اعلی سطح-6، IL-1، ٹیومر نیکروسس فیکٹر-، اور سی-ری ایکٹیو پروٹین کو بوڑھوں میں بیماری اور اموات کے بڑھتے ہوئے خطرے سے جوڑا گیا ہے۔ چوہوں میں دائمی ڈی گیلیکٹوز کا علاج دماغی پرانتستا اور ہپپوکیمپس 1 میں نیورونل اپوپٹوٹک سگنلنگ پاتھ ویز کو چالو کرنے اور نیوروئنفلامیشن کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔

عمر بڑھنے کے نتیجے میں دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک فیکٹر (BDNF) میں کمی آتی ہے جو کہ سیکھنے اور یادداشت سے منسلک پلاسٹک کی تبدیلیوں میں مصروف ایک اہم پروٹین ہے اور ساتھ ہی نیورونل پھیلاؤ اور سالمیت کے لیے ایک اہم ثالث ہے۔

عمر بڑھنے میں تاخیر اور علمی کارکردگی کی حمایت کرنے والے ناول مرکبات کی دریافت سب سے بڑے چیلنجوں میں سے ایک بن گئی ہے۔ میٹفارمین خون – دماغی رکاوٹ میں تیزی سے داخل ہو جاتا ہے اور دماغ کے کئی علاقوں میں بنتا ہے، بشمول پٹیوٹری غدود اور ہپپوکیمپس 11۔ یہ ثابت کیا گیا ہے کہ طویل مدتی میٹفارمین انتظامیہ عمر سے متعلق پیتھولوجیکل پیچیدگیوں کے آغاز کو کم کرتی ہے اور انسانوں میں لمبی عمر کو بڑھاتی ہے۔ مزید برآں، میٹفارمین کو علمی خرابی اور طرز عمل کی خرابیوں کو بہتر بنانے کے لیے دکھایا گیا ہے جیسے ذیابیطس اور غیر ذیابیطیس دونوں افراد میں اضطراب 13,14 اور نیوروڈیجینریٹیو امراض کے مریضوں میں۔ تاہم، عمر سے متعلق اعصابی کمزوری کو بہتر بنانے میں میٹفارمین کے اثرات کے بنیادی میکانزم پیچیدہ ہیں اور ابھی تک پوری طرح سے سمجھ میں نہیں آئے ہیں۔

میٹفارمین کے نیورو پروٹیکٹو اثرات بنیادی طور پر AMP- ایکٹیویٹڈ پروٹین کناز (AMPK) سگنلنگ پاتھ وے 11 کو چالو کرنے سے منسوب ہو سکتے ہیں۔ AMPK ایکٹیویشن BDNF کے اظہار کو ریگولیٹ کرتا ہے، جس کا Synaptic ٹرانسمیشن اور میموری کو مضبوط بنانے میں اہم کردار ہوتا ہے۔ AMPK ایکٹیویشن کی اس اچھی طرح سے قائم شدہ خاصیت کے علاوہ، پچھلے نتائج نے یہ ثابت کیا ہے کہ میٹفارمین آکسیڈیٹیو تناؤ کی بحالی، نیورو انفلامیشن میں کمی، اور اپوپٹوسس کی روک تھام کے ذریعے یادداشت کو بڑھا سکتا ہے، جو کہ نیوروڈیجینریٹو عوارض کے علاقے میں اپنے طبی اشارے کو بڑھا سکتا ہے۔ میٹفارمین phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) راستے کا ایک مضبوط ایکٹیویٹر ہے جو apoptosis کو روکنے اور سیل کی بقا کو فروغ دینے میں ایک اہم اہم سگنلنگ راستہ ہے۔

میٹفارمین کے فوائد کو مدنظر رکھتے ہوئے، جس میں اس کی حفاظت، قابل استطاعت، اور قابل استعمال؛ ہم نے چوہوں میں ڈی گیلیکٹوز کی حوصلہ افزائی کی وجہ سے ہونے والی اعصابی خرابی کے خلاف میٹفارمین انتظامیہ کے نیورو پروٹیکٹو اثرات کا مطالعہ کیا۔ مزید برآں، ان حفاظتی اثرات کے بنیادی مالیکیولر میکانزم کی چھان بین کی گئی۔

مواد اور طریقے

جانور۔200-250 گرام وزنی Tirty Wister albino نر چوہوں کا استعمال فیکلٹی آف میڈیسن، Menoufa University، مصر میں ریسرچ ایتھیکل کمیٹی سے ضروری منظوری حاصل کرنے کے بعد کیا گیا (رجسٹریشن نمبر 10/2022 PHYS 9)۔ تجرباتی طریقہ کار نے ARRIVE رہنما خطوط پر عمل کیا۔ چوہوں کو تار میش پنجروں (80×40×30 سینٹی میٹر) میں رکھا گیا تھا۔ تمام جانوروں کو مطالعہ کے دورانیے کے دوران خوراک اور پانی تک مکمل رسائی فراہم کی گئی تھی جس کے بعد انہیں 2 ہفتوں تک مستقل ماحولیاتی حالات اور 12:{10}}گھنٹہ روشنی/گہرا چکر لگایا گیا تھا۔

تجرباتی نمونہ.جانوروں کو تصادفی طور پر تین گروہوں میں تقسیم کیا گیا تھا (10/گروپ):

1. کنٹرول گروپ: زبانی گیویج کے ذریعے نمکین محلول موصول ہوا۔

2. d-galactose (D-gal) گروپ: d-galactose (Sigma-Aldrich St. Louis, USA) کو 100 mg/kg جسمانی وزن کی خوراک میں نمکین محلول میں مسلسل آٹھ ہفتوں تک گیسٹرک لیویج کے ذریعے تحلیل کیا گیا

3. d-galactose plus Metformin (D-gal plus Met) علاج شدہ گروپ: حاصل شدہ d-galactose (D-gal گروپ میں اسی خوراک کے ذریعے) اور metformin (Sigma-Aldrich St. Louis, USA) کو نمکین محلول میں تحلیل کیا گیا 200 ملی گرام/کلوگرام/ دن کی خوراک میں گیسٹرک لیویج کے ذریعے مسلسل آٹھ ہفتوں تک16

آٹھ ہفتوں کی تکمیل کے بعد، تمام چوہوں کا اعصابی سلوک کا جائزہ لیا گیا۔ اس کے بعد، چوہوں کو بے ہوشی کی گئی اور گریوا کی لمبائی اور سندچیوتی کے ذریعہ قربانی دی گئی۔ دماغ نکالا گیا اور فاسفیٹ بفر نمکین (pH 7.4) سے دھویا گیا۔ بائیں نصف کرہ کا وزن کیا گیا تھا اور اسے دو حصوں میں تقسیم کیا گیا تھا۔ ان میں سے ایک بائیو کیمیکل تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا اور باقی آدھا RT-PCR کے مطالعہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہپپوکیمپل ٹشوز کے ہسٹوپیتھولوجیکل اور امیونو ہسٹو کیمیکل تشخیص کے لیے دائیں نصف کرہ کو 10 فیصد فارملین نمکین میں طے کیا گیا تھا۔

اعصابی سلوک کے ٹیسٹ۔ناول آبجیکٹ کی پہچان۔ نوول آبجیکٹ ریکگنیشن ٹیسٹ کا استعمال چوہوں کی ایک واقف ترتیب میں کسی نئی چیز کو پہچاننے کی صلاحیت کا اندازہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔ ہر چوہے کی تین دن کی جانچ ہوتی تھی، جس میں تین مراحل شامل تھے: عادت، تربیت اور جانچ۔ چوہوں کو رہائش کے مرحلے کے دوران کھلے میدان کے آلات (50 سینٹی میٹر × 50 سینٹی میٹر × 40 سینٹی میٹر) میں رکھا گیا تھا، اور انہیں بغیر کسی چیز کے موافقت کے لیے دس منٹ کا وقت دیا گیا تھا۔ تربیت کے مرحلے کے دوران ہر چوہے کو ایک چیمبر میں دو ایک جیسی اشیاء کے ساتھ پانچ منٹ تک رکھا گیا تھا۔ چوبیس گھنٹے کے بعد، ٹیسٹ کے مرحلے کے دوران ہر چوہے کو پانچ منٹ کے لیے چیمبر میں رکھا گیا، جس میں پرانی چیزوں میں سے ایک کو نئی چیز سے تبدیل کرنا شامل تھا۔ سٹاپ واچ کا استعمال آبجیکٹ کی تلاش کے دورانیے کے لیے کیا گیا تھا۔ امتیازی اشاریہ [=(ناول آبجیکٹ ایکسپلوریشن ٹائم–فیمیلیل آبجیکٹ ایکسپلوریشن ٹائم)/کل ایکسپلوریشن ٹائم×100 فیصد] چوہوں کی علمی کارکردگی کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ الکحل کھلے میدان اور چوہوں کے درمیان موجود اشیاء کو صاف کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔

مورس واٹر بھولبلییا۔ مورس واٹر میز کا استعمال مقامی سیکھنے اور یادداشت پر میٹفارمین کے اثرات کو جانچنے کے لیے کیا گیا تھا۔ ایک پول سٹینلیس سٹیل کا بنا ہوا تھا، جس کا قطر 210 سینٹی میٹر اور اونچائی 50 سینٹی میٹر تھی جس میں پانی کی سطح سے 1 سینٹی میٹر نیچے ڈوبے ہوئے فرار کا پلیٹ فارم بھی شامل تھا۔ پانی کو 24±1 ڈگری پر برقرار رکھا گیا تھا۔ حصول کے کام کی جانچ کے پانچ دنوں میں ہر دن چار آزمائشوں کے ساتھ جانچ کی گئی۔ ہر ٹرائل کے دوران خفیہ پلیٹ فارم تک پہنچنے کے لیے درکار وقت کو فرار میں تاخیر کے طور پر ریکارڈ کیا گیا تھا۔ خفیہ پلیٹ فارم کا پتہ لگانے کے لیے چوہوں کو زیادہ سے زیادہ 60 سیکنڈ کا وقت دیا گیا۔ 60 سیکنڈ کی زیادہ سے زیادہ وقت مقرر کی گئی تھی، اور چوہے کو دستی طور پر چھپے ہوئے پلیٹ فارم کی طرف رہنمائی کی گئی تھی۔ پانچویں دن آخری ٹرائل کے 24 گھنٹے بعد ایک ہی تحقیقاتی ٹرائل کیا گیا۔ پلیٹ فارم کو ہٹا دیا گیا اور چوہے کو ٹریننگ کواڈرینٹ کے مخالف کواڈرینٹ سے پول میں رکھا گیا۔ پھر، چوہے کو 60 سیکنڈ تک آزادانہ طور پر تیرنے کی اجازت دی گئی۔ ہدف کواڈرینٹ میں گزارا گیا وقت 19 ریکارڈ کیا گیا۔

ایلیویٹڈ پلس میز (EPM) ٹیسٹ۔ EPM چوہوں میں اضطراب جیسے رویے کا جائزہ لینے کے لیے ایک قائم شدہ تکنیک ہے۔ یہ لکڑی سے بنا تھا اور کھلے اور بند بازوؤں پر مشتمل تھا (لمبائی 50 سینٹی میٹر × چوڑائی 10 سینٹی میٹر)۔ دونوں بند بازو 40 سینٹی میٹر اونچی دیواروں سے بندھے ہوئے تھے۔ بازوؤں کو مرکزی مربع پلیٹ فارم (10×10 سینٹی میٹر) سے جوڑا گیا تھا۔ اپریٹس فرش سے 50 سینٹی میٹر اونچا تھا۔ ہر چوہے کو بند بازو کا سامنا کرنے والے آلات کے بیچ میں رکھا گیا تھا اور اسے پانچ منٹ تک آزادانہ طور پر حرکت کرنے کی اجازت دی گئی تھی۔ کھلے اور بند بازوؤں میں گزارے گئے وقت کو ریکارڈ کیا گیا۔ نیز، 20 میں اوپن آرمز اندراجات ریکارڈ کیے گئے۔ پہلے دن (حصول سیشن)، ہر چوہے کو 90 سیکنڈ تک ای پی ایم کے سامنے لایا گیا۔ چوہے کو بند بازو تک پہنچنے میں جو وقت لگتا ہے اسے TL کے طور پر ریکارڈ کیا گیا تھا۔ وہ چوہے جو 90 کی دہائی میں بند بازوؤں میں داخل ہونے میں ناکام رہے انہیں مطالعہ سے خارج کر دیا گیا۔ دوسرے دن (برقرار رکھنے کا سیشن)، ہر چوہے کو کھلے بازو میں ڈال دیا گیا، اور TL زیادہ سے زیادہ 90 s21 کے لیے ریکارڈ کیا گیا۔

بائیو کیمیکل تجزیہ۔دماغی بافتوں کو پی بی ایس محلول سے پرفیوز کیا گیا، پھر 5 ملی لیٹر کولڈ بفر فی گرام ٹشو میں ہم آہنگ کیا گیا۔ دماغی بافتوں کی سینٹرفیوگریشن 4000 rpm پر 15 منٹ کے لیے کی گئی، پھر سپرنٹنٹ کو ہٹا کر −80 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا جب تک کہ میلونڈیالڈہائیڈ (MDA) اور سوپر آکسائیڈ ڈسمیوٹیز (SOD) کی پیمائش روایتی رنگ میٹرک (QuantiChrom™، BioAssay Systems) کے ذریعے کی گئی۔ USA)، سیرم ٹیومر نیکروسس فیکٹر (TNF-)، Interleukin 10 (IL-10)، اور Brain-Drived Neurotropic Factor (BDNF) ELISA kit (Quantikine, Abcam company, Cambridge, UK) کا استعمال کرتے ہوئے مینوفیکچرر کے مطابق ہدایات

ریورس ٹرانسکرپٹیز پولیمریز چین ری ایکشن تکنیک (RT‑PCR) کا استعمال کرتے ہوئے AMPK اور PI3K جین اظہار کی مقداری پرکھ۔دماغی بافتوں کو امریکہ سے کیجین آر این ایزی پلس یونیورسل کٹ کا استعمال کرتے ہوئے کل RNA تنہائی کے لیے تیار کیا گیا تھا۔ پھر، آر این اے کے معیار اور پاکیزگی کی یقین دہانی کرائی گئی۔ RNA استعمال تک −80 ڈگری پر محفوظ تھا۔ اس کے بعد، پہلا مرحلہ صرف ایک سائیکل کے لیے اپلائیڈ بایو سسٹم 2720 تھرمل سائکلر (سنگاپور) کا استعمال کرتے ہوئے QuantiTect ریورس ٹرانسکرپشن کٹ، Qiagen کا استعمال کرتے ہوئے cDNA کی ترکیب تھا۔ GAPDH پرائمر RT-PCR کے رد عمل میں RNA لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیے گئے تھے۔ دوسرا مرحلہ cDNA ایمپلیفیکیشن تھا: cDNA کو SYBR گرین بیسڈ مقداری ریئل ٹائم پی سی آر میں AMPK کے رشتہ دار کوانٹیفیکیشن (RQ) اور SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit، USA کے ذریعے PI3K جین ایکسپریشن میں درج ذیل ڈیزائن کردہ پرائمر (مڈلینڈ، ٹیکساس) کا استعمال کرتے ہوئے استعمال کیا گیا۔ ): AMPK کے لیے Te فارورڈ پرائمر (TGCGTGTACGAAGGAAGAATCC) تھا۔ اور ریورس پرائمر (TGTGACTTCCAGGTCGGGGAGTT) تھا۔ PI3K کے لیے فارورڈ پرائمر (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA) تھا، اور ریورس پرائمر (GAAACTTTTTCCCACCACGA) تھا۔ آخر میں، اپلائیڈ بایو سسٹم 7500 سافٹ ویئر ورژن 2.0.1 کے ساتھ ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔ AMPK اور PI3K جین ایکسپریشن کا RQ تقابلی ∆∆Ct طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا، جہاں ہدف جینز (AMPK اور PI3K) mRNA کی مقدار کو ایک اینڈوجینس ریفرنس جین (GAPDH) میں معمول بنایا جاتا ہے اور ایک کنٹرول کے مطابق ہوتا ہے۔

دماغی بافتوں کی ہسٹوپیتھولوجیکل تشخیص۔ہسٹولوجیکل معائنہ۔ دماغی بافتوں کو 10 فیصد فارملین محلول میں طے کیا گیا تھا، پیرافین میں سرایت کیا گیا تھا، اور 5 μm موٹائی کے سیریل کورونل حصے حاصل کیے گئے تھے۔ اس کے بعد دماغ کے ہپپوکیمپس کے حصوں کو ہلکے خوردبین سے جانچنے کے لیے ہیماتوکسیلین اور ایوسین (H&E) سے داغ دیا گیا۔

ہپپوکیمپس کا امیونو ہسٹو کیمیکل داغ۔ کیسپیس کے امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ-3 (CAT نمبر: ab32351, Abcam company 152 Grove Street Waltham, M02453, USA) اور Synaptophysin (CAT نمبر: ab32127، Abcam کمپنی 152 Grove Street Waltham, USA4 نے M03 کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا) مونوکلونل اینٹی باڈیز Bcl-2 (CAT نمبر: ab59348, Abcam company 152 Grove Street Waltham, M02453, USA) کے لیے یہ خرگوش پولی کلونل اینٹی باڈیز کے استعمال سے ہوا۔ انہیں ایک شیشی میں موصول ہوا تھا جس میں 1 ملی لیٹر اینٹی باڈی تھی۔ اینٹی کیسپیس-3، اینٹی سیناپٹوفسن، اور اینٹی بی سی ایل-2 کو بالترتیب 1:50، 1:400 اور 1:100 میں پتلی مقدار میں استعمال کیا گیا۔ حصوں کو 5 µm پر کاٹا گیا تھا اور ایک خودکار LINK 48 امیونوسٹینر (Dako, Agilent Technologies Inc, Santa Clara, USA) کے ذریعہ داغ دیا گیا تھا۔ گرمی کی بازیافت کے لیے، امیونوسٹینر کے ذریعے سائٹریٹ بفر کا استعمال کیا جاتا تھا۔ سلائیڈز کو پرائمری ڈلیٹڈ اینٹی باڈیز کے ذریعے خود بخود داغ دیا گیا تھا۔ رد عمل کے لیے مثبت کنٹرول بالترتیب عام انسانی ٹانسل، ہیومن لبلبہ، اور فولیکولر اڈینوما کے لیے مخصوص پیرافین ایمبیڈڈ سیکشنز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا غیر مدافعتی سیرم کے ساتھ بنیادی اینٹی باڈیز کو تبدیل کرکے منفی کنٹرول کیے گئے تھے۔

ہسٹوپیتھولوجی اور امیونو ہسٹو کیمیکل مارکر (کیسپیس-3، سیناپٹوفسن، اور بی سی ایل-2) کا اندازہ ہپپوکیمپس کے مختلف علاقوں بشمول CA1، CA2، اور CA3 میں کیا گیا تھا۔

شماریاتی تجزیہ.نتائج کو اوسط ±معیاری انحراف (SD) کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ تغیرات کا تجزیہ (ANOVA) مختلف گروپوں کے شماریاتی تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا، Origin® سافٹ ویئر اور امکانات کے امکانات (p اقدار) کا استعمال کرتے ہوئے۔ پی اقدار<0.05 were considered significant.

اخلاقیات کی منظوری اور شرکت کے لیے رضامندی۔یہ کام فیکلٹی آف میڈیسن، مینوفہ یونیورسٹی، مصر کی اخلاقی کمیٹی کے رہنما خطوط کے ذریعے اور منظور کیا گیا تھا۔

نتائج

اعصابی سلوک کے ٹیسٹ۔ناول آبجیکٹ ٹیسٹ کے بارے میں، کنٹرول گروپ (-37.16±3.31 فیصد بمقابلہ 30.16±2.92 فیصد، بالترتیب، P<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group  (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).

مورس بھولبلییا ٹیسٹ کے بارے میں، کنٹرول گروپ (58.16 ± 1.94، 4{ {19}}.62±1.33، 32.75±1.10، 24.37±1.58، اور 15.29±0.98 s بمقابلہ 40.16±2.92، 25.16±1.15، 17.04±1.15، 17.04±1.08، .5±1.08±. 86 بالترتیب، پی<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75,   and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s,   respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group.  However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).

ایلیویٹڈ پلس میز ٹیسٹ میں، چوہوں کے کھلے بازوؤں میں گزارے گئے دورانیے کی اوسط قدر D-gal گروپ میں نمایاں طور پر کم تھی جب کنٹرول گروپ (60±6.54 s بمقابلہ 90.83±3.48 s، بالترتیب ، پی<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).

بائیو کیمیکل ٹیسٹ۔دماغ کے ایم ڈی اے کی سطح کی اوسط قدر نمایاں طور پر زیادہ تھی، جب کہ کنٹرول گروپ (70±3.23 nmol/mg پروٹین اور 13.05±1) کے مقابلے D-gal گروپ میں دماغی SOD لیول کی اوسط قدر نمایاں طور پر کم تھی۔ }} U/mg پروٹین بمقابلہ 33.76±2.13 nmol/mg پروٹین اور بالترتیب 29.11±4.34 U/mg پروٹین، P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and  21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).

دماغ کی TNF سطح کی اوسط قدر نمایاں طور پر زیادہ تھی، جب کہ کنٹرول گروپ (67.50 ± 10.03 pg/mg پروٹین اور 72.91 ±8.45 pg/mg پروٹین بمقابلہ 16.61 ±1.21 pg/mg پروٹین اور 157.23 ±12.46 pg/mg پروٹین، بالترتیب، P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein,   respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).

کنٹرول گروپ (125.72±4.17 pg/mg پروٹین بمقابلہ 225.20±5.52 pg/mg پروٹین، بالترتیب، P<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).

مقداری RT‑PCR (qRT‑PCR)۔ AMPK اور PI3k جینز کا اظہار (0.52±0.11 اور 0.37±0.03، بالترتیب، P<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the  D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) جب کنٹرول گروپ کے ساتھ موازنہ کیا جائے (تصویر 6)۔

ہسٹوپیتھولوجی۔کنٹرول گروپ میں ہپپوکیمپل ٹشو کے H&E داغ نے غیر معمولی پیتھولوجیکل تبدیلیوں کا انکشاف کیا۔ D-gal گروپ نے بڑے پیمانے پر ورم اور گلیوسس کے ساتھ بہت زیادہ نیورونل انحطاط اور اپوپٹوٹک لاشیں دکھائیں۔ تاہم، ڈی-گیل پلس میٹ گروپ کے حصوں میں کچھ نیورونل انحطاط اور ہلکے ورم اور ہلکے فوکل گلائیوسس کے ساتھ کچھ اپوپٹوٹک جسم دکھائے گئے (تصویر 7)۔

امیونو ہسٹو کیمسٹری. امیونو ہسٹو کیمیکل نتائج نے انکشاف کیا کہ ہپپوکیمپل ٹشو میں Synaptophysin اظہار کی H اسکور ویلیو نمایاں طور پر کم تھی (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).

ہپپوکیمپل ٹشو میں کیسپیس-3 اظہار کی H اسکور ویلیو نمایاں طور پر زیادہ تھی (P<0.05) in the  D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group  (Fig. 9). 

ہپپوکیمپل ٹشو میں Bcl-2 اظہار کی H اسکور ویلیو نمایاں طور پر کم تھی (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).

بحث

اوسط متوقع عمر میں اضافہ بوڑھوں میں بیماری کا خطرہ بڑھاتا ہے، خاص طور پر علمی میدان میں جو دماغ میں اعصابی نقصان کی وجہ سے کم از کم جزوی طور پر ہو سکتا ہے۔ یہ اچھی طرح سے قبول کیا جاتا ہے کہ ڈی-گیلیکٹوز کا طویل مدتی انجیکشن عمر بڑھنے اور معمولی اعصابی نقصان اور یادداشت کی خرابیوں میں معاون ہے۔ چونکہ D-galinduced عمر بڑھنے کے ساتھ neurodegeneration بھی ہوتا ہے، یہ عمر سے وابستہ نیوروڈیجنریشن میں شامل مالیکیولر میکانزم کا مطالعہ کرنے اور نئے علاج کے طریقوں کی جانچ کے لیے ایک مثالی نمونہ ہو سکتا ہے۔

ہمارے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ D-gal کی دائمی انتظامیہ نے چوہوں میں نیاپن کی حوصلہ افزائی کی تلاش کے طرز عمل اور ورکنگ میموری کو خراب کیا۔ یہ ناول آبجیکٹ، مورس واٹر میز، اور ایلیویٹڈ پلس میز ٹیسٹ کے نتائج میں واضح تھا۔ یہ نتائج دیگر رپورٹ شدہ مطالعات کے مطابق تھے۔ دوسری جانب؛ D-gal گروپ کے مقابلے میں میٹفارمین کے ساتھ علاج نے کام کرنے والی یادداشت اور نیاپن کی ترجیح کو بہتر بنایا۔ ہمارے نتائج کی حمایت کرتے ہوئے، ایک پچھلی تحقیق میں بتایا گیا ہے کہ میٹفارمین نے اسٹریپٹوزوٹوسن سے متاثرہ ذیابیطس کے چوہوں میں قلیل مدتی یادداشت کو بہتر بنایا ہے۔ یہ اچھی طرح سے دستاویزی ہے کہ عمر بڑھنے کا تعلق نہ صرف علمی افعال میں کمی کے ساتھ ہے بلکہ جذباتی تبدیلیوں کے ساتھ بھی ہے جس میں اضطراب جیسا رویہ بھی شامل ہے جس کے نتیجے میں فنکشنل خرابی ہوتی ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، EPM ٹیسٹ کے نتائج نے کنٹرول گروپ کے مقابلے میں D-gal گروپ میں اضطراب جیسا رویہ ظاہر کیا۔ جبکہ میٹفارمین کے ساتھ علاج نے اضطراب جیسا رویہ کم کیا۔

موجودہ مطالعے سے انکشاف ہوا ہے کہ D-gal کی زبانی انتظامیہ کی وجہ سے ہونے والی اعصابی تبدیلیاں دماغ کے آکسیڈیٹیو اسٹریس مارکروں میں خلل کے ساتھ تھیں۔ دماغی ٹشو ہوموجنیٹ میں ایم ڈی اے کی سطح کی اوسط قدر نمایاں طور پر زیادہ تھی، جب کہ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں ڈی-گال گروپ میں اینٹی آکسیڈینٹ انزائم ایس او ڈی کی سرگرمی نمایاں طور پر کم تھی۔ اسی طرح کے نتائج پہلے 23,26 بتائے گئے تھے۔ D-gal پروٹین کے فن تعمیر میں مختلف مفت امائنز کے ساتھ غیر انزیمیٹک گلائیکیشن کے ذریعے تعامل کرتا ہے، جس کے نتیجے میں جدید ترین گلائی کیشن پروڈکٹس تیار ہوتے ہیں۔ اس کے نتیجے میں ROS کی نسل پیدا ہوتی ہے جو ڈی این اے، لپڈز اور پروٹین کو آکسیڈیٹیو نقصان کے ذریعے دماغی عمر بڑھاتا ہے۔ D-gal کی دائمی انتظامیہ کی وجہ سے یادداشت میں کمی اور سیکھنے کی خرابی کو آزاد ریڈیکلز کی نسل سے منسوب کیا جا سکتا ہے، جس کے نتیجے میں نیوروجنسیس کی خرابی اور بالآخر، نیوروڈیجنریشن27۔ مزید یہ کہ دماغ کے نیوران زیادہ لپڈ مواد کی موجودگی اور زیادہ آکسیجن کی کھپت کی وجہ سے آکسیڈیٹیو تناؤ کے لیے زیادہ حساس ہوتے ہیں۔

اس کے برعکس، میٹفارمین انتظامیہ نے ریڈوکس توازن کو نمایاں طور پر بحال کیا۔ شواہد نے ثابت کیا کہ میٹفارمین مائٹوکونڈریل پارمیبلٹی ٹرانزیشنل پور (ایم پی ٹی پی) کو روک سکتا ہے اور آر او ایس کی پیداوار اور لپڈ پیرو آکسیڈیشن کو کم کر سکتا ہے۔ لہٰذا، یہ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ میٹفارمین کے مخالف عمر رسیدہ اثر کو ممکنہ طور پر اس کے اینٹی آکسیڈیٹیو دفاع کے ذریعے ثالثی کیا جا سکتا ہے۔

آکسیڈیٹیو تناؤ کے علاوہ، سوزش D-gal علاج کا ایک اہم عمر بڑھنے کا طریقہ کار بھی ہے۔ D-gal ROS کی نسل کو فروغ دیتا ہے جو سوزش کے راستوں کو چالو کرتا ہے۔ دائمی نیورو انفلامیشن اور پرو سوزش سائٹوکائنز کا اخراج عمر بڑھنے کی علامت ہیں۔ ایک معاہدہ ہے کہ سوزش والی سائٹوکائنز آکسیڈیٹیو تناؤ میں شامل ہیں۔ TNF-، IL-6، اور IL-1 آکسیڈیٹیو تناؤ کی نشوونما اور بڑھنے میں ضروری ہیں۔ یہ سائٹوکائنز ROS کے ساتھ وابستہ ہیں اور نیوکلیئر فیکٹر-κB (NF-κB) کو نیوکلئس میں منتقل کرنے کے لیے فعال کرتی ہیں اور iNOS اور COX2 جیسے سوزش کے حامی جینوں کے اظہار کو منظم کرتی ہیں، جو سوزش اور مدافعتی ردعمل میں ملوث ہیں، اور اس کے نتیجے میں فائبروسس، اپوپٹوسس، اور شدید مرحلے کے ردعمل جو اعضاء کو نقصان پہنچاتے ہیں۔ مذکورہ بالا ڈیٹا ہمارے نتائج سے مطابقت رکھتا تھا، کیونکہ TNF-alpha کی سطح نمایاں طور پر زیادہ تھی، اور IL-10 D-gal گروپ میں کنٹرول گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھی۔

دوسری طرف، میٹفارمین کے ساتھ علاج کے نتیجے میں ڈی-گال گروپ کے مقابلے میں سوزش کے نشانات میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ میٹفارمین کے سوزش آمیز اثرات کو AMPK سگنلنگ کی ایکٹیویشن سے منسوب کیا جا سکتا ہے، جو NF-κB29 کی روک تھام کے ذریعے سوزش کے رد عمل کو دباتا ہے۔ اس کے علاوہ، اس نے دماغ میں سوزش والی سائٹوکائنز کی پیداوار اور مائکروگلیئل ایکٹیویشن کو کم کیا جس کے نتیجے میں، آکسیڈیٹیو تناؤ کم ہوتا ہے۔

میٹفارمین کے عمل کے تحت مالیکیولر میکانزم کو مزید سمجھنے کے لیے، ہم نے AMPK اور PI3k کے پروٹین ایکسپریشنز کا جائزہ لیا۔ ہمارے مطالعے سے انکشاف ہوا ہے کہ AMPK کے اظہار کو کنٹرول گروپ کے مقابلے میں D-gal گروپ میں نمایاں طور پر نیچے ریگولیٹ کیا گیا تھا، جب کہ D-gal گروپ کے مقابلے میں میٹفارمین کے علاج والے گروپ میں اس کی سطح کو نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ پچھلے مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ عمر کے ساتھ AMPK ایکٹیویشن اور AMPK ردعمل کم ہوتا ہے، جو بدلے ہوئے میٹابولک ضابطے کی وضاحت کر سکتا ہے، جس کے نتیجے میں آٹوفجی میں کمی اور آکسیڈیٹیو تناؤ میں اضافہ ہوتا ہے۔ میٹفارمین کو Tr-17232 میں AMPK کے فاسفوریلیشن کو بڑھا کر AMPK کو فعال کرنے کے لیے پایا گیا۔ AMPK میٹفارمین کا بنیادی ہدف ہے اس کے ادراک میں خلل کے خلاف حفاظتی کام کے لیے۔ Ghadernezhad et al. نے رپورٹ کیا کہ AMPK کی میٹفارمین حوصلہ افزائی ایکٹیویشن نے ہپپوکیمپل نیورونز میں BDNF/P70S6K پاتھ وے کو چالو کیا تاکہ عالمی دماغی اسکیمیا/ریپرفیوژن چوہا ماڈل میں غیر فعال اجتناب کے کام میں میموری کی تشکیل کو بڑھایا جا سکے۔ BDNF ایکٹیویشن اعصابی افعال جیسے سیکھنے، میموری، Synaptic ٹرانسمیشن، اور پلاسٹکٹی 33 کے ضابطے میں ایک اہم کردار رکھتی ہے۔ متعدد مطالعات نے یہ ثابت کیا کہ AMPK طویل مدتی صلاحیت (LTP) کے ماڈیولر کے طور پر کام کر سکتا ہے، اور یہ میموری کی تشکیل کے لیے ضروری ہے۔ . لہذا، ہمارے مطالعہ میں میٹفارمین کی حوصلہ افزائی میموری کی بہتری AMPK سگنلنگ ایکٹیویشن کے ذریعے ثالثی کی جا سکتی ہے۔

【مزید معلومات کے لیے: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】