متعدد علاج کے مرکبات کو قدرتی طور پر پرچر نامیاتی وسائل سے الگ کر دیا گیا ہے

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

متعدد علاج کے مرکبات کو قدرتی طور پر پرچر نامیاتی وسائل سے الگ کر دیا گیا ہے، جو محفوظ اور موثر حیاتیاتی سرگرمیوں کے ساتھ مرکبات کے اقتصادی اور پائیدار ذرائع پیش کر سکتے ہیں۔ کاسمیٹکس کی صنعت میں، عمر مخالف سرگرمیوں کے ساتھ قدرتی مرکبات کی بے تابی سے تلاش کی جاتی ہے۔ اس طرح، ہم نے Rubusfraxinifolius کے پتوں سے مختلف نچوڑ تیار کیے اور جلد کی عمر کے خلاف حفاظتی اثرات کے ساتھ مرکبات کو الگ کرنے کے لیے انزائم انحبیشن اسیس کا استعمال کیا۔ Rubus fraxinifolius Poir سے دو triterpenoids الگ تھلگ تھے۔ پتے ڈھانچے کی خصوصیت سپیکٹروسکوپک تجزیہ (LC-ESI-MS,1D/2D NMR) اور رپورٹ کردہ ڈیٹا کے مقابلے میں تھی۔ مرکب 1 اور 2 کا تعین 2،3-O-ethylene glycol،19-hydroxyurs-12-en-23,28-dioic acid اور 2,{{15} }O-propanediol،19-hydroxyurs-12-en-28-oic acid. میتھانول کے نچوڑ اور الگ تھلگوں کو ایلسٹیس اور ٹائروسینیز پر ان کے روکنے والے اثرات کے لئے جانچا گیا۔ مرکبات 1 اور 2 نے ICso 122.199 ug/mL اور 98.22 ug/mL کے ساتھ ایلسٹیز کو روکا، اور ICso 207.79 ug/army اور 221.51 ug/mL کے ساتھ بالترتیب ٹائروسینیز کو بھی روکا۔ مالیکیولر ڈاکنگ نے ثابت کیا کہ دونوں مرکبات کا انزائمز سے وابستگی ہے۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

اگرچہ حاصل کرنا مشکل ہے، قدرتی اینٹی ایجنگ مادے جو کہ انسانوں کے لیے محفوظ ہیں اقتصادی طور پر اور پائیدار طور پر وافر قدرتی وسائل سے حاصل کیے جا سکتے ہیں۔ روبس (Rosaceae) کی تقریباً 700 پرجاتیوں کو عالمی سطح پر تقسیم کیا جاتا ہے، حالانکہ اشنکٹبندیی علاقوں میں کچھ انواع پائی جاتی ہیں۔ اس جینس میں غذائی اجزاء (شوگر، وٹامنز، وغیرہ)، ثانوی میٹابولائٹس (ٹرائٹرپینائڈز، فلیوونائڈز، پولیفینول وغیرہ) شامل ہیں، اور اس میں بہت سی اینٹی ایجنگ سرگرمیاں ہیں (اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹ ایلسٹیس، اینٹ ٹائروسینیز، اینٹی کولیگنیس، اینٹی یووی، سوزش، زخم کی شفا یابی، وغیرہ) 1. اس کے علاوہ، روبس پرجاتیوں نے مختلف حیاتیاتی سرگرمیوں کے ساتھ متنوع ٹرائیٹرپینز پر مشتمل ہونے کی بھی اطلاع دی۔

انڈونیشیا میں، R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) جاوا، بورنیو، وغیرہ میں تقسیم کیا جاتا ہے، اور اسے 'شہری' کے نام سے جانا جاتا ہے۔cistanche کیا ہےمزید یہ کہ، کچھ مقامی کسان ان پودوں کی کٹائی کرتے ہیں، اور بیری کا پھل عام طور پر تازہ یا منجمد کھایا جاتا ہے۔ ہمارے پچھلے مطالعے نے یہ ظاہر کیا کہ R. frascinifolius stem extract میں elastase، tyrosinase، اور ایک اینٹی آکسیڈینٹ کے طور پر روکنے کی سرگرمی ہے۔ کچھ دیگر تحقیقات سے یہ بھی معلوم ہوا کہ R. fraxinifolius کے پتے اور پھل میں ایک طاقتور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی ہے؟

Cistanche بڑھاپے کو روک سکتا ہے۔

Elastase ایک سیرین پروٹیز انزائم ہے، جو جلد کی جھریوں یا ڈرمل لچکدار فائبر (ایلسٹن) کے انحطاط کے ذریعے جھریاں پڑنے میں اہم کردار ادا کرتا ہے اور جلد کی لچک میں کمی کا سبب بنتا ہے۔ ان میں سے ایک جلد کا فبروبلاسٹ سے ماخوذ ایلسٹیس ہے۔ اس طرح، جلد کی عمر بڑھنے کا سبب بننے والے elastin فائبر کے انحطاط کے منتظمین کے طور پر، elastase inhibitors نے کاسمیٹک تیاریوں کے ایجنٹ کے طور پر توجہ مبذول کرائی ہے، 12۔ میلانوجینیسیس ٹائروسینیز کے ذریعہ ثالثی کی جاتی ہے اور دو مراحل کے رد عمل کے ذریعے میلانین بائیو سنتھیس کو منظم کرتی ہے۔ ابتدائی مرحلے میں، L-tyrosine کو L-3،4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) میں ہائیڈرو آکسیلیٹ کیا جاتا ہے۔ دوسرے مرحلے میں، L-DOPA کو متعلقہ O-quinone میں آکسائڈائز کیا جاتا ہے۔ لہذا، ٹائروسینیز روکنے والی سرگرمی والے قدرتی مرکبات عام طور پر کاسمیٹکس میں استعمال ہوتے ہیں جو میلانین کے ساتھ ہائپر پگمنٹیشن کو روکتے ہیں اور اس وجہ سے جلد کو سفید کرنے کے حق میں ہیں۔اینٹی ایجنگ cistancheالاسٹیز اور ٹائروسینیز انزائم انابیٹرز کو جلد کی سفیدی، بڑھاپے سے بچنے یا جھریوں کو روکنے والے ایجنٹوں کے طور پر جلد کے امراض کے علاج کے لیے تیار کیا جا سکتا ہے۔

اس مطالعہ نے R.fraxinifolius کے پتوں سے ursane triterpenoids کو الگ کیا اور الیکٹرو اسپرے آئنائزیشن ماس اسپیکٹروسکوپی (ESI-MS) اور 'H NMR, |3CNMR, اور 2D NMR (DEPT, HSQC, HMQC, اور HMBC) کا استعمال کرتے ہوئے سپیکٹروسکوپک تجزیوں میں ان کے ڈھانچے کو واضح کیا۔ اس کے بعد، ہم نے خام عرقوں، فرکشنز، اور الگ تھلگ مرکبات کی elastase اور tyrosinase روکنے والی سرگرمیاں انجام دیں۔

اس تحقیق میں سلیکو طریقہ کے ذریعے دو منتخب مرکبات کی سرگرمی بھی دیکھی گئی۔ DockThorl516 کے ساتھ مالیکیولر ڈاکنگ اپروچ کا مظاہرہ کیا گیا۔ اس تحقیق میں استعمال ہونے والے میکرو مالیکیولز پروٹین ڈیٹا بینک (RCSB PDB,2000) سے حاصل کیے گئے تھے جن کی شناخت 2y9x اور 3hgp کے ساتھ بالترتیب tyrosinase اور elastase کے لیے کی گئی تھی۔ PyMOL1920 کے ساتھ مشاہدہ کیا گیا تھا۔

نتائج اور مباحثہ

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>100 ug/mL میں 40 فیصد، جبکہ n-hexane extract میں کوئی سرگرمی نہیں تھی (تصویر 1)۔ کچھ روبس نے ایلسٹیز کی روک تھام کی سرگرمی بھی دکھائی جیسے R. Sanctus（% inhibition 14.68-49.20 in 100 ug/mL）, R.compactus,R. robustus، etc.221. لہذا، ہم نے ویکیوم مائع کرومیٹوگرافی/VLC کا استعمال کرتے ہوئے ایکٹو ایکسٹریکٹس کو الگ کیا اور ہر ایک سے ll فریکشنز اکٹھے کیے ہیں۔ ایتھیل ایسیٹیٹ کے نچوڑ سے حاصل ہونے والے حصوں نے کمزور ایلسٹیس روکنے والی سرگرمیاں ظاہر کیں (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

مائع کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹروسکوپی (LCMS)، 'H اور 13CNMR، DEPT، heteronuclear single quantum coherence (HSQC)، heteronuclear ایک سے زیادہ کوانٹم correlation (HMQC)، اور heteronuclear ایک سے زیادہ بانڈ کور (HMQC) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کی شناخت اور خصوصیات کی گئیں۔ جدول 1 نے مرکبات کا NMR سپیکٹرل ڈیٹا دکھایا۔

کمپاؤنڈ 1: ایک بے ساختہ سفید پاؤڈر کے طور پر الگ تھلگ تھا۔ اس کمپاؤنڈ کے لیے LCMS-ESI سپیکٹرا نے m/z 543.32[MH]t پر ایک سالماتی آئن چوٹی کو ظاہر کیا، جو کہ سالماتی فارمولہ C32H48O- کی تجویز کرتا ہے جس میں نو غیر سنترپتی کے مساوی ہوتے ہیں۔ IR سپیکٹرا نے ہائیڈروکسیل (3.34l43 اور 3.43 سینٹی میٹر) کے ساتھ جذب میکسما کا انکشاف کیا۔ اولیفینک (1.684 سینٹی میٹر-1) فنکشنل گروپس۔ مزید یہ کہ، 'کمپاؤنڈ کے H NMR سپیکٹرا I نے میتھائن پروٹون (CH) کو 2.6 پر سنگل سگنل ظاہر کیا، جو ursane قسم کے H-18 کے لیے ایک خصوصیت کا اشارہ ہے۔ 19-O-متبادل کے ساتھ triterpenes. triterpene قسم 19a-hydroxy-ursane میں بھی 2.6 ppm کے ارد گرد کے علاقے میں ایک عام پروٹون سگنل ہوتا ہے۔ یہ ڈیشیلڈ سگنل دوسرے ordinalI میتھیلین پروٹون سگنلز سے واضح طور پر مختلف ہو سکتا ہے، جس میں 5.28(t,J=6Hz) پر اولیفینک پروٹون (H12) کی وجہ سے خصوصیت کی تبدیلی ہوتی ہے۔cistanche befíciosHMQC(13Cx'H) اور HMBC(15Cx'H) سپیکٹرا کی طرف سے مکمل اور غیر واضح 'H اور l3C کیمیکل شفٹ اسائنمنٹس کی مدد کی گئی۔ {5}}(تصویر 2a)۔ دیگر مخصوص حروف پانچ میتھائل سنگلٹس کے لیے 1.89,1 پر ملے۔ J=6 Hz)، اور olefinic پروٹون سگنل 5.30(t, J=7 Hz, H-12) پر۔ موجودہ13CNMR سپیکٹرا 32 کاربن گونج دکھاتا ہے، اور DEPT اور HMQC سپیکٹرا کے ساتھ، دو کاربونیل کاربن ظاہر کرتا ہے（δC183.70,C-28 اور 8-178.96,C-23）، ایک اولیفینک کاربن oc 127.23،C-12 پر، ایک اولیفینک کواٹرنری کاربن(oc139.49,C-13)، ایک آکسیجن بیئرنگ کواٹرنری کاربن （o-72.7، C-19 )، دس الیفاٹک میتھیلینز اور چھ میتھائل کاربن۔ δ-127.23（C-12）اور 139.49(C-13) پر دو اولیفینک کاربن ursane-triterpenoid قسم کی خصوصیت تھے۔ ایک اور سگنل نے اشارہ کیا کہ ethylene glycol （-OCH-CH-O-） سگنلز پر δ4.62（d, J=11.5 Hz）, 4.05（d, J=11 پر دکھایا گیا تھا۔ 5 Hz）, 3.52（d, J=11.5Hz） and 4.06（d, J=11.5Hz） اور δ61.27（t） اور 63.20（t） کے ساتھ سپورٹ کیا گیا تھا۔ یہ پر واقع تھا۔ C-2andC-3 HMBC سپیکٹرا میں طویل فاصلے کے ارتباط کی موجودگی کی بنیاد پر۔ لہذا، مرکب 1 کی شناخت 2،3-O-ethylene glycol،19-hydroxyurs-12-en-23,28-dioic acid (تصویر 3a) کے طور پر کی گئی۔

کمپاؤنڈ 2: سفید بے ساختہ پاؤڈر کے طور پر حاصل کیا گیا تھا۔ MS-ESI m/z 527.33 [MH]t(calcd.For 528.3815)۔ LCMS-ESI سپیکٹرا میں، ایک سالماتی آئن کی چوٹی m/z 527.33 [MH]t پر موجود ہے، جو مالیکیولر فارمولہ CH Os کی نشاندہی کرتا ہے، جس کے لیے 8 ڈگری غیر سنترپتی کی ضرورت ہوتی ہے۔" IR سپیکٹرم میں ہائیڈروکسیل (2,928 سینٹی میٹر{2,927 سینٹی میٹر) سے مماثل جذب میکسیما ہوتا ہے۔ {15}})اور olefinic(1,686cm-1) فنکشنل گروپس۔ مزید برآں، 'کمپاؤنڈ 2 کے لیے HNMR سپیکٹرا نے 2.42 کا سنگلٹ دکھایا، جو کہ {{24 کے ساتھ ursane قسم کے triterpene کے H18 کی خصوصیت ہے }}O-متبادل۔Cistanche Extract Anti Radiationدیگر مخصوص خصوصیت والے سپیکٹرا میں og1 میں چھ میتھائل سنگلٹس کی موجودگی شامل تھی۔{1}}.76,0.97,0.69,1.30اور 1.17(ہر ایک -24-28,H-30), 0.91 (d,J=7Hz) پر ایک میتھائل ڈبلٹ، اور ou 5.37 (d, J=7 Hz پر اولیفینک پروٹون سگنل، H-12)۔ متعلقہ l3(CNMR اور DEPT سپیکٹرا 33 کاربن گونج دکھاتے ہیں، اور HSQC اور HMQC سپیکٹرا کاربونیل کاربن (oc 182.23, C-28)، ایک اولیفینک کاربن کی موجودگی کی نشاندہی کرتے ہیں （δ-129.36, C -12）، ایک اولیفینک کواٹرنری کاربن （δ-140.24، C-13）، ایک آکسیجن بیئرنگ کواٹرنری کاربن (oc73.68، C-19)، گیارہ الفاٹک میتھیلین، اور سیون میتھائل کاربن۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ کمپاؤنڈ 2 میں ursane-triterpenoid کنکال ہوتا ہے۔ دیگر سگنلز og 3.22(d,J=11 پر 1,3-propanediol فنکشنل گروپ کی موجودگی کی نشاندہی کرتے ہیں۔ .5 ہرٹز، 3.42(d، J=10.5 Hz)، 1.38(m)، 1.51(m) اور 4.02(d, J=11.5Hz) اور 3.36(t, J{ {57}}.5Hz۔ اس کے فنکشنل گروپ کا C2-C3 کے ساتھ ایک طویل فاصلے تک تعلق ہے۔ ان نتائج کی بنیاد پر، کمپاؤنڈ 2 کی شناخت 2،3-O-Propanediol،{{ کے طور پر کی گئی۔ 66}ہائیڈرو آکسیرس-12-en-28-oic ایسڈ (فگس.2b اور 3b)۔ اسی طرح کا ایک مرکب 2 ہے،3-O-Isopropylidene torments acid، Rubus xanthocarpus.7 سے الگ تھلگ

جدول 1 میں، تمام 'H' اور 'C NMR سپیکٹرا کا موازنہ ٹارمینٹ ایسڈ (TA/2a,3a,19-ٹرائی ہائیڈروکسی-12-ursen-28-oic acid）² سے کیا گیا، جو کہ ایک ursane triterpenoid جو کئی Rubus species-p Tormentic acid میں پایا گیا ہے مرکبات 1 اور 2 کے ساتھ مضبوط مماثلت رکھتا ہے، سوائے اس کے کہ C-23 اور C31-33 سے متعلق کیمیائی تبدیلیاں مختلف تھیں۔ ڈی ای پی ٹی، ایچ ایم کیو سی، اور ایچ ایم بی سی تجربات (تصویر 2)۔

triterpenoid torments ایسڈ قدرتی پودوں کے کھانے میں بڑے پیمانے پر تقسیم کیا جاتا ہے۔ اس میں مختلف بایو ایکٹیویٹیز ہیں: ہائپوگلیسیمک اثرات، اینٹی سوزش، اور اینٹی ایتھروجینک خصوصیات عروقی ہموار پٹھوں کے خلیوں کے پھیلاؤ کو کم کرتی ہیں، اور گردوں، پروسٹیٹ، اور میلانوما کینسر سیل لائنوں میں antiproliferative سرگرمیاں 2426۔ لہذا، چونکہ ان مرکبات کا ڈھانچہ ایک ہی ہے، اس لیے ان میں مناسب ممکنہ سرگرمیاں نہیں ہیں۔

شکل 4، الگ تھلگ کی روک تھام کرنے والی ایلسٹیس اور ٹائروسینیز سرگرمی کی نمائندگی کرتا ہے۔ وٹرو انزائم انبیبیشن اسیس سے حاصل کردہ ڈیٹا کو معیاری انحراف (SD) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ مرکبات 1 اور 2 نے ICso 122.199 اور 98.22 ug/mL کے ساتھ elastase کو روکا، اور ICso 207.79 اور 221.51 ug/mL کے ساتھ بالترتیب ٹائروسینیز کو بھی روکا۔ کچھ pentacyclic triterpenoids (ursolic acid اور oleanolic acid) میں elastase inhibition activity 2728 ہونے کی اطلاع ہے۔ کمپاؤنڈ 2 کی بھی ایلسٹیز کی روک تھام کی قیمت کمپاؤنڈ 1 سے کم ہے۔ دونوں مرکبات مثبت کنٹرول اولیانولک ایسڈ کے مقابلے میں کم روکی سرگرمی تھے، جس کی ICso قدر 90.39 ug/mL تھی۔ معاہدے میں، پچھلے مطالعات نے 76.5 ug/mL کے oleanolic ایسڈ کے لیے ICso اور ursolic acid28 کے لیے 31.0 ug/ml کی ICso قدر ظاہر کی۔ پینٹا سائکلک ٹرائٹرپینز کے پہلے کی اطلاع شدہ حرکیاتی تجزیوں سے پتہ چلتا ہے کہ یہ مرکبات مسابقتی اور الٹی طور پر نیوٹروفیل ایلسٹیز کو روکتے ہیں۔ اسی مطالعہ میں، مالیکیولر ڈاکنگ کے تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ مالیکیولر سکفولڈنگ موئیٹی 28-COOH اور پینٹا سائکلک ٹرائیٹرپینز میں ڈبل بانڈ ان کی روک تھام کی سرگرمیوں کے لیے ضروری ہیں۔

بڑھتی ہوئی عمر کے ساتھ پیدا ہونے والے مسائل میں سے ایک ہائپر پگمنٹیشن ہے۔cistanche herbaلہذا، جلد کو ہلکا کرنے والے ایجنٹوں یا نئے ڈیپگمنٹنگ کی تلاش جاری ہے۔ ٹائروسینیز کو دبانا میلانوجینیسیس کے خلاف کام کر سکتا ہے۔ جیسا کہ تصویر 4 میں دکھایا گیا ہے، میتھانول ایکسٹریکٹ اور مرکبات I اور 2 نے ٹائروسینیز انحیبیٹرز کے طور پر اعتدال پسند سرگرمیوں کا مظاہرہ کیا۔

اس تحقیق میں، مالیکیولر ڈاکنگ کا استعمال منتخب مرکبات کی ٹائروسینیز اور ایلسٹیس کو ان کے اہداف کے طور پر پابند کرنے والی سرگرمیوں کا تجزیہ کرنے کے لیے بھی کیا گیا تھا۔ استعمال شدہ کرسٹل ڈھانچے 2Y9X تھے، ٹائروسینیز کا ایک کرسٹل ڈھانچہ Agaricus bisporus سے inhibitor tropolone کے ساتھ؛ اور BHGP، ایک قوی پیپٹائڈائل انحیبیٹر FR130180 کے ساتھ کمپلیکس پورسین لبلبے کی ایلسٹیس کا ایک کرسٹل ڈھانچہ۔ دونوں کا انتخاب اس لیے کیا گیا تھا کہ وہ اسی جاندار سے حاصل کیے گئے تھے جو اس تحقیق کے وٹرو پرکھ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ میکرو مالیکیولز بھی اپنے متعلقہ روکنے والوں کے پابند ہیں تاکہ انزائم کنفارمیشن کی فعال حالت حاصل کی جا سکے۔ کوکرسٹلز کو مالیکیولر ڈاکنگ ٹارگٹ کے مرکز کے طور پر کمپاؤنڈ بائنڈنگ کے امکانات کو کم کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا تاکہ اسکورنگ کا عمل زیادہ موثر ہو جائے۔

مالیکیولر ڈاکنگ سے، دونوں مرکبات کے لیے اوسط بائنڈنگ وابستگی حاصل کی گئی تھی جیسا کہ تصویر 5 اور 6 میں دکھایا گیا ہے۔ وابستگی کی پیشن گوئی کا استعمال مختلف لیگنڈز کی درجہ بندی کرنے کے لیے کیا جاتا ہے ہر کمپاؤنڈ کے سب سے اوپر کی توانائی کے پوز کو مدنظر رکھتے ہوئے، بہتر توانائی کے پوز کی پیشن گوئی اس کے ذریعے دکھائی جاتی ہے۔ کم بائنڈنگ وابستگی کے اسکور 16۔ نامزد انحیبیٹر ٹراپولون کی دوبارہ ڈاکنگ -7.41 kcal/mol کی اوسط پابند وابستگی کے ساتھ کی گئی تھی۔ مرکبات 1 اور 2 کی ٹائروسینیز سے اوسط پابند وابستگی بالترتیب -7.84 kcal/mol اور -8.37 kcal/mol تھی (ٹیبل 2)۔ دونوں مرکبات کی پیش گوئی کی گئی تھی کہ وہ روکنے والے سے بہتر تعلق رکھتے ہیں۔

دریں اثنا، elastaseredocking کی اوسط پابند وابستگی -7.84 kcal/mol تھی۔ مرکبات 1 اور 2 کی ایلسٹیز سے اوسط پابند وابستگی بالترتیب -7.58kcal/mol اور -8.06 kcal/mol تھی۔ اگرچہ نتیجہ یہ ظاہر کرتا ہے کہ کمپاؤنڈ 1 کا کرسٹل سے کم وابستگی ہے، یہ قدرے مختلف ہے(<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

طریقے

عام تجرباتی طریقہ کار۔ JEOL JNM-ECZ500R/S1 آلہ استعمال کرتے ہوئے 'H اور' NMR سپیکٹرا 500 MHz پر ریکارڈ کیا گیا۔ انفراریڈ (IR) سپیکٹرا کو FTIR، IRPrestige-21، Shimadzu سے ناپا گیا۔ دیگر تجزیے Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof انسٹرومنٹ، ایک VersaMax Microplate ریڈر اور BioTek ELX800 Microplate Reader، lore-coated aluminium sheets TLC-Silica gel 60 GF254 (Merck, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔ ، کالم کرومیٹوگرافی (CC) کھلی کرومیٹوگرافی کے لیے 70-230 میش اور ویکیوم کرومیٹوگرافی کے لیے 230-400 میش کے ساتھ سلیکا جیل 60 (مرک، ڈرمسٹادٹ، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دی گئی۔ پلانٹ مواد. R. fraxinifolius کے پتے دسمبر 2018 میں 4,343 فٹ کی بلندی پر ماؤنٹ پینگرینگو، مغربی جاوا کے ایک شجرکاری کے علاقے سے اکٹھے کیے گئے تھے۔ نمونے کی شناخت ایک ماہر نباتات (ڈاکٹر جونی سیٹیجو) نے انڈونیشین انسٹی ٹیوٹ آف بیالوجی کے ریسرچ سینٹر میں کی تھی۔ سائنسز، انڈونیشیا، نمونہ نمبر 033/IPH.1.01/if.07 کے ساتھ۔ پودے کے مواد کو جمع کرنے کے لیے کسان سے اجازت لی گئی تھی اور ادارہ جاتی ضوابط اور ہدایات کی تعمیل کی گئی تھی۔

نکالنا اور تنہائی۔ ہوا سے خشک پاؤڈر شدہ پتے (2300 g) کو متعلقہ عرق فراہم کرنے کے لیے گریڈینٹ سالوینٹ (n-hexane، EtOAc، اور MeOH) کے ساتھ سوکسہلیٹ اپریٹس کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا، پھر اسے روٹری ایوپوریٹر کے ساتھ بخارات بنایا گیا۔ اور ویکیوم اوون۔ میتھانول ایکسٹریکٹ (291 جی) اور ایتھائل ایسٹیٹ ایکسٹریکٹ (65 جی) کو سلیکا جیل پر جذب کیا گیا اور ویکیوم مائع کرومیٹوگرافی/وی ایل سی پرفارم کیا گیا، EtOAc: MeOH (1:0 سے 0:1 تک) کے مرحلہ وار میلان کے ساتھ۔ ہر ایک نچوڑ (Eal-Hall اور M1-Mill and) کے لیے فریکشن تیار کریں۔ TLC میں وینلن سلفیورک ری ایجنٹس کے ساتھ مثبت رد عمل والے اسی طرح کے حصوں کو ملایا گیا تھا۔ کسر کی پیداوار: Eal-3 (2.27 g);Ea4-6(8.47 g);Ea7-8(12.9 g);Ea9-11 (22.3 g); اور M1-3 (4.89 گرام)؛ M4-5 (5.1 گرام)؛ M6-7 (6.02g)؛ M8(166.42g)؛ M9(10.53g)؛ M{{38 }} (2.9 گرام)۔ تمام فرکشنز کو روکنے والے ایلسٹیس سرگرمی کے لیے جمع کرایا گیا تھا، Fr۔ M8 نے سب سے زیادہ پیداوار دی اور اس میں زبردست سرگرمی تھی۔ Fr. M8 کو سلیکا جیل پر CC کے ذریعے پے در پے مزید تقسیم کیا گیا (ایک مرحلہ وار میلان کے ساتھ ایلیونٹ CH2Cl2/MeOH) اور Sephadex LH-20 کالم (CHCl3-MeOH 100:10، v/v. دو حصوں کے ساتھ eluting) کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا گیا۔ ٹھوس نوعیت کا مظاہرہ کیا اور دو الگ تھلگ حاصل کرنے کے لیے کلوروفارم اور میتھانول کے ساتھ کرسٹلائز کیے گئے: مرکب 1 (18 ملی گرام) اور:2 (31 ملی گرام)۔ تمام الگ تھلگوں کی پاکیزگی کا اندازہ دو جہتی TLC کے ذریعے کیا گیا اور 5 فیصد گندھک کا استعمال کرتے ہوئے جگہ کا تصور کیا۔ میتھانول میں تیزاب، اس کے بعد پلیٹوں کو 110 ڈگری پر 5 منٹ تک گرم کریں۔

پولرائزیشن ٹرانسفر (DEPT)NMR، heteronuclear single quantum coherence (HSQC)، heteronuclear ایک سے زیادہ کوانٹم ارتباط (HMQClear)، اور ایک سے زیادہ کوانٹم کوہرنس (HSQC) کے ذریعے مائع کرومیٹوگرافی-ماس سپیکٹروسکوپی (LCMS)، LH، اور '3C بگاڑ میں اضافہ کا استعمال کرتے ہوئے کرسٹل کی شناخت اور خصوصیات کی گئیں۔ بانڈ ارتباط (HMBC)۔

Elastase روکنا پرکھ. Elastase روکنا پرکھ کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے کچھ ترمیم کے ساتھ بیان کیا گیا تھا۔ مختصراً، Nunc-96 کنویں مائکرو ٹائٹر پلیٹوں میں، 20-μL aliquots of 0.8-Trizma ڈگری بیس بفر میں یونٹس/mL PPE （pH 8۔{6}} ） کو 20-μL نمونوں کے ساتھ ملایا گیا، اور اس کے بعد مرکب کو Trizma ڈگری بیس بفر میں 180 μL تک پتلا کر دیا گیا۔ ٹیسٹ کے نچوڑوں کو 15 منٹ کے لیے اینزائم کے ساتھ پہلے سے لگایا گیا تھا، اور 20- سبسٹریٹ N-succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide (A3PVN; 2.9mM) کے μL ایلی کوٹس کو شامل کیا گیا تھا اور مزید 15 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ مثبت کنٹرول اور خالی کنویں میں بالترتیب oleanolic ایسڈ اور پانی موجود تھا۔ تجربات سہ رخی میں کیے گئے تھے، اور جذب کے مطابق روک تھام کی شرح کا تعین کیا گیا تھا۔ VersaMax مائکروپلیٹ ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے 401 nm پر ance۔ مندرجہ ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے فیصد کی روک تھام کا حساب لگایا گیا تھا:

جہاں Eis انزائم ری ایکشن کا جاذب ہے، Eb انزائم خالی کا جاذب ہے، T ٹیسٹ کے نمونے کا جاذب ہے، اور Tb ٹیسٹ خالی کا جاذب ہے۔ ارتکاز (50,75,100,125,150 ug/mL) کے خلاف فیصد elastase inhibition کے لکیری گراف سے بھی اقدار کا تعین کیا گیا تھا۔ ٹائروسینیز روکنا پرکھ۔ Tyrosinase inhibition کا تعین DOPA-chrome فارمیشن کے طریقہ کار کو استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا معمولی ترمیم کے ساتھ۔ مختصراً، 96-کنویں پلیٹوں میں، DMSO کے 20 μL ایلی کوٹس （کنٹرول） یا مختلف ارتکاز پر ٹیسٹ مرکبات کو 40 μL ایلی کوٹس 30 U/mL مشروم ٹائروسینیز （Sigma Aldrich）} μL1 کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ 0۔{13}}M فاسفیٹ بفر （pH 6.8）۔ وہ کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لئے پہلے سے لگائے گئے تھے۔ رد عمل کا آغاز ہر کنویں میں 10mML-DOPA کے 4μL ایلی کوٹس کو شامل کرکے اور 20 منٹ کے لئے 37 ڈگری پر انکیوبٹنگ کے ذریعے کیا گیا تھا۔ Tyrosinase سرگرمی پھر 475 nm پر جاذب کی پیمائش کرکے طے کی گئی۔ کوجک ایسڈ کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ تجربات سہ رخی میں کیے گئے۔ ٹائروسینیز کی روک تھام کا فیصد درج ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیا گیا تھا۔

جہاں E انزائم ری ایکشن کا جاذب ہے، Eb انزائم خالی کا جاذب ہے، T ٹیسٹ کے نمونے کا جاذب ہے، اور Tb ٹیسٹ خالی کا جاذب ہے۔ ارتکاز (250,125,62.5,31.25,15.6 ug/mL) کے خلاف فیصد elastase inhibition کے لکیری گراف سے بھی اقدار کا تعین کیا گیا تھا۔

مالیکیولر ڈاکنگ۔ اس تحقیق میں، سلیکو فارماسولوجیکل سرگرمی میں ایک ڈاکٹر کا استعمال کرتے ہوئے سالماتی ڈاکنگ کے ساتھ پیش گوئی کی گئی تھی۔ ٹارگٹڈ مالیکیولر ڈاکنگ ایک کوکرسٹلائزڈ لیگنڈ کو فعال سائٹ کے مرکز کے طور پر استعمال کرکے کی گئی تھی۔ سٹرکچر 2Y9X ٹائروسینیز مالیکیولر ڈاکنگ کے لیے استعمال کیا گیا تھا جو ٹروپولون کے ساتھ مشروم ٹائروسینیز کو روکنے والا ہے، اس کے کوکرسٹل کے طور پر۔ مالیکیولر ڈاکنگ سائٹ کا مرکز -10.032؛-28.769 اور-43.467 پر بالترتیب X، Y، اور Z طول و عرض کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔ چین A کو استعمال کے لیے الگ کر دیا گیا اور ہولمیم ایٹم کو UCSF Chimera کا استعمال کرتے ہوئے ڈھانچے سے ہٹا دیا گیا۔

اس تحقیق میں 3HGP کی ساخت، ایک پورسین ایلسٹیس بھی استعمال کی گئی تھی۔ FR130180، کیونکہ کوکرسٹل کو مالیکیولر ڈاکنگ سائٹ کے مرکز کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ کوآرڈینیٹ بالترتیب 12.453,9.237، اور 1.199 تھے X,Y,Z طول و عرض کے لیے۔ پابند وابستگی کا تجزیہ ہر سالماتی ڈاکنگ کیلکولیشن کے دس بہترین کنفارمرز سے کیا گیا۔

یہ مضمون Scientifc رپورٹس سے ماخوذ ہے۔ (2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x