MiR-214 PTEN/AKT/mTOR-ریگولیٹڈ آٹوفجی کے ذریعے سیپسس سے متاثرہ شدید گردے کی چوٹ کو بہتر بناتا ہے۔

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصہ پچھلے مطالعات نے تجویز کیا ہے کہ آکسیڈیٹیو تناؤ اور آٹوفیجی کے نتائج شدید ہوتے ہیں۔گردے کی چوٹ (AKI) سیپسس کے دوران اور مائیکرو آر این اے (miR) -214 کے تحفظ میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔گردےآکسیڈیٹیو تناؤ کا شکار۔ موجودہ مطالعہ کا مقصد یہ جانچنا ہے کہ آیا miR-214 کی بحالی کا تعلق سیپسس میں آٹوفجی سے ہے۔ سیکل لیگیشن اور پنکچر (سی ایل پی) کے ماؤس ماڈل میں آٹوفجی کے کردار کی تحقیقات کی گئیں۔ ریورس ٹرانسکرپشن - مقداری پولیمریز چین ری ایکشن (RT‑qPCR) miR-214 کے اظہار کا تجزیہ کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ کی ساخت اور کامگردےچوہوں سے کٹائی کا جائزہ لیا گیا۔گردہامیونو ہسٹو کیمیکل، امیونو فلوروسینٹ اور ویسٹرن بلوٹنگ کے ساتھ آٹوفیجی کی سطح کا پتہ چلا۔ یہ پایا گیا کہ miR-214 کی سطح کو روک کر سیپٹک چوہوں میں AKI کو کم کر سکتا ہے۔گردہآٹوفجی مزید برآں، miR-214 نے PTEN اظہار کو خاموش کرکے آٹوفجی کو روکا۔گردہسیپٹک چوہوں کے ٹشوز۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ miR‑214 نے PTEN/AKT/mTOR پاتھ وے کے ضابطے کے ذریعے آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کر کے اور آٹوفجی کو روک کر CLP-حوصلہ افزائی AKI کو بہتر کیا۔

مطلوبہ الفاظ:مائیکرو آر این اے 214، سیپسس، گردے کی شدید چوٹ، آٹوفجی، رینل

تعارف  شدیدگردے کی چوٹ(AKI) سیپسس کی سب سے عام پیچیدگیوں میں سے ایک ہے اور 40-50 فیصد سیپٹک مریضوں میں ہوتی ہے، جس کی شرح اموات 60 فیصد (1) تک ہوتی ہے۔ تاہم، سیپسس سے متاثرہ AKI کا روگجنن ابھی تک واضح نہیں ہے۔ آٹوفیجی کو سیپسس سے متاثرہ AKI میں کلیدی کردار ادا کرنے کی اطلاع دی گئی ہے اور سیپسس (2,3) کے دوران AKI کی نشوونما میں آٹوفجی کے نتائج کو روکنا ہے۔ پچھلے مطالعات (4,5) نے اس بات کی تصدیق کی ہے کہ سیپسس متعدد اعضاء میں آٹوفجی کو متحرک کرتا ہے، بشمولگردہ(6) اور آٹوفیجک عمل خراب مائٹوکونڈریا اور آکسیڈیٹیو تناؤ (7) کو ہٹانے میں شامل ہیں۔ تاہم، ضرورت سے زیادہ آٹوفیجی ناپسندیدہ اور نقصان دہ سیل کی موت کا سبب بن سکتی ہے (8)۔ لہذا، آٹوفیجی کی ایک اعتدال پسند سطح سیپسس سے متاثرہ AKI کو کم کرنے کی کلید ہے۔ پچھلے مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ miR-214 apoptosis (9) کو روک کر اسکیمیا-reperfusion-حوصلہ افزائی AKI کو بہتر بناتا ہے اور miR-214 ذیابیطس نیفروپیتھی میں رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) / AKTOR / AKT وے کے ذریعے آکسیڈیٹیو تناؤ کو دباتا ہے۔ موجودہ مطالعے سے معلوم ہوا ہے کہ miR-214 آٹوفیجی (11) کو روک کر چوہوں میں سیپسس سے متاثرہ مایوکارڈیل dysfunction کو کم کر سکتا ہے۔ تاہم، آیا miR-214 سیپسس سے متاثرہ AKI کو بہتر بنا سکتا ہے اس کی وضاحت کرنا باقی ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، یہ قیاس کیا گیا تھا کہ miR-214 آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کرکے اور PTEN/AKT/mTOR راستے کے ضابطے کے ذریعے آٹوفجی کو روک کر CLP-حوصلہ افزائی AKI کو کم کرتا ہے۔

CISTANCHE گردے/ گردوں کی بیماری کو بہتر کرے گا۔

مواد اور طریقے

جانور۔موجودہ مطالعہ میں کل 100 کنمنگ نر چوہے (وزن، 20.40 ± 2.92 جی؛ عمر، 6-8 ہفتے) ہیبی میڈیکل یونیورسٹی (شیجیازوانگ، چین) کے میڈیکل لیبارٹری اینیمل سینٹر کے ذریعہ فراہم کیے گئے تھے۔ تمام چوہوں کو 24˚C پر 50 فیصد نمی کے ساتھ 12‑h روشنی/تاریک چکر کے مطابق بنایا گیا تھا اور انہیں تجربات سے 1 ہفتہ پہلے یا اس سے زیادہ یا اس کے برابر خوراک اور پانی تک مفت رسائی دی گئی تھی۔ تمام تجرباتی طریقہ کار نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ کے رہنما خطوط (NIH اشاعت نمبر 85‑23، نظر ثانی شدہ 1996) اور کینگزہو سنٹرل ہسپتال کی ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹیوں کی منظوری (منظوری نمبر 2017‑020‑) کے مطابق سختی سے انجام دیئے گئے تھے۔ 01)۔ تمام سرجری اینستھیزیا کے تحت کی گئی تھیں اور تکلیف کو کم کرنے کی ہر ممکن کوشش کی گئی تھی۔

Cecal ligation and puncture (CLP)۔سی ایل پی چوہوں پر مورائن سیپسس ماڈل بنانے کے لئے انجام دیا گیا تھا ، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (12)۔ isoflurane inhalation (3 فیصد پر حوصلہ افزائی اور 0.5 فیصد پر برقرار رکھا گیا) کے ذریعے بے ہوشی کے بعد، ایک 1 سینٹی میٹر مڈ لائن چیرا کاٹا گیا۔ بے نقاب سیکم (سرے سے 1 سینٹی میٹر کا فاصلہ) کو 23 گیج کی سوئی کا استعمال کرتے ہوئے دو پنکچروں سے باندھا گیا تھا۔ سیکم نے آہستہ سے تھوڑی مقدار میں فضلہ نکالا اور اسے اپنی جسمانی حالت میں واپس رکھ دیا گیا۔ پیٹ کی دیوار 3‑0 ریشم کی چوٹی کے ساتھ تہوں میں سینچی ہوئی تھی۔ طریقہ کار کے بعد، 1 ملی لیٹر 0.9 فیصد نمکین کو نیچے کے نیچے انجیکشن لگایا گیا۔ چوہوں کو صرف پانی تک مفت رسائی فراہم کی گئی۔ شام ماڈل چوہوں کو اسی طرح چلایا گیا جس طرح سی ایل پی ماڈل کے بغیر سی ایل پی کے۔

تجرباتی نمونہ. چوہوں (n=6 برائے شمع سرجری اور CLP) کو تصادفی طور پر سات گروپوں کو تفویض کیا گیا تھا: شام گروپ، CLP گروپ، اڈینو وائرس (Ad)-گرین فلوروسینٹ پروٹین (GFP) پلس CLP گروپ، Ad-miR‑214 پلس CLP گروپ , anti-miR‑214 پلس CLP گروپ، PTEN inhibitor plus CLP گروپ اور Ad‑miR‑214 پلس PTEN inhibitor plus CLP گروپ۔ شام گروپ کے چوہوں کو اسی طریقہ کار کے سامنے لایا گیا تھا لیکن سیکم کے ligation اور پنکچر کے بغیر۔ دوسرے گروپوں میں چوہوں نے سیکل لیگیشن اور سوراخ حاصل کیا۔ تمام چوہوں کو خون، پیشاب اور جمع کرنے کے لیے isoflurane سانس کے ذریعے جلدی سے بے ہوشی کی گئی۔گردہنمونے آخری علاج کے 24 گھنٹے بعد۔

اڈینو وائرس کی ثالثی ایڈ-miR-214، anti-miR-214، یا Ad-GFPVivo اور PTEN inhibitor انجیکشن میں جین کی منتقلی۔  Ad‑miR‑214، anti‑miR‑214، یا Ad‑GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) کو CLP سے 4 دن پہلے چوہوں کے پیٹ کی گہا میں پہنچایا گیا تھا۔ مختصراً، چوہوں کو isoflurane سانس کے ذریعے بے ہوشی کی گئی۔ ایک کیتھیٹر جس میں 200 µl اڈینو وائرس (2x1011 pfu، miR‑214، anti-miR‑214، یا Ad‑GFP کا اظہار کرتا ہے) کو عام چوہوں کو انٹراپریٹونیل انجیکشن کے ذریعے لگایا گیا تھا۔ PTEN inhibitor (VO‑OHpic، intraperitoneal، Sigma‑Aldrich؛ Merck KGaA) CLP چوہوں کو دیا گیا تھا جنہوں نے 10 µg/kg کی ایک خوراک پر انٹراپیریٹونیئل انجیکشن کے ذریعے اینٹی miR‑214 حاصل کیا تھا۔ .

گردے کی تقریب کا اندازہ۔ خون کے نمونے چوہوں کے دل سے حاصل کیے گئے، اس کے بعد سیرم اکٹھا کرنے کے لیے سینٹرفیوگریشن (کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ 3،000 xg پر)۔ خون میں یوریا نائٹروجن (BUN) اور سیرم کریٹینائن (Cr) کے سیرم کی سطحوں کا تعین Hitachi 7600 خودکار تجزیہ کار (Hitachi, Ltd.) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ ELISA کی سطح کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔گردے کی چوٹپیشاب کے نمونوں میں مالیکیول‑1 (KIM‑1؛ بلی نمبر RKM100؛ R&D Systems, Inc.) اور نیوٹروفیل جیلیٹنیز سے وابستہ لیپوکلن (NGAL؛ بلی نمبر DY3508؛ R&D Systems, Inc.)۔

سیرم سوزش سائٹوکائن کے لئے پرکھ۔سیرم TNF‑ (cat. no. H052) اور IL‑6 (cat. no. H007) کا معائنہ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق تجارتی ELISA کٹس (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) کے ذریعے کیا گیا۔آکسیڈیٹیو تناؤ مارکر کی پیمائش. متعلقہ پرکھ کٹ (نانجنگ جیانچینگ بائیو انجینیئرنگ انسٹی ٹیوٹ، نانجنگ، چین) کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق میلونڈیلڈہائڈ (MDA) کی سطح کی پیمائش کرنے اور سپر آکسائیڈ خارج کرنے والے (SOD) کی سرگرمی کو جانچنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

ہسٹولوجی اور نلی نما چوٹ کا اسکور۔ تمام چوہوں کا نشانہ بنایا گیا۔گردہCLP کے 24 گھنٹے بعد اینستھیزیا کے تحت پرفیوژن۔ دیگردہنمونوں کو 4 فیصد پیرافارمیلڈہائڈ میں 72 گھنٹے کے لیے 4˚C پر طے کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ٹشو کے نمونوں کو ایتھنول سلوشنز کی ایک درجہ بندی کی سیریز میں پانی کی کمی کی گئی تھی، جو پیرافین میں سرایت کر گئے تھے اور 4‑µm حصوں میں کٹے ہوئے تھے۔ حصوں (4 µm) کو مائکروٹوم کا استعمال کرتے ہوئے کاٹا گیا تھا اور ہسٹولوجیکل معائنہ کے لئے کمرے کے درجہ حرارت پر ٹشو کے حصوں کو ہیماتوکسیلین (5 منٹ) اور eosin (1 منٹ) سے داغ دیا گیا تھا۔ مائیکروسکوپ (BX51، اولمپس کارپوریشن) کا استعمال کرتے ہوئے سلائیڈوں کی جانچ اور درجہ بندی کی گئی۔گردوںtissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 فیصد (13)۔

ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM)۔تازهگردےفاسفیٹ بفرڈ نمکین میں دھویا جاتا ہے، اور 1 ملی میٹر کیوبز میں کاٹا جاتا ہے اور ترتیب وار 2.5 فیصد گلوٹرالڈہائڈ میں 4˚C پر 24 گھنٹے کے لیے طے کیا جاتا ہے۔ حصوں کو 4˚C پر 2 گھنٹے کے لیے 1 فیصد اوسمیم ٹیٹرو آکسائیڈ میں ڈبو دیا گیا، درجہ بندی والے ایتھنول میں پانی کی کمی اور epoxyresin میں سرایت کر دی گئی۔ آخر میں، الٹراتھن سیکشنز (60 nm) کو 60 منٹ کے لیے 20˚C پر یورینیل ایسیٹیٹ اور لیڈ سائٹریٹ کے ساتھ دگنا کر دیا گیا۔ یہ مشاہدہ الیکٹران مائیکروسکوپی فلم 4489 (ESTAR موٹی بیس؛ کوڈک) کا استعمال کرتے ہوئے 80 kV پر ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ (Tecnai؛ Hitachi, Ltd.) پر کیا گیا۔

امیونو ہسٹو کیمسٹری (IHC)۔تازهگردہٹشوز کو 4 فیصد پیرافارمیلڈہائڈ (4˚C پر 72 گھنٹے کے لئے) میں فکس کیا گیا تھا اور پیرافین میں سرایت کیا گیا تھا۔ نمونوں کو 4 µm-موٹی حصوں میں کاٹا گیا تھا اور xylene میں deparaffinized کیا گیا تھا۔ ٹشو سیکشنز کو PBS سے دھونے کے بعد، انہیں 10 mM سائٹریٹ بفر (pH 6.0) میں اینٹیجن کی بازیافت کے لیے 4 منٹ کے لیے ابالا گیا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر PBS میں 10 فیصد گوٹ سیرم کے ساتھ بلاک کر دیا گیا۔ 1 گھنٹے کے لیے بنیادی اینٹی باڈی (اینٹی LC3B؛ 1:400؛ بلی نمبر 4412؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریشن) کو ہدایات کے مطابق شامل کیا گیا اور 12 گھنٹے کے لیے 4˚C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ ثانوی اینٹی باڈی (بکری اینٹی ریبٹ ایچ آر پی؛ 1:2،000؛ بلی نمبر BS13278؛ بائیو ورلڈ ٹیکنالوجی، انکارپوریشن) کو کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک شامل کیا گیا اور انکیوبیٹ کیا گیا۔ DAB (100 µl) کو ہلکے خوردبین (ماڈل CX31‑P؛ اولمپس کارپوریشن) کے نیچے مشاہدہ کیے جانے والے داغ کے ساتھ 5 منٹ کے لئے شامل کیا گیا اور اس کا مقابلہ کیا گیا۔ مثبت داغ کی شدت، جو کہ بھوری دکھائی دیتی تھی، کا تعین Image-Pro Plus 6.0 تصویری تجزیہ سافٹ ویئر (Media Cybernetics, Inc.) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ انٹیگرل آپٹیکل ڈینسٹی (IOD) کو شدت کی نمائندگی کرنے کے لیے شمار کیا گیا تھا۔ پروٹین کے اظہار میں اضافہ کے ساتھ ہی IOD قدروں میں اضافہ ہوا۔

ریورس ٹرانسکرپشن - مقداری(RT-q) پی سی آر۔ سے کل آر این اے نکالا گیا تھا۔گردے کے ٹشوTRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.) کا استعمال کرتے ہوئے ماڈل کی شمولیت کے بعد۔ TaqMan ریورس ٹرانسکرپشن کٹ (cat. no. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) کی ہدایات کے مطابق، RNA کو الٹا cDNA میں نقل کیا گیا تھا۔ درج ذیل تھرمو سائیکلنگ حالات استعمال کیے گئے تھے (miR‑214): 5 منٹ کے لیے 95˚C پر ابتدائی ڈینیچریشن؛ اس کے بعد 30 سیکنڈ کے لیے 95˚C پر ڈینیچریشن کے 40 چکر، 30 سیکنڈ کے لیے 60˚C پر اینیلنگ اور 30 ​​سیکنڈ کے لیے 72˚C پر لمبا ہونا۔ RT‑qPCR کو ABI Prism 7500 Sequence Detection System (PerkinElmer, Inc.) اور ایک معیاری SYBR گرین PCR کٹ (Toyobo Life Science) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ U6 کو miR-214 کے اندرونی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ پرائمر کی ترتیب حسب ذیل تھی: miR‑214، آگے، 5'‑AGCATAATACAGCAGGCACAGAC‑3' اور ریورس، 5'‑AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC‑3'؛ U6، آگے، 5'‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3' اور ریورس، 5'‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3'۔ ان تجربات کو چھ بار نقل کیا گیا۔ 2‑ΔΔCq طریقہ (14) کا استعمال کرتے ہوئے نتائج کا تجزیہ کیا گیا۔ LC3، p62، PTEN، AKT اور mTOR کی mRNA اظہار کی سطحوں کا اندازہ RT-qPCR کے ذریعے کیا گیا۔ ان جینوں کے اندرونی حوالہ کے طور پر ‑ایکٹین کے ساتھ، 2‑ΔΔCq کو ہدف کے جینوں کے رشتہ دار اظہار کی پیمائش کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ جدول I میں دکھائے گئے پرائمر سیکوینسز کو سنگون بائیوٹیک کمپنی لمیٹڈ نے ترکیب کیا تھا۔

مغربی دھبہ۔ گردہہوموجنیٹ بنانے کے لیے ٹشو کو RIPA lysate (Beyotime Institute of Biotechnology) کے ساتھ ملایا گیا اور جب کوئی ظاہر ٹشو نہیں دیکھا گیا تو lysis کو روک دیا گیا۔ نمونوں کو 13،000 xg پر 10 منٹ کے لیے ‑4˚C پر سینٹرفیوج کیا گیا اور مغربی دھبے کے تجزیے کے لیے سپرنٹنٹ کو بازیافت کیا گیا۔ مختصراً، مائیکرو بی سی اے پروٹین پرکھ کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی تعداد کا تعین کیا گیا۔ پروٹین کے نمونے (80 µg فی نمونہ) 12 فیصد سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولیاکریلامائڈیل الیکٹروفورسس کو کم کرکے الگ کیے گئے اور پھر راتوں رات 4˚C پر پولی وینیلائیڈین ڈائی فلورائیڈ جھلیوں پر منتقل کردیئے گئے۔ علیحدہ پروٹین کو پی وی ڈی ایف جھلیوں میں منتقل کیا گیا تھا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 5 فیصد سکمڈ دودھ کو 2 گھنٹے تک بلاک کرنے کے بعد، جھلیوں کو راتوں رات (4˚C پر) بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔ درج ذیل بنیادی اینٹی باڈیز (تمام سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریٹڈ) استعمال کیے گئے تھے: لائٹ چین 3B (1:1،000؛ بلی نمبر 4412)، p62 (1:1،000؛ بلی نمبر 4412)، اینٹی PTEN (1:1،000؛ بلی نمبر 9188)، اینٹی فاسفوریلیٹڈ (p)‑AKT (Ser473) (1:1،000؛ بلی نمبر 4060)، اینٹی-AKT (1:1،000؛ بلی نمبر 9272)، مخالف p‑mTOR (Ser 2448) (1:1،000؛ بلی نمبر 5536)، اینٹی ایم ٹی او آر (1:1،000؛ بلی نمبر 2972) اور ایکٹین (1:2،000؛ بلی نمبر 4970)۔ دھونے کے بعد، جھلیوں کو HRP کنجوگیٹڈ اینٹی خرگوش سیکنڈری اینٹی باڈیز (1:3،000؛ بلی نمبر A0208؛ بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی) کے ساتھ (کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک) لگایا گیا تھا۔ اموبیلون ویسٹرن (ملی پور سگما) کے ساتھ پروٹین بینڈ کا پتہ چلا اور ٹوٹل-لیب TL120 سافٹ ویئر (نان لائنر ڈائنامکس، 2.01) کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔ پروٹین کے اظہار کو ایکٹین میں معمول بنایا گیا تھا۔

شماریاتی تجزیہ. گراف پیڈ پرزم 9 کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔{1}} (GraphPad Software, Inc.)۔ تمام اعداد و شمار کو ان کی تقسیم کے لحاظ سے، مسلسل متغیرات کے لیے ± معیاری انحراف یا میڈینز (انٹرکوارٹائل رینجز) کے بطور پیش کیا گیا تھا۔ بنیادی خصوصیات اور نتائج کا موازنہ یک طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا گیا جس کے بعد Tukey کا پوسٹ ہاک ٹیسٹ، یا Kruskal-Wallis ٹیسٹ کے بعد Dunn کا مناسب ٹیسٹ۔ پی<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

نتائج

CLP کے بعد ٹائم پوائنٹ 24 گھنٹے۔ پچھلے مطالعات میں بتایا گیا ہے (6,15,16) کہ بائیو کیمیکل (یعنی، LC3 اور p62) تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ CLP کے 6-8 گھنٹے کے بعد سیپسس کے بڑھنے کے ساتھ آٹوفجی فلوکس کو دبا دیا جاتا ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، آٹولیسوسوم کی تعدادگردہسرجری کے بعد 24 گھنٹے کے اندر CLP سے علاج شدہ چوہوں میں اضافہ ہوا۔ اس کے علاوہ، کے مارکر کا تجزیہگردے کی چوٹیہ دکھایاگردوں کی تقریبCLP کے 24 گھنٹے بعد سب سے زیادہ نقصان پہنچا۔ لہذا، CLP کے بعد 24 گھنٹے کا ٹائم پوائنٹ درج ذیل تجربات کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔

گردے کے ٹشوز میں miR-214 پر ریگولیٹری اثر۔ RT-qPCR تجزیہ CLP سے علاج شدہ چوہوں میں miR-214 اظہار کا پتہ لگانے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ یہ پایا گیا کہ miR-214 اظہار کو تھوڑا سا اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔گردہسی ایل پی سرجری کے بعد ٹشوز 24 گھنٹے، شیم گروپ کے مقابلے (1.47 گنا، پی<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">گردہٹشو، شیم گروپ کے مقابلے میں (دونوں P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).

CISTANCHE گردے/ گردوں کی خرابی کو بہتر کرے گا۔

سیپٹک چوہوں میں گردوں کی خرابی پر miR-214 کا اثر.خون، پیشاب اور جمع کرنے کے لیے تمام چوہوں کی قربانی دی گئی۔گردہسی ایل پی سرجری کے 24 گھنٹے بعد نمونے۔ BUN اور Cr کی شدت کے اہم اشارے ہیں۔گردوںخرابی (17) مزید برآں، NGAL اور KIM-1 کی شناخت مخصوص بائیو مارکر کے طور پر کی گئی ہے۔گردے کی چوٹاور ان کے بڑھے ہوئے اظہار کا تعلق ابتدائی سے ہے۔گردوںAKI (17) میں نلی نما چوٹ۔ جیسا کہ تصویر 2A-D میں دکھایا گیا ہے، شیم گروپ کے مقابلے CLP سرجری کے بعد BUN، Cr، KIM-1 اور NGAL کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ تاہم، Ad-miR-214 نے CLP گروپ (تمام P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">گردے کی تقریبپیرامیٹرز تاہم، PTEN inhibitor کے ساتھ پہلے سے علاج کے بعد، Ad-miR-214 کے تحفظ کے اثرات کو بڑھایا گیا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ miR-214 سیپٹک چوہوں میں گردے کی خرابی کو کم کرتا ہے۔

گردوں کی سوزش اور آکسیڈیٹیو تناؤ پر miR-214 کا اثر۔جیسا کہ تصویر 3A اور B میں دکھایا گیا ہے، CLP نے TNF‑ اور IL‑6 کی سطح کو نمایاں طور پر بلند کیا، جبکہ Ad‑miR‑214 نے ان مارکروں کی سطح کو نمایاں طور پر کم کیا۔ کے ساتھ مقابلے میں

سیپٹک چوہوں میں رینل آٹوفجی پر miR-214 کا اثر۔موجودہ مطالعہ نے LC3 میں تبدیلیوں کا جائزہ لیا۔گردہIHC سٹیننگ کے ذریعے ٹشوز۔ جیسا کہ تصویر 6 میں دکھایا گیا ہے، سی ایل پی گروپ میں شیم گروپ (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">

miR‑214 روکنے کے لیے AKT/mTOR راستے کو چالو کرتا ہے۔گردے کے ؤتکوں میں PTEN کو خاموش کر کے آٹوفجی.میں آٹوفجی پر سی ایل پی کا اثرگردہLC3‑II/I اور p62 کی سطحوں کا اندازہ لگا کر ٹشوز کی چھان بین کی گئی۔ PTEN/AKT/mTOR سگنلنگ پاتھ وے آٹوفجی (18) میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ PTEN-AKT/mTOR راستے پر miR‑214 کے اثر کی تحقیقات کے لیے، LC3‑II/I، p62، AKT، p‑AKT، mTOR، p‑mTOR اور PTEN کی پروٹین کی سطح کا مغربی بلاٹنگ اور RT‑ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ کیو پی سی آر تجزیہ۔ جیسا کہ تصویر 7A‑C میں دکھایا گیا ہے، LC3‑II/LC3‑I کی شرح میں اضافے اور p62 کی سطح میں کمی کے ساتھ، ان پروٹینوں میں تیزی سے تبدیلی واقع ہوتی ہے (دونوں P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">گردہ tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05)۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ آٹوفیجی سی ایل پی کی طرف سے حوصلہ افزائی کی گئی تھی، اور miR-214 کی حد سے زیادہ کارکردگی اسے جزوی طور پر روک سکتی ہے۔

جیسا کہ تصویر 7A اور D‑F میں دکھایا گیا ہے، PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">گردہ tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05)۔ ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ CLP حوصلہ افزائی کرتا ہے۔گردہAKT/mTOR راستے کو روک کر ٹشو آٹوفجی۔ Ad‑miR‑214 نے PTEN کو خاموش کر کے AKT/mTOR پاتھ وے کو چالو کیاگردہٹشوز تاہم، CLP گروپ کے مقابلے میں، anti-miR-214 نے ایم ٹی او آر کے اظہار کو نمایاں طور پر روکا نہیں۔ لہذا، RT-qPCR کو مزید PTEN/AKT/mTOR سگنلنگ پاتھ وے سے متعلق جینوں کے mRNA کے اظہار کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ RT‑qPCR (تصویر 8) کے نتائج کے مطابق، شام گروپ کے مقابلے میں، p62، LC3 اور PTEN کے mRNA اظہار کی سطح میں واضح اضافہ ہوا، جبکہ AKT اور mTOR کے mRNA اظہار میں CLP گروپ میں کمی واقع ہوئی۔ CLP گروپ، Ad-miR-214، PTEN کے مقابلے میں

روکنے والے اور Ad-miR-214 کے علاوہ PTEN روکنے والے گروپوں نے LC3 اور PTEN کے mRNA اظہار میں کمی ظاہر کی، لیکن p62، AKT اور mTOR کے mRNA اظہار میں اضافہ ہوا (تمام P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05)۔ اس طرح، آٹوفجی پر p62 کا اثر ٹرانسکرپشن کے بعد کی سطح کے بجائے نقل کی سطح پر ہو سکتا ہے۔ موجودہ نتائج نے ظاہر کیا کہ miR-214 نے PTEN کے اظہار کو کم کیا اور AKT/mTOR سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کیا۔

بحث

موجودہ مطالعے سے پتا چلا ہے کہ ضرورت سے زیادہ آٹوفیجی اس کے لیے نقصان دہ ہے۔گردوں کی تقریبسیپٹک چوہوں میں. پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ miR-214 خلیوں اور ٹشوز (19-22) کے لئے ایک آنکوجین کے طور پر بڑھتے ہوئے پھیلاؤ، میٹاسٹیسیس، حملے اور افعال سے وابستہ ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ miR-214 apoptosis کو کم کرنے، آکسیڈیٹیو تناؤ اور سوزش کے عوامل کو کم کرنے کے ذریعے AKI کے خلاف حفاظتی کردار ادا کرتا ہے (21,23)۔ موجودہ مطالعہ نے آٹوفیجی کی ماڈلن میں miR-214 کی ممکنہ شمولیت پر توجہ مرکوز کرتے ہوئے سیپسس سے متاثرہ AKI پر miR-214 کے حفاظتی اثر کے بنیادی میکانزم کا مزید جائزہ لیا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ آکسیڈیٹیو تناؤ میں واقع ہوئی ہے۔گردہCLP سرجری کی انتظامیہ کے بعد۔ دریں اثنا، آٹوفجی کی ایکٹیویشن اس میں ہوتی ہے۔گردہ.ایلیویٹڈ LC3 II/I اور p62 میں کمیگردہCLP سرجری کے ساتھ علاج کے بعد مشاہدہ کیا گیا تھا۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، miR-214 کا اوور ایکسپریشن نمایاں طور پر کم ہوا۔گردہپیتھولوجیکل چوٹ اورگردہسیپسس کی وجہ سے خرابی. تاہم، miR-214 کی روک تھام نے renoprotection کے مخالف رجحان کو ظاہر کیا۔ اس کے علاوہ، Ad-miR-214 کے تحفظ کے اثر کو PTEN inhibitor کے ذریعے بڑھایا گیا۔

ایک سیپٹک میںگردہ، ضرورت سے زیادہ سوزش ROS کی پیداوار میں بڑے پیمانے پر اضافے کے ساتھ ہوتی ہے اور ROS کی ایک بڑی تعداد مائٹوکونڈریل ڈھانچے میں تبدیلیوں کو متحرک کرتی ہے اور مائٹوکونڈریل فنکشن کو متاثر کرتی ہے، جس کی وجہ سے جسم ایک شیطانی چکر میں داخل ہوتا ہے جو بڑھتا ہے۔گردہنقصان (24,25)۔ لہذا، آکسیڈیٹیو تناؤ سیپسس سے متاثرہ AKI کے اہم پیتھولوجیکل میکانزم میں سے ایک ہوسکتا ہے۔ موجودہ مطالعہ نے ضرورت سے زیادہ آکسیڈیٹیو تناؤ کو ظاہر کرنے والے مزید شواہد فراہم کیے، جس کی نشاندہی ایم ڈی اے کی پیداوار میں اضافہ اور ایس او ڈی کی سرگرمی میں کمی سے ہوئی ہے۔گردہCLP سرجری کے بعد ٹشوز۔ مزید یہ کہ، یہ پایا گیا کہ miR-214 کا زیادہ اظہار اس کی حفاظت کر سکتا ہے۔گردہسی ایل پی کی حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو چوٹ کے خلاف، جو آٹوفیجک روک میں شامل ہے۔ یہ پچھلے مطالعات سے مطابقت رکھتا ہے کہ miR-214 مختلف خلیوں اور بافتوں کو آکسیڈیٹیو تناؤ (26,27) سے بچاتا ہے۔

سیپسس کی نشوونما میں آٹوفیجی ایک 'دو دھاری تلوار' کے طور پر کام کرتی ہے: بیسل آٹوفیجی زہریلے آکسیڈیٹیو پروٹینز کو ہٹا کر حفاظتی اثرات مرتب کرسکتی ہے، لیکن ضرورت سے زیادہ آٹوفیجی شدید تناؤ میں آٹوفیجک سیلولر موت کا باعث بن سکتی ہے، جیسے ROS پھٹنا (28,29) . یہ دکھایا گیا ہے کہ ابتدائی طور پر سیپسس میں آٹوفیجی چالو ہوتی ہے، اس کے بعد آٹوفیجک سیل ڈیتھ (30) کی وجہ سے غیر فعال ہونے کا مرحلہ آتا ہے، جو سیپسس کی وجہ سے آکسیڈیٹیو چوٹ کو بڑھاتا ہے۔ موجودہ مطالعے میں، PTEN inhibitor یا miR-214 کے اوور ایکسپریشن نے CLP سے علاج شدہ چوہوں میں اینٹی آکسیڈیٹیو رینو پروٹیکشن ظاہر کیا۔ تاہم، miR-214 کی روک تھام نے antioxidative renoprotection کے مخالف رجحان کو ظاہر کیا۔ لہذا ضرورت سے زیادہ یا ناکافی آٹوفجی کا سبب بن سکتا ہے۔گردے کا نقصان; دونوں خراب ہیں اور آخر کار سیل کی موت کو اکساتے ہیں۔ لہذا، سیپٹک حالت میں آکسیڈیٹیو چوٹ کو کم کرنے کے لیے آٹوفجی کی اعتدال پسند سطح کو برقرار رکھنا کلید ہے۔

CISTANCHE گردے/ گردوں کے درد کو بہتر کرے گا۔

جمع ہونے والے شواہد نے اشارہ کیا ہے کہ miR-214 مختلف خلیوں اور بافتوں میں آٹوفجی کو روکتا ہے (31-33)۔ موجودہ مطالعے میں، miR-214 کا زیادہ اظہار CLP کی حوصلہ افزائی آٹوفجی کو روکنے کے لیے پایا گیا تھا۔گردے کے ٹشوز،جیسا کہ پروٹین مارکروں میں تبدیلیوں سے ظاہر ہوتا ہے، جیسے LC3‑II/I اور p62۔ مزید برآں، نتائج نے یہ ظاہر کیا کہ miR-214 کے زیادہ اظہار نے ضرورت سے زیادہ آٹوفجی کو روک کر CLP کی حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو چوٹ کو کم کیا۔ موجودہ مطالعہ نے مالیکیولر میکانزم کی بھی چھان بین کی جس کے ذریعے miR-214 ماڈیول کرتا ہے۔گردہسیپسس سے متاثرہ AKI میں آٹوفجی۔ PTEN/AKT/mTOR ایک اہم سگنلنگ پاتھ وے ہے جو ریگولیٹ کرتا ہے۔گردہآٹوفیجی (34,35) اور جو سیپسس سے متاثرہ AKI میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے، اور PTEN PI3K/AKT/mTOR سگنلنگ پاتھ وے کا ایک منفی روکنے والا ہے۔ پچھلے مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ miR‑214 مختلف ماڈلز (36-38) میں PI3K/AKT/mTOR سگنلنگ پاتھ وے کے ذریعے آٹوفجی کو منظم کر سکتا ہے۔ ما ایٹ ال (39) نے پایا کہ miR-214 ذیابیطس کے گردوں میں آٹوفجی کو کم کر سکتا ہے۔ لہذا، یہ قیاس کیا گیا تھا کہ سی ایل پی کی حوصلہ افزائی AKI پر miR-214 کے اثرات PTEN/AKT/mTOR راستے کے ضابطے میں شامل ہو سکتے ہیں۔ خاص طور پر، موجودہ مطالعہ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ CLP سرجری نے PTEN کی سطح کو نمایاں طور پر بلند کیا لیکن p-AKT اور p-mTOR کی سطح کو کم کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ CLP سرجری نے AKT/mTOR راستے کو غیر فعال کر دیا۔ اس کے علاوہ، miR-214 کے اوور ایکسپریشن نے AKT/mTOR پاتھ وے کو CLP سے حوصلہ افزائی آٹوفجی میں PTEN کو خاموش کر کے چالو کیا۔گردہٹشوز تاہم، anti-miR-214 نے مغربی بلاٹ تجزیوں میں ایم ٹی او آر کے اظہار کو نمایاں طور پر نہیں روکا۔ اس طرح، RT‑qPCR کو مزید PTEN/AKT/mTOR سگنلنگ پاتھ وے سے متعلق جینوں کے mRNA کے اظہار کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ موجودہ مطالعہ نے نشاندہی کی کہ miR-214 نے PTEN کے اظہار کو کم کیا اور آٹوفجی کو روکنے کے لیے AKT/mTOR سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کیا۔ تاہم، کے طریقہ کار سے متعلق اضافی تفصیلات حاصل کرنے کے لیے مزید جامع مطالعات کی جانی چاہیے۔گردہسیپٹک حالت میں آٹوفیجی۔

نتیجہ اخذ کرنے کے لیے، موجودہ مطالعے کے نتائج نے تجویز کیا کہ miR-214 نے سیپسس کے خلاف حفاظتی کردار ادا کیا۔گردے کی چوٹآکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کرکے اور PTEN/AKT/mTOR پاتھ وے کے ضابطے کے ذریعے آٹوفجی کو روک کر۔ موجودہ نتائج نے تجویز کیا کہ miR-214 سیپسس سے متاثرہ AKI کے لئے ممکنہ علاج کا ہدف ہوسکتا ہے۔ تاہم، موجودہ مطالعہ میں 6-8 ہفتے پرانے چوہوں کا استعمال کیا گیا ہے، لہذا بالغ چوہوں میں miR-214 کے طریقہ کار پر مزید تحقیق کی ضرورت ہے۔