Naringin اور Hesperidin نر وِسٹار چوہوں میں Diclofenac-حوصلہ افزائی ہیپاٹوٹوکسٹی کا مقابلہ کرتے ہیں ان کے اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی انفلامیٹری، اور اینٹی پاپٹوٹک سرگرمیاں حصہ 1

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

1. تعارف

غیر سٹیرایڈیل اینٹی سوزش والی دوائیں NSAIDs کے مختلف ضمنی اثرات ہوتے ہیں [1]۔ Diclofenac، اس قسم کی دوائیوں میں سے ایک کے طور پر، ایک phenylacetic ایسڈ مشتق ہے جو کہ کچھ حالات کے علاج کے لیے طویل عرصے سے ینالجیسک اور ایک سوزش کش دوا کے طور پر استعمال ہوتا رہا ہے [2]۔ اس کے عمل کے طریقہ کار میں، diclofenac cyclooxygenase-(COX-) کو روکتا ہے۔ 2 انزائمز زیادہ طاقت کے ساتھ جو یہ COX پر کام کرتا ہے-1 [3]۔ اگرچہ diclofenac کے طاقتور علاج کے اثرات ہیں، لیکن اس کا مستقل استعمال خوراک پر منحصر سنگین منفی اثرات سے وابستہ ہے [3]۔ میں اضافہآکسیڈیٹیواینٹی آکسیڈینٹ دفاعی نظام کے تناؤ اور دباؤ کی اطلاع مختلف اشاعتوں کے ذریعہ دی گئی تھی جو منشیات کے زہریلے اور ضمنی اثرات کو شامل کرنے میں ملوث تھے [4,5]۔ ڈیکلوفیناک کے ساتھ مل کر سٹرس فلاوونائڈز جیسے اینٹی آکسیڈنٹس کا استعمال ڈیکلوفیناک کی وجہ سے آکسیڈیٹیو تناؤ کا مقابلہ کرسکتا ہے اور اس طرح منشیات کے مضر اثرات اور زہریلے پن کو روک سکتا ہے۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

کھٹی انواع کے پھلوں کے کھٹے ذائقے اور کڑوے ذائقے کے لیے ذمہ دار نارنگن وسیع اسپیکٹرم فارماسولوجیکل اور علاج کی خصوصیات رکھتا ہے جیسے لپڈ کو کم کرنے والا، سوزش کو کم کرنے والا، آزاد ریڈیکل اسکیوینجنگ، اینٹی آکسیڈیٹیو، اینٹی ہائپرلیپیڈیمک،

antiapoptotic، اور antiatherogenic خصوصیات [6,7. Hesperidin ایک اور flavonoid ہے جو Citrus پرجاتیوں سے الگ تھلگ ہے جس میں کئی حیاتیاتی خصوصیات ہیں، خاص طور پر اینٹی آکسیڈینٹ اور سوزش کو دور کرنے والے [8]۔ یہ اطلاع دی گئی ہے کہ ہیسپریڈن نے سائٹوکوم سے متاثرہ جگر کے بافتوں کی چوٹ کو بہتر بنایاہسٹوپیتھولوجیکلامتحان [9]۔ یہ بھی انکشاف ہوا کہ ہیسپریڈین کو دبانے میں موثر تھا۔سوزشاور الرجک علامات اور الرجک ناک کی سوزش کے علاج میں[10]۔ لہذا، یہ مطالعہ diclofenac-حوصلہ افزائی جگر کی زہریلا پر naringin اور hesperidin کے ممکنہ حفاظتی اثرات کا جائزہ لینے اور احتیاطی کارروائی میں سوزش، آکسیڈیٹیو تناؤ، اور apoptosis کے ماڈیول کے کردار کو تلاش کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 کیمیکل اور کٹس۔ Diclofenac سوڈیم النصر فارماسیوٹیکل کیمیکل کمپنی، مصر سے حاصل کیا گیا تھا۔

Naringin اور hesperidin Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO, USA) نے تیار کیے تھے۔ دیگر تمام استعمال شدہ کیمیکل تجزیاتی گریڈ کے ہیں اور مقامی کیمیکل کمپنیوں سے حاصل کیے گئے تھے۔ Alanine transaminase (ALT) اور aspartate trans-aminase (AST) کٹس Spinreact, Ctra Sta Coloma, 7.17176 St., Esteve de Bas, Girona, Spain سے حاصل کی گئیں۔ Lactate dehydrogenase (LDH) اور y-glutamyltransferase (GGT) سپیکٹرم، مصری کمپنی برائے بائیو ٹیکنالوجی، Obour سٹی انڈسٹریل ایریا، قاہرہ، مصر سے حاصل کیے گئے تھے۔ الکلائن فاسفیٹیس (ALP) کٹ بائیو ڈائیگنوسٹک، 29 تحریر سینٹ، ڈوکی، گیزا، مصر سے حاصل کی گئی تھی۔ البومن اور بلیروبن کٹس ڈائمنڈ، 24 ایل مون-متزہ سینٹ، ہیلیوپولیس، قاہرہ، مصر سے حاصل کی گئیں۔

Cistanche قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتا ہے۔

2.2.تجرباتی جانور۔ موجودہ کام میں ویسٹار سٹرین کے بالغ نر چوہوں کا وزن 100-130g (9-1l ہفتے) تجرباتی جانوروں کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

وہ انی مل ہاؤس آف اوتھلمولوجی ریسرچ انسٹی ٹیوٹ، گیزا، مصر سے حاصل کیے گئے تھے۔ جانوروں کو اچھی طرح سے ہوا والے پنجروں میں روزانہ 12 گھنٹے ہلکے اندھیرے اور درجہ حرارت 20 سے 25 ڈگری کے درمیان رکھا جاتا تھا۔ چوہوں کو روزانہ معیاری گولی والی خوراک اور واٹر ایڈ لیبٹم کے ساتھ پورا کیا جاتا تھا۔ موافقت کے لیے تجربہ شروع کرنے سے پہلے اور کسی بھی درمیانی انفیکشن کو خارج کرنے کے لیے جانوروں کو دو ہفتوں تک نگرانی میں رکھا گیا تھا۔ تمام جانوروں کے طریقہ کار، بینی سیف یونیورسٹی، مصر کی فیکلٹی آف سائنس فار کیئر اینڈ یوز آف دی اینیملز کی تجرباتی جانوروں کی اخلاقیات کمیٹی کے رہنما خطوط اور ہدایات کے مطابق ہیں۔ اخلاقی منظوری کا نمبر BSU/FS/2015/15 ہے۔ جانوروں کی تکالیف اور تکالیف کو کم کرنے کی تمام کوششیں کی گئیں۔

2.3.جانوروں کی گروپ بندی۔ اس تجربے میں تیس نر چوہوں کا استعمال کیا گیا تھا اور انہیں پانچ گروپوں میں مختص کیا گیا تھا (شکل 1)۔

گروپ 1 (نارمل) کے چوہوں نے انٹراپریٹونیل انجیکشن کے ذریعے نمکین (وہ گاڑی جس میں ڈائیکلوفیناک کو حل کیا گیا تھا) کے مساوی حجم حاصل کیا اور 1 فیصد کے مساوی حجم بھی دیا۔carboxymethylسیلولوز (CMC؛ وہ گاڑی جس میں نارنگن اور ہیسپریڈین کو تحلیل کیا گیا تھا) روزانہ 4 ہفتوں تک زبانی گیویج کے ذریعے۔ گروپ 2 (ڈائیکلوفینیک انجیکشن والے گروپ) کو انٹراپریٹونیل انتظامیہ کے ذریعہ 3 ملی گرام / کلوگرام جسمانی وزن (کلوگرام ڈبلیو ٹی) / دن کی خوراک پر ڈائکلوفینیک (سلین میں تحلیل) انجکشن لگایا گیا تھا اور اسے 1 فیصد کے مساوی حجم بھی دیا گیا تھا۔ CMC کی طرف سے روزانہ 4 ہفتوں تک زبانی نالی کریں۔ گروپ 3 (ڈائیکلوفینیک انجکشن والے گروپ کو نارنگن کے ساتھ علاج کیا گیا) کو گروپ 2 کی طرح ڈیکلوفینیک دیا گیا اور 20mg/kgb کی خوراک کی سطح پر نارنگن (1 فیصد CMC میں تحلیل) کے ساتھ زبانی طور پر علاج کیا گیا۔ wt/day by oral gavage[12] 4 ہفتوں کے لیے۔ گروپ 4 (ڈائیکلوفینیک انجیکشن والے گروپ کو ہیسپریڈین کے ساتھ علاج کیا گیا) کو گروپ 2 کی طرح ڈیکلوفینیک دیا گیا اور 4 کے لئے 20mg/kg b.wt/day [13] کی خوراک پر زبانی طور پر hesperidin (1 فیصد CMC میں حل شدہ) کے ساتھ علاج کیا گیا۔ ہفتے گروپ 5 (ڈائیکلوفینیک انجکشن والے گروپ کو نارنگن اور ہیسپریڈین کے ساتھ علاج کیا گیا) کو گروپ 2 کی طرح ڈیکلوفینیک کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا اور زبانی طور پر نارنگن اورhesperidin(1 فیصد CMC میں تحلیل) 20mg/kg b. wt/دن 4 ہفتوں کے لیے۔

2.4.خون اور جگر کا نمونہ لینا۔

تجربے کے اختتام پر، چوہوں کو خوراک سے محروم کر دیا گیا، اور خون کی رگوں سے خون کے نمونے جمع کیے گئے۔ خون کے نمونوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر جمنے کے لیے چھوڑ دیا گیا اور پھر 15 منٹ کے لیے 3000rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ خون کے ہر نمونے کے سیرم کو تین شیشیوں میں تقسیم کیا گیا تھا جنہیں بائیو کیمیکل تجزیہ کے لیے استعمال ہونے تک -30 ڈگری پر رکھا گیا تھا۔

جگولر رگ سے خون کے نمونے لینے کے بعد، چوہوں کو euthanized اور جدا کیا گیا۔ ہر چوہے کے جگر کو تیزی سے نکال کر جراثیم سے پاک نمکین میں دھویا گیا ({{0}}.9 فیصد NaCl۔ جگر کے ٹکڑوں کو ہسٹولوجیکل تحقیقات کے لیے 10 فیصد نیوٹرل بفرڈ فارملین میں طے کیا گیا۔ آکسیڈیٹیو تناؤ اور اینٹی آکسیڈینٹ دفاعی مارکروں کے تعین کے لیے جراثیم سے پاک آئسوٹونک نمکین (0.9 فیصد NaCl) میں -30 ڈگری پر ڈیپ فریزر۔ ریورس ٹرانسکرپٹیس پولیمریز چین ری ایکشن (RT-PCR) تجزیہ۔

2.5 سیرم میں جگر کے فنکشن پیرامیٹرز کا پتہ لگانا۔

ALT اور AST سرگرمیوں کا تخمینہ نیکوٹینامائڈ اڈینائن ڈینیوکلیوٹائڈ ہائیڈروجن (NADH) آکسیڈیشن کے طریقہ کار کے مطابق بالترتیب مرے [14] اور مرے [15] کے طریقوں کے مطابق لگایا گیا تھا، اسپین رییکٹ، اسپین سے خریدی گئی ریجنٹ کٹس کا استعمال کرتے ہوئے۔ مختصراً، ALT الانائن کو پائروویٹ میں تبدیل کرتا ہے، جسے LDH کے ذریعے کم کر کے لییکٹیٹ میں تبدیل کر دیا جاتا ہے، اور NADH کو نیکوٹینامائڈ اڈینائن ڈینیوکلیوٹائڈ (NAD) میں آکسائڈائز کیا جاتا ہے۔ NADH کے ارتکاز میں کمی کی شرح، 340nm پر فوٹوومیٹرک طور پر ماپا جاتا ہے، سیرم کے نمونے میں موجود ALT کے کیٹلیٹک ارتکاز کے متناسب ہے۔ دوسری طرف، AST اسپارٹیٹ کو آکسالواسیٹیٹ میں تبدیل کرنے کے لیے اتپریرک کرتا ہے، جو میلیٹ ڈیہائیڈروجنیز (MDH) کے ذریعے میلیٹ میں کم ہو جاتا ہے، اور NADH کو NAD میں آکسائڈائز کیا جاتا ہے۔ NADH کے ارتکاز میں کمی کی شرح، جو فوٹوومیٹرک طور پر 340nm پر ماپا جاتا ہے، سیرم کے نمونے میں موجود AST کے کیٹلیٹک ارتکاز کے متناسب ہے۔ وین ڈیر ہیڈن ایٹ ال کے طریقہ کار کے مطابق سیرم ایل ڈی ایچ کی سرگرمی کا پتہ چلا۔ [16]۔ اس طریقہ میں، LDH NAD* اور L-lactate پیدا کرنے کے لیے پائروویٹ اور NADH کے درمیان رد عمل کو متحرک کرتا ہے۔ NADH کے ارتکاز میں کمی کی شرح، 340 nm پر فوٹوومیٹرک طور پر ماپا جاتا ہے، نمونے میں موجود LDH کے کیٹلیٹک ارتکاز کے متناسب ہے۔ سیرم ALP سرگرمی کا تعین بیلفیلڈ اور گولڈ برگ [17] کے طریقہ کار کے مطابق بائیو ڈائیگنوسٹک، مصر سے حاصل کردہ کٹس کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ پی ایچ 10 پر فینائل فاسفیٹ (5 mmol/L) میں سیرم کا نمونہ شامل کرکے،

ALP فینول اور فاسفیٹ کی تشکیل کا باعث بنتا ہے۔ آزاد شدہ فینول کو 4-امینو فینازون اور پوٹاشیم فیریکانائیڈ کی موجودگی میں 510nm پر رنگین پیمائش کی جاتی ہے۔ جی جی ٹی کی سرگرمی کا تعین Szasz اور Persijn [18] کے طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا جو اسپیکٹرم ڈائیگنوسٹک، مصری کمپنی برائے بائیو ٹیکنالوجی، مصر سے حاصل کی گئی تھی۔ GGT ان-گلوٹامیل گروپ کو سبسٹریٹ L- -glutamyl-p-nitroanilide سے منتقل کرتا ہے، جو کروموجن p-nitroanilide (PNA) کو آزاد کرتا ہے جس کی پیمائش 418nm ہوتی ہے اور اس کی تشکیل GGT سرگرمی کے متناسب ہے۔ سیرم البومین کی سطح کا تعین ڈوماس ایٹ ال کے طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا۔ [19] ڈائمنڈ، مصر سے خریدی گئی ری ایجنٹ کٹس کا استعمال۔ طریقہ، مختصراً، سائٹریٹ بفر pH 3.8 میں 2mL برو-مور سول گرین (0.12mmol/L) میں 10μL سیرم شامل کرکے انجام دیا گیا۔ البومین/bromocresolگرین کمپلیکس، ردعمل کی طرف سے تشکیل، 630nm پر ماپا گیا تھا. ڈائمنڈ، مصر سے خریدی گئی ریجنٹ کٹس کا استعمال کرتے ہوئے مالوئے اور ایولین [20] کے طریقوں کے مطابق سیرم بلیروبن کی سطح کی جانچ کی گئی۔ بلیروبن کا اندازہ لگانے کا یہ طریقہ وین ڈین برگ کے رد عمل پر مبنی ہے۔ اس رد عمل میں، بلیروبن ڈیازوٹائزڈ سلفانیلک ایسڈ کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتا ہے تاکہ azobilirubin پیدا ہو جس کا رنگ جامنی ہے اور اس کی پیمائش فوٹو میٹرک طور پر 578nm پر کی گئی تھی۔ رنگ کی شدت سیرم میں بلیروبن کی مقدار کے براہ راست متناسب ہے۔

2.6۔ جگر کے آکسیڈیٹیو تناؤ اور اینٹی آکسیڈینٹ دفاعی نظام کے پیرامیٹرز کا اندازہ۔

لیور لپڈ پیرو آکسائڈریشن (LPO) کا تعین Preuss et al کے طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا۔ [21]۔ مختصراً، پروٹین کو 1 ملی لیور ہوموجنیٹ میں 0.15mL 76 فیصد ٹرائکلورواسیٹک ایسڈ (TCA) شامل کر کے تیار کیا گیا۔ اس کے بعد، 0.35mL thiobarbituric acid (TBA) کو رنگ تیار کرنے والے ایجنٹ کے طور پر، الگ کیے گئے سپرنٹنٹ میں شامل کیا گیا۔ 30 منٹ تک 80 ڈگری پر پانی کے غسل میں انکیوبیشن کے بعد تیار شدہ بیہوش گلابی رنگ کی پیمائش 532nm پر کی گئی۔ MDA(malondialdehyde or 1,1,3,3-tetra methoxy propane) کو معیاری کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ جگر میں گلوٹاتھیون (GSH) کے کم مواد کا تعین 0.5 mL5,5'-dithiobis (2-nitrogen-zoic acid), Elman's reagent (بطور رنگ تیار کرنے والے ایجنٹ) اور فاسفیٹ بفر محلول (pH 7) کو شامل کرکے کیا گیا تھا۔ Beutler et al کے طریقہ کار کی بنیاد پر پروٹین کی بارش کے بعد سپر ناٹینٹ کو ہم آہنگ کرنا۔ [22]۔ نمونے اور GSH معیارات میں تیار شدہ پیلے رنگ کو خالی کے مقابلے میں 412nm پر ماپا گیا۔ جگر کے GPx کی سرگرمی کو Matkovics et al کے طریقہ کار کے مطابق ماپا گیا۔[23] کچھ ترامیم کے ساتھ۔ یہ طریقہ GSH کی کھوج پر مبنی ہے جو انزائم کے ذریعہ بقایا GSH کا پتہ لگانے اور اسے کل سے گھٹا کر آکسیڈائزڈ گلوٹاتھیون (GSSG) میں تبدیل ہوتا ہے۔ مختصراً، 50 μL ہوموجنیٹ سپرنٹنٹ کو ایک Wasserman ٹیوب میں شامل کیا گیا جس میں 350μL Tris بفر （pH 7.6）، 50μL GSH محلول（2mM）، اور 50μL H, O, (3.38mM) شامل ہیں۔ پھر، انکیوبیشن کے 10 منٹ کے بعد، بقایا GSH مواد کو GSH کے تعین کے لیے پہلے بیان کردہ طریقہ سے 430nm پر ماپا گیا۔ معیاری ٹیسٹ 50μL نمونے کی بجائے 50μL ڈسٹل واٹر شامل کرکے تیار کیا گیا تھا اور خالی ٹیسٹ 50μL نمونے اور 50μL GSH محلول کی بجائے 100μL ڈسٹل واٹر شامل کرکے تیار کیا گیا تھا۔ نمونے میں بقایا GSH مواد کا پتہ لگانے کے بعد، GSH کو آکسیڈائزڈ شکل (GSSG) میں تبدیل کر دیا جاتا ہے اور انزائم کی سرگرمی کا حساب لگایا جا سکتا ہے۔ مارکلنڈ اور مارکلنڈ [24] کے طریقہ کار کے مطابق لیور سپر آکسائیڈ خارج کرنے (SOD) سرگرمی کا پتہ چلا۔ رد عمل ایس او ڈی کے ذریعہ پائروگالول کے آٹو آکسیڈیشن کی روک تھام پر مبنی ہے۔ یہ عمل سپر آکسائیڈ آئنوں کی موجودگی پر منحصر ہے۔ انزائم کی مقدار جو معدومیت میں 50 فیصد رکاوٹ کا سبب بنتی ہے کنٹرول کے مقابلے میں 1 منٹ میں تبدیل ہوتی ہے اسے انزائم کی ایک اکائی کے طور پر شمار کیا جاتا ہے۔

2.7.سیرم TNF-، IL-17، اور IL-4 کی سطحوں کا تعین۔

سیرم TNF-، I-17، اور I-4 سطحوں کا تخمینہ مخصوص انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کٹس کے مطابق مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق لگایا گیا تھا۔ Rat TNF-alpha ELISA کٹ (کیٹلاگ نمبر: MBS355371)، IL-17 ELISA کٹ (کیٹلاگ نمبر.MBS5203506)، اور IL-4 ELISA کٹ (کیٹلاگ نمبر: MBS494192) MyBioSource, Inc سے حاصل کی گئیں۔ ، سان ڈیاگو، CA، USA. یہ ELISA کٹس سینڈوچ ELISA استعمال کرتی ہیں۔ مختصراً، ان کٹس میں فراہم کردہ مائیکرو ELISA پلیٹوں کو متعلقہ سائٹوکائن کے لیے مخصوص اینٹی باڈی کے ساتھ پری کوٹ کیا گیا ہے۔ معیارات یا نمونے مناسب مائیکرو ELISA پلیٹ ویلز میں شامل کیے جاتے ہیں اور مخصوص اینٹی باڈیز کے ساتھ مل جاتے ہیں۔ اس کے بعد، متعلقہ سائٹوکائن اور ایوڈین ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز (HRP) کنجوگیٹ کے لیے مخصوص ایک بایوٹینیلیٹڈ ڈیٹیکشن اینٹی باڈی کو ہر مائکروپلیٹ میں اچھی طرح سے شامل کیا جاتا ہے اور انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ مفت اجزاء کو دھویا جاتا ہے. سبسٹریٹ حل ہر کنویں میں شامل کیا جاتا ہے۔ صرف وہ کنویں جن میں سائٹوکائن، بایوٹینیلیٹڈ ڈیٹیکشن اینٹی باڈیز اور ایوڈین-ایچ آر پی کنجوگیٹ ہوتے ہیں نیلے رنگ کے دکھائی دیں گے۔ انزائم-سبسٹریٹ رد عمل سلفورک ایسڈ محلول کے اضافے سے ختم ہو جاتا ہے اور رنگ پیلا ہو جاتا ہے۔ آپٹیکل کثافت (OD) کو 450 nm کی طول موج پر سپیکٹرو فوٹومیٹرک طور پر ماپا جاتا ہے۔ OD قدر ٹیسٹ شدہ سائٹوکائن کے ارتکاز کے متناسب ہے اور نمونوں میں اس کے ارتکاز کا تعین نمونوں کے OD کا معیاری وکر سے موازنہ کر کے کیا جا سکتا ہے۔

2.8. p53 کے mRNA اظہار کا پتہ لگانا

2.8.1.RNA تنہائی۔

چومزنسکی اور ساچی [25] اور بوم ایٹ ال کے طریقہ کار کے مطابق کل آر این اے کو جگر کے ٹشو سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ تھرمو فشر سائنٹیفک انکارپوریشن، روچیسٹر، نیویارک، USA سے حاصل کردہ تھرمو سائنٹیفک GeneJET RNA پیوریفیکیشن کٹ کا استعمال۔ مختصراً، جگر کے نمونوں کو لیسز بفر میں لیس اور ہم آہنگ کیا جاتا ہے، جس میں guanidine thiocyanate ایک chaotropic نمک کے طور پر اور -mercaptoethanol RNA کو endogenous RNases سے بچانے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ اس کے بعد لیسیٹ کو ایتھنول کے ساتھ ملایا جاتا ہے اور پیوریفیکیشن کالم پر لوڈ کیا جاتا ہے۔ چاوٹروپک نمک اور ایتھنول آر این اے کو سلیکا جھلی سے باندھنے کا سبب بنتا ہے جب کہ لیسیٹ کالم کے ذریعے کاتا جاتا ہے۔ اس کے بعد، کالم کو واش بفرز سے دھو کر جھلی سے نجاست کو مؤثر طریقے سے ہٹا دیا جاتا ہے۔ اس کے بعد خالص آر این اے کو نیوکلیز سے پاک پانی کے ساتھ کم آئنک طاقت والے حالات میں ایلوٹ کیا جاتا ہے۔ الگ تھلگ RNA کی سطحوں کا تعین ایک الٹرا وائلٹ (UV) سپیکٹرو فوٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور 260nm اور 280 nm پر آپٹیکل کثافت (OD) پر جاذبیت کو لیا گیا تھا۔ RNA کو سمبروک اور رسل کے [27]فارمولے （RNA（ug/μL）=ODat 260nm×dilution×40ug/mL/1000） کی بنیاد پر کوانٹیفائیڈ اور کوالیفائی کیا گیا تھا۔ ہر ایک نکالے گئے RNA نمونے کے لیے، OD کے درمیان 260 nm اور OD کے درمیان 280nm پر تناسب اور تناسب 1.7 اور 2.0 کے درمیان ہے جو نکالے گئے RNA کی اعلیٰ پاکیزگی کو یقینی بناتا ہے۔

2.8.2 RT-PCR Assay.RT-PCR پرکھ کا اطلاق Thermo Scientific Verso 1-Step RT-PCR ریڈی مکس کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک انکارپوریشن،

روچیسٹر، نیو یارک، USA) جگر p53 کے mRNA اظہار کا پتہ لگانے کے لیے۔ مختصر طور پر، ایک قدمی رد عمل میں، RNA کو الٹا cDNA میں نقل کیا گیا اور تیار کردہ cDNA کو Techne 32 Ther-mocycler کے ذریعے بڑھا دیا گیا۔ رد عمل کا مرکب Veso Enzyme Mix（1μL）، 2X One-Step PCR ReadyMix（25μL）، RT بڑھانے والا（25μL）، فارورڈ پرائمر（10μM; 1μL）، ریورس پرائمر（10μM;1μ）، ٹیمپلیٹ RNA（1 ng;1.5μL）، اور واٹر نیوکلیز فری کل حجم 50μL تک مکمل کرنے کے لیے۔ تھرمل سائیکلنگ پروگرام میں cDNA کی ترکیب (temp.50 ڈگری، 15 منٹ، 1 سائیکل)، verso inactivation (temp.95 ڈگری، 2 منٹ، 1 سائیکل)، denaturation (temp.95 ڈگری، 20 سیکنڈ)، annealing (temp. 55 ڈگری سینٹی گریڈ، 30 سیکنڈ)، ایکسٹینشن (ٹمپریچر 72 ڈگری، 1 منٹ)، اور فائنل ایکسٹینشن (ٹیمپیچر 72 ڈگری، 5 منٹ، 1 سائیکل)۔ اینیلنگ اور ایکسٹینشن کے بعد ڈینیچریشن کے چکروں کی تعداد 35 سائیکل ہے۔ ریورس ٹرانسکرپشن اور ایمپلیفیکیشن کے بعد، 10μL PCR مصنوعات کا تجزیہ 1×Tris Borate EDTA buffer(TBE) pH 8 میں ایتھیڈیم برومائیڈ سے داغے ہوئے 1.5 فیصد ایگروز جیل پر کیا گیا۔{39}}.5۔ الیکٹروفوریٹک تصویر کو جیل دستاویزی نظام (جیل ڈوکو ایڈوانسڈ) کے ذریعے تصور اور تجزیہ کیا گیا تھا، اور اقدار کو ایکٹین کی مقدار کے مطابق معمول بنایا گیا تھا۔ پرائمر جوڑی کی ترتیب p53 5'd CAGCGTGATGATGGTAAGGA 3' (آگے) اور 5'd GCGTTGCTCTGATGGTGA 3' (ریورس) اسیری [28] کے مطابق تھے۔

2.9 ہسٹوپیتھولوجیکل تحقیقات۔ قربانی اور ڈسکشن کے بعد، ہر چوہے کے جگر کو تیزی سے نکالا گیا اور پھر اسے نمکین محلول میں پرفیوز کیا گیا۔

ہر چوہے کے جگر سے ٹکڑے （3 mm²） لئے گئے اور انہیں 10 فیصد غیر جانبدار بفرڈ فارملین میں چوبیس گھنٹے تک طے کیا گیا۔ فکسڈ جگروں کو مزید پروسیسنگ کے لیے پیتھالوجی ڈیپارٹمنٹ، فیکلٹی آف ویٹرنری میڈیسن، بینی سوف یونیورسٹی کو بھیجا گیا، موم میں بلاکنگ، سیکشننگ، اور ہیماتوکسیلین اور ای اوسین (H&E) کے ساتھ داغ لگانے کے لیے[29]۔ ہسٹوپیتھولوجیکل اسکورز کا پتہ لگانے کے لئے جگر کے داغ والے حصوں کی جانچ کی گئی۔ ہر حصے کے تین تصادفی طور پر منتخب کردہ فیلڈز (×100) میں، زخموں یا زخموں کو غیر حاضر (0)، ہلکے (I)، اعتدال پسند ()، اور شدید (II) تبدیلیوں کے لیے درجہ بندی کیا گیا، 0 فیصد، بالترتیب 30 فیصد سے کم، 30-50 فیصد، اور 50 فیصد سے زیادہ [30]۔ درجہ بندی شدہ گھاووں میں ہائیڈروپک اور ویکیولر انحطاط، سوزشی خلیوں کی دراندازی، نیکروسس، اپوپٹوس، کپفر سیل کا پھیلاؤ، فیٹی تبدیلیاں اور سٹیٹوسس، خون کی نالیوں اور سینوسائڈز، اور بائل ڈکٹ کے اپکلا استر کا ہائپرپلاسیا شامل ہیں۔

2.10 کیسپیس کا امیونو ہسٹو کیمیکل پتہ لگانا-3۔

پیرافن سے جڑے جگر کے نمونوں کو 5um موٹے حصوں میں تقسیم کرنے کے لیے محکمہ پیتھالوجی، نیشنل کینسر انسٹی ٹیوٹ میں منتقل کیا گیا تھا جو کہ مثبت چارج والی سلائیڈز (فشر سائنٹیفک، پِٹسبرگ، PA) پر نصب تھے۔ کیسپیس-3 ری ایکٹیویٹی کو گیلی ایٹ ال کے طریقوں کے مطابق پروسیس کیا گیا تھا۔[31] اور احمد اور احمد [32]۔ مختصراً، اینٹیجن کی بازیافت کے بعد، کیسپیس-3(سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی، سانتا کروز، CA، USA) کے لیے ایک پتلا شدہ بنیادی اینٹی باڈی کو 1 گھنٹے کے لیے جگر کے حصوں میں لگایا گیا تھا۔ پتلا بائیوٹینیلیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈی (ڈاکو سائٹومیشن کٹ) شامل کیا گیا، اور 37 ڈگری پر 15 منٹ تک انکیوبیشن کیا گیا۔ اس کے بعد، ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز کو اسٹریپٹاویڈن (ڈاکو سائٹومیشن کٹ) کے ساتھ جوڑ کر مزید 15 منٹ تک انکیوبیشن کے لیے لگایا گیا۔ پابند اینٹی باڈی کمپلیکس کو 3,3'-diaminobenzidine (DAB) سبسٹریٹ کے رد عمل اور ہیماتوکسیلین کے ساتھ کاؤنٹرسٹیننگ کے ذریعے تصور کیا گیا تھا۔ جگر کے تمام حصوں کو ایک ہی حالت میں اینٹی باڈیز کے یکساں گھٹاؤ کے ساتھ اور ایک ہی مدت میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا، لہذا مختلف مطالعاتی گروپوں میں امیونوسٹیننگ کا موازنہ کیا جا سکتا تھا۔ ہر تیاری کے لئے، ایک منفی کنٹرول کیا گیا تھا (بغیر بنیادی اینٹی باڈی کے ایک سلائیڈ)۔ حصوں کو ہلکے خوردبین کے تحت تصور کیا گیا تھا، اور سیل کی مدافعتی صلاحیت کی حد کا اندازہ کیا گیا تھا. جگر کے حصوں کی تصاویر ڈیجیٹل کیمرے (Leica، DM2500M Leica، Wetzlar، Germany) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئیں۔ لیبلنگ کی جانچ اور تجزیہ مفت سافٹ ویئر ورژن ImageJ(1.51d)[33] کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ امیج جے سافٹ ویئر کا استعمال کیسپیس کے مثبت رد عمل کی مربوط شدتوں (پکسلز میں) کی پیمائش کے لیے کیا گیا تھا-3۔

2.11۔ شماریاتی تجزیہ.

Results were represented in tables and graphs as the mean±standarderror(SE). The data were analyzed by LSD analysis to discern the main effects and to compare various groups with each other using PC-STAT, University of Georgia(USA)[34]. Values of p>0.05 کو شماریاتی طور پر غیر اہم طور پر مختلف سمجھا جاتا تھا، جبکہ p کی قدریں۔<0.05 were="" significantly="" and="" highly="" significantly="">

3. نتائج

3.1 جگر کے فنکشن سے متعلق سیرم پیرامیٹرز پر اثر۔

روزانہ 4 ہفتوں تک ڈیکلوفینیک کے انٹراپیریٹونیئل انجیکشن نے ایک اہم بلندی کی حوصلہ افزائی کی (p<0.05)in serum="" alt,="" ast,="" ldh,="" alp,="" and="" ggt="" activities="" as="" well="" as="" serum="" total="" bilirubin="" level.="" the="" cotreatment="" of="" diclofenac-injected="" ani-mals="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" induced="" a="" decrease="" in="" these="" elevated="" levels.="" while="" the="" cotreatment="" of="" diclofenac-injected="" rats="" with="" naringin="" induced="" a="" significant="" decrease=""><0.05)in the="" elevated="" serum="" ast,="" ldh,="" alp,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels,="" it="" produced="" a="" nonsignificant="" effect="" (p="">0.05) ALT سرگرمی پر۔ ہیسپریڈین کے ساتھ ڈیکلوفینیک انجیکشن والے جانوروں کے علاج نے ایک اہم اثر پیدا کیا (p<0.05)on the="" elevated="" alt,="" ast,="" ldh,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels="" while="" it="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" effect="" in="" serum="" alp=""><0.05). the="" cotreatment="" with="" naringin="" and="" hesperidin="" in="" combination="" successfully="" caused="" a="" significant="" decrease=""><0.05)in all="" elevated="" parameters="" related="" to="" liver="" function="" including="" alt,="" ast,="" ldh,="" alp,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels.="" moreover,="" the="" treatment="" with="" the="" combination="" of="" naringin="" and="" hesperidin="" appeared="" to="" be="" the="" most="" effective="" in="" improving="" the="" elevated="" ast,="" alp,="" and="" ggt="" activities(table="" 1).="" serum="" albumin="" level,="" on="" the="" other="" hand,="" exhibited="" a="" nonsignificant="" change="" (p="">0.05) تمام گروپس میں۔

3.2.جگر کے آکسیڈیٹیو تناؤ اور اینٹی آکسیڈینٹ دفاعی نظام پر اثر۔

روزانہ 4 ہفتوں تک ڈائکلوفینیک کے انٹراپریٹونیل انجیکشن نے ایک اہم بلندی پیدا کی (p<0.05)in liver="" lpo="" and="" a="" significant=""><0.05) in="" liver="" gsh="" con-tent="" and="" gpx="" and="" sod="" activities.="" the="" treatment="" of="" diclofenac-injected="" animals="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" induced="" a="" significant=""><0.05)in liver="" lpo.="" narin-gin="" and="" its="" combination="" with="" hesperidin="" were="" more="" potent="" than="" hesperidin="" alone="" in="" decreasing="" the="" elevated="" liver="" lpo="" product.="" while="" the="" treatment="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" produced="" a="" significant="" increase=""><0.05) in="" liver="" gpx="" and="" sod="" activities,="" only="" naringin,="" and="" hesperidin="" in="" combination="" induced="" a="" significant="" increase=""><0.05) in="" liver="" gsh="" content="" (table="">

3.3 جگر p53 mRNA اظہار پر اثر۔

جیسا کہ شکل 2 میں اشارہ کیا گیا ہے، پروپوپٹوٹک پروٹین p53 mRNA اظہار میں نمایاں اضافہ ہوا ہے (p<0.05)in the="" liver="" of="" diclofenac-injected="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" the="" treatment="" with="" naringin,="" hesperidin,="" and="" their="" combination="" produced="" a="" significant=""><0.05)decrease in="" p53="" mrna="" expression="" in="" comparison="" with="" diclofenac-injected="" control.="" there="" is="" no="" significant="" difference="" between="" the="" three="" treatments="" when="" compared="" with="" each="">

3.4.سیرم TNF-، IL-17، اور-4سطحوں پر اثر۔ جدول 3 میں، 4 ہفتوں تک ڈیکلوفینیک کے روزانہ انٹراپریٹونیل انجیکشن نے نمایاں اضافہ کیا(p<0.05)in serum="" tnf-αand="" il-17="" levels="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" serum="" il-4="">

ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں کے نارنگن اور/یا ہیسپریڈن کے ساتھ علاج نے نمایاں بہتری کی حوصلہ افزائی کی (p<0.05)of altered="" serum="" tnf-a,="" il-17,="" and="" i-4="" levels.="" the="" treatment="" with="" the="" combination="" of="" both="" flavonoids="" was="" the="" most="" potent="" in="" increasing="" the="" lowered="" il-4level;="" the="" effect="" of="" the="" combination="" was="" more="" significantly="" potent=""><0.05)as compared="" with="" the="" effect="" of="" either="" naringin="" or="">

3.5 جگر کے ہسٹوپیتھولوجیکل نتائج۔

شکل 3 ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں کے جگر کی ہسٹولوجیکل تبدیلیوں پر نارنگن اور/یا ہیسپریڈین کے اثر کو ظاہر کرتی ہے۔ شکل 3(a) جگر کو ہیپاٹک لوبول کی عام ہسٹولوجیکل ساخت کے ساتھ دکھاتا ہے۔ دوسری طرف، ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں کے جگر میں نقصان دہ ہسٹولوجیکل تبدیلیوں کی نمائش کی گئی جیسے ہیپاٹوسیٹس کی ہائیڈروپک انحطاط، اپوپٹوٹک خلیات، اور مونو نیوکلیئر خلیات (شکل 3(بی)) کے ساتھ پورٹل دراندازی کے علاوہ سائٹوپلاسمک ویکیولائزیشن کے علاوہ فوکل سوزش خلیوں کی دراندازی سے وابستہ (شکل 3(c))۔ ان تبدیلیوں میں کچھ حد تک ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں میں ترمیم کی گئی تھی جن کا نارنگن کے ساتھ علاج کیا گیا تھا جس میں چھٹپٹ ہیپاٹائٹس (شکل 3(d)) کی واحد چربی والی تبدیلی ظاہر ہوتی ہے۔ ہیسپریڈین کے ساتھ ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں کے علاج سے جگر کی ہسٹولوجیکل تبدیلیوں میں بہتری آئی ہے جیسا کہ ڈیکلوفینیک انجیکشن کنٹرول کے مقابلے میں ہے لیکن اس کے باوجود چھٹپٹ ہیپاٹوسائٹس کی فیٹی تبدیلی، کپفر خلیوں کی معمولی سرگرمی، اور چند اپوپٹوٹک خلیات کی موجودگی (شکل) 3(e))۔ اسی طرح، ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں کے علاج نے نارنگین اور ہیسپریڈین کے امتزاج کے ساتھ جگر کی ہسٹولوجیکل تبدیلیوں کو ڈیکلوفینیک انجیکشن کنٹرول کے مقابلے میں بہتر کیا۔ تاہم، دونوں flavonoids کے امتزاج کے ساتھ diclofenac انجکشن والے چوہوں کے جگر میں Kupffer سیل کے پھیلاؤ اور معمولی cytoplasmic vacuolization (شکل 3(f)) کی نمائش ہوئی۔ ایسا لگتا تھا کہ نارنگن اور ہیسپریڈین کا مشترکہ اثر جگر کے ہسٹولوجیکل فن تعمیر کو بہتر بنانے میں سب سے زیادہ طاقتور تھا۔

تمام گروپوں کے ہسٹوپیتھولوجیکل تبدیلی کے اسکور ٹیبل 4 میں درج کیے گئے ہیں۔ عام کنٹرول کے جگر کے حصے نے تمام ہسٹولوجیکل گھاووں کے لیے صفر اسکور دکھائے۔ جگر کے ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں نے گریڈ III سے گریڈ 0 تک کے مختلف درجات کی ہسٹولوجیکل لیزن اسکورز کی نمائش کی۔ ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں کو ہیسپریڈین اور نارنگن کی انتظامیہ کے نتیجے میں ہسٹولوجیکل گھاووں میں نمایاں بہتری آئی جن میں ہائیڈروپک اور ویکیولر انحطاط، سوزش کے خلیوں کی دراندازی، نیکروسس، اپوپٹوس، کپفر سیل کا پھیلاؤ، چکنائی کی تبدیلی، سٹیٹوسس، بھیڑ شامل ہیں۔

FcuRE 2: diclofenac کے زیر انتظام چوہوں کے جگر میں p53 mRNA اظہار پر naringin، hesperidin، اور ان کے امتزاج کا اثر۔ مطلب، جو مختلف علامتوں کا اشتراک کرتے ہیں، p میں نمایاں طور پر مختلف ہیں۔<0.05. blood="" vessels="" and="" sinusoids,="" and="" hyperplasia="" of="" the="" epithelial="" lining="" of="" the="" bile="" duct;="" thereby,="" the="" liver="" exhibited="" lower="" grades="" of="" histopathological="" change="" scores="" in="" the="" diclofenac-injected="" groups="" treated="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" in="" comparison="" with="" diclofenac-injected="" control="" rats.="" the="" combinatory="" effect="" of="" naringin="" and="" hesperidin="" was="" the="" most="" potent="" in="" decreasing="" the="" histopathological="" lesion="">

3.6۔ امیونو ہسٹو کیمیکل پرکھ۔

امیونو ہسٹو کیمیکل طور پر داغدار جگر کے حصوں کو شکل 4 میں دکھایا گیا ہے اور تصویری تجزیہ کے نتائج کو شکل 5 میں دکھایا گیا ہے۔

تصویر 4 میں فوٹو مائکروگرافس اور شکل 5 میں ڈیٹا نے انکشاف کیا کہ ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں میں کیسپیس-3 اظہار میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ ڈیکلوفینیک انجیکشن والے چوہوں کا نارنگن، ہیسپریڈین اور ان کے امتزاج کے ساتھ علاج کے نتیجے میں جگر میں بلند کیسپیس-3 اظہار میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ نارنگن اور ہیسپریڈین کا مشترکہ اثر بلند کیسپیس-3 مواد کو کم کرنے میں سب سے زیادہ طاقتور تھا۔ مرکب کے ساتھ علاج نے جگر کے کیسپیس-3 اظہار کو معمول بنایا۔

یہ مضمون آکسیڈیٹیو میڈیسن اینڈ سیلولر لمبییوٹی والیوم 2021، آرٹیکل ID 9990091، 14 صفحات https://doi.org/10.1155/2021/9990091 سے لیا گیا ہے۔