یادداشت کے فنکشن، مائٹوکونڈریل ڈائنامکس، آکسیڈیٹیو تناؤ، اور D-Galactose-حوصلہ افزائی عمر رسیدہ چوہوں میں نیوروئنفلامیشن پر ورزش اور MitoQ کے نیورو پروٹیکٹو فوائد حصہ 2

2.6۔ ٹشو کی تیاری

TE اور یادداشت کے رویے کے 8 ہفتوں کے ٹیسٹ مکمل کرنے کے بعد، تمام چوہوں کو CO2 سانس کے ذریعے ایتھانائز کیا گیا، اور ہر علاج کے گروپ میں 7 جانوروں سے دماغی ٹشوز کاٹے گئے۔

میموری رویے ٹیسٹ میموری کا اندازہ کرنے کے لئے ایک مؤثر ذریعہ ہے. بڑھتے ہوئے سماجی اور کام کے دباؤ کے ساتھ، لوگوں کی یادداشت زیادہ اہم ہوتی جا رہی ہے۔ لہذا، میموری کے رویے کا ٹیسٹ لینے سے ہمیں اپنی یادداشت کی سطح کو سمجھنے میں مدد مل سکتی ہے اور ٹیسٹ کے نتائج کے مطابق اپنی یادداشت کو بہتر بنانے اور برقرار رکھنے کے لیے موثر اقدامات کرنے میں مدد مل سکتی ہے۔

خاص طور پر، میموری کے رویے کے ٹیسٹ لوگوں کی معلومات حاصل کرنے، اس پر کارروائی کرنے، ذخیرہ کرنے اور بازیافت کرنے کی صلاحیت کا اندازہ لگا سکتے ہیں۔ مختلف قسم کی معلومات جیسے زبان، نمبر، تصاویر وغیرہ کی جانچ کے ذریعے لوگوں کی یادداشت کو مکمل طور پر جانچا جا سکتا ہے۔ ٹیسٹ کے نتائج ہماری کمزوریوں اور طاقتوں کو سمجھنے اور اپنی یادداشت کو کیسے مضبوط کرنے میں مدد کرنے کے لیے مختلف اسکور فراہم کریں گے۔

عملی طور پر، یادداشت کے رویے کے بہت سے ٹیسٹ پیشہ ورانہ نکات اور تجاویز بھی فراہم کرتے ہیں۔ مثال کے طور پر اچھی نیند، متوازن خوراک، مناسب ورزش اور دماغی ورزشیں یہ سب لوگوں کی یادداشت کو بہتر بنانے کے لیے فائدہ مند ہیں۔ ان طریقوں کے ذریعے، ہم اپنی یادداشت کو برقرار رکھنے کے وقت، یادداشت کی تولیدی صلاحیت، اور دیگر پہلوؤں کو بہتر بنا سکتے ہیں، تاکہ روزمرہ کی زندگی یا کام کی ضروریات کو بہتر طریقے سے ڈھال سکیں۔

مختصر یہ کہ یادداشت کے رویے کا ٹیسٹ کسی کی یادداشت کو سمجھنے، جانچنے اور بہتر کرنے کے لیے بہت مفید ہے۔ ہمیں اپنی اصل صورت حال کے مطابق اپنی یادداشت کو مضبوط کرنے کے لیے مناسب طریقے بھی اپنانے چاہئیں، تاکہ زیادہ بھرپور اور بھرپور زندگی کی مضبوط بنیاد رکھی جا سکے۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche یادداشت کو نمایاں طور پر بہتر بنا سکتا ہے کیونکہ Cistanche ایک روایتی چینی ادویاتی مواد ہے جس میں بہت سے منفرد اثرات ہیں، جن میں سے ایک یادداشت کو بہتر بنانا ہے۔ Cistanche کا اثر اس میں موجود مختلف فعال اجزاء سے آتا ہے، بشمول tannic acid، polysaccharides، flavonoid glycosides وغیرہ۔ یہ اجزاء مختلف طریقوں سے دماغی صحت کو فروغ دے سکتے ہیں۔

شارٹ ٹرم میموری کو بہتر بنانے کا طریقہ جانیں پر کلک کریں۔

دماغی پرانتستا اور ہپپوکیمپس کو الگ کرنے کے بعد، دماغ کے بافتوں کو مائع نائٹروجن میں فلیش سے منجمد کر دیا گیا اور تجزیہ تک −80 ◦C پر محفوظ کیا گیا۔ باقی 5 جانور امیونو ہسٹو کیمسٹری (IHC) تجزیہ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔

چھاتی کی گہا کھولنے کے بعد، 50 ایم ایم فاسفیٹ بفرڈ نمکین (پی بی ایس) کو بائیں ویںٹرکل سے 10 منٹ تک گزارا گیا، اور پھر جانور کو 100 ایم ایم پی بی ایس میں 4٪ پیرافارمیلڈہائڈ (پی ایف اے) کے ساتھ پرفیوز کیا گیا۔

پرفیوژن فکسیشن کے بعد، دماغ کی کٹائی کی گئی، 4% PFA میں رکھا گیا، اور 4 گھنٹے کے لیے 4 ◦C پر طے کیا گیا۔ دماغ کے فکسڈ ٹشو کو 30% سوکروز کے محلول میں 2 دن تک ڈبو دیا گیا اور پھر کریوسٹیٹ (کریوسٹیٹ) کا استعمال کرتے ہوئے 40 µm موٹی سلائسوں میں کاٹا گیا۔ لائیکا مائیکرو سسٹم، نسلوچ، جرمنی)۔

2.7۔ مائٹوکونڈریا تنہائی

مائٹوکونڈریا کو الگ تھلگ کرنے کے لیے، ہم نے مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق مائٹوکونڈریا ایکسٹریکشن کٹ (IMGENEX Corporation، San Diego, CA, USA) کا استعمال کیا۔ ہر 100 mgof ہپپوکیمپل ٹشو کے لیے، 1 ملی لیٹر ہوموجنائزنگ بفر شامل کیا گیا۔

ہوموجنائزیشن کے بعد، ٹشو کو 4◦C پر 10 منٹ کے لیے 900×g پر سینٹری فیوج کیا گیا، اور سپرنٹنٹ کو اکٹھا کیا گیا اور 15،000×g پر 30 منٹ کے لیے 4◦C پر دوبارہ سینٹرفیوج کیا گیا۔

سینٹرفیوجڈ سائٹوسولک فریکشن کو لے کر، سائٹوسول کو الگ کر دیا گیا، اور بقیہ گولی کو 1 mLof سسپنشن بفر میں اچھی طرح سے ملایا گیا، 15،000× g 10 منٹ کے لیے 4 ◦C پر سینٹرفیوگ کرنے سے پہلے۔

سپرنٹنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا، اور 15،000× g کو 10 منٹ کے لیے 4 ◦C پر اچھی طرح سے مکس کرنے اور دوبارہ سینٹرفیوجنگ کرنے سے پہلے مزید 1 mL سسپنشن بفر شامل کیا گیا۔

سپرناٹینٹ کو ہٹا دیا گیا، اور باقی گولی 1 ملی لیٹر مکمل مائٹوکونڈریل لیسیز بفر میں 30 منٹ کے لیے 4 ◦C پر تحلیل کر دی گئی۔ اس کے بعد مائٹوکونڈریل ایکسٹریکٹ کو 15،000× g پر 5 منٹ کے لیے 4◦C پر سینٹرفیوج کیا گیا، اور سپرنٹنٹ (مائٹوکونڈریل فریکشن) کو اکٹھا کیا گیا۔

2.8۔ مغربی بلاٹنگ
بریڈ فورڈ کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے مائٹوکونڈریل تنہائی کے ذریعہ حاصل کردہ کل پروٹین کی مقدار درست کردی گئی۔ مائٹوکونڈریل پروٹین کی مساوی مقدار (30 µg فی لین) سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس (SDS-PAGE) (8% یا 12%) پر لوڈ کی گئی تھی۔

الیکٹروفورسس کے بعد، پروٹین کو پولی وینیلائیڈین فلورائڈ (پی وی ڈی ایف) جھلی (ملی پور، بوسٹن، ایم اے، یو ایس اے) میں منتقل کیا گیا۔

بلاکنگ کمرے کے درجہ حرارت پر 1×Tris-buffered saline کا استعمال کرتے ہوئے 5% BSA کے ساتھ Tween-20 (TBS-T) محلول کا استعمال کرتے ہوئے 1 گھنٹے کے لیے کیا گیا، اور پھر 4 ◦C پر راتوں رات پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ جھلی کا رد عمل ظاہر کیا گیا۔

درج ذیل بنیادی اینٹی باڈیز استعمال کی گئیں: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, catalase, and -actin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, dilution:1 :1000) اور TNF- (Abcam، Cambridge، UK، dilution: 1:1000)۔

اس کے بعد جھلیوں کو واشنگ بفر (PBS with 0.1% Tween 20) سے دھویا گیا، جس کے بعد انہیں ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز (HRP) کے ساتھ کنجوگیٹڈ بکری اینٹی خرگوش سیکنڈری اینٹی باڈیز forp22 phox، gp91 فاکس، اور TNF سے دھویا گیا۔ - (انویٹروجن، کارلسباد، CA، USA، dilution: 1:5000)۔

HRPconjugated goat anti-mouse ثانوی اینٹی باڈیز Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2، catalase، اور -actin (سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی، dilution: 1:5000) کے لیے استعمال کی گئیں۔

ای سی ایل ویسٹرن بلوٹنگ کا پتہ لگانے کے نظام (سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کے اظہار کی سطح کا پتہ لگایا گیا۔ تیار شدہ پروٹین بینڈز کی کثافت کا تجزیہ ChemiDoc XRS جیل امیجنگ سسٹم (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

2.9 امیونو ہسٹو کیمسٹری (IHC)
IHC تجزیہ کے لیے، ہر علاج کے گروپ میں منتخب ٹشوز کے لیے فری فلوٹنگ کا طریقہ استعمال کیا گیا تھا۔ ٹشو 3× کو 10 منٹ ہر ایک کو 0.01 M PBS میں دھونے کے بعد، ٹشو 0.01 M سوڈیم سائٹریٹ پر مشتمل بیکر میں 60 منٹ کے لیے 80 ◦C پر انکیوبیٹ ہوتا ہے، جس کے بعد 10% میں بلاک ہو جاتا ہے۔ عام گدھے کا سیرم (ملی پور سگما، برلنگٹن، ایم اے، امریکہ)۔

اس کے بعد ٹشو کے نمونے کو پرائمری اینٹی باڈیز اینٹی پی 22 فاکس (سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی، ڈائلیشن: 1:500) اور اینٹی گلیل فائبریلری ایسڈک پروٹین (GFAP) (Abcam، dilution:1:500) کے ساتھ رد عمل ظاہر کیا گیا۔ h 4 ◦C پر۔ اگلے دن، ٹشو کو 3×5 منٹ کے لیے ہر 0.01 M PBS میں دھویا گیا اور پھر HRP-conjugated goat anti-mouse ثانوی اینٹی باڈی (Santa Cruz Biotechnology، dilution: 1:5000) کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک رد عمل ظاہر کیا۔

آخر میں، ٹشو کو کمرے کے درجہ حرارت پر ویکٹاسٹین-ایلیٹ اے بی سی کٹ (ویکٹر لیبارٹریز، برلنگیم، سی اے، یو ایس اے) کے حل کا استعمال کرتے ہوئے انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور نتائج کو DABPeroxidase سبسٹریٹ کٹ (ویکٹر لیبارٹریز) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔

ہر ٹشو سلائس کو ایک بڑھتے ہوئے میڈیم (ویکٹر لیبارٹریز) کا استعمال کرتے ہوئے ایک سلائیڈ پر نصب کیا گیا تھا اور ہلکے مائکروسکوپ (لائیکا مائیکرو سسٹم) کا استعمال کرتے ہوئے معائنہ کیا گیا تھا۔

2.10 شماریاتی تجزیہ

ونڈوز ورژن 18 کے لیے SPSS کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔{1}} (SPSS Inc., Chicago, IL,USA)۔ تمام اقدار کو اوسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ شماریاتی اہمیت کا تعین یک طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا جا رہا تھا۔ بونفیرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ ایک سے زیادہ موازنہ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ p < 0.05 پر فرق کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔

3. نتائج

3.1 D-Gal-حوصلہ افزائی عمر رسیدہ چوہوں کے ہپپو کیمپس میں Mitochondrial Dynamics-related Proteins کے اظہار پر ٹریڈمل ورزش اور MitoQ کے اثرات

ہم نے تصدیق کی کہ TE اور MitoQ نے عمر رسیدہ چوہوں کے ہپپو کیمپس میں مائٹوکونڈریل فیوژن سے متعلق عوامل (Mfn1, Mfn2, Opa1) اور فِشن سے متعلقہ عوامل (Drp1, Fis1) کو متاثر کیا (شکل 1)۔

مائٹوکونڈریل فیوژن سے متعلق عوامل کے اظہار کی سطح علاج کے گروپوں (Mfn1, F4, 34=134.750, p < 0.001; Mfn2, F4,34=80 کے درمیان نمایاں طور پر مختلف ہیں۔ 816, p <0.001;Opa1, F4,34=51.456, p=0.001)۔

مائٹوکونڈریل فیوژن سے متعلقہ عوامل کی اظہار کی سطح بھی علاج کے گروپوں کے درمیان نمایاں طور پر مختلف تھی (Drp1, F4, 34=53.448, p < 0۔{11}}01; Fis1,F4,34=116 .313، p <0.001)۔ پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے نتائج شکل 1 میں دکھائے گئے ہیں۔

Y-CON گروپ کے مقابلے میں، D-CON گروپ میں مائٹوکونڈریل فیوژن سے متعلق عوامل کا اظہار کم ہوا اور D-TE، D-MI، اور D-COMBI گروپوں میں بڑھتے ہوئے رجحانات کو ظاہر کیا۔

دوسری طرف، Y-CON گروپ کے مقابلے D-CON گروپ میں mitochondrial fision-related factor Drp1 کے اظہار میں اضافہ ہوا۔ جبکہ TE کے ساتھ امتزاج علاج سے مائٹوکونڈریل فِشن سگنلز میں کمی واقع ہوئی تھی، لیکن اکیلے MitoQ کے علاج سے کوئی خاص تبدیلی نہیں آئی۔

دوسرے مائٹوکونڈریل فِشن سے متعلق عنصر، Fis1 نے Drp1 کی طرح کم ہوتے رجحانات کا مظاہرہ کیا لیکن صرف MitoQ علاج سے اس میں کمی واقع ہوئی۔

شکل 1. D-galactose (D-gal) کی حوصلہ افزائی عمر رسیدہ چوہوں کے ہپپوکیمپس میں مائٹوکونڈریل ڈائنامکس سے متعلق پروٹین کے اظہار پر ٹریڈمل ورزش اور مائٹو کیون (MitoQ) کا اثر۔ (A) مائٹوکونڈریل فیوژن اور فیوژن سے متعلق پروٹین کے نمائندہ مغربی دھبے۔ (B–F) مغربی بلاٹ بینڈز کا کثافت میٹرک تجزیہ - ایکٹین پر معمول بنا۔ مغربی دھبے میں دکھایا گیا ڈیٹا چوہوں کے سات دماغوں سے لیا گیا ہے۔

-ایکٹین کو اندرونی کنٹرول کے طور پر جانچا گیا تھا۔ بونفیرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ ANOVA کے بعد استعمال کیا گیا تھا۔ اقدار کا مطلب ہے ± SEM۔

ایک نوجوان کنٹرول گروپ (Y-CON) گروپ سے شماریاتی فرق کی نشاندہی کرتا ہے۔ b D-galactose گروپ (D-CON) گروپ سے شماریاتی فرق کی نشاندہی کرتا ہے۔ c D-galactose پلس ٹریڈمل ورزش (D-TE) گروپ سے شماریاتی فرق کی نشاندہی کرتا ہے۔

d D-galactose plus MitoQ (D-MI) گروپ (p < 0.05) سے شماریاتی فرق کو ظاہر کرتا ہے۔ D-COMBI؛ D-galactose پلس TE اور MitoQ گروپ۔

3.2 D-Gal-حوصلہ افزائی عمر رسیدہ چوہوں کے دماغی کارٹیکس اور ہپپوکیمپس میں NADPH آکسیڈیس سبونائٹس کے اظہار پر ٹریڈمل ورزش اور MitoQ کے اثرات

ہم نے دماغی پرانتستا میں p22 فاکس کی مدافعتی صلاحیت اور عمر بڑھنے والے چوہوں کے ہپپوکیمپس (شکل 2) (CA3,F4,24=18.786, p < 0 میں علاج کے گروپوں کے درمیان اہم فرق دیکھا۔{11 }}01؛ کارٹیکس، F4،24=12.662، p <0.001)۔

کارٹیکس میں، D-CON گروپوں نے Y-CON گروپ کے مقابلے p22 فاکس کی مدافعتی صلاحیت میں اضافہ دکھایا، جس میں D-TE، D-MI، اور D-COMBI گروپوں میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔

CA3 میں، D-CON کے مقابلے D-TE اور D-COMBI گروپس میں p22 فاکس کی بڑھتی ہوئی قوت مدافعت میں کمی واقع ہوئی۔ NOX subunits p22 phox, gp91 phox, اور p47phox کے پروٹین اظہار کی سطح گروپوں کے درمیان نمایاں طور پر مختلف تھی (p22 phox, F4, {{10}}.513, p < 0۔{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p <0.001; p47 phox, 34=69.249, p <0.001).

پوسٹ ہوسٹسٹ کے نتائج نے Y-CON کے مقابلے D-CON میں NOX ذیلی یونٹ کی سطح میں نمایاں اضافہ ظاہر کیا۔ تاہم، D-CON گروپ کے مقابلے تمام مداخلتی گروپوں میں NOX ذیلی یونٹ کی سطح کم تھی۔

خاص طور پر، D-MI گروپ کے مقابلے D-TE میں p22 فاکس اور gq91 فاکس کے اظہار میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ ان نتائج سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ورزش اور MitoQ انفرادی طور پر دماغ میں عمر رسیدہ آکسیڈیٹیو تناؤ کو روکتے ہیں، لیکن ان کے امتزاج کے نتیجے میں کوئی اضافی اثرات نہیں ہوتے۔

شکل 2. دماغی پرانتستا میں NADPH آکسیڈیس ذیلی یونٹس اور D-gal کی حوصلہ افزائی عمر رسیدہ چوہوں کے ہپپوکیمپس کے اظہار پر ٹریڈمل ورزش اور MitoQ کے اثرات۔ (A1) ہر گروپ میں دماغی پرانتستا اور D-gal-حوصلہ افزائی ایجگراٹس کے ہپپوکیمپس میں NAPDH p22 فاکس امیونوری ایکٹیویٹی کو ظاہر کرنے والے فوٹو مائکروگرافس۔ A1 میں سیاہ مستطیل تصاویر کے اس حصے کی نشاندہی کرتا ہے جیسا کہ f–i اورp–t میں دکھایا گیا ہے۔ (A2, A3) دماغی پرانتستا اور ہپپوکیمپس میں NADPH p22 فاکس سٹیننگ کی آپٹیکل ڈینسٹی کوانٹیفیکیشن۔

انووا کے بعد بونفرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ۔ قدریں بطور ذریعہ پیش کی جاتی ہیں ± SEM۔ (n=5 جانور)۔ (a–e اور k–o) اسکیل بار=100 µm، (f–j اور p–t) اسکیل بار=50 µm۔ (B) ہپپوکیمپس میں NADPH آکسیڈیس سبونائٹس کے لیے نمائندہ ویسٹرن بلاٹ امیجز۔

(C-E) ہپپوکیمپس میں NADPH آکسیڈیس ذیلی یونٹس کی مقدار۔ مغربی دھبے میں دکھایا گیا ڈیٹا چوہوں کے سات دماغوں سے لیا گیا تھا۔ -ایکٹین کو اندرونی کنٹرول کے طور پر جانچا گیا تھا۔ بونفیرونی پوسٹ ہاک ٹیسٹ انووا کے بعد استعمال کیا گیا تھا۔ اقدار کا مطلب ہے ± SEM۔

a Y-CON گروپ سے شماریاتی فرق کو ظاہر کرتا ہے۔ b D-CON گروپ سے شماریاتی فرق کی نشاندہی کرتا ہے۔ c D-TE گروپ سے شماریاتی فرق کو ظاہر کرتا ہے۔(p < 0.05)۔

3.3 D-Gal-حوصلہ افزائی عمر رسیدہ چوہوں کے دماغی کارٹیکس اور ہپپوکیمپل ڈینٹیٹ گائرس میں GFAP اظہار پر ٹریڈمل ورزش اور MitoQ کا اثر

ہم نے عمر رسیدہ چوہوں کے دماغی کارٹیکس اور ہپپوکیمپل ڈینٹیٹ گائرس (DG) میں GFAP امیونوری ایکٹیویٹی میں علاج کے گروپوں کے درمیان اہم فرق دیکھا (شکل 3) (Cortex, F4, 24=13.524, p < 0.001 ؛ DG, F4, 24=30.364)۔

پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے نتائج نے ظاہر کیا کہ D-gal علاج نے کارٹیکس اور ڈی جی دونوں میں GFAP مدافعتی صلاحیت میں نمایاں اضافہ کیا۔

D-CON گروپ کے مقابلے میں، تمام مداخلتی گروپوں میں کارٹیکس میں GFAP کی سطح کم ہوئی، اور D-TE اور D-COMBI گروپوں میں DG میں GFAP کی سطح کم ہوئی، جب کہ D-MI گروپ نے GFAP مدافعتی سرگرمی میں فرق ظاہر کیا۔ پرانتستا کے علاقے میں.

اس طرح، اگرچہ TE یا MitoQ علاج نے پرانتستا میں D-gal-حوصلہ افزائی نیوروئنفلامیشن کو کم کیا، صرف TE مداخلت نے DG میں مثبت اثرات پیدا کیے ہیں۔

For more information:1950477648nn@gmail.com