Cistanche Tubulosa سے ایک نئے Coumarin Glycosyltransferase CtUGT1 کی مالیکیولر کلوننگ اور بائیو کیمیکل خصوصیات

مزید معلومات کے لیے:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

خلاصہ

UDP-glycosyltransferases (UGTs) ثانوی میٹابولائٹ بائیو سنتھیسس میں شامل انزائمز کا ایک اہم اور فعال طور پر متنوع خاندان ہے۔ Coumarin امیدوار فارماسولوجیکل سرگرمیوں کے ساتھ قدرتی مصنوعات کے سب سے زیادہ عام کنکال میں سے ایک ہے. تاہم، آج تک، بہت سے لوگوں نے پودوں سے GT کی اطلاع دی ہے جو بنیادی طور پر فلیوونائڈز کو چینی قبول کرنے والے کے طور پر تسلیم کرتے ہیں۔ صرف محدود GTs کومارین کے گلائکوسیلیشن کو متحرک کرسکتے ہیں۔ اس مطالعہ میں، ایک نئے UGT سے کلون کیا گیا تھاCistanche tubulosa، ایک قیمتی روایتی ٹانک چینی جڑی بوٹی، جو متنوع گلائکوسائیڈز جیسے فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز، لگنان گلائکوسائیڈز، اور ایریڈائڈ گلائکوسائیڈز سے بھرپور ہے۔ ترتیب کی سیدھ اور فائیلوجنیٹک تجزیہ نے یہ ظاہر کیا۔CtUGT1phylogenetically زیادہ تر رپورٹ کردہ flavonoid UGTs سے دور ہے اور phenylpropanoid UGTs سے ملحق ہے۔ وسیع پیمانے پر وٹرو ینجائم assays میں پایا کہ اگرچہCtUGT1میں بائیو ایکٹیو گلائکوسائیڈز کے بائیو سنتھیسز میں شامل نہیں تھے۔Cistanche tubulosa، یہ کافی پیداوار میں coumarins umbelliferone 1، esculetin 2، اور hymecromone 3 کے گلوکوسیلیشن کو متحرک کر سکتا ہے۔ glycosylated مصنوعات کی شناخت حوالہ معیارات یا NMR سپیکٹروسکوپی کے مقابلے کے ذریعے کی گئی تھی، اور نتائج نے اشارہ کیا کہCtUGT1C7- OH پوزیشن پر ہائیڈروکسیل کومارینز کے گلوکوسیلیشن کو علاقائی طور پر متحرک کر سکتا ہے۔ اہم اوشیشوں کا تعین کیاCtUGT1ہومولوجی ماڈلنگ اور مالیکیولر ڈاکنگ کے تجزیوں کی بنیاد پر کی سرگرمی پر مزید بحث کی گئی۔ سائٹ کی طرف سے ڈائریکٹڈ mutagenesis کے نتائج کے ساتھ مل کر، یہ پایا گیا کہ H19 نے کیٹالیسس کی اہم بنیاد کے طور پر ایک ناقابل تلافی کردار ادا کیا۔CtUGT1بائیو ایکٹیو کومرین گلائکوسائیڈز کی انزیمیٹک تیاری میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ:پلانٹ گلائکوسائلٹرانسفیریز، کومارین گلائکوسائیڈز،Cistanche tubulosaہومولوجی ماڈلنگ، سائٹ کی طرف سے ہدایت شدہ mutagenesis

cistanche اقتباس کے فوائد کی مصنوعات پر کلک کریں۔

تعارف

Glycosylation ثانوی قدرتی مصنوعات کی ساخت میں تبدیلی کی سب سے عام اقسام میں سے ایک ہے۔ Glycosylation aglycon کے استحکام اور/یا حل پذیری کو تبدیل کر سکتا ہے، اور متعدد کنجوجیشن اقسام کی وجہ سے قدرتی/غیر فطری مصنوعات کے تنوع میں بہت زیادہ حصہ ڈال سکتا ہے۔ پودوں میں، یہ رد عمل عام طور پر uridine diphosphate (UDP) پر منحصر glycosyltransferases (UGTs) کے ذریعے کیے جاتے تھے، ایک قسم کے انزائمز جو کہ متحرک نیوکلیوٹائیڈ شوگر سے ایک گلائکوسائل قبول کرنے والے مالیکیول میں مونوساکرائیڈ موئیٹیز کی منتقلی کو متحرک کرتے ہیں جو کاربوہائیڈر، گائیکوسیلٹرانسائیڈ، گلائکوہائیڈریٹس، گلائکوہائیڈریٹس ہو سکتا ہے۔ ، یا پولی سیکرائیڈ [1,2]

آج تک، UGT کو انکوڈنگ کرنے والے بہت سے جینز کو کئی پودوں سے الگ کر دیا گیا ہے [3]۔ گلائکوسیلیشن بنیادی طور پر ہائیڈروکسیل گروپس یا ثانوی مصنوعات کی ایک وسیع رینج کے کاربوکسائل گروپس میں ہوا، جیسے فلیوونائڈز [4]، فینیلپروپینائڈز [5]، ٹیرپینائڈز [6]، سٹیرائڈز [7]، الکلائڈز [8]، وغیرہ۔ Coumarins phenylpropanoids میٹابولائٹس ہیں جو پودوں کی بہت سی پرجاتیوں میں بڑے پیمانے پر تقسیم ہوتے ہیں۔ قدرتی طور پر پائے جانے والے کومارین اکثر گلائکوکونجگیٹس کے طور پر موجود ہوتے ہیں، اور یہ مشتق فارماسولوجیکل سرگرمیوں کے ایک وسیع میدان عمل کی نمائش کرتے ہیں، بشمول اینٹی آکسیڈینٹ [9]، اینٹی وائرل [10,11]، ہیپاٹوپروٹیکٹو [12]، سوزش روکنے والی [13]، اینٹی کینسر [14]۔ ]، antimutagenic [15]، اور cholinesterase (ChE) اور monoamine oxidase (MAO) روکنے والی سرگرمیاں [14,15]، وغیرہ۔ تاہم، آج تک، سب سے زیادہ رپورٹ ہونے والے اور وسیع پیمانے پر تحقیق شدہ flavonoids UGTs کے مقابلے میں، صرف محدود UGTs تھے۔ شوگر کی مقدار کو کومارین میں منتقل کرنے کے قابل بتایا گیا ہے [16-18]۔

متنوع گلائکوسائیڈز سے مالا مال پودے UGTs کے ایک مثالی جین پول کے طور پر کام کر سکتے ہیں جس میں ناول کیٹالیسس کی سرگرمیاں ہیں۔ مزید برآں، متعدد UGTs کے پاس متعدد ذیلی ذخیروں کے گلائکوسیلیشن کو متحرک کرنے کے لیے کافی قبول کنندہ کے پاس ہونے کی اطلاع دی گئی ہے، جن میں سے کچھ کو پودوں میں بھی الگ نہیں کیا گیا تھا [19]۔ اس مضمون میں، ایک ناول glycosyltransferaseCtUGT1سے شناخت کیا گیا تھاCistanche tubulosa، ایک روایتی دواؤں کی جڑی بوٹی جو متنوع گلائکوسائیڈز جیسے فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز (PhGs)، lignan glycosides، اور iridoid glycosides کے ساتھ وافر ہے۔ ہیٹرولوگس اظہار اور فنکشن کی خصوصیت نے یہ ظاہر کیا کہ اگرچہ دوبارہ پیدا ہونے والا ہے۔CtUGT1میں ان گلائکوسائیڈز کے بائیو سنتھیسز میں شامل نہیں تھا۔Cistanche tubulosa، یہ ہائیڈروکسیل کومارینز کے گلوکوسیلیشن کو متحرک کر سکتا ہے، اور یہ رد عمل ریجیو خاص طور پر کومارنز امبیلی فیرون 1 کی OH پوزیشن، بڑھتے ہوئے 2، اور ہائمکرومون 3 پر ہوا ہے تاکہ تین فارماسولوجیکل طور پر فعال مرکبات سکمنگ (1a)، (1a) پیدا ہو سکیں۔ ، اور 4-میتھیلمبیلیفریل گلوکوسائیڈ (3a) بالترتیب کافی پیداوار کے ساتھ۔ اس کے علاوہ، بینزوفینون سبسٹریٹ 4,4′-dihydroxy benzophenone (4)، isoflavone substrate genistein (5)، اور anthraquinone substrate aloe-emodin (6) کو بھی قبول کیا جا سکتا ہے۔CtUGT1. اتپریرک خصوصیات اور کلیدی اوشیشوں کی کٹالیسس کی صلاحیت کو واضح کرتی ہے۔CtUGT1ہومولوجی ماڈلنگ، آٹو ڈاک تجزیہ، اور سائٹ کی طرف سے ہدایت شدہ mutagenesis کی بنیاد پر بھی جانچا گیا۔

2. تجرباتی

2.1 پودوں کا مواد اور کیمیکل

Cistanche tubulosaاس مطالعہ میں استعمال کیا گیا ہیٹیان، سنکیانگ خود مختار علاقوں کے صحرائی علاقوں سے جمع کیا گیا تھا۔ ان کی نباتاتی شناخت کی تصدیق پیکنگ یونیورسٹی کے پروفیسر پینگفی ٹو نے کی۔ اس تحقیق میں تجربہ شدہ کومارنز اور دیگر ذیلی ذخائر سگما-الڈرچ (سینٹ لوئس، یو ایس اے)، چینگڈو پش بائیوٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (چینگڈو، چائنا) اور چینگڈو بائیو پیوریفائی فائٹو کیمیکل کمپنی لمیٹڈ (چینگڈو، چین) سے خریدے گئے تھے۔ ) جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا جائے۔ سکیمنگ (1a) اور cichoriin (2a) کے حوالے کے معیارات ووہان کیم فیسس بائیو کیمیکل کمپنی لمیٹڈ (ووہان، چین) سے خریدے گئے تھے۔

2.2 Cistanche tubulosa سے CtUGT1 کی سالماتی کلوننگ

کا کل آر این اےCistanche tubulosaاومیگا پلانٹ آر این اے کٹ (GA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے مانسل تنے سے نکالا گیا اور مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے PrimeScript™ RT ریجنٹ کٹ (TaKaRa, Japan) کے ساتھ cDNA میں الٹا نقل کیا گیا۔ ایک ڈیجنریٹ پرائمر 3′RACE کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا جس کی بنیاد پر محفوظ شدہ PSPG (پلانٹ سیکنڈری پروڈکٹ گلائکوسائل ٹرانسفریز) - پلانٹ گلائکوسائل ٹرانسفریز کے باکس میں امینو ایسڈ کی ترتیب کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔ کے 3′-end اور 5′-end amplificationsCtUGT1پرائمر (ٹیبل ایس 1) کا استعمال کرتے ہوئے مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق اسمارٹ ریس سی ڈی این اے ایمپلیفیکیشن کٹ (کلونٹیک، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ کی مکمل لمبائی سی ڈی این اےCtUGT1PCR کے ذریعے KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Japan) کا استعمال کرتے ہوئے مندرجہ ذیل شرائط کے تحت جین کے مخصوص پرائمر جوڑوں (ٹیبل S1) کے ساتھ بڑھایا گیا: 2 منٹ کے لیے 94 ◦C پر ابتدائی ڈینیچریشن مرحلہ، اس کے بعد ڈینیچریشن کے 35 چکر 15 s کے لیے 98 ◦C، 30 s کے لیے 55 ◦C پر اینیلنگ، اور 55 s کے لیے 68 ◦C پر توسیع، 7 منٹ کے لیے 68 ◦C پر آخری توسیعی قدم کے ساتھ۔ حاصل کیے گئے تمام ڈی این اے کے ٹکڑوں کو ایک pEASY-Blunt ویکٹر (TransGen Biotech، China) میں کلون کیا گیا اور ترتیب دیا گیا۔

2.3۔ ترتیب کی سیدھ اور فائیلوجنیٹک تجزیہ

کی ترتیب کی سیدھCtUGT1رپورٹ شدہ glycosyltransferases کے ساتھ (ٹیبل S2) DNAMAN 4{2}} سافٹ ویئر پیکج (Lynnon Biosoft, Canada) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ محرکات اور ڈومینز کا تجزیہ ایک محفوظ ڈومین ٹول (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ فائیلوجنیٹک درخت MEGA 7 کو بوٹسٹریپ کرکے بنایا گیا تھا۔ ترجمہ شدہ پروٹین کی ترتیبCtUGT1ClustalW کے ساتھ NCBI GenBank ڈیٹا بیس (ٹیبل S3) میں جمع کردہ معروف پلانٹ glycosyltransferases کے ساتھ منسلک کیا گیا تھا۔

2.4 Escherichia coli میں CtUGT1 کا ہیٹرولوگس اظہار اور پروٹین صاف کرنا

کا کوڈنگ علاقہCtUGT1ٹیبل S1 میں دکھائے گئے پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے پابندی والی سائٹوں کے طور پر BamH I اور Not I کے ساتھ بڑھا دیا گیا تھا۔ پی سی آر کے رد عمل KOD-Plus-Neo DNA Polymerase (TOYOBO، Osaka، Japan) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔ حاصل کردہ ترتیبوں کی تصدیق pEASY-Blunt ویکٹر (TransGen Biotech، China) میں کلوننگ کے ذریعے کی گئی۔ کی تصدیق شدہ امپلیفیکیشن پروڈکٹCtUGT1بعد میں ہضم کیا گیا اور اظہار ویکٹر pET-28a(plus ) (Novagen, USA) میں ذیلی کلون کیا گیا۔ تصدیق شدہ تعمیر کو پھر E. coli Transetta (DE3) میں تبدیل کر دیا گیا تاکہ دوبارہ پیدا ہونے والے تناؤ کو حاصل کیا جا سکے۔ 1:1{{ کے تناسب سے 50 ug⋅mL− 1 kanamycin اور 40 ug⋅mL− 1 chloromycetin پر مشتمل Luria-Bertani (LB) میڈیم میں راتوں رات دوبارہ پیدا ہونے والے تناؤ کی ثقافت کو ٹیکہ لگایا گیا تھا۔ 19}0۔ ثقافتوں کو 37 ◦C، 200 rpm پر اگایا گیا جب تک کہ OD600 کی قدر 0.4–0.6 تک نہ پہنچ جائے۔ Isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) کو بعد میں 0.5 mM کی حتمی حراستی میں شامل کیا گیا اور خلیات کو 18 ◦C، 180 rpm پر 16 گھنٹے تک بڑھایا گیا۔ پھر سیل چھروں کو سینٹرفیوگریشن (7600 ×g، 10 منٹ، 4 ◦C) کے ذریعے کاٹا گیا، اور 3 mL/g ٹھنڈا لیسیز بفر (ضمنی ڈیٹا نوٹ 1) میں دوبارہ معطل کیا گیا، اور برف پر سونیکیشن سے خلل پڑا۔ سیل کے ملبے کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 7600 ×g، 4 ◦C پر تقریباً 30 منٹ تک ہٹا دیا گیا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق پہلے سے متوازن ہسٹریپ کالم (جی ای ہیلتھ کیئر، اپسالا، سویڈن) وابستگی کرومیٹوگرافی کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ریکومبیننٹ پروٹین کو ایلیوشن بفر کے 10 کالم والیوم (ضمنی ڈیٹا نوٹ 1) کے ذریعہ تیار کیا گیا تھا جس میں 250 ایم ایم امیڈازول تھا۔ پروٹین کی پاکیزگی کا تجزیہ 10 فیصد SDS-PAGE سے کیا گیا۔ صاف شدہ پروٹین کو 30 kDa الٹرا فلٹریشن ٹیوب (سگما-الڈرچ، USA) کے ذریعے مرتکز کیا گیا تھا اور PD-10 کالم (GE ہیلتھ کیئر، اپسالا، سویڈن) کو ڈیسالٹنگ بفر (ضمنی ڈیٹا نوٹ 1) کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا۔ BSA کو بطور معیار استعمال کرتے ہوئے بریڈ فورڈ کے طریقہ کار سے پروٹین کی حراستی کا تعین کیا گیا تھا۔

2.5 انزیمیٹک ایکٹیویٹی اسسیس اور CtUGT1 کی سبسٹریٹ کی خصوصیت

کی glycosylation سرگرمی کی تحقیقات کرنے کے لئےCtUGT1، انزائم اسسیس کو ایک رد عمل کے مرکب (150 μL) میں انجام دیا گیا تھا جو کہ 0.4 mM aglycone، 0.8 mM UDP-گلوکوز (UDPG)، اور 50 ug پیوریفائیڈ پر مشتمل تھا۔CtUGT1ڈیسالٹنگ بفر میں پروٹین۔ تمام رد عمل کو 12 گھنٹے کے لیے 30 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا اور 300 μL کولڈ میتھانول شامل کرکے ختم کیا گیا۔ HPLC-UV/ESI-MS کے تجزیوں کے لیے سپرناٹینٹ کو جمع کرنے کے لیے مرکب کو 15،000 ×g پر 30 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ ہر رد عمل کے لئے تین متوازی اسیس معمول کے مطابق کیے جاتے تھے۔ HPLC (Agilent 1260, USA) 1 mL⋅min− 1، اور کالم کے درجہ حرارت کے بہاؤ کی شرح پر ایک diode array detector اور CAPCELL PAK C18 کالم (250 mm × 4.6 mm, 5 μm; Shiseido, Japan) سے لیس تھا۔ 30 ◦C پر برقرار رکھا گیا تھا۔ موبائل فیز A (یعنی 0.1 فیصد فارمک ایسڈ آبی محلول) اور B (یعنی ایسٹونیٹرائل) پر مشتمل تھا۔ تدریجی پروگرام ٹیبل S4 میں درج تھے۔ HRESI-MS ڈیٹا کو LCMS-IT-TOF سسٹم پر ریکارڈ کیا گیا تھا، جس میں ESI انٹرفیس (Shimadzu, Kyoto, Japan) لگایا گیا تھا جس میں الٹرا ہائی پیوریٹی He تصادم گیس کے طور پر اور N2 کو نیبولائزنگ گیس کے طور پر رکھا گیا تھا۔ آپٹمائزڈ ESI سورس پیرامیٹرز حسب ذیل تھے: میان گیس کے بہاؤ کی شرح، 1.5 mL⋅min− 1; معاون گیس کے بہاؤ کی شرح، 1.5 mL⋅min− 1؛ سپرے وولٹیج، 4.5 kV؛ کیپلیری درجہ حرارت، 200 ◦C۔ مکمل اسکین ایم ایس تجزیہ کے لیے سپیکٹرا کو 100–1500 m/z رینج میں ریکارڈ کیا گیا۔

2.6۔ رد عمل کے وقت کے اثرات، انزائم کی سرگرمی پر پی ایچ ویلیو اور درجہ حرارت، اور CtUGT1 کے حرکی مطالعہ

کی انزائم کی سرگرمی پر ردعمل کے وقت، پی ایچ کی قدر، اور درجہ حرارت کے اثراتCtUGT1جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے رد عمل کے حالات میں شوگر کے عطیہ دہندہ کے طور پر UDPG اور 3 کو شوگر قبول کرنے والے کے طور پر استعمال کرتے ہوئے ٹیسٹ کیا گیا۔ زیادہ سے زیادہ پی ایچ کے تعین کے لیے، انزائم کی سرگرمی کا موازنہ 100 mM بفر (سائٹرک ایسڈ-سوڈیم سائٹریٹ) میں پی ایچ کی قدروں کے ساتھ 3۔{12}} سے 6 تک کیا گیا۔ 14}}, 10{{20}} mM بفر (KH2PO4-K2HPO4) جس کی pH قدریں 6 سے ہیں۔{28}} سے 8۔{29} }، 100 mM بفر (Tris-HCl) جس کی pH قدریں 7.0 سے 9.0 تک ہیں، 100 mM بفر (Na2CO3-NaHCO3) pH اقدار کے ساتھ 9.0 سے 11.0 تک ہیں۔ زیادہ سے زیادہ رد عمل کے درجہ حرارت کی جانچ کرنے کے لیے، رد عمل کو 0 سے 65 ◦C تک کے مختلف درجہ حرارت پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ رد عمل کے ٹائم کورسز کا اندازہ 0 اور 24 گھنٹے کے درمیان 12 مختلف ٹائم پوائنٹس پر کیا گیا۔ تمام تجربات سہ رخی میں کیے گئے تھے۔ HPLC-MS کے ذریعہ رد عمل کے مرکب کا تجزیہ کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ کے کائنےٹک اسٹڈیز کے لیےCtUGT1100 μL کی حتمی والیوم میں انزیمیٹک اسیس انجام دیے گئے جس میں 100 mM KH2PO4-K2HPO4 بفر (pH 8.0)، 25 ug پیوریفائیڈCtUGT1, UDPG کا 3 mM، اور 3 کا مختلف ارتکاز (50–3000 μM)۔ رد عمل 37 ◦C پر 30 منٹ کے لیے کیے گئے اور پھر 100 μL آئس کولڈ میتھانول کے ساتھ ختم کیے گئے۔ ان تمام رد عمل کو سہ رخی میں انجام دیا گیا تھا، اور انزائم کی سرگرمی کا اندازہ متعلقہ گلوکوسیلیٹڈ ڈیریویٹوز کی مقدار کے ذریعے کیا گیا تھا۔ کائنےٹک پیرامیٹرز، بشمول Michaelis-Menten constant (Km) اور Vmax، گراف پیڈ پرزم 5 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے نان لائنر ریگریشن تجزیہ کے ذریعے شمار کیے گئے۔

2.7۔ CtUGT1 کی سبسٹریٹ اور شوگر ڈونر سلیکٹیوٹی

کی سبسٹریٹ ترجیحات کو دریافت کرنے کے لیےCtUGT1، مختلف ساختی اقسام سے تعلق رکھنے والے کل 27 ذیلی ذخیروں کا تجربہ UDPG کو بطور عطیہ دہندہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ ان کی کیمیائی معلومات کو ٹیبل S5 میں درج کیا گیا تھا، اور ان کے ڈھانچے کو انجیر میں دکھایا گیا تھا۔ S1 اور S2۔ شوگر کے عطیہ دہندگان کے انتخاب کی تحقیقات کے لیےCtUGT1umbelliferone (1)، esculetin (2)، hymecromone (3)، 4,4′-dihydroxy benzophenone (4)، genistein (5)، اور aloe-emodin (6) کو UDPG، UDP- کے ساتھ سبسٹریٹس کے طور پر استعمال کرتے ہوئے اسسیس کیے گئے تھے۔ N acetyl galactosamine، UDP-galactose، GDP-mannose، GDP-fucose، UDP galacturonic acid، UDP-rhamnose بطور شوگر عطیہ کرنے والے بالترتیب۔ تمام تجربات سہ رخی میں کیے گئے تھے۔ HPLC-MS کے ذریعہ رد عمل کے مرکب کا تجزیہ کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔

2.8۔ CtUGT1 کے ذریعے 4-میتھیلمبیلیفریل گلوکوسائیڈ (مرکب 3a) کی تیاری

تیاری کے رد عمل کا مرکب {{0}}.034 ملی میٹر سبسٹریٹ مرکب 3، 0.04 ملی میٹر یو ڈی پی جی، 5 ملی گرام پیوریفائیڈ پر مشتمل تھا۔CtUGT150 mL ردعمل بفر میں۔ زیادہ سے زیادہ حالات (100 mM KH2PO4-K2HPO4 کے ساتھ pH 8.0؛ 37 ◦C) پر رد عمل نرمی سے مشتعل تھے۔ 24 گھنٹے کے لیے 37 ◦C پر انکیوبیشن کے بعد، 30 منٹ کے لیے 12،000 ×g پر سینٹرفیوگ کرنے کے بعد ری ایکشن سپرنیٹنٹ کو کالم کرومیٹوگرافی کے ذریعے میکروپورس رال (MCI GEL CHP) کے ذریعے الگ کیا گیا۔ موبائل مرحلہ 100 فیصد پانی سے 100 فیصد میتھانول کا تدریجی اخراج تھا۔ HPLC-UV کے ذریعہ ہر ایک حصہ کا تجزیہ کیا گیا۔ صرف ٹارگٹڈ پروڈکٹس پر مشتمل فرکشن کم دباؤ کے تحت خشک ہونے کے لیے بخارات بن گئے اور 1H جوہری مقناطیسی گونج (NMR) سپیکٹروسکوپی اور 13C NMR سپیکٹروسکوپی کی خصوصیت ہے۔

2.9 مالیکیولر ڈاکنگ اور CtUGT1 کی سائٹ ڈائریکٹڈ mutagenesis

کا پروٹین ماڈلCtUGT1SWISS-MODEL [21-25] کا استعمال کرکے قائم کیا گیا تھا۔ Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) کے کرسٹل ڈھانچے کو ٹیمپلیٹ ڈھانچے کے طور پر منتخب کیا گیا تھا [26]۔ قائم کردہ ماڈل کا اندازہ VERIFY-3D [27,28] کے ذریعے کیا گیا۔ آٹو ڈاک وینا کو مالیکیولر ڈاکنگ اسٹڈیز [29] کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔ UGT74F2 [30] کا کرسٹل ڈھانچہ، Arabidopsis thaliana سے ایک glycosyltransferase، ligand UDP اور salicylic acid کے ساتھ کمپلیکس میں (PDB ID 5U6M) کو بالترتیب شوگر ڈونر جیب اور شوگر قبول کرنے والے جیب کے تجزیہ کے لیے کنٹرول ڈھانچے کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ . MGLTools (مالیکیولر گرافکس لیبارٹری ٹولز) سے آٹو-ڈاک ٹولز 1.5.6 کو شوگر ڈونر UDPG اور مالیکیولر ڈاکنگ کے لیے سبسٹریٹ 1, 2 تیار کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ فعال سائٹ کے گہا کے ارد گرد باقیات کی سائیڈ چینز کو لچکدار سیٹ کیا گیا تھا، اور لیگنڈس کے گھومنے کے قابل بانڈز کو گھومنے کے لیے آزاد چھوڑ دیا گیا تھا۔ سب سے زیادہ (kcat/mol) وابستگی کے ساتھ Vina ڈاکنگ ماڈل کے ذریعہ فیصلہ کیے گئے اعلی درجے کے پوز کو PyMOL 2.0 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے بصری تجزیہ کا نشانہ بنایا گیا۔

mutagenesis تحقیقات کے لئے، ترتیب مرضی کے جینCtUGT1(ضمنی اعداد و شمار نوٹ 2) کو جنگلی قسم کے طور پر ترکیب اور جانچا گیا تھا۔ کی سائٹ کی طرف سے ہدایت mutagenesisCtUGT1فاسٹ میوٹیجینیسیس سسٹم (ٹرانسجن بائیوٹیک) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ اتپریورتیوں کو آپٹمائزڈ جین کے سانچے سے بڑھایا گیا تھا جسے ٹیبل S1 میں دکھائے گئے مخصوص پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے ایک ویکٹر میں پی ای ٹی-28تعمیر کیا گیا ہے۔ متضاد اظہار کے لیے E. coli (DE3) میں تبدیل ہونے سے پہلے تعمیر شدہ اتپریورتیوں کی تصدیق PCR اور ترتیب کے ذریعے کی گئی۔ جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے پروٹین صاف کرنے اور انزائم کے رد عمل کو انجام دیا اور تجزیہ کیا گیا۔

3. نتائج اور مباحثہ

3.1 CtUGT1 جین کی مکمل لمبائی cDNA کلوننگ سےCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) ایک روایتی چینی دواؤں کی جڑی بوٹی ہے جو مختلف قسم کے بایو ایکٹیو قدرتی گلائکوسائیڈز تیار کرتی ہے۔ اس کے جینوم میں موجود نئے glycosyltransferases جینز کی کافی تعداد ہونی چاہیے۔ دلچسپ کیٹالیسس سرگرمیوں کے ساتھ ناول گلائکوسائل ٹرانسفریز تلاش کرنے کے لیے، 3′-RACE کے لیے ایک ڈیجنریٹ پرائمر کو محفوظ شدہ PSPG شکل کی بنیاد پر ڈیزائن کیا گیا تھا تاکہ اجازت دینے والے UGTs کو کلون کیا جا سکے۔Cistanche tubulosa. حاصل کردہ 3′ اختتامی ترتیب کا مزید تجزیہ NCBI بلاسٹ نے کیا اور 5′-RACE کے لیے مخصوص پرائمر حاصل کردہ ترتیب کی بنیاد پر ڈیزائن کیا گیا۔ بڑھا ہوا 5′ cDNA ختم ہوتا ہے اور 3′ cDNA کے سروں کو الگ کر دیا گیا تھا اور اس کی پوری لمبائیCtUGT1ترتیب، بشمول 1739 نیوکلیوٹائڈز، حاصل کیا گیا تھا (تصویر S3) اور ضمنی ڈیٹا نوٹ 3 میں درج ہے۔ اس کے بعد، ایک اوپن ریڈنگ فریم (ORF)CtUGT1NCBI ORF فائنڈر ٹولز کے ذریعہ پایا گیا تھا اور 1482 bp کوڈنگ کی ترتیب کو ٹیبل S1 میں مخصوص پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے RT-PCR ایمپلیفیکیشن کے ذریعے کامیابی کے ساتھ کلون کیا گیا تھا۔ CtUGT1 کا cDNA تسلسل NCBI (الحاق نمبر MW629113) کو جمع کرایا گیا ہے۔

3.2 ترتیب کا تجزیہ اور CtUGT1 کا متضاد اظہار

دیCtUGT1جین سے 55.78 kDa کے تخمینہ مالیکیولر ماس کے ساتھ 493 امینو ایسڈ کی باقیات کے پروٹین کو انکوڈ کرنے کی توقع تھی۔ این سی بی آئی کے دھماکے میں انکشاف ہوا کہ پروٹین کی ترتیب کی کٹوتیCtUGT1UGT86A1-جیسے خامروں کے ساتھ سب سے زیادہ شناخت (76.39 فیصد) کا اشتراک کرتا ہے۔ اس قسم کے انزائم کے بائیو کیمیکل افعال کو مکمل طور پر نمایاں نہیں کیا گیا ہے۔ یہ پیشین گوئی کی گئی ہے کہ وہ پودوں کی موافقت میں ابیوٹک دباؤ میں شامل ہوسکتے ہیں۔ CtUGT1 اور دیگر پودوں کے glycosyltransferases کے امینو ایسڈ کی ترتیب کو تصویر S4 میں دکھایا گیا ہے۔

PSPG شکل کی انتہائی محفوظ 44 باقیات سی ٹرمینل پر پائی گئیں۔CtUGT1. PSPG-box کے اندر، HCGWNS کا ایک پیپٹائڈ تسلسل 373 ویں امینو ایسڈ پر واقع تھا، جو تمام گلائکوسائل ٹرانسفریز کے 95 فیصد میں پایا گیا ہے [31]۔ PSPG شکل کی آخری باقیات گلوٹامین تھی، جس نے اشارہ کیا کہ یہ انزائم UDPG کو اپنے شوگر ڈونر کے طور پر استعمال کرتا ہے [32] (تصویر S4)۔ فائیلوجنیٹک درخت کی پیش گوئی پولی پیپٹائڈ کی ترتیب کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔CtUGT1اور مختلف قسم کے پودوں کی اصل glycosyltransferases جو مختلف ثانوی میٹابولائٹس کے بائیو سنتھیسس میں شامل تھے۔ اب تک، پودوں سے زیادہ تر رپورٹ شدہ گلائکوسائل ٹرانسفریز نے فلیوونائڈز کو ان کے ذیلی ذخیرے کے طور پر تسلیم کیا ہے، جیسے کہ فلاوون 7-O-glycosyltransferases، flavonoid 3-O-glucosyltransferases، isoflavone 7-O-glycosyltransferases، اور چالکون گلائکوسائلٹرانسفیریز۔ Phylogenetic تجزیہ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہCtUGT1flavonoid GTs کے کلیڈ میں گروپ نہیں کیا گیا ہے۔ اس کے بجائے، یہ UGT74T1 اور UGT74S1 (Linum usitatissimum سے lignan glycosyltransferases) اور NtGT2 (Nicotiana tabacum سے coumarin glycosyltransferase) کے قریب واقع ہے، جس نے اشارہ کیا کہCtUGT1فینیلپروپینائڈ سبسٹریٹس (تصویر 1) کی طرف کچھ نئی کیٹالیسس سرگرمیاں ہو سکتی ہیں، خاص طور پر اس بات پر غور کیا گیا ہے کہ ان کلیڈز سے تعلق رکھنے والے صرف محدود اراکین کو فعال طور پر شناخت کیا گیا ہے۔

اس کی کیٹالیسس سرگرمی کو مزید ظاہر کرنے کے لیے،CtUGT1ترتیب کو E. coli Transetta (DE3) خلیوں میں T7 lac پروموٹر کے کنٹرول میں اس کے 6-ٹیگ شدہ فیوژن پروٹین کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ اس کا ٹیگ شدہ دوبارہ پیدا کرنے والاCtUGT1Ni–NTA affinity chromatography کے ذریعے مؤثر طریقے سے یکسانیت سے پاک کیا گیا تھا۔ پیوریفائیڈ ریکومبیننٹ CtUGT1 کا مالیکیولر وزن تقریباً 55 kDa (تصویر S5) تھا، جو کہ پیش گوئی شدہ مالیکیولر ماس کے مطابق ہے۔

3.3 CtUGT1 کی وٹرو قبول کنندہ سبسٹریٹ کی خصوصیت

کی glycosylation سرگرمی کی جانچ کرنے کے لئےCtUGT1، ان وٹرو انزیمیٹک اسسز انجام دیئے گئے تھے۔ UDPG شوگر ڈونر کے طور پر استعمال ہوتا تھا۔ شوگر قبول کرنے والوں کا انتخاب مختلف خدشات کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔ سب سے پہلے،CtUGT1جین سے کلون کیا گیا تھا۔Cistanche tubulosaجس کے اہم کیمیائی اجزاء PhGs ہیں۔ اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ آیاCtUGT1پی ایچ جی کے بائیو سنتھیسز میں شامل ہے، پی ایچ جی کے عام اگلیکونزCistanche tubulosaجیسے ٹائروسول (NP1, Fig. S2) اور salidroside (NP2, Fig. S2) سب سے پہلے سبسٹریٹس کے طور پر منتخب کیے گئے تھے۔ بدقسمتی سے، HPLC اور HRESI-MS کے تجزیوں میں کوئی گلائکوسلیٹڈ پروڈکٹس نہیں ملے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہCtUGT1پی ایچ جی کے بائیو سنتھیسس میں شامل نہیں ہوسکتا ہے۔

دوم، ترتیب کی ترتیب اور فائیلوجنیٹک تجزیہ کے نتائج کی بنیاد پر (تصویر 1)،CtUGT1phylogenetically lignanoid اور coumarin glycosyltransferases سے متعلق تھا، جس نے تجویز کیا کہCtUGT1شاید ایک phenylpropanoid glycosyltransferase ہے۔ اس پیشین گوئی کی توثیق کرنے کے لیے، تین کومارین سبسٹریٹس 1، 2، اور 3 ایک ساتھ مل کر ایک lignanoid سبسٹریٹ میگنولول NP17 کا بالترتیب شوگر قبول کرنے والوں کے طور پر تجربہ کیا گیا۔ حرارت سے غیر فعال انزائمز (100 ◦C، 10 منٹ) کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ HPLC-HRESI-MS NP17 کو بطور سبسٹریٹ استعمال کرتے ہوئے رد عمل کے تجزیہ میں کوئی پروڈکٹ نہیں ملی۔ اس کے برعکس،CtUGT1ٹیسٹ شدہ کومارین سبسٹریٹس (1،2،3) کے خلاف گلوکوسیلیشن کی واضح صلاحیتوں کو ظاہر کیا۔ مثال کے طور پر سبسٹریٹ 1 کا استعمال کرتے ہوئے، جیسا کہ تصویر 2A میں دکھایا گیا ہے، سبسٹریٹ 1 (19.75 منٹ) کے مقابلے میں ایک نئی چوٹی (1a) جس میں برقرار رکھنے کے وقت میں کمی (11.46 منٹ) تھیCtUGT137.78 فیصد کی پیداوار پر۔ اس کا یووی جذب سپیکٹرم 1 کے مساوی ہے۔ HRESI-MS سپیکٹرم نے ظاہر کیا کہ چوٹی 1a نے m/z 325.1029 پر ایک [M پلس H] پلس، اور m/z 347.0710 پر ایک [M پلس Na] جمع ظاہر کیا (calcd. ) C15H16O8 کے پیشن گوئی شدہ فارمولے کے ساتھ، جو کہ 1 سے 162 amu زیادہ تھا اور گلوکوسلیٹڈ پروڈکٹ کے نظریاتی فارمولے سے مطابقت رکھتا ہے (تصویر 2A)۔ اسی طرح، سبسٹریٹ 2 (14.21 منٹ، تصویر 2B) اور 3 (21.92 منٹ، تصویر 2C) کا گلوکوسلیٹڈ پروڈکٹ بھی 10.85 منٹ اور 13.80 منٹ کے برقرار رکھنے کے وقت پایا گیا، جس میں تبدیلی کی شرح 22.03 فیصد اور 68.7 فیصد ہے۔ بالترتیب مصنوعات کا مالیکیولر ماس گلوکوسلیٹڈ پروڈکٹس کے حسابی ماس کے ساتھ بالکل مماثل ہے، جس نے اس بات کی تصدیق کیCtUGT1کومارین مرکبات 1–3 (ٹیبل 1) کے گلوکوسیلیشن کو متحرک کرسکتا ہے۔

اس کے بعد، اس بات پر غور کرتے ہوئے کہ حال ہی میں رپورٹ کیے گئے زیادہ تر انزائمز نے وٹرو میں کیٹالیسس پراسکیوٹی کا مظاہرہ کیا، تاکہ اس کے سبسٹریٹ سپیکٹرم کو مزید دریافت کیا جا سکے۔CtUGT1، مختلف قسم کے قدرتی مصنوعات سے تعلق رکھنے والے متنوع مرکبات کی طرف وسیع پیمانے پر انزائم اسسیس کیے گئے، بشمول فلاوونائڈز، فینولک مرکبات، کومارینز، اسٹیلبین، اینتھراکوئنز، بینزوفینون، نیفتھلین، اور iridoid (Figs. S1-S2)، UDPG کے طور پر استعمال کرتے ہوئے شوگر ڈونر. یہ پایا گیا کہ بینزوفینون سبسٹریٹ 4,4′-dihydroxy benzophenone (4)، isoflavone substrate genistein (5)، اور anthraquinone substrate aloe-emodin (6) کو بھی اتپریرک کیا جا سکتا ہے۔CtUGT1اعلی قطبیت (تصویر 3) کے ساتھ متعلقہ گلوکوسیلیٹڈ پروڈکٹ 4a, 5a, 6a بنانے کے لیے۔ HRESI-MS تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ مصنوعات کی آئن چوٹیاں سبسٹریٹس سے 162 amu زیادہ تھیں، یہ تجویز کرتی ہے کہCtUGT1ان مرکبات کے گلوکوسیلیشن کو ان کے متعلقہ مونو گلوکوسائیڈ پروڈکٹ بنانے کے لیے متحرک کر سکتا ہے۔ 4، 5 اور 6 کی تبادلوں کی شرح بالترتیب 4.12 فیصد، 14.14 فیصد اور 23.33 فیصد تھی (ٹیبل 1)۔

شوگر کے عطیہ دہندگان کی سلیکٹیوٹیCtUGT1بھی دریافت کیا گیا تھا. UDPG کے علاوہ، چھ دیگر عطیہ دہندگان، بشمول UDP-N-acetyl galactosamine، UDP galactose، GDP-mannose، GDP-fucose، UDP-galacturonic acid، اور UDP rhamnose، کو قبول کنندگان کے طور پر سبسٹریٹس 1–6 کا استعمال کرتے ہوئے جانچا گیا۔ نتائج نے یہ ظاہر کیا۔CtUGT1خصوصی طور پر UDPG کو شوگر کے عطیہ دہندہ کے طور پر منتخب کیا گیا۔ جب دیگر چالو شکروں کی جانچ کی گئی تو کوئی پروڈکٹ نہیں دیکھا گیا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔

3.4 حیاتیاتی کیمیائی خصوصیات اور CtUGT1 کے حرکیاتی پیرامیٹرز

کی حیاتیاتی کیمیائی خصوصیاتCtUGT13 کو شوگر قبول کرنے والے کے طور پر اور UDPG کو شوگر کے عطیہ دہندہ کے طور پر استعمال کرتے ہوئے تحقیق کی گئی جیسا کہ تصویر 4 میں اشارہ کیا گیا ہے۔ کٹالیسس سرگرمیCtUGT14–60 ◦C درجہ حرارت کی حد میں جانچا گیا، بہترین سرگرمی 37 ◦C (تصویر 4A) پر پائی گئی۔ پی ایچ 3۔{7}} اور 9۔{9}} کے درمیان انزائم کی سرگرمی کا تجزیہ ظاہر کرتا ہے کہ پی ایچ 8.0 (100 ایم ایم بفر KH2PO4-K2HPO4، تصویر 4C) پر بہترین pH قدر دیکھی گئی۔ گلوکوسیلیشن پروڈکٹ 3a کی پیداوار میں 1 گھنٹہ کے اندر خطی طور پر اضافہ ہوا اور شرح نمو 5 گھنٹے کے بعد برابر ہو رہی تھی (تصویر 4B)۔ کی ظاہری کلومیٹر قدرCtUGT13 کے لیے 218.7 ± 7.176 μM تھا، اور Vmax 0 تھا۔{7}}2255 ± 0.0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1۔

3.5 انزیمیٹک تیاری اور گلوکوسیلیٹڈ مصنوعات کی ساختی شناخت

انزائم اسیس کے نتائج کی بنیاد پر،CtUGT1ایک مخصوص گلوکوسائلٹرانسفیریز ہوتا ہے جو مختلف قسم کی قدرتی مصنوعات کے گلوکوسیلیشن کو متحرک کرسکتا ہے۔ مصنوعات کی HPLC-HR-MS معلومات کا خلاصہ جدول 1 میں دیا گیا ہے۔ ان میں سے، کومارین سبسٹریٹس نے کافی تبادلوں کی شرح کی نمائش کی۔ کومارینز کے خلاف انزائم کی سرگرمی کا مزید تجزیہ کیا گیا۔ واضح رہے کہ تینوں تجربہ شدہ کومارین سبسٹریٹس نے قبول کیا ہے۔CtUGT1C-7 پوزیشن پر ایک ہائیڈروکسیل گروپ ہے، جبکہ ایسکولیٹین (2) کے پاس C-6 پوزیشن پر ایک اضافی ہائیڈروکسیل گروپ ہے۔ esculetin کے گلوکوسائلیٹڈ پروڈکٹ کا HPLC پروفائل تصویر 2 میں دکھایا گیا ہے۔ صرف ایک پروڈکٹ کا مشاہدہ کیا گیا، جس سے پتہ چلتا ہے کہ گلوکوسائلیشن ری ایکشن ریجیو خاص طور پر C-6 یا C-7 پوزیشن پر ہوا ہے۔ گلائکوسیلیشن سائٹ کی تصدیق کرنے کے لیے، پروڈکٹ 2a کی شناخت HPLC-UV/HRESI-MS تجزیہ کے ذریعے مستند گلوکوسائیڈز کے مقابلے میں کی گئی۔ رد عمل کے نظام میں مستند گلوکوسائیڈ سیچورین (7-2 کی OH پوزیشن پر گلوکوسائلڈ) کو شامل کرتے وقت، چوٹی 2a کے ساتھ اوورلیپ ہو گئی، شریک HPLC پروفائل نے مزید تصدیق کی کہ 2 کا گلائکوسلیٹڈ پروڈکٹ اتپریرکCtUGT1cichoriin [33] ہے، جس نے ثابت کیا کہ گلوکوزائل موئیٹی خاص طور پر C7-OH پوزیشن پر منتقل کی گئی تھی۔ پروڈکٹ 1a کی شناخت بھی حوالہ معیار کے ساتھ موازنہ کرکے کی گئی تھی۔ UV-HPLC سپیکٹرا کے ساتھ شریک HPLC تجزیہ (تصویر 2) نے انکشاف کیا کہ 1a کی کیمیائی ساخت کو سکیمنگ [34] کے طور پر منسوب کیا گیا تھا، جو C7-OH پوزیشن پر 1 کا گلوکوسلیٹڈ پروڈکٹ ہے۔

پروڈکٹ 3a کو ایک بڑے پیمانے پر رد عمل سے تیار کیا گیا تھا اور ساختی طور پر HRESI-MS، 1H NMR، اور 13C NMR سپیکٹروسکوپی (تصویر S13، S14، اور نوٹ 4) کی خصوصیت تھی۔ 1H NMR سگنل میں، سبسٹریٹ 3 کے مقابلے میں، C{{10}} پوزیشن پر ایک فینولک ہائیڈروکسیل سگنل غائب ہو گیا، اور C-7 کا کاربن سگنل δ 1 منتقل ہو گیا۔{25} } ppm ہائی فیلڈ میں، جبکہ C-6 اور C-8 سگنل 13C NMR میں کم فیلڈ میں شفٹ ہو گئے۔ ان نتائج نے اس بات کی تصدیق کی کہ گلوکوپیرانوسیل کی باقیات 3 [35] کی C-7 پوزیشن پر فینولک ہائیڈروکسیل گروپ کے ساتھ منسلک تھیں۔ اس کے علاوہ، 1H NMR سپیکٹرم نے δH 5 پر anomeric پروٹون سگنل دکھائے۔{22}} (1H, d, J=7.0 Hz); شوگر کا جزو -D-glucopyranose ہونے کا اشارہ کیا گیا تھا۔ اس نتیجہ نے ظاہر کیا۔CtUGT1ایک coumarin O-glucosyltransferase ہے جس نے hydroxyl coumarin کے گلوکوسیلیشن کو 7-OH پوزیشن پر اتپریرک کیا۔

3.6۔ ہومولوجی ماڈلنگ، مالیکیولر ڈاکنگ، اور CtUGT1 پروٹین کی سائٹ ڈائریکٹڈ mutagenesis

وسیع پیمانے پر انزائم رد عمل نے انکشاف کیا کہCtUGT1تین کومارین کے گلوکوسیلیشن کو ان کے متعلقہ گلوکوسلیٹڈ پروڈکٹ میں اتپریرک کر سکتا ہے، اور گلوکوسیلیٹڈ پوزیشن خاص طور پر 7- OH پوزیشن پر واقع ہوئی۔ کی کیٹالیسس سرگرمیوں کا تعین کرنے والے کلیدی اوشیشوں کی نشاندہی کرناCtUGT1، ہومولوجی ماڈلنگ، مالیکیولر ڈاکنگ، اور CtUGT1 کی سائٹ پر مبنی mutagenesis تحقیقات کی گئیں۔ CtUGT1 کے لئے ہم جنس مالیکیولر ماڈلنگ SWISS-MODEL [21-25] کا استعمال کرتے ہوئے قائم کی گئی تھی۔ Medicago truncatula glycosyl transferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) کا کرسٹل ڈھانچہ، جس کا تعین 2.1 Å کے ریزولوشن پر کیا گیا، نے زیادہ سے زیادہ ترتیب ہومولوجی اور کم E-value کے ساتھ سب سے زیادہ کل سکور دکھایا، ٹیمپلیٹ ڈھانچے کے طور پر منتخب کیا گیا [26]۔ قائم کردہ ماڈل کی معقولیت کا اندازہ رامچندرن پلاٹ (تصویر S6) میں دکھایا گیا ہے، قائم کردہ ماڈل میں 88.5 فیصد باقیات سب سے زیادہ پسندیدہ علاقے میں ہیں۔ CtUGT1 کا ہومولوجی ماڈل بالترتیب N- اور C-ٹرمینل میں دو ملتے جلتے Rossmann-type folds motifs پر مشتمل ہے (تصویر 5A)۔ N-ٹرمینل ڈومین میں سات پھنسے ہوئے متوازی چادریں ہیں جن کے ارد گرد دس ہیلیکس ہیں۔ سی ٹرمینل ڈومین چھ پھنسے ہوئے شیٹس پر مشتمل ہے جس میں نو ہیلائسز (تصویر 5A، S7) ہیں۔

کی فعال جیب کو مزید واضح کرنے کے لیےCtUGT1، سالماتی ڈاکنگ کی گئی تھی۔ چونکہ UGT85H2 میں صرف apo فارم کا ڈھانچہ ہے، ایک اور ہومولوگ UGT74F2 جس میں UDP اور سیلیسیلک ایسڈ دونوں ہیں بطور دو ligands کو کنٹرول ٹیمپلیٹ کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ UDPG کو شوگر ڈونر کے طور پر تیار کیا گیا تھا۔ دو کومارین سبسٹریٹس 1 اور 2 کو بالترتیب شوگر قبول کرنے والوں کے طور پر تیار کیا گیا تھا۔ گلائکوسائل ڈونر اور قبول کنندہ کی بائنڈنگ سائٹس کا حساب لگایا گیا اور انہیں الگ سے ڈوک کیا گیا جیسا کہ تصویر 5 میں دکھایا گیا ہے۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ دونوں بائنڈنگ جیبیں مضبوطی سے بھرے N-ٹرمینس ڈومین اور C کے تعامل کے علاقے میں گہری درار کے اندر واقع ہیں۔ - کا ٹرمینس ڈومینCtUGT1اور مقامی طور پر ایک دوسرے کے قریب (تصویر 5A)۔ کا سی ٹرمینسCtUGT1بنیادی طور پر گلائکوسائل ڈونر کے ساتھ رابطے میں شامل ہے جیسا کہ دوسرے پودوں کے UGTs میں بیان کیا گیا ہے، اور آس پاس کی زیادہ تر باقیات ہائیڈرو فیلک اور انتہائی محفوظ ہیں۔ جیسا کہ عام پی ایس پی جی باکس، اس شکل میں باقیات W377 UDPG (تصویر 5B) کے گلوکوز گروپ کے ساتھ ہائیڈروجن بانڈ بنا سکتے ہیں۔ اس شکل میں N378 اور S379 UDPG کے ڈائی فاسفیٹ گروپ (تصویر 5B) کے ساتھ ہائیڈروجن بانڈ بنا سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، ڈاکنگ کے نتائج کے مطابق، W356 اور Q359 کے باقیات ہائیڈروجن بانڈ کے تعامل کے ذریعے یوریڈین گروپ کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں تاکہ فعال جیب میں ڈونر کو مستحکم کیا جا سکے۔ ان پیش گوئی شدہ کلیدی اوشیشوں کے کام کی توثیق کرنے کے لئے، کل 16 سائٹس کا انتخاب کیا گیا اور الانائن اسکیننگ میوٹیجینیسیس کا نشانہ بنایا گیا۔ ان اتپریورتیوں کی کیٹالیسس سرگرمیوں کا تجربہ مذکورہ تمام چھ مثبت ذیلی ذخیروں کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ HPLC کے تجزیوں سے پتہ چلتا ہے کہ جب G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397, اور D398 کی باقیات کو تبدیل کر دیا گیا تو glancosy کی سرگرمی تھی تمام آزمائشی ذیلی ذخیروں کی طرف مکمل طور پر کھو گیا ہے۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ مذکورہ بالا 16 باقیات وہ کلیدی باقیات ہیں جو UDPG ڈونر کے پابند ہونے اور گلائکوسیلیشن کی سرگرمی کا تعین کرتی ہیں۔CtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 فیصد ) جیسے V14، V132، E153، T212، اور I209 (تصویر S8)۔ یہ پیش گوئی کی گئی ہے کہ خوشبو دار انگوٹھی کے ارد گرد موجود یہ ہائیڈروفوبک باقیات بائنڈنگ جیب میں موجود سبسٹریٹ کے ساتھ وین ڈیر والز کے تعامل کو تشکیل دے سکتے ہیں۔

4. بحث

Glycosylation بہت سے ثانوی میٹابولائٹس کے بائیو سنتھیس کے راستوں میں ترمیم کے اہم ترین مراحل میں سے ایک ہے۔ گلائکوسیلیشن قدرتی مصنوعات کی پانی میں حل پذیری کو بہتر بنا کر اور ان کے زہریلے پن کو کم کر کے حیاتیاتی دستیابی کو بڑھا سکتی ہے۔ کومارین کو قدرتی طور پر پائے جانے والے فینولک مادوں کی ایک بڑی کلاس کے اندر سب سے آسان شکل سمجھا جاتا ہے جو بینزین کی انگوٹھی کے ساتھ ملائے ہوئے پائرون انگوٹھی سے بنایا گیا ہے۔ دونوں قدرتی اور مصنوعی کومارین پر مبنی مرکبات نے دواؤں کے کیمسٹوں اور منشیات کے ڈیزائن کے سائنسدانوں کی اپنی متنوع فارماسولوجیکل اور حیاتیاتی خصوصیات کے نتیجے میں بہت زیادہ توجہ مبذول کی ہے [36]۔ کومارین کی مزید گلائکوسلیٹڈ ترمیم ان مرکبات کے ساختی تنوع کو تقویت دینے اور ان کی حل پذیری اور جیو دستیابی کو بھی بہتر بنانے میں مدد دے سکتی ہے۔ پودوں میں، اس طرح کے گلائکوسیلیشن کے عمل کو UDP-glycosyltransferase کے ذریعے اتپریرک کیا جاتا ہے۔ اگرچہ آج تک مختلف پودوں سے متعدد UGTs کی نشاندہی کی گئی ہے، زیادہ تر رپورٹ شدہ UGTs flavonoids کی glycosylated ترمیم میں ملوث تھے۔ صرف محدود UGTs کے بارے میں بتایا گیا ہے کہ وہ کومارین کو ذیلی جگہوں کے طور پر قبول کرنے کے قابل ہیں۔ اس مطالعہ میں، ایک نیا glycosyltransferase جینCtUGT1روایتی چینی جڑی بوٹی سے کلون کیا گیا تھاCistanche tubulosa. ترتیب کی سیدھ اور فائیلوجنیٹک تجزیہ کے نتائج نے ظاہر کیا۔CtUGT1phylogenetically زیادہ تر رپورٹ کردہ flavonoid UGTs سے دور ہے، اور phenylpropanoid UGTs کے بہت قریب ہے۔ وسیع پیمانے پر انزائم اسسیس نے انکشاف کیا کہ CtUGT1 فینائل ایتھنول مرکبات کے گلائکوسیلیشن کو پی ایچ جی بنانے کے لیے اتپریرک نہیں کر سکتا، جو کہ کا بنیادی کیمیائی جزو ہے۔Cistanche tubulosa. اس کے بجائے، یہ coumarins کو اس کے ذیلی ذخیرے کے طور پر پہچان سکتا ہے، اور glycosylation کا رد عمل کر سکتا ہے۔ مصنوعات کی ساخت کی وضاحت سے پتہ چلتا ہے کہ گلیکوسیلیشن سائٹ کی طرف سے اتپریرکCtUGT1ریجیو خاص طور پر کمارینز کی C7-OH پوزیشن پر ہوا۔ CtUGT1 کا استعمال کرتے ہوئے، تین coumarin glycosides بشمول skimming (1a)، cichoriin (2a)، اور 4-methylumbelliferyl glucoside (3a) کو کامیابی کے ساتھ انزیمیٹک ترکیب اور ساختی طور پر شناخت کیا گیا۔ ان تینوں مرکبات کو دواسازی کے طور پر فعال مالیکیول کے طور پر رپورٹ کیا گیا تھا۔ مثال کے طور پر، 1a کو مختلف فارماسولوجیکل سرگرمیوں کا حامل سمجھا جاتا ہے، جن میں رینو پروٹیکٹو سرگرمی، اینٹی سوزش، اینٹی کینسر، اور اینٹی امیبک خصوصیات شامل ہیں [37]۔ 2a نے کچھ گرام مثبت بیکٹیریا جیسے بیکیلس سیریئس اور اسٹیفیلوکوکس اوریئس کے خلاف اعلی اینٹی بیکٹیریل سرگرمی ظاہر کی [38]۔ 3a پودوں کو کیمیکلز اور زہریلے مادوں کے خلاف ردعمل کی صلاحیتوں کو بہتر بنانے میں مدد کر سکتا ہے [39]۔

coumarins کے علاوہ، وسیع پیمانے پر انزائم اسسیس نے پایاCtUGT1بینزوفینون سبسٹریٹ 4، آئسوفلاون سبسٹریٹ 5، اور اینتھراکوئنون سبسٹریٹ 6 کی طرف قابل مشاہدہ گلوکوسیلیشن سرگرمی بھی دکھائی گئی، جس نے اشارہ کیا کہ CtUGT1 میں کچھ مخصوص سبسٹریٹ رواداری ہے۔ بہر حال،CtUGT1میں glycosides اجزاء کی حیاتیاتی ترکیب کو متحرک نہیں کر سکتاCistanche tubulosaجیسے phenylethanoid glycosides (PhGs)، lignanoid glycosides، اور iridoid glycosides۔ اس کے علاوہ، پچھلی تحقیقات کے مطابق، کوئی کومارین گلائکوسائیڈز کو الگ تھلگ نہیں کیا گیا تھا۔Cistanche tubulosa. تو، کا vivo فنکشنCtUGT1اب بھی مزید دریافت کرنے کی ضرورت ہے. کومارین سبسٹریٹس کی طرف CtUGT1 کی گلوکوسیلیشن سرگرمی اس انزائم کو کومارینز کے انزیمیٹک گلائکوسیلیشن ترمیم کے لیے ایک کارآمد ٹول بناتی ہے اور یہ بھی اشارہ کیا کہ پودے کے ثانوی میٹابولک انزائمز ناقابل یقین کیٹالیسس سرگرمیاں انجام دے سکتے ہیں جو ان کے مقامی افعال سے بہت آگے ہیں۔

مسابقتی دلچسپی کا اعلان

مصنفین اعلان کرتے ہیں کہ مفادات کا کوئی تنازعہ نہیں ہے۔

اعتراف

اس کام کی مالی مدد بیجنگ نیچرل سائنس فاؤنڈیشن (گرانٹ نمبر 7192112) نے کی تھی۔ CAST کی طرف سے ینگ ایلیٹ سائنٹسٹ اسپانسرشپ پروگرام (گرانٹ نمبر CACM− 2018− QNRC1− 02)؛ چین کی نیشنل نیچرل سائنس فاؤنڈیشن (گرانٹ نمبر 81402809)؛ چائنا اسکالرشپ کونسل اسٹیٹ اسکالرشپ فنڈ (گرانٹ نمبر 201906555010) اور بیجنگ یونیورسٹی آف چائنیز میڈیسن کے ایلیٹ ینگ اسکالرز کے لیے سائنس فاؤنڈیشن (گرانٹ نمبر 2018-JYB-XJQ006)۔

ضمیمہ A. ضمنی ڈیٹا

اس مضمون کا اضافی ڈیٹا https://doi پر آن لائن پایا جا سکتا ہے۔ org/10.1016/j.fitote.2021.104995۔

منجانب: ' سالماتی کلوننگ اور ایک نئے کومرین گلائکوسائلٹرانسفریز کی حیاتیاتی کیمیائی خصوصیاتCtUGT1سےCistanche tubulosaکی طرف سےXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

حوالہ جات

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Arabidopsis thaliana کے UDPglycosyltransferase ملٹی جین فیملی کا Phylogenetic تجزیہ، J. Biol۔ کیم 276 (2001) 4338–4343، https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200۔
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: mutant glycosidases for oligosaccharide synthesis, J. Am. کیم Soc 120 (1998) 5583–5584، https://doi.org/10.1021/ja980833d۔
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, غیر معمولی شوگر بائیو سنتھیسز اور قدرتی پروڈکٹ گلائکو ڈائیورسیفیکیشن، نیچر 446 (2007) 1008–1016، https://doi.org/ 10.1038/nature05814۔
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Advances on the vivo and in vitro glycosylations of flavonoids, Appl. مائکروبیول بائیو ٹیکنالوجی 104 (2020) 6587–6600، https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z۔
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Molecular cloning and characterization of UDP-glucose: volatile benzenoid/phenylpropanoid glucosyltransferase in petunia flowers, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245، https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245۔
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases from plants, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394، https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016۔
[7] جی سنگھ، وائی وی دھر، ایم ایچ آصف، پی مصرا، اسٹیرول گلائکوسائل ٹرانسفریز انزائمز کی عملی اہمیت کی کھوج، پروگ۔ لپڈ ریس 69 (2018) 1–10، https://doi۔ org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, The Primary in vivo steroidal alkaloid glucosyltransferase from potato, Phytochemistry. 67 (2006) 1590–1597، https://doi.org/10.1016/j.phytochem۔
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Antioxidant Activity of citrus limonoids, flavonoids, and coumarins, J. Agric. فوڈ کیم۔ 53 (2005) 2009–2014، https://doi.org/10.1021/jf0484632۔
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, gammaherpesviruses کے خلاف angelicin کی اینٹی وائرل سرگرمی, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83، https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009۔
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Coumarin-based derivatives with طاقتور اینٹی HIV سرگرمی، Fitoterapia. 150 (2021) 104863، https://doi.org/10.1016/j۔ fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Antioxidant activity and hepatoprotective potential of Cedrelopsis grevei on cypermethrin induced oxidative stress and liver loss in نر چوہوں, BMC Complement. متبادل میڈ. 15 (2015) 251، https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2۔
[13] وائی بنسل، پی سیٹھی، جی بنسل، کومارین: سوزش کے انووں کے لیے ایک ممکنہ مرکز، میڈ۔ کیم Res. 22 (2013) 3049–3060، https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6۔
[14] ایم کمار، آر سنگلا، جے ڈنڈریال، وی جیٹک، کومارین ڈیریویٹوز بطور اینٹی کینسر ایجنٹس پھیپھڑوں کے کینسر کے علاج کے لیے: ایک جائزہ، اینٹی کینسر ایجنٹس میڈ۔ کیم 18 (2018) 964–984، https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926۔
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: a natural, privileged and versatile scaffold for bioactive compounds, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org 10.3390/molecules23020250۔
[16] T. Taguchi، N. Ubukata، H. Hayashida، M. Yamamoto، Okazaki، ایک گلوکوسائلٹرانسفیریز کی کلوننگ اور خصوصیت جو 7-فلاونول کے ہائیڈروکسیل گروپ اور 3-کومارین کے ہائیڈروکسیل گروپ پر رد عمل ظاہر کرتی ہے۔ تمباکو کے خلیات، آرک. بائیو کیم۔ بائیوفیس۔ 420 (2003) 95–102، https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027۔
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, polygonum multiflorum, Biosci کی ٹرانسجینک بالوں والی جڑوں کے ذریعے coumarin glycosides کی Biosynthesis. بائیو ٹیکنالوجی بائیو کیم۔ 76 (2012) 1008–1010، https://doi.org/10.1271/bbb.110347۔
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, مالیکیولر کلوننگ اور کومارین گلوکوسائلٹرانسفیریز کی خصوصیت فاربائٹس نیل (Ipomoea nil) کی بالوں والی جڑوں میں، پلانٹ ٹشو کلٹ۔ لیٹ 31 (2014) 21–28، https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a۔
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Trollius سے ایک promiscuous Cglycosyltransferase کی مالیکیولر اور ساختی خصوصیات چنینسس، اینجیو۔ کیم انٹر ایڈ انج. 58 (2019) 11513–11520، https://doi.org/10.1002/anie.201905505۔
[20] ایس کمار، جی سٹیچر، کے تمورا، MEGA7: سالماتی ارتقائی جینیاتی تجزیہ ورژن 7.0 بڑے ڈیٹاسیٹس کے لیے، Mol. بائول ارتقاء 33 (2016) 1870–1874، https://doi. org/10.1093/molbev/msw054۔
[21] A. واٹر ہاؤس، M. Bertoni، S. Bienert، G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, سوئس ماڈل: پروٹین کے ڈھانچے اور کمپلیکس کی ہومولوجی ماڈلنگ، نیوکلک ایسڈ ریس۔ 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427۔
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, SWISS-MODEL اور Swiss-Pdb ناظرین کے ساتھ خودکار تقابلی پروٹین ڈھانچے کی ماڈلنگ: ایک تاریخی تناظر، الیکٹروفورسس 30 (2009) S162–S173، https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140۔
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, The SWISS-MODEL repository-نئی خصوصیات اور فعالیت، Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319، https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132۔
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo- فاصلاتی رکاوٹوں کا اطلاق ماڈل کے معیار کے تخمینے، بایو انفارمیٹکس پر ہوتا ہے۔ 36 (2020) 1765–1771، https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828۔
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, homo- اور hetero-oligomers کے بائنری تعاملات سے آگے homology، Sci کی ماڈلنگ پروٹین کواٹرنری ڈھانچہ۔ نمائندہ 7 (2017) 10480، https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8۔
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, Medicago truncatula UGT85H2- کا کرسٹل ڈھانچہ ایک ملٹی فنکشنل (iso) flavonoid کی ساختی بنیاد کی بصیرت glycosyltransferase، J. Mol. بائول 370 (2007) 951–963، https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036۔
[27] R. Lüthy، JU Bowie، D. Eisenberg، تین جہتی پروفائلز کے ساتھ پروٹین ماڈلز کا اندازہ، فطرت 356 (1992) 83–85، https://doi.org/10.1038/ 356083a0۔
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: پروٹین ڈھانچے کے سٹیری کیمیکل معیار کو چیک کرنے کے لیے ایک پروگرام، J. Appl. کرسٹالوگر۔ 26 (1993) 283–291، https://doi.org/10.1107/S0907444998006684۔
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: ایک نئے اسکورنگ فنکشن کے ساتھ ڈاکنگ کی رفتار اور درستگی کو بہتر بنانا، موثر اصلاح اور ملٹی تھریڈنگ، J. Comput۔ کیم 31 (2010) 455–461، https://doi.org/10.1002/jcc.21334۔
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Arabidopsis thaliana, Sci سے UGT74F1 اور UGT74F2 کے ذریعہ سیلیسیلک ایسڈ گلوکوز کنجوجیشنز میں فرق۔ نمائندہ 7 (2017) 46629، https://doi.org/10.1038/srep46629۔
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases in plant natural products synthesis: characterization of a supergene family, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386، https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9۔
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, A. Alteration of چینی عطیہ دہندہ کی خصوصیات of plant glycosyltransferases by one point mutation, Arch. بائیو کیم۔ بائیوفیس۔ 429 (2004) 198–203، https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation of phenolic compounds by Pharbitis nil hairy roots: I. coumarin کا ​​Glucosylation اور فلاوون مشتقات، Biosci. بائیو ٹیکنالوجی بائیو کیم۔ 68 (2004) 2032–2039، https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032۔
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, cyclodextrin dicyanohydrins, Eur کے ذریعے اتپریرک زہریلے قدرتی گلوکوسائیڈز کا ہائیڈرولیسس۔ J. تنظیم کیم 2008 (2010) 745–752، HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954۔
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformation of hydroxycoumarin derivatives by Cutharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/1012124.ph. .
[36] T. Alwarhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, coumarin-based anticancer agents کی حالیہ پیشرفت: ایک تازہ ترین جائزہ، Bioorg. کیم 103 (2020) 104163، https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163۔
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Effects of a coumarin derivative, 4-methylumbelliferone, on seed germination and seedling in Arabidopsis, J. Chem. ایکول 37 (2011) 880–890، https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3۔
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Eight new eudesmane- اور eremophilane-type sesquiterpenoids from Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121، https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017۔
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, چوہے کے پلازما میں UHPLC-MS/MS کے ذریعے سکیمنگ کا تعین اور فارماکاکینیٹک مطالعہ، J. فارم . بایومیڈ مقعد 179 (2020) 112969، https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969۔