ایرل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر سگنلنگ پاتھ وے کی ماڈیولیشن جنین وائرس کی نقل پر اثرات حصہ 1

خلاصہ:

Junín وائرس (JUNV)، خاندان Arenaviridae کا ایک رکن، ارجنٹائن ہیمرجک بخار کا ایٹولوجیکل ایجنٹ ہے، ارجنٹائن کے دیہی علاقے میں ایک مقامی بیماری ہے جس میں مخصوص کیموتھراپی کی کمی ہے۔ ایرل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر (AHR) کئی ممالیہ کے ٹشوز میں ظاہر ہوتا ہے اور اسے متغیر ذرائع سے ligands کے سینسر اور سیل کے مدافعتی ردعمل کے ماڈیولر کے طور پر اشارہ کیا گیا ہے۔

جنین وائرس ایک نایاب وائرس ہے جو انسانی مدافعتی نظام کو متاثر کرتا ہے اور شدید مدافعتی ردعمل کا سبب بنتا ہے۔ تاہم، استثنیٰ واحد حکمت عملی نہیں ہے جو جنین وائرس سے لڑنے میں ناکام رہتی ہے۔

سب سے پہلے، کافی آرام اور نیند آپ کے مدافعتی نظام کو صحت مند رکھنے کے لیے ضروری ہے۔ نیند کے دوران، جسم سائٹوکائنز نامی مادوں کو خارج کرتا ہے جو مدافعتی نظام کو وائرس اور دیگر بیرونی خطرات کا زیادہ مؤثر طریقے سے جواب دینے میں مدد کرتا ہے۔

دوسری بات یہ کہ صحت مند کھانے کی عادات بھی قوت مدافعت کو بہتر بنانے کی کلید ہیں۔ وٹامن سی اور ڈی سے بھرپور غذائیں، جیسے کھٹی پھل اور مشروم، آپ کے جسم کے مدافعتی ردعمل کو بڑھانے میں مدد کر سکتے ہیں۔

اس کے علاوہ اعتدال پسند ورزش بھی قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتی ہے۔ مناسب ورزش سے جسم میں خون کے سفید خلیات کی تعداد میں اضافہ ہوتا ہے، جس سے مدافعتی نظام کی صلاحیت میں اضافہ ہوتا ہے۔

آخر میں، ایک اچھی دماغی حالت بھی مدافعتی نظام کی صحت کے لیے بہت ضروری ہے۔ تناؤ اور اضطراب جسم کے مدافعتی ردعمل کو متاثر کر سکتا ہے، اس لیے پر سکون اور مثبت رہنا ضروری ہے۔

مختصراً، اگرچہ جنین وائرس کا مدافعتی نظام پر اثر پڑتا ہے، لیکن اپنے طرز زندگی کو بہتر بنا کر اور مثبت رویہ برقرار رکھ کر، ہم اپنی قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتے ہیں اور وائرس کے حملوں کو مؤثر طریقے سے روک سکتے ہیں اور ان کا جواب دے سکتے ہیں۔ اس نقطہ نظر سے، ہمیں اپنی قوت مدافعت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے۔ Cistanche قوت مدافعت کو نمایاں طور پر بہتر بنا سکتا ہے، کیونکہ گوشت کی راکھ میں حیاتیاتی طور پر فعال اجزاء کی ایک قسم ہوتی ہے، جیسے کہ پولی سیکرائڈز، دو کھمبیاں، ہوانگ لی وغیرہ۔ یہ اجزاء مدافعتی نظام کو متحرک کر سکتے ہیں، نظام میں موجود مختلف قسم کے خلیات، اپنی قوت مدافعت کو بڑھا سکتے ہیں۔

cistanche deserticola سپلیمنٹ پر کلک کریں۔

دلچسپ بات یہ ہے کہ حالیہ مطالعات نے تجویز کیا ہے کہ AHR سگنلنگ پاتھ وے کی ایکٹیویشن یا ڈپریشن متنوع انسانی وائرل انفیکشن کے نتائج میں کردار ادا کر سکتا ہے۔ موجودہ رپورٹ میں، وٹرو انفیکشن میں JUNV پر AHR کے فارماسولوجیکل ماڈیولیشن کے اثر کا تجزیہ کیا گیا۔ ابتدائی مائیکرو رے اسکریننگ سے پتہ چلتا ہے کہ JUNV سے متاثرہ ہیپاٹک سیلز میں اے ایچ آر کا راستہ زیادہ متاثر ہوا تھا۔

بیک وقت، JUNV سٹرین IV4454 اور Candid#1 کے ساتھ Vero اور Huh-7 خلیات کے انفیکشن کو خوراک پر منحصر انداز میں CH223191، ایک مخصوص AHR مخالف، کے ساتھ علاج کے ذریعے نمایاں طور پر روکا گیا تھا، جیسا کہ انفیکٹیوٹی اسیسز سے پتہ چلا ہے، وقت RT-PCR اور وائرل پروٹین کی امیونو فلوروسینس کا پتہ لگانا۔ مزید برآں، JUNV انفیکشن میں AHR کا پرو وائرل کردار IFN-I کے راستے سے آزاد دکھائی دیتا ہے۔ ہمارے نتائج اے ایچ ایف کے کنٹرول کے لیے ممکنہ ہدف کے طور پر اے ایچ آر کی فارماسولوجیکل ماڈیولیشن کے امید افزا تناظر کی حمایت کرتے ہیں۔

مطلوبہ الفاظ:

ایریل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر؛ جنین وائرس؛ ایرینا وائرس؛ ارجنٹائن ہیمرج بخار؛ میزبان علاج کا ہدف۔

1. تعارف

فی الحال، اس بات کی تائید کرنے والے بڑھتے ہوئے شواہد موجود ہیں کہ ایرل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر (AHR) میزبان مدافعتی ردعمل کا ایک اہم ماڈیولیٹر ہے اور یہ خصوصیت انفرادی اور آبادی کی سطح پر انفیکشن کے امتیازی طبی نتائج میں حصہ ڈالتی ہے [1,2]۔ اے ایچ آر ایک سائٹوپلاسمک ریسیپٹر ہے جو ممالیہ کے ٹشوز میں ہر جگہ ظاہر ہوتا ہے، جو کہ مختلف قسم کے اینڈوجینس اور خارجی لیگنڈس کے سینسر کے طور پر کام کرتا ہے جو مختلف ماخذ جیسے آلودگی، خوراک، مائکرو بایوم، اور میزبان میٹابولزم [3–5] ہے۔

درحقیقت، یہ سختی سے تجویز کیا گیا ہے کہ ماحولیاتی عوامل اور وائرل انفیکشن [1,2] کے درمیان باہمی تعامل پر AHR کا بڑا اثر ہے۔ ایک بار جب اے ایچ آر ایک لیگنڈ مالیکیول کو پہچان لیتا ہے، تو اسے نیوکلئس میں منتقل کیا جاتا ہے جہاں یہ ایرل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر نیوکلیئر ٹرانسلوکیٹر کے ساتھ ہیٹروڈیمریز کرتا ہے اور زینو بائیوٹک میٹابولزم جینز (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1) کے اظہار کو منظم کرتا ہے۔

AHR دوسرے ٹرانسکرپشن عوامل کے ساتھ بھی بات چیت کر سکتا ہے، جیسے NF-kB، سگنلنگ راستوں کی ایک وسیع صف کو ماڈیول کرنے کے لیے، بشمول وہ لوگ جو مدافعتی ردعمل میں شامل ہیں [6–8]۔ اے ایچ آر امیونوریگولیٹری جینوں کے اظہار کو ماڈیول کر سکتا ہے اور سوزش والے ڈینڈریٹک خلیوں اور ٹی سیلز [9-11] کے فرق کے راستوں کو تبدیل کر سکتا ہے۔

ہمارے تحقیقی گروپ کے ذریعہ کئے گئے حالیہ مطالعات نے یہ ثابت کیا ہے کہ زیکا (ZIKV)، ڈینگی (DENV)، [12] اور شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم کورونا وائرس 2 (SARS-CoV) کے دوران اے ایچ آر سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنا ایک پرو وائرل کردار ادا کرتا ہے۔ 4}) انفیکشنز [13]۔ نوٹ، اس بات کی تصدیق کی گئی کہ اے ایچ آر کی روک تھام نے ان وائرل ماڈلز میں وائرل نقل کو کم کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ اے ایچ آر ایک امید افزا اینٹی وائرل حکمت عملی کی نمائندگی کرتا ہے۔

Junín وائرس (JUNV) Arenaviridae خاندان سے ایک لفافہ سیگمنٹڈ RNA جینوم وائرس ہے [14]۔ ہر آر این اے سیگمنٹ دو پروٹینوں کو مخالف سمتوں میں انکوڈ کرتا ہے۔ ایک طرف، بڑا طبقہ (L RNA) RNA پر منحصر RNA پولیمریز (L) اور میٹرکس پروٹین (Z) کے لیے انکوڈ کرتا ہے۔

دوسری طرف، چھوٹا طبقہ (S RNA) نیوکلیوپروٹین (NP) اور گلائکوپروٹین پیشگی (GPC) کے لیے انکوڈ کرتا ہے، جسے پروٹیز کے ذریعے تین ذیلی یونٹس (GP1، GP2، اور سگنل پیپٹائڈ SSP) پیدا کرنے کے لیے کلیو کیا جاتا ہے۔ گلائکوپروٹین کمپلیکس بنانے کے لیے ایک ساتھ رکھا جاتا ہے [14]۔

JUNV ارجنٹائن ہیمرجک فیور (AHF) کا ایٹولوجیکل ایجنٹ ہے [15]، ایک مقامی بیماری جو ارجنٹائن کے مرطوب پامپا علاقے میں دیہی کارکنوں کی آبادی کو متاثر کرتی ہے۔ نوٹ، اے ایچ ایف کی ایک خصوصیت متاثرہ مریضوں کی طرف سے پیش کردہ طبی علامات کی وسیع رینج ہے۔ غیر علامتی یا ہلکی بیماری، فلو جیسی علامات کے ساتھ، 70-80 فیصد انفیکشنز میں ہوتی ہے۔ تاہم، سنگین صورتوں میں ہیمرج اور اعصابی پیچیدگیاں شامل ہوتی ہیں جن میں ہسپتال میں داخل مریضوں میں شرح اموات 20 سے 30 فیصد تک ہوتی ہے [15]۔

اہم بات یہ ہے کہ Candid#1 نامی ایک لائیو ٹینیویٹڈ ویکسین AHF [15,16] کے سنگین کیسز کو روکنے میں انتہائی کارگر ثابت ہوئی ہے۔ تاہم، بیماری کے خلاف دستیاب واحد علاج صحت یاب مریضوں سے مدافعتی پلازما کا انتظام ہے۔ ایک ایسی تھراپی جو مہلک کیسوں کی تعداد کو کم کرنے کے لیے صرف اس صورت میں دکھایا گیا ہے جب پہلی علامات کے آغاز کے بعد 8 دن کے اندر اندر کروایا جائے [17]۔

اگرچہ حالیہ برسوں میں انفیکشن کے دوران اے ایچ آر کے اثر پر متعدد شواہد اکٹھے کیے گئے ہیں، لیکن اب بھی ارینا وائرس کے انفیکشن کے دوران اس کے کردار کے بارے میں کوئی واضح ثبوت نہیں ہے [2]۔

چونکہ دیہی آبادی مسلسل AHR ligands کے سامنے آتی ہے، جیسے کہ زرعی صنعت کے آلودگی جیسے کہ زرعی کیمیکل، کیڑے مار ادویات، اور جیواشم ایندھن کے دہن کی ضمنی مصنوعات [18]، ہم نے اس کام میں ان وٹرو اے ایچ آر فارماسولوجیکل ماڈیولیشن کے اثرات کا جائزہ لیا۔ JUNV انفیکشن کے لئے سیلولر ردعمل اور AHF بیماری میں علاج کی مداخلت کے امیدوار کے ہدف کے طور پر AHR کا ممکنہ استعمال۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 سیل لائنز

مندرجہ ذیل سیل لائنیں استعمال کی گئیں: Huh-7 (JCRB Cell Bank #0403) اور HepG-2 ATCC HB8065، دو انسانی ہیپاٹوسائٹ سے ماخوذ کارسنوما سیل لائنز؛ Vero ATCC CCL-81، بندر سے ماخوذ گردے کے اپکلا سیل لائن۔ ایگل کے کم از کم ضروری میڈیم (MEM) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) میں ہر سیل لائن کی کاشت 5 فیصد نوزائیدہ بچھڑے کے سیرم (NBCS) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) کے ساتھ مکمل کی گئی تھی۔ 50 µg/mL gentamycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1 mM سوڈیم پائروویٹ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2 mM L-glutamine (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham) MA، USA)، اور HCl/NaHCO3 کے ساتھ بفرڈ۔ سیل لائنوں کو 5 فیصد CO2 ماحول کے ساتھ 37 ◦C پر مہذب اور برقرار رکھا گیا تھا۔

2.2 وائرل تناؤ

مندرجہ ذیل وائرل تناؤ کا استعمال کیا گیا تھا: قدرتی طور پر کم IV4454 تناؤ جو AHF کے ہلکے انسانی کیس سے حاصل کیا گیا تھا [19] اور ویکسین سے کم کینڈیڈ #1 تناؤ [20]۔ ویرو سیلز کا استعمال وائرس اسٹاک جنریشن کے لیے اور معیاری تختی پرکھ کے ذریعے وائرس ٹائٹریشن کے لیے کیا گیا تھا۔

متعدی ایجنٹوں کے ساتھ تمام کام بایو سیفٹی لیول 2 کی سہولیات میں انجام دیا گیا تھا اور اسے بیونس آئرس یونیورسٹی کے اسکول آف سائنسز کے دفتر برائے ماحولیاتی صحت اور حفاظت سے منظور کیا گیا تھا۔ انفیکشن کے طریقہ کار میں شامل تمام اہلکاروں کو Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas ڈاکٹر JI Maiztegui (Pergamino, Buenos Aires, Argentina) کی طرف سے فراہم کردہ Candid-1 سے ٹیکہ لگایا گیا تھا۔

2.3۔ مائیکرو رے تجزیہ

کل 5 × 105 HepG2 سیلز 25 cm2 کلچر فلاسکس میں لگائے گئے تھے اور JUNV IV4454 سے انفیکشن کی ضرب (MOI) میں 1 یا فرضی انفیکشن سے متاثر ہوئے تھے۔ آر این اے کو 24 اور 48 گھنٹے پوسٹ انفیکشن (pi) پر RNAeasy (کیجین، ہلڈن، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا اور پاک کیا گیا۔ نانوڈروپ کا استعمال کرتے ہوئے آر این اے کی تعداد کی پیمائش کی گئی۔ HepG2 خلیوں کے جین ایکسپریشن پروفائلز کو مائکرو رے تجزیہ (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips) کا استعمال کرتے ہوئے نمایاں کیا گیا تھا تاکہ میزبان جینوں کی شناخت کی جاسکے جو ٹرانسکرپشن کے ذریعہ انفیکشن کے ذریعہ منظم ہیں۔

انفیکشن کے ذریعے نمایاں طور پر ریگولیٹ کیے گئے میزبان جینوں کی کل تعداد کا حساب ہر ٹائم پوائنٹ کے لیے ان جینوں کی شناخت کے ذریعے کیا گیا جس میں کم از کم 16-گنا اظہار میں تبدیلی اور 95 فیصد امکان ظاہر کیا گیا تھا (p {{ 3}}.05)۔

WebGestalt سافٹ ویئر (http://www.webgestalt.org، 3 جولائی 2020 کو حاصل کیا گیا)، جو Wikipathways ڈیٹا بیس کو استعمال کرتا ہے، اسے جین اونٹولوجی اور راستے سے زیادہ نمائندگی کے تجزیوں کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ نقل کے تجربات مختلف دنوں پر کیے گئے (n=3 آزاد تجربات فی شرط)۔

2.4 چھوٹے مالیکیول مرکبات

مصنوعی AHR-مخصوص مسابقتی مخالف CH223191، 1-میتھائل-این-[2-میتھائل4-[2-(2-میتھائل فینائل)ڈیازینیل]فینائل]{ {9}}H-pyrazole-5-carboxamide (Tocris Bioscience, Bristol, United Kingdom)، dimethyl سلفوکسائیڈ (DMSO) میں حل کیا گیا تھا اور 1.25، 2.5، 5، 10، 20، 40، اور ارتکاز میں استعمال کیا گیا تھا۔ 80 µM

ٹرپٹوفن میٹابولائٹ L-kynurenine، (2S)-2-Amino-4-(2-aminophenyl)-4-oxobutanoic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) تھا DMSO میں حل کیا جاتا ہے اور 2.5، 5، 10، 20، 40، 80، 160، اور 320 µM کے ارتکاز میں استعمال ہوتا ہے۔

تمام علاج روشنی کی عدم موجودگی میں کیے گئے تھے، اس لیے کہ مرکبات فوٹو حساسیت کو پیش کرتے ہیں۔

2.5 سیل وائبلٹی اسیسز

سیل کی قابل عملیت کے تعین کے لیے Huh-7 اور Vero سیل monolayers کو MEM 5 فیصد NBCS میں 24 گھنٹے کے لیے 96 کنویں پلیٹوں میں اگایا گیا۔ 90 فیصد سنگم پر سیل monolayers کا علاج 72 گھنٹے کے لیے CH223191 (1.25 µM سے 80 µM) اور کینورینائن (5 µM سے 320 µM) کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ موک کا علاج ڈی ایم ایس او کے اسی ارتکاز کے ساتھ کیا گیا جو ligand کے علاج کی سب سے زیادہ خوراک ہے اور اسے 100 فیصد سیل کی عملداری کے طور پر سمجھا جاتا تھا۔

تمام علاج چار گنا میں کئے گئے تھے۔ سیل کی قابل عملیت کا اندازہ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (Sigma-Aldrich, St) سے کیا گیا تھا۔ لوئس، MO، USA) پرکھ۔ FLUOstar OPTIMA مائکروپلیٹ ریڈر میں جذب 570 nm پر ماپا گیا۔ سیل کے قابل عمل فیصد کا تعین فرضی جذب اقدار کا استعمال کرتے ہوئے علاج کے جذب کے نتائج کو رشتہ دار بنا کر کیا گیا تھا۔

مزید برآں، علاج شدہ خلیوں کی نشوونما کی صلاحیت اور مورفولوجی کا مطالعہ ہلکے خوردبین کے تحت کیا گیا۔ تصاویر Nikon Eclipse TS100 مائکروسکوپ کے ساتھ 72 گھنٹے پر لی گئیں۔ اضافہ: 100×; این اے: 0.25۔

2.6۔ علاج اور وائرل انفیکشن

Vero اور Huh{{0}} سیل monolayers کو CH223191 اور kynurenine کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا تھا MEM 1.5 فیصد NBCS میں بالترتیب 1 h یا 24 h کے لیے، 37 ◦C پر۔ CH223191 1.25 اور 20 µM کے درمیان ارتکاز میں استعمال کیا گیا تھا، جبکہ kynurenine 5 اور 80 µM کے درمیان ارتکاز میں استعمال کیا گیا تھا۔ پھر، وائرل انفیکشن 0.5 کے MOI پر یا تو IV4454 یا Candid #1 سٹرین کے ساتھ کیا گیا۔ 1 گھنٹہ کے بعد، انوکولہ کو ہٹا دیا گیا اور خلیوں کو مذکورہ حراستی میں 48 گھنٹے تک دونوں مرکبات کے سامنے لایا گیا۔ 48 گھنٹے پر پائ سپرنٹینٹس کو تختی پرکھ کے لئے جمع کیا گیا تھا اور سیل مونولیئرز کو بالواسطہ امیونو فلوروسینس یا RT-qPCR کے لئے پروسیس کیا گیا تھا۔

2.7۔ بالواسطہ امیونو فلوروسینس

Huh-7 monolayers جن کا علاج CH223191 یا kynurenine سے کیا گیا اور JUNV سے متاثر جیسا کہ اوپر بتایا گیا ہے، 10 منٹ کے لیے −20 ◦C پر میتھانول کے ساتھ 48 h pi پر طے کیا گیا، PBS کے ساتھ تین بار دھویا گیا، اور 4 ◦C پر تازہ PBS میں محفوظ کیا گیا۔ پروسیسنگ تک.

درج ذیل اینٹی باڈیز کا استعمال کیا گیا تھا: بنیادی ماؤس مونوکلونل اینٹی این پی اینٹی باڈیز (1:200) (NA05-AG12) [21] اور سیکنڈری Alexa Fluor 488 conjugated anti-mouse goat antibodies (1:200) (A{{ 10}}) (تھرمو فشر سائنٹیفک، والتھم، ایم اے، امریکہ)۔ سیل نیوکلی 40،6-diamidino-2- phenylindole (DAPI) (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) سے داغے ہوئے تھے۔ مائکروسکوپی اور فوٹو گرافی کا ڈیٹا Olympus IX71 فلوروسینس مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا جس میں QImaging Exi-Aqua کیمرہ منسلک ہے (پکسل سائز: 6.45 µm؛ فوٹو ڈیٹیکٹر ایریا: 1392 × 1040 پکسلز2)۔

فلوروسینس ڈیٹا کی مقدار فجی سافٹ ویئر (ورژن 1.53v) (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، بیتیسڈا، MD، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ فیجی سافٹ ویئر (ورژن 1.53v) میں شامل سیل کاؤنٹر پلگ ان کے ذریعے DAPI- داغدار نیوکلئس اور NP- مثبت خلیوں کی دستی مقدار کو دستی طور پر انجام دیا گیا تھا۔ اگر NP وائرل اینٹیجن سٹیننگ کا پتہ لگایا جا سکے تو خلیوں کو مثبت سمجھا جاتا تھا۔ NP-مثبت خلیوں کی فیصد کا اظہار NP-مثبت خلیوں اور ہر فیلڈ میں کل خلیوں کے درمیان تناسب کے طور پر کیا گیا تھا اور پھر اوسط فیصد کا تعین اور پیش کیا گیا تھا۔

NP-مثبت خلیوں کی فلوروسینس کی شدت انفرادی خلیوں کی اوسط گرے ویلیو کی پیمائش کرکے اور بیک گراؤنڈ فلوروسینس کو گھٹا کر حاصل کی گئی تھی۔ وائرل فوکی کو NP- منفی خلیوں سے گھرا ہوا NP- مثبت خلیوں کے گروپوں پر غور کرکے محدود کیا گیا تھا۔ وائرل فوکی کو 3 مختلف تصادفی طور پر منتخب کردہ فیلڈز سے 3 مختلف امیجز پر شمار کیا گیا تھا اور اوسط فوکی سائز کا تعین ان خلیوں کی تعداد سے کیا گیا تھا جنہوں نے انہیں بنایا تھا۔

2.8۔ وائرل نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانا

کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق، ہائی وے ADN/ARN PuriPrep-VIRUS کٹ K1501 (Inbio Highway، Buenos Aires، Argentina) کا استعمال کرتے ہوئے متاثرہ سیل monolayers سے نیوکلک ایسڈ نکالا گیا۔ JUNV RNA وائرل لوڈ اور سیلولر ٹرانسکرپٹس کی مقدار کا تعین RT-qPCR کے ذریعے کیا گیا۔ ریورس ٹرانسکرپٹ بے ترتیب پرائمر اور مولونی مورین لیوکیمیا وائرس ریورس ٹرانسکرپٹیس (M-MLV RT) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔

فریگمنٹ ایمپلیفیکیشن کے لیے، درج ذیل پرائمر استعمال کیے گئے: JUNV-np (فارورڈ: 5 0 -GGC ATC CTT CAG AAC ATC-30، ریورس: 50 -CGC ACA GTG GAT CCT AGGC{{4} } ), ahr (فارورڈ: 50 -ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC-30؛ ریورس: 50 -CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG-30 ), cyp1a1 ( فارورڈ: 50 -TTCCGACACTCTTCCTTCGT-30؛ ریورس: 50 -ATGGTTAGCCCATAGATGGG-30 ), -ایکٹین (فارورڈ: 50 -TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG{{17} }}؛ ریورس: 50 -TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-30 )۔ پی سی آر سائیکل کی تفصیلات حسب ذیل تھیں: ابتدائی ڈی نیچرلائزیشن 2 منٹ 95 ◦C پر؛ 45 ایمپلیفیکیشن سائیکل جس میں 95 ◦C پر 30 سیکنڈ، 58 ◦C پر 1 منٹ، اور 72 ◦C پر 1 منٹ؛ 72 ◦C پر 5 منٹ کا آخری چکر؛ آخر میں، پگھلنے کے منحنی خطوط کئے گئے. MyiQ2 آلات (Bio-Rad Laboratories، Hercules, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے پتہ لگایا گیا تھا۔ نتائج کو 2−∆∆Ct (فولڈ چینج) کے طور پر رپورٹ کیا گیا اور -ایکٹین کو ہاؤس کیپنگ جین کے طور پر استعمال کرتے ہوئے معمول بنایا گیا۔

2.9 تختی پرکھ

وائرل پیداوار کا تعین معیاری تختی پرکھ کے ذریعہ کیا گیا تھا۔ سیل سپرنٹنٹس کو اکٹھا کیا گیا تھا اور ویرو سیل مونولیئرز کو 37 ◦C پر 1 گھنٹہ تک متاثر کرنے کے لیے سیریل ڈائیوشن تیار کیے گئے تھے۔ وائرل جذب کے بعد، انوکولہ کو ہٹا دیا گیا، MEM 5 فیصد NBCS کو 0.7 فیصد میتھائل سیلولوز کے ساتھ شامل کیا گیا اور خلیوں کو 5 فیصد CO2 انکیوبیٹر میں 37 ◦C پر 1 ہفتہ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد، سیل monolayers کو 10 فیصد formaldehyde کے ساتھ طے کیا گیا، دھویا گیا، اور کرسٹل وایلیٹ سے داغ دیا گیا۔ وائرل ٹائٹر کا حساب تختی بنانے والے یونٹ (PFU) کی مقدار کے بعد کیا گیا۔

2.10 شماریاتی تجزیہ

مائیکرو رے شماریاتی تجزیہ WebGestalt سافٹ ویئر (http://www. webgestalt.org/، 3 جولائی 2020 کو حاصل کیا گیا) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ اعداد و شمار کو وسط ± SD One-way ANOVA کے ساتھ ڈنیٹ کے پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے ساتھ بیان کیا گیا ہے GraphPad Prism 8 (ورژن 8.0.1) for Windows 11 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) شماریاتی اہمیت کو جانچنے کے لیے انجام دیا گیا تھا۔ p 0.05 سے کم یا اس کے برابر شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔

For more information:1950477648nn@gmail.com