نینو دودھ پروٹین-مسیلج کمپلیکس: کردار کشی اور کینسر مخالف اثر حصہ 2

مزید معلومات کے لیے رابطہ کریںtina.xiang@wecistanche.com

حصہ 1 سیکھنے کے لیے لنک پر کلک کریں:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3۔ مواد اور طریقے

3.1. مواد

پودے گو اوواٹا (ذیلی گول) بھوسی اور زیزیفوس سپینا کرسٹی (نبیک) کا پکنے والا پھل گیزا، مصر سے خریدا گیا تھا؛ دودھ پروٹین کنٹینیٹیڈ (ایم پی،81.3 فیصد پروٹین) فونٹیرا کمپنی (آکلینڈ، نیوزی لینڈ) سے خریدا گیا تھا۔ ایم پی سی میں کیسین اور وہپروٹین بڑی حد تک ان کے آبائی اور مماثل، مائسیلر میں ہیں، دودھ میں پائے جانے والوں کے لئے تشکیل دیتے ہیں۔ استعمال ہونے والے تمام کیمیکل تجزیاتی پاکیزگی کے تھے۔

3.2.اسابگول ہسکی مسیلج (آئی ایچ ایم) اور نابیگ مسیلج (این اے بی ایم) کی تیاری

اسابگول بھوسی مسیلج (آئی ایچ ایم) اور نبیک مسیلج (نابم) کو المکسود ایٹ ال کے بیان کردہ طریقہ کار کے مطابق تیار کیا گیا تھا۔ [5]۔ مختصر اصابگول بھوسی کی معطلی 100 ایم ایل ڈسٹلڈ پانی میں 1.2 گرام تحلیل کرکے تیار کی گئی اور ایسیٹون محلول سے پاک کیا گیا۔ اس کے نتیجے میں جیل کو استعمال ہونے تک ریفریجریٹر (4-5°سی) میں ذخیرہ کیا گیا تھا۔

این اے بی ایم کے لئے پکے ہوئے نبیک پھلوں کو گندگی دور کرنے کے لئے نل کے پانی سے اچھی طرح دھویا گیا تھا۔ تازہ پھلوں کو بیجوں سے الگ کیا گیا اور چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹنے کے بعد 1:10 (ڈبلیو/وی) کے تناسب سے ڈسٹلڈ پانی کے ساتھ ملایا گیا۔ اس آمیزے کو لیبارٹری بلینڈر (توشیبا مکسی، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے ملایا گیا تھا اور اسے ریفریجریٹر میں 12 ایچ کے لئے کھڑے ہونے کی اجازت دی گئی تھی۔

اس کے بعد میسیلاگنس عرق کو ٢٠ آر پی ایم پر ٣٠ منٹ کے لئے سنٹرفیوز کیا گیا تھا اور ململ کے کپڑے کے ذریعے فلٹر کیا گیا تھا۔ اس کے نتیجے میں چپچپا حل پذیر میسیلیج کو ایسیٹون کے ساتھ تیز کیا گیا تھا۔ حاصل کردہ خام میسیلیج استعمال ہونے تک ریفریجریٹر میں ذخیرہ کیا گیا تھا۔

تجزیاتی مقاصد کے لئے، مسیلج کو بال مل ایم ایم 400 (ریٹش، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے 40°سینڈ گراؤنڈ پر ہوا کے اوون میں خشک کیا گیا تھا۔ سائیلیئم ہسک میسیلیج پاؤڈر (پی ایچ ایم پی) اور نبیک میسیلیج پاؤڈر (این اے بی ایم پی) کی کیمیائی ترکیب کی پیمائش کی گئی ہے۔ نمی، پروٹین، چربی، راکھ، خام فائبر اور کل کاربوہائیڈریٹ کی مقدار بالترتیب 8.49، 0.34,0.21,2.13,1.53,اور 87.44 فیصد اور پی ایچ ایم پی کے لئے 9.18,42,2.05,2.69,1.70,اور 78.26 فیصد رہی۔ اس کے نتیجے میں پاؤڈر کو مزید تجزیے تک ٹھنڈے درجہ حرارت (4-5° سینٹی سینٹی چیونٹی) پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔

مزید معلومات جاننے کے لیے کلک کریں

3.3. دودھ پروٹین-مسیلج کمپلیکس کی تیاری (ایم پی ایم سی)

آئی ایچ ایم اور این اے بی ایم کے ساتھ دودھ پروٹین (ایم پی) کمپلیکس کچھ تبدیلیوں کے ساتھ مور ایٹ ال کے مطابق تیار کیے گئے تھے [44]۔ دودھ پروٹین مرکوز ڈسٹلڈ پانی میں دوبارہ تشکیل دیا گیا تھا (10٪). اس کے نتیجے میں دودھ کے پروٹین کولوئڈ کو آئی ایچ ایم اور این اے بی ایم کے ساتھ 1:3 (او/او) کے تناسب سے ملایا گیا۔ مرکب کے پی ایچ کو ١٠ میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا اور ١٠ منٹ کے لئے کھڑے ہونے کے لئے چھوڑ دیا گیا تھا۔ اس کے بعد 0.1 این ایچ سی ایل کا استعمال کرتے ہوئے پی ایچ کو کم کرکے 3.5 کر دیا گیا اور مزید 10 منٹ کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ اس کے بعد پی ایچ کو فلٹر پیپر پر ایم پی ایم سی بی آئی فلٹریشن جمع کرنے کے لئے 0.5 ایم این اے او ایچ کا استعمال کرتے ہوئے پی ایچ 4.6 میں ایڈجسٹ کیا گیا: ایم پی کے ساتھ ساتھ نتیجہ ایم پی ایم سی کو نووالیفی-این ایل 500 لائوفیلائزر، ساونت انسٹرومنٹس، ہولبروک، این وائی، امریکہ کا استعمال کرتے ہوئے -45°سی سی فار 24 ایچ پر لائوفیلائزیشن کے ذریعے خشک کیا گیا۔

3.4. فاسیکوکیمیکل اور فنکشنل خصوصیات

پیمائش 3.4.1.pH

10 فیصد حل پر اس کے نتیجے میں مصنوعات کے پی ایچ کی پیمائش ایک کیلیبریٹڈ پی ایچ میٹر (ہینا، ایچ آئی 902 میٹر، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔

3.4.2.بلک کثافت (بی ڈی)، ٹیپڈ کثافت (ٹی ڈی) اور کار انڈیکس کا تعین

ایم پی ایم سی پاؤڈر کو 25 ملین ایل تک 50 میٹر پیمائش والے سلنڈر میں ڈالا گیا جو غیر استعمال شدہ حجم کے مطابق تھا، اور پھر 5-10 بار ٹیپ کریں یہاں تک کہ پاؤڈر کے حجم میں مزید کوئی تبدیلی ٹیپ شدہ حجم کے مطابق نوٹ نہ کی جائے۔

بلک کثافت، ٹیپ شدہ کثافت اور کار کے اشاریہ کا تعین مندرجہ ذیل مساوات [45] کا اطلاق کرتے ہوئے کیا گیا تھا:

(1) بی ڈی = کمیت / غیر استعمال شدہ حجم

(2) ٹی ڈی = کمیت/ٹیپ شدہ حجم

(3) کار کا اشاریہ (٪) =(ٹی ڈی-بی ڈی)/ٹی ڈی×100

3.4.3. واٹر جذب انڈیکس (ڈبلیو اے آئی) اور واٹر سولبلٹی انڈیکس (ڈبلیو ایس ڈی)

یاگس اور گوگس کے بیان کردہ طریقہ کار کے مطابق ایم پی اور ایم پی ایم سی کے پانی کی حل پذیری اور پانی جذب کرنے کے اشاریوں کا کچھ ترمیمات کے ساتھ معائنہ کیا گیا [46]۔ نمونے (0.5 گرام) 10 ایم ایل ڈسٹلڈ پانی میں 25°سن ایک سنٹرفیوز ٹیوب پر منتشر کر دیئے گئے تھے۔ 30 منٹ تک کھڑے رہنے کے بعد، ہر 5 منٹ میں ٹیوب الٹ کے ساتھ، نمونوں کو 15 منٹ کے لئے 3500 آر پی ایم پر سنٹرفیوز کیا گیا تھا۔ فلٹریٹ کو ایلومینیم پلیٹ میں منتقل کیا گیا اور 105° سی پر 3 گھنٹہ کے لئے خشک کیا گیا۔ بقیہ جیل کا وزن ریکارڈ کیا گیا اور ڈبلیو ایس آئی اور ڈبلیو اے آئی کا تعین درج ذیل تھا:

(4) ڈبلیو اے آئی (جی/جی)= نمونے کے جیل/ خشک وزن کا وزن بڑھنا

(5) ڈبلیو ایس آئی٪= نمونے کے 100/خشک وزن × میں خشک ٹھوس کا وزن

3.4.4. دودھ پروٹین ڈائجسٹبلٹی

پروٹین ڈائجسٹایبلٹی کا تعین عبد الغانی ایٹ ال کے مطابق کیا گیا تھا۔ [47]۔ مختصر اس طور پر ایم پی اور ایم پی ایم سی کے نمونے 6.38 ملی گرام/ایم ایل کے ارتکاز پر ڈسٹلڈ پانی میں منتشر کیے گئے اور پی ایچ کو 8.0 سے ایڈجسٹ کیا گیا۔ ایک ملی لیٹر تازہ تیار کردہ انزائم اسٹاک محلول (1.6 ملی گرام/ایم ایل ٹرائیپسن، 3.1 ملی گرام/ایم ایل چیموٹریپسن، اور 1.3 ملی گرام/ایم ایل ای آر امینو پیپٹاڈیس1

(ای آر اے پی 1) کو 37° سینٹی میٹر پروٹین معطلی کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ پی ایچ کو 10 منٹ کے بعد ریکارڈ کیا گیا تھا، اور انزائم کی سرگرمی کا تعین کیسین کو حوالہ کے طور پر استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ پروٹین ڈائجسٹبلٹی کا حساب لگانے کے لیے مندرجہ ذیل مساوات کا استعمال کیا گیا [47]:

(6)٪ ہضم = 210.46-18.10 (پی ایچ)

3.5.پی ایچ ایم اور این اے بی ایم کے فینولک کسریں

ایچ پی ایل سی تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے مسیلج نمونوں کے فینولک مرکبات السید ایٹ ال کے بیان کردہ پروٹوکول کے ذریعہ کیے گئے تھے۔ [48]۔ مختصراختصار کے طور پر، مسیلج عرق کا تجزیہ ایک ایجلنٹ 1260 سیریز ایچ پی ایل سی سسٹم (ایجلنٹ ٹیکنالوجیز انکارپوریٹڈ، سانتا کلارا، سی اے، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ علیحدگی سی 18 کالم (100 ملی میٹر×4.6 ملی میٹر یعنی 5 ام) کا استعمال کرتے ہوئے منظور کی گئی تھی۔ موبائل مرحلے میں (اے) پانی 0.2٪ ایچ 3پی او 4، (بی) میتھانول، اور (سی) ایسیٹونیٹریل 0.6 ملین ایل/منٹ کی فلو ریٹ پر تھا۔ گریڈینٹ ایلوٹ اگلی اسکیم کے مطابق تھا: 0-11 منٹ (96٪اے، 2٪ بی)؛ 11-13 منٹ (50٪ اے,25٪بی);13-17منٹ (40٪ اے,30٪بی);17-20.5 منٹ (50٪بی,50٪سی);اور 20.5-30 منٹ (96٪ اے,2٪ بی). سراغ رسانی طول موج (یو وی ڈیٹیکٹر، 284 این ایم) 284 این ایم پر سیٹ کیا گیا تھا۔ انجکشن کا سائز 20 μL تھا اور کالم کا درجہ حرارت 30° سینٹی سینٹی چ پر برقرار رکھا گیا تھا۔ مرکبات کو ان کی برقراری کے وقت کا مستند معیار سے موازنہ کرکے جانا جاتا تھا۔ مرکب مقدار کا جائزہ لینے کے لئے کیلیبریشن کروز کا استعمال کیا گیا۔

3.6.ایم پی اور ایم پی ایم سی کا کل فینولک اور فلیونوئڈ مواد

پولی فینولک مواد کا تعین فولن سیوکیلٹیو طریقہ کار نے کچھ ترمیمات کے ساتھ کیا [5]۔ مختصر اکیس لاکھ ایم ایل ملی کیو واٹر جس میں 10 ملی گرام ایم پی یا ایم پی ایم سی شامل تھی، کو 2 ملین ایل 2 فیصد سوڈیم کاربونیٹ اور 0.1 ملین ایل 50 فیصد فولن سیوکلٹیو ری ایجنٹ کے ساتھ ملایا گیا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کی انکیوبیشن کے بعد، رد عمل کے مرکب کی جذب کو ایک سپیکٹروفوٹو میٹر (ہٹچی، ماڈل 100-20) کا استعمال کرتے ہوئے خالی پانی کے طور پر ڈیونائزڈ پانی کے خلاف 750 این ایم پر ناپا گیا۔ گیلک ایسڈ (جی اے) کو ایک معیاری فینولک مرکب کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا، اور سات پوائنٹس معیاری منحنی (0-200 ملی گرام/ایل) تعمیر کیا گیا تھا۔ نتائج کا اظہار ملی گرام گیلک ایسڈ کے مساوی فی گرام پروٹین (جی اے ای/ جی) کے طور پر کیا گیا۔

فلیونوئڈزمواد کا تعین ایلومینیم کلورائڈ طریقہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے ایبیڈیلماکسوڈ ایٹ ال نے کچھ ترمیمات کے ساتھ بیان کیا تھا [5]۔ مختصر اکیس لاکھ ایم پی یا ایم پی ایم سی پر مشتمل 2.8 ایم ایل ملی کیو پانی کو 0.1 ملین ایل ایل 10 فیصد ایلومینیم کلورائڈ ہیکساہائیڈریٹ اور 0.1 ایم ایل 1 ایم پوٹاشیم ایسیٹیٹ کے ساتھ ملایا گیا۔ 40 منٹ تک کمرے کے درجہ حرارت پر انکیوبیشن کے بعد، رد عمل کے مرکب کی جذب کو خالی کے طور پر ڈیونائزڈ پانی کے مقابلے میں 415 این ایم پر ناپا گیا۔ کوئرسیٹن کو سات پوائنٹس معیاری منحنی (0-50 ملی گرام/ایل) کا استعمال کرتے ہوئے ایک معیار کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ کل فلیونوئڈ مواد کو ملی گرام کوئرسیٹن مساوی (کیو ای/ جی) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔

3.7. ایم پی اور ایم پی ایم سی کی اینٹی آکسیڈنٹ سرگرمی

ایم پی اور ایم پی ایم سی کی کل فری ریڈیکل اسکیوینجنگ صلاحیت کا جائزہ تین مختلف اینٹی آکسیڈنٹ مضامین کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا: مستحکم 2,2-ڈفینیل-1-پیکریلیہائیڈرازیل (ڈی پی پی ایچ)، ازینو بس (3-ایتھیلبینزوتھیازولین-6-سلفونک ایسڈ (اے بی ٹی ایس) اور ہائیڈروکسیل ریڈیکل (ایچ ایس) بنیاد پرست جیسا کہ پہلے المکسود ایٹ ال [5] نے بیان کیا تھا۔

3.8 ایم پی اور ایم پی ایم سی کا امینو ایسڈز پروفائل

پیکسا ایٹ ال کے مطابق 6 این ایچ سی ایل کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کے نمونوں کو تیزاب ہائیڈرولائیز کیا گیا تھا۔ [49. ایک خودکار امینو ایسڈ تجزیہ کار (اے اے اے 400، آئی این جی اوز لمیٹڈ) امینو ایسڈ کے تعین کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔

3.9. ریولوجیکل خصوصیات

نمونے تیار کیے گئے جیسا کہ بارنس [50] نے کچھ ترمیمات کے ساتھ بیان کیا ہے۔ پی ایچ 7 میں 2.5٪(ڈبلیو/ڈبلیو) حل کی چپچپاہٹ کا تعین 25±1°سی پر بروک فیلڈ وسکومیٹر (ڈی وی-2+ پرو، ریوکالک سافٹ ویئر، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ تناؤ (σ) اور چپچپاہٹ (این) کو کترنے کی شرح کے کام کے طور پر منصوبہ بندی کی گئی تھی۔ پاور لا ماڈل کے مستقل مزاجی اشاریہ (کے) اور فلو بیہیویئر انڈیکس (این) کا حساب لگایا گیا:

این کی قیمت نیوٹنی سیال کے لئے 1 کے برابر ہے اور سیال ہے کہ کترنے پتلا اور شیر گاڑھا سیال کے لئے 1 سے زیادہ ہیں کے لئے 0 سے 1 تک مختلف ہوتا ہے [51].

3.10.ڈفرینشل اسکیننگ کیلوریمیٹری (ڈی ایس سی)

ایم پی اور ایم پی ایم سی کی تھرمل خصوصیات کی پیمائش ایک تفریقی اسکیننگ کیلوری میٹر (پرکن ایلمر، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔ نمونے (4-6 ملی گرام) ایک ایلومینیم پلیٹ میں رکھے گئے تھے اور سیل کر دیا گیا تھا. اس کے بعد ہر پین کو 350° سی تک گرم کیا گیا جس میں خشک نائٹروجن گیس کا بہاؤ 20 میٹر من-1 پر 10° سی منٹ-1 کی ہیٹنگ ریٹ پر تھا۔ ڈی ایس سی تھرموگرام کی انڈوتھرمک چوٹی سے ڈیناٹریشن شروع درجہ حرارت، زیادہ سے زیادہ منتقلی کا درجہ حرارت اور تنزلی کا نقطہ تخمینہ [52] لگایا گیا تھا۔ ڈی ایس سی منحنی میں انڈوتھرمک چوٹی کے نیچے کے علاقے سے منتقلی اینتھلپی ویلیو (اے ایچ) کا تعین کیا گیا تھا، اور خالی ایلومینیم پین کو حوالہ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

3.11. فوریر ٹرانسفارم انفراریڈ اسپیکٹرواسکوپی (ایف ٹی آئی آر)

600 اور 3500 سینٹی میٹر-1 کے درمیان انفراریڈ سپیکٹرا کی پیمائش 25 °4 سینٹی میٹر-1 کی ریزولوشن کا استعمال کرتے ہوئے اور 10 اسکین فی سیکنڈ حاصل کرنے کے لئے تخفیف شدہ کل عکاسی کے طریقہ کار کے ذریعہ ایف ٹی آئی آر اسپیکٹروفوٹو میٹر (کیو ایف اے فلیکس، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔

3.12. ٹرانسمیشن الیکٹرون مائیکرواسکوپی

ایم پی اور ایم پی ایم سی کے مائیکرو سٹرکچر کو 80 کے وی پر ٹرانسمیشن الیکٹرون مائیکرواسکوپ (جے ای او ایل، جے ای ایم 1400 فلیش، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔ منفی داغ لگانے کے طریقہ کار میں کریو اسٹیج کا اطلاق کیا گیا [53]۔

3.13.ایم پی اور ایم پی ایم سی پر حیاتیاتی مطالعے

3.13.1.In ویٹرو اینٹی کینسر سرگرمی

اس تجربے میں استعمال ہونے والی تمام سیل لائنیں امریکی ٹائپ کلچر کلیکشن (اے ٹی سی سی، مناساس، وی اے، امریکہ) سے حاصل کی گئیں۔ اس پرکھ میں دو انسانی سرطان سیل لائنیں استعمال کی گئیں: ممیری ایڈینوکارسینوما (ایم سی ایف-7، اے ٹی سی سی ایچ ٹی بی-22 ٹی ایم)اور ہیپاٹوسیلولر کارسینوما (ہیپ جی 2، اے ٹی سی سی 4 ایچ بی-8065ٹی ایم)۔ موازنہ کے لئے غیر کینسر زدہ جلد فائبروبلسٹ بی جے-1 (اے ٹی سی سی(8) سی آر ایل-2522 ٹی ایم) اور ایپیتھیلیئل بریسٹ ایم سی ایف-12 ایف (اے ٹی سی سی سی آر ایل-10782ٹی ایم) سیل لائنوں کی بھی جانچ کی گئی۔ ڈلبیکو کے ترمیم شدہ ایگل میڈیم (ڈی ایم ای ایم/ ہائی گلوکوز، میں سیل لائنیں اگائی گئیں، ہائکلون ٹی ایم، امریکہ) 10 فیصد فیٹل بوائن سیرم (ایف بی ایس، گیبکو، برازیل)، 100 یو/ایم ایل پینسلین، 100 یو جی/ایم ایل اسٹریپٹومائیسن، اور 25 این جی/ایم ایل ایمفوٹیریکن بی (سگما، اوک ویل، او این، کینیڈا) کے ساتھ سپلیمنٹ کیا گیا اور 5 فیصد سی او کے ساتھ 37° سی پر ثقافت کی گئی۔ ثقافت کے میڈیم کو ہر دوسرے دن ایک تازہ میڈیم سے تبدیل کیا جاتا تھا۔ جب خلیات 70 فیصد روانی تک پہنچ گئے تو انہیں 0.25 فیصد ٹرپسن ای ڈی ٹی اے (1ایکس) گیبکو، کینیڈا کا استعمال کرتے ہوئے الگ کر دیا گیا اور ایک نئے کلچر فلاسک میں منتقل کر دیا گیا۔ دوسرے راستے کے بعد، خلیوں کو 2×10* خلیوں/کنویں کے ارتکاز پر 96 کنویں کی پلیٹ میں ٹرپسن ائز کیا گیا اور پلیٹ کیا گیا۔ 24 گھنٹہ کی انکیوبیشن کے بعد، میڈیم کو ڈیکینٹ کیا گیا، اور خلیوں کو پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھویا گیا پھر پروٹین کے نمونوں کے مختلف ارتکاز (1، 5,10، اور 20یو جی/ایم ایل) پر مشتمل ثقافت میڈیم کے 200 μL کے ساتھ علاج کیا گیا۔ ڈوکسوروبیسن ایچ سی ایل (4 یو جی/ایم ایل) کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا جبکہ غیر ضمیمہ شدہ میڈیم سے علاج کیے جانے والے خلیوں کو منفی کنٹرول کے طور پر لیا گیا۔ پلیٹوں کو 37° سی سی پر 24 گھنٹہ اورسرطان مخالفنمونوں کی سرگرمی کا تعین ریپیٹو ایٹ ال کے مطابق غیر جانبدار سرخ استعمال کے استعمال سے کیا گیا تھا۔ [54]۔ مختصر اکیوبیشن پیریڈ کے بعد میڈیم کو 150 یو ایل نیوٹرل ریڈ ڈائی (100 ملی گرام/ایم ایل) سے تبدیل کیا گیا جو سیرم فری میڈیم میں تحلیل کیا گیا اور خلیوں کو 37°سی سی پر 3 ایچ کے عوض انکوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد، خلیوں کو پی بی ایس کے ساتھ دھویا گیا، اور 150 μL ایلوشن میڈیم (ایٹی او ایچ/ ایککووہ، 50∶1) شامل کیا گیا جس کے بعد مکمل تحلیل کو یقینی بنانے کے لئے 10 منٹ تک نرم ہلنا ہوا۔ جذب کرنے کی پیمائش مائیکروٹیٹر پلیٹ ریڈر (بائیو ٹیک، 96 ویل پلیٹس، ای ایل ایکس 808، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے 540 این ایم پر کی گئی تھی۔

جہاں اے سی کنٹرول کی جذب ہے اور جیسا کہ نمونے کی جذب ہے۔ فیصد خلیات کی موت کو سائٹوٹوکسٹی (٪) کے طور پر پیش کیا گیا اور ارتکاز جو 50 فیصد خلیوں (آئی سی 50) کو ہلاک کرتا ہے ہر نمونے کے لئے حساب لگایا گیا تھا۔

3.13.2.پی 53، بی کس، کیسپیس-3، اور بی سی ایل-2 پروٹین کی سطح کا تعین

ایم پی اور ایم پی ایم سی کے آئی سی ایس او کے ساتھ 24 گھنٹہ بعد علاج کے بعد کلیدی اپوپوٹوسس پروٹین مارکر ز کی سیلولر سطح کا تعین کیا گیا تھا۔ مختصر اختصار کے ساتھ ہیپ جی-2، ایم سی ایف-7، بی جے-1 اور ایم سی ایف-12 ایف سیلوں کو 6 ویل پلیٹوں میں 5× 10* سیل/ویل پر سیڈ کیا گیا۔ 37 ° سی پر نمونوں کے ساتھ 24 گھنٹہ کی انکیوبیشن کے بعد، خلیات کو اکٹھا کیا گیا اور لیٹ کیا گیا پھر 10,000 آر پی ایم پر 4° سی پر 20 منٹ کے لئے سنٹرفیوز کیا گیا۔ پروٹین کے ارتکاز کا اندازہ بریڈفورڈ کے پرکھ [55] نے سپرناٹنٹ میں لگایا تھا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات [56] کے مطابق کیسپاس-3 سرگرمی کا تجزیہ ایک کلریمیٹرک اسی کٹ (ابکام، اے بی 39401) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ مختصر اختصار کے ساتھ، 10 ملی گرام پروٹین کو 50 یو ایل کاسپاس سبسٹریٹ میں شامل کیا گیا اور آخری حجم کو 37 ° سی پر ری ایکشن بفر کا استعمال کرتے ہوئے 200 μL میں ایڈجسٹ کیا گیا، اور اس آمیزے کو اندھیرے میں 1 ایچ کے لئے انکوبیٹ کیا گیا جس کے بعد 405 این ایم پر کیسپاس-3 ارتکاز کی پیمائش کی گئی۔

پرو اپوپٹوٹک مارکر پی 53، ایسوسی ایٹڈ ایکس (باکس) اور اینٹی اپوپٹوٹک مارکر بی سیل لمفوما-2 (بی سی ایل-2) کی سطح کا تعین سیل لائسیٹ میں انزائم لنکڈ ایمیونوسوربینٹ اسسی سمپل سٹیپ ایلیسا کا استعمال کرتے ہوئے مینوفیکچرر کی ہدایات (اے بی 2072225، اے بی 119506 اور اب199080؛ ابکام، امریکہ)، بالترتیب [57,58].

3.13.3.ڈی این اے نقصان آکسیڈیٹیو اسٹریس پروٹیکشن کی طرف سے متاثر

ڈی این اے کے نقصان کی پرکھ کی گئی جیسا کہ پہلے لیبا ایٹ ال [59] نے معمولی ترمیم کے ساتھ بیان کیا تھا۔ ریبونوکلیز انہیبیٹر پلاسمیڈ آر این ایچ 1 (NM_203387) ہیومن ٹیگڈ او آر ایف کلون 10 μg/μL کے مختصر،3 μL میں فینٹن کے ریایجنٹ (ایچ 2 او 2 کے 5 ایم اور فیایس او 4 کے 0.3 میٹر اور ای ڈی ٹی اے کے 0.6 میٹر) کے ساتھ ملایا گیا اور آخری حجم کو فاسفیٹ بفر (ایچ 2 پی او اے، 8.3 میٹر، پی ایچ 7.4) کا استعمال کرتے ہوئے 25 μL میں ایڈجسٹ کیا گیا۔ اس کے بعد اس مسئلے کا حل 20 منٹ کے لیے 37 ° سی پر پیدا کیا گیا۔ فینٹن کے ری ایجنٹ کی وجہ سے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کے خلاف ایم پی اور ایم پی ایم سی کی اینٹی آکسیڈنٹ پروٹیکشن صلاحیت کا جائزہ لینے کے لئے 5 μg/ایم ایل ایم پی/این اے بی ایم، ایم پی/آئی ایچ ایم اور ایم پی کو انکیوبیشن سے قبل شامل کیا گیا تھا۔ آر این ایچ 1 پلاسمیڈ ڈی این اے (3 μL، 10 μg/μL) کو ڈی این اے پروٹیکشن کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔

3.13.4.پی سی آر پر مبنی جینومک ڈی این اے نقصان پر اسی

ہومو سیپیئنز میتھیلینٹیٹراہائیڈروفولیٹ ریکٹاز (ایم ٹی ایچ ایف آر) جین کو خون کے جینومک سے پی سی آر کا استعمال کرتے ہوئے بڑھایا گیا تھا جو پہلے صحت مند خون کے نمونوں سے ایک معیاری ڈی این اے نکالنے کی کٹ [60] کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ ڈی این اے کو ایم پی یا ایم پی ایم سی کے ساتھ فینٹن کے ری ایجنٹ کے ساتھ یا اس کے بغیر ١٠ منٹ کے لئے انکوبیٹ کیا گیا تھا۔ فارورڈ5'ٹی گاگاگاگاگٹی جی ٹی سی ٹی جی سی ٹی جی جی اے-3' اور ریورس 5'اے جی ٹی جی ٹی گاگاجی جی ٹی جی-3'پرائمرز کا استعمال کرتے ہوئے 198 بی پی کے ٹکڑے کو بڑھایا گیا۔ علاج شدہ ڈی این اے کی 50 این جی کا استعمال کرتے ہوئے، پی سی آر ایمپلیفیکیشن اگلے تھرموسائیکلر (94° سی برائے 5 منٹ کے بعد کیا گیا، اس کے بعد ڈیناٹوریشن کے 25 سائیکل، 94 ° سی پر 30؛ اینیلنگ، 60° سی پر 30؛ اور 25 سائیکلوں کے لئے 72° سی پر توسیع،30 اور 5 منٹ کے لئے 72° سینٹی گریڈ پر 1 آخری توسیع ی چکر۔ پی سی آر رد عمل کے نمونوں کا اطلاق ایگاروز جیل الیکٹروفورسس (2 فیصد) کے لئے کیا گیا تھا۔

3.13.5. جین اظہار پروفائلنگ از آر ٹی کیو پی سی آر

آئی سی 50 کے سامنے آنے والے اہم پرو اور اینٹی اپوپٹک مارکر جینز کے جین اظہار کے تجزیے ہیپ جی-2، ایم سی ایف-7، بی جے-1 اور ایم سی ایف-12 ایف سیلز کے ساتھ کیے گئے جو 72 ایچ کے لئے حاصل کردہ ڈیٹا (ٹیبل 3)۔ مختصرا، مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق کل آر این اے پیوریفیکیشن کٹ (کیو آئی اے جی ای این.، تھورولڈ، او این، کینیڈا) کا استعمال کرتے ہوئے کل آر این اے نکالا گیا تھا۔ سی ڈی این اے

تالیف کی گئی جیسا کہ پہلے ابوالآواز ایٹ ال نے بیان کیا تھا۔ [61]۔ ایمپلیفیکیشن پروگرام اور پی سی آر ایمپلیکون کی خصوصیت کا مظاہرہ کیا گیا اور اس کا جائزہ کوانٹی ٹیک ٹ ایس وائی بی آر گرین پی سی آر کٹ (کیاگن، جرمنی) کے ساتھ روٹر جین او 5-پلیکس ایچ آر ایم تھرمل سائیکلر (کیاجن، جرمنی) کے استعمال سے کیا گیا جیسا کہ پہلے معیاری پروٹوکول [61] کے بعد دستاویزی شکل دی گئی تھی۔ مندرجہ ذیل پرائمر استعمال کیے گئے: Hs_P53_1 ایس جی کوانٹی ٹیکٹ پرائمر اسسے (کیو ٹی 00060235)؛ Hs_CASP3_1_SG کوان ٹی ٹیکٹ پرائمر اسسے (کیو ٹی 00023947)؛ بی سیل لمفوما 2 Hs_BCL2_1_SG کوانٹی ٹیکٹ پرائمر اسسے (کیو ٹی 00025011)؛ بی سی ایل-2 جیسا پروٹین Hs_BAX_1_SG کوانٹی ٹیکٹ پرائمر اسسے (کیو ٹی 00031192)؛ اور 18ایس آر ڈی این اے ہاؤس کیپنگ (ایچ کے) جین Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect پرائمر اسی (کیو ٹی00199367)۔ پی سی آر تھرمل سائیکلنگ پروگرام اور جین اظہار تجزیہ 18 ایس جین کے مقابلے میں فولڈ تبدیلی کا تعین کرنے کے لئے بنیادی طور پر کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے رپورٹ کیا گیا تھا [61].

3.14.شماریاتی تجزیہ

حاصل کردہ نتائج کا اظہار معیاری انحراف ± مطلب کے طور پر کیا گیا تھا۔ اعداد و شمار ایس پی ایس ایس سافٹ ویئر 11.5 (ایس پی ایس ایس، انک شکاگو، آئی ایل، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے تھے۔ ڈنکن کے متعدد رینج ٹیسٹ کو تمام نمونوں کے درمیان نمایاں فرق کا تعین کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا، اور اختلافات کو پی پر اہم سمجھا جاتا تھا<>

4۔ نتائج

آخر میں، اس تحقیق سے پتہ چلا ہے کہ دودھ پروٹین کے ساتھ ملاناکثیر الاضلاعحل کی تفریق کے ذریعے پی ایچ پیچیدگی کے لئے ایک موزوں تکنیک ہے۔ اس کے نتیجے میں دودھ پروٹین میسیلیج کمپلیکس (ایم پی ایم سی) میں فینولک کافی زیادہ ہوتا ہے اورفلیونوئڈزدودھ پروٹین (ایم پی) سے مشمولات. ڈی ایس سی کے نتائج سے پتہ چلا ہے کہ پولی سیکرائیڈز کے ساتھ ایم پی کی پیچیدگی نے ڈیناٹریشن درجہ حرارت میں تبدیلی کے ساتھ تھرمل استحکام میں نمایاں اضافہ کیا۔ فنکشنل گروپوں کی شناخت کے لئے ایف ٹی آئی آر کے تجزیے کیے گئے اور تیار کمپلیکس کے بہاؤ کے رویے کی تحقیقات کی گئیں۔ دودھ کے پروٹین کے ڈبلیو ایس آئی اور ڈبلیو اے آئی کو این اے بی ایم یا آئی ایچ ایم کے ساتھ پیچیدگی سے بڑھایا گیا تھا۔ ٹی ای ایم کا استعمال تیار کمپلیکس کے مائیکرو سٹرکچر کو تصور کرنے کے لئے کیا گیا تھا۔ دوسری جانب اسکے نتیجے میں اسابگول ہسک میسیلیج (ایچ ایم) یا نبیک مسیلج (این اے بی ایم) کے ساتھ دودھ کے پروٹین کمپلیکس سے اینٹی آکسیڈنٹ اور اینٹی کینسر اثر میں مقامی دودھ کے پروٹین کو پیچھے چھوڑنے کی توقع ہے۔ خلاصہ یہ ہے کہ ایم پی ایم سی نے ماڈل چھاتی کے سرطان اور ہیپاٹک کارسینوما سیل لائنوں (بالترتیب ایم سی ایف 7 اور ایچ ای پی جی 2) کے خلاف منفرد اینٹی کینسر خصوصیات کا اظہار کیا جیسا کہ غیر جانبدار سرخ استعمال کے پرکھ سے ثابت ہوتا ہے۔

ایم پی ایم سی نے دونوں میں اضافہ کیااینٹی آکسیڈنٹاور پھیلاؤ کے خلاف سرگرمی۔ کیسپاس اہم ریگولیٹر پروٹین ہیں جو اپوپٹوسس انڈکشن میں ملوث ہیں۔ کیسپاس 3 پروٹین اور ایم آر این اے ٹرانسکرپٹ (فگر 9 اے، بی) کا اپ ریگولیشن اپوپٹوسس کے راستے میں دیگر پروٹین کو کنٹرول کرتا ہے، جس کی خصوصیت بیکس سے متاثرہ سائٹوکروم سی ریلیز کے ساتھ مائٹوکونڈریا جھلی کا گرنا اور کیسپاس 9 کی فعالیت ہے جس سے کیسپاس 3 کی بعد کی مشغولیت ہوتی ہے۔ کیسپ3، پی 53 اور باکس کے اپ ریگولیشن کے ساتھ ساتھ بی سی ایل-2 اظہار میں کمی سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ ایم پی ایم سیسنڈ اپپوٹوسس انڈکشن، جہاں پی 53 کا اپ ریگولیشن باکس کے اظہار کو متحرک کرے گا، جس کے نتیجے میں سائٹوکروم سی ریلیز ہوگی، جس کے بعد کیسپاس-9 اور-3 ایکٹیویشن ہوگی۔ مزید برآں، بی سی ایل-2 سائٹوکروم سی ریلیز کو روکنے کے لئے جانا جاتا ہے۔ ہمارے مطالعے میں ایم پی ایم سی کی طرف سے متاثرہ بی سی ایل-2 ڈاؤن ریگولیشن کو بلا مقابلہ باکس سے متاثرہ سائٹوکروم سی ریلیز اور اس کے بعد اپوپٹوسس کی سہولت فراہم کرنے کے لئے دکھایا گیا تھا۔

پروٹین پولی سیکرائڈ کمپلیکس کا کینسر مخالف اثر ان کمپلیکس کے اطلاق پر مزید روشن خیالی فراہم کرتا ہے جو کم سے کم ضمنی اثرات کے ساتھ سستے اور موثر کینسر تھراپیز کی ترقی میں استعمال کیا جائے گا۔