حصہ 1: NF-kB کا ایک روکنے والا اور AMPK کا ایک اگونسٹ: الزائمر کی بیماری کے خلاف ایکٹیوسائیڈ کے لیے سگنلنگ پاتھ ویز حاصل کرنے کے لیے نیٹ ورک کی پیشن گوئی اور ملٹی اومکس انٹیگریشن

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

ینگ کیو لی1†، یی چن1†، سی کیو جیانگ1 ، یوآن-یوان شی2 ، Xiao-Li Jiang1 ، شان-شان وو1 , پنگ چاؤ1 ، ہوئی ینگ وانگ1 ، پنگ لی1* اور فی لی1,2*

¹ حالت چابی لیبارٹری کی قدرتی دوائیاں، چین فارماسیوٹیکل جامع درس گاہ، نانجنگ، چین، ² کالج کی فارمیسی،سنکیانگ میڈیکل یونیورسٹی، ارومچی، چین

تعارف

بڑھتی عمر اور آبادی میں تیزی سے اضافے کے ساتھ، دنیا میں ڈیمنشیا کے کیسز کی تعداد میں اضافہ ہوا ہے۔ایک دماغی مرض کا نام ہے(AD) ایک عام neurodegenerative بیماری ہے جس کے ساتھ علمی خرابی اور dyskinesia (Perea et al., 2020) ہوتا ہے، جو ڈیمنشیا کی سب سے زیادہ کثرت سے ہوتی ہے۔ یہ شدید اعصابی نقصان، سنائیل پلیکس، اور نیوروفائبرلری ٹینگلز (Shiao et al.، 2017) کی خصوصیت رکھتا ہے۔ AD کے روگجنن(ایک دماغی مرض کا نام ہے)کثیر جہتی ہے اور نیورو انفلامیشن سے منسلک ہے۔ Neuroinflammation glial خلیات کے ایکٹیویشن سے چلتی ہے، جس کا AD کی موجودگی اور نشوونما سے گہرا تعلق ہے۔(ایک دماغی مرض کا نام ہے)(Hanslik and Ulland، 2020؛ Linnerbauer and Rothhammer، 2020)۔ نیورو انفلامیشن کے بڑھنے اور بڑھنے کے دوران، مائیکروگلیہ کو ایک اہم عنصر سمجھا جاتا ہے۔

مائیکروگلیا مرکزی اعصابی نظام میں بنیادی مدافعتی خلیات ہیں، جو دماغ کی نشوونما، اعصابی ماحول کی دیکھ بھال، نیز چوٹ اور مرمت کے ردعمل جیسے عمل کے جھرن سے قریبی تعلق رکھتے ہیں (Perea et al., 2020)۔ مزید برآں، مائیکروگلیہ کو M1 فینوٹائپ کے لیے متحرک کیا جا سکتا ہے اور جب نیوروئنفلامیشن سے متعلق بیماریوں جیسے کہ AD میں سوزش کے حامی سائٹوکائنز کے اظہار کو بڑھایا جا سکتا ہے۔(ایک دماغی مرض کا نام ہے)ہوتا ہے (Tsukahara et al.، 2020)۔ مطالعات یہ بھی ظاہر کرتے ہیں کہ M1 فینوٹائپ میں پولرائزیشن اکثر میٹابولک عوارض (Li L. et al., 2020) کے ساتھ ہوتی ہے، جس کے نتیجے میں توانائی کے میٹابولزم کا عدم توازن اور mitochondrial dysfunction (اگروال اور جھا، 2020) ہوتا ہے۔ یہ منفی تبدیلیاں نیوروڈیجنریشن سے حاصل ہوتی ہیں، یہاں تک کہ AD(ایک دماغی مرض کا نام ہے).

ایکٹیوسائیڈ(ACT)، ایک phenylethanoid glycoside، بنیادی طور پر ماخوذ ہے۔Cistanche tubulosa. بڑھتے ہوئے شواہد نے یہ تجویز کیا ہے کہ ACT میں متعدد فارماسولوجیکل سرگرمیاں ہیں، بشمول نیورو پروٹیکٹو (وی ایٹ ال۔، 2019)، سوزش مخالف (لائی ایٹ ال۔، 2019)، اور اینٹی آکسیڈینٹ (جی ایٹ ال۔، 2019) کے اثرات۔ خاص طور پر، یہ ثابت ہوا ہے کہ ACT سیکھنے اور یادداشت کی خرابی کو بہتر بنا سکتا ہے اور ساتھ ہی اسٹریپٹوزوٹوسن سے متاثرہ چوہوں میں توانائی کے تحول کو بڑھا سکتا ہے (چن جے ایٹ ال۔، 2020)۔ اس کے علاوہ، یہ تجرباتی آٹو امیون انسیفالومائلائٹس چوہوں (لی ڈبلیو ایٹ ال۔، 2020) میں نیورونل اپوپٹوٹک سیل کی موت اور مائٹوکونڈریل نقصان کو بھی روک سکتا ہے۔ تاہم، مائیکروگلیہ M1/M2 پولرائزیشن اور اس کے طریقہ کار پر ACT کا اثر شاذ و نادر ہی رپورٹ کیا جاتا ہے۔ ابھی تک، مائٹوکونڈریا فنکشن کی مرمت اور سیل میٹابولزم کے ضابطے جیسے میکانزم واضح نہیں ہیں اور درست طریقہ کار کو واضح کرنے کے لیے مزید سائنسی تحقیق کی ضرورت ہے۔

موجودہ رپورٹ کا مقصد ACT کی علاج کی افادیت کے ساتھ ساتھ AD پر ACT کے بنیادی مالیکیولر میکانزم کی چھان بین کرنا ہے۔(ایک دماغی مرض کا نام ہے). اس کے ساتھ، مربوط ڈیٹا بیس کی بنیاد پر منشیات کے ہدف کی شناخت کا ایک منظم طریقہ کار قائم کیا گیا ہے۔ ہم RNA-sequencing (RNA-seq) کو میٹابولومکس کے طریقہ کار اور سالماتی حیاتیات کی تکنیکوں کے ساتھ مربوط کرکے مالیکیولر بائیولوجیکل سطح پر ACT کے ممکنہ میکانزم کی مزید تفتیش کرتے ہیں۔ ان سلیکو، ان ویوو، اور وٹرو میں منظم اسکریننگ کی حکمت عملی کا امتزاج روایتی چینی ادویات کے کثیر ہدف مرکبات کو معروضی طور پر دریافت کرنے کے لیے ایک نیا پروٹوکول فراہم کرتا ہے۔

Cistanche tubulosa علاج کر سکتا ہےایک دماغی مرض کا نام ہے

مواد اور طریقے

نیٹ ورک ماڈلنگ

ACT کے اہداف کی پیشن گوئی اور دریافت کرنے کے لیے چار آن لائن پلیٹ فارمز کو یکجا کیا گیا تھا، یعنی GeneCards1، مماثلت اینسبل اپروچ (SEA2)، SwissTargetPrediction3، اور PharmMapper4۔ AD کی تمام جین ایسوسی ایشنز(ایک دماغی مرض کا نام ہے)DisGeNET5 اور GeneCards سے آزادانہ طور پر جمع کیے گئے تھے۔ String database6 کے ذریعے کیے گئے ہدف–ٹارگٹ تعامل کے تجزیے کے بعد، نیٹ ورک کو مزید Cytoscape (ورژن 3.8.2) سافٹ ویئر کے ذریعے مربوط کیا گیا۔ GO اور KEGG افزودگی کا تجزیہ DAVID ڈیٹا بیس 7 پر نیٹ ورک کی تشریح اور مائن کرنے کے لیے کیا گیا۔

جانور اور ماڈل گروپنگ

اس تحقیق میں جنگلی قسم کی زیبرا فش (AB سٹرین، 4 ماہ پرانی) کا انتخاب کیا گیا تھا (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.)۔ پچھلے طریقہ (Li YQ et al., 2020) پر عمل کرتے ہوئے انہیں 28oC پر 14/10-گھنٹہ روشنی/تاریک چکر کے تحت برقرار رکھا گیا تھا۔ زیبرا فش کے تمام تجربات چائنا فارماسیوٹیکل یونیورسٹی کی اینیمل ایتھکس کمیٹی کی نگرانی میں کیے گئے۔

زیبرا فش لاروا کو چھ گروپوں میں تقسیم کیا گیا اور ان کا علاج 3 دن بعد فرٹیلائزیشن (dpf) سے 7 dpf تک کیا گیا: کنٹرول گروپ، ماڈل گروپ، ماڈل پلس ڈونپیزل ہائیڈروکلورائڈ (DPZ، Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) گروپ، اور ماڈل پلس ایکٹ (HPLC طہارت 98 فیصد، Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) گروپس۔ کنٹرول گروپ کو درمیانے درجے میں 0.2 فیصد DMSO کے ساتھ برقرار رکھا گیا تھا اور ماڈل گروپ کو 150 uM AlCl3 (pH 5.8) کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ ماڈل پلس ڈی پی زیڈ گروپ کا AlCl3 اور 8 uM DPZ کے ساتھ مشترکہ علاج کیا گیا تھا۔ ماڈل پلس ACT گروپوں کو AlCl3 اور ACT کے مختلف ارتکاز (200, 100, اور 50 u M) کے ساتھ مل کر علاج کیا گیا۔

طرز عمل کا تجزیہ

زیبرا فش لاروا کی نقل و حرکت ویوپوائنٹ رویے کے تجزیہ کار (زیبرالاب، 2018، ویو پوائنٹ لائف سائنسز کمپنی، لمیٹڈ) کے ذریعے 28oC پر ریکارڈ کی گئی۔ مختصراً، رویے کے پیرامیٹرز اور رزلٹ پروسیسنگ اس طریقہ سے مطابقت رکھتے تھے جو ہم نے پہلے قائم کیا تھا (Li YQ et al., 2020)۔ اس کے ساتھ، اوسط رفتار (AS)، رفتار کی تبدیلی (AS)، dyskinesia ریکوری ریٹ (DRR)، اور رسپانس ایفیسینسی (RE، فیصد) کو زیبرا فش میں ڈسکینیشیا کی بازیابی کا اندازہ کرنے کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔

Acetylcholinesterase اور Choline Acetyltransferase سرگرمی کا تعین

3 سے 7 ڈی پی ایف تک علاج کرنے کے بعد، زیبرا فش لاروا کو Acetylcholinesterase (AChE) اور Choline Acetyltransferase (CHAT) کی سرگرمیوں کی پیمائش کے لیے اکٹھا کیا گیا۔ کارخانہ دار کے پروٹوکول کی بنیاد پر، سرگرمی کا پتہ انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کٹس (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) کے ذریعے پایا گیا۔

سیل کلچر اور علاج

BV-2 سیل لائن امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (ATCC, Manassas, VA, United States) سے خریدی گئی تھی۔ وہ DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) میں مہذب تھے۔ میڈیم کو 10 فیصد FBS (Gibco, Grand Island, NY, United States) کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا،

100 U/ml پینسلن، اور 100 mg/ml streptomycin، 37oC پر 95 فیصد ہوا/5 فیصد CO2 کے ساتھ۔ BV-2 خلیوں کو ACT (50, 25, اور 12.5 uM) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا یا lipopolysaccharide (LPS, 1 ug/ml; Sigma- Aldrich, St Louis, MO, United States) کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے متحرک کیا گیا تھا۔ خلیات کو الٹی خوردبین (نیکون ای سی ایل آئی پی ایس ای ٹی 2، جاپان) کے تحت دیکھا گیا۔

سیل وائبلٹی پرکھ

سیل کاؤنٹنگ کٹ-8 (CCK-8) پرکھ (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) سیل کی قابل عملیت کا جائزہ لینے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ مختصراً، مائیکرو پلیٹ ریڈر (Bio-Tek Instrument، Winooski، VT، United States) کے ساتھ جذب کو 450 nm پر ماپا گیا۔

نائٹرک آکسائیڈ پروڈکشن پرکھ

نائٹرک آکسائیڈ (NO) کا تعین BV-2 کلچر سپرنٹنٹ میں Griess reagent کا استعمال کرتے ہوئے نائٹریٹ کی سطح کی پیمائش کر کے کیا گیا تھا۔ مختصراً، میڈیم (100 ul) کو ایک نئی 96-کنویں پلیٹ میں منتقل کیا گیا، ہر کنویں میں گریسس ریجنٹ کا ایک ہی حجم شامل کیا گیا اور اندھیرے میں 15 منٹ تک رد عمل ظاہر کیا۔ 540 nm پر جذب کا تعین مائکروپلیٹ ریڈر کے ذریعہ کیا گیا تھا۔

سپرنٹنٹ میں سوزش والی سائٹوکائنز کی سطح

BV-2 سیل سپرنٹنٹ میں TNF-a، IL-1، اور IL-10 کی تعداد کا تعین ELISA کٹس کے ذریعہ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق کیا گیا تھا۔

HPLC-Q-TOF-MS تجزیہ کے ذریعے سیلولر میٹابولزم کا تعین

BV-2 خلیات کو الگ الگ چھ کنویں ڈش میں سیڈ کیا گیا تھا (n=6/گروپ)۔ علاج کے بعد، میڈیم کو ہٹا دیا گیا تھا، اور خلیات کو ٹھنڈے پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھویا گیا تھا. اس کے بعد سیل میٹابولزم کو دبانے کے لیے انہیں فوری طور پر مائع نائٹروجن کے سامنے لایا گیا۔ خلیوں کو 80 فیصد ٹھنڈے میتھانول کے ساتھ کاٹا گیا تھا۔ پروٹین کی بارش کو آسان بنانے کے لیے، خلیات کو 1 منٹ کے لیے بھرپور طریقے سے گھمایا گیا اور 13،000 rpm (15 منٹ، 4oC) پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سیل معطلی کو نائٹروجن کی ندی کے نیچے خشک کیا گیا تھا۔ خشک باقیات کو پہلے سے ٹھنڈا 25 فیصد ایسٹونائٹرائل کے 150 ul میں دوبارہ تشکیل دیا گیا تھا۔ ترتیب کے تجزیہ کے استحکام اور درستگی کو یقینی بنانے کے لیے، برابر حجم (10 ul) کے ساتھ ہر سیل کے نمونے کو کوالٹی کنٹرول کے نمونوں کے طور پر ملایا گیا تھا۔ میٹابولائٹ کا پتہ لگانے کے دوران، ان نمونوں کو ہر چھ نمونوں کے بعد ان کے استحکام کی تصدیق کرنے کے لئے انجکشن کیا گیا تھا. HPLC-Q-TOF-MS کے لیے ایک 1-ul aliquot لگایا گیا تھا۔

تجزیہ ایک Agilent 1290 HPLC سسٹم پر کیا گیا تھا۔

Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) ماس اسپیکٹرومیٹر (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, United States) کے ساتھ منسلک ہے۔ علیحدگی ACQUITY UPLC BEH C18 کالم (2.1 منٹ 100 ملی میٹر، 1.7 um) پر کی گئی تھی۔ موبائل فیز 0.1 فیصد فارمک ایسڈ – واٹر (v/v; A) اور acetonitrile (B) پر مشتمل تھا۔

بہاؤ کی شرح درج ذیل بہترین تدریجی اخراج کی حالت کے ساتھ {{0}}.4 ملی لیٹر فی منٹ پر سیٹ کی گئی تھی: 0 سے 2 منٹ، 5 فیصد B؛ 2 سے 20 منٹ، 5 سے 95 فیصد بی (مثبت آئن موڈ)؛ 0 سے 2 منٹ، 5 فیصد B؛ 2 سے 20 منٹ، 5 سے 95 فیصد B (منفی آئن موڈ)۔ ماس اسپیکٹومیٹر کے آپریشن کے پیرامیٹرز اس طرح مقرر کیے گئے تھے: گیس کا درجہ حرارت، 320oC؛ خشک کرنے والی گیس، 10 L/منٹ؛ نیبولائزر، 35 پی ایس آئی؛ VCap, 4,000 V; فریگمنٹر، 120 وی۔

ڈیٹا MetaboAnalyst8 کے ساتھ کیا گیا تھا۔ ادب کے ساتھ مل کر، HMDB9 پر مختلف میٹابولائٹس (VIP > 1، t-test p < 0.05)="" کی="" شناخت="" کی="" گئی="" تھی۔="" آخر="" میں،="" میٹابو="" اینالسٹ="" کے="" ساتھ="" راستے="" کا="" تجزیہ="" کیا="">

مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل کی پیمائش

مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق فلوروسینٹ پروب JC-1 (بیو ٹائم، چین) کا استعمال کرتے ہوئے مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل (MMP) کا پتہ لگایا گیا۔ مختصراً، مختلف گروپوں کے خلیات کو PBS سے دھویا گیا اور 37oC پر 20 منٹ کے لیے JC-1 سٹیننگ سلوشن سے انکیوبیٹ کیا گیا۔ داغ لگانے کے بعد، خلیات کو داغدار بفر کا استعمال کرتے ہوئے دو بار دھویا گیا۔ پھر، فلوروسینٹ سگنلز کا پتہ فلو سائٹومیٹری (BD Accuri C6) سے ہوا۔

Mitochondrial Adenosine 5f-Triphosphate کی پیمائش

مائٹوکونڈریا میں Adenosine 5/-triphosphate (ATP) کی حراستی کا پتہ ATP Assay Kit (Beyotime، China) سے ہوا۔ مختصراً، مختلف گروپس کے BV-2 سیلز کے کلچر میڈیم کو ضائع کر دیا گیا، اور سیلز کو برف پر لیسز بفر کے ساتھ ہم آہنگ کر دیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن کے بعد حاصل ہونے والا سپرنٹنٹ (12,000 جی،

5 منٹ) ATP حراستی کا تعین کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ روشنی کا پتہ EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer) نے لگایا تھا۔

کا انتظام(ایک دماغی مرض کا نام ہے)

انٹرا سیلولر ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں کی سطح کی پیمائش

رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) Assay Kit (Beotime، China) کو ROS کی سطح کی پیمائش کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ مختلف گروپوں کے خلیوں کو DCFH-DA (10 uM) کے ساتھ 20 منٹ کے لئے 37oC پر لگایا گیا تھا۔ تحقیقات کی لوڈنگ کے بعد، خلیوں کو DMEM کے ساتھ تین بار دھویا گیا۔ پھر، فلوروسینٹ سگنلز کا پتہ فلو سائٹومیٹری (BD Accuri C6) سے ہوا۔

ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی

BV-2 خلیات کو چھ کنویں کی ڈش میں سیڈ کیا گیا تھا۔ میڈیم کو ہٹا دیا گیا اور ہر کنویں میں 1 ملی لیٹر 2.5 فیصد گلوٹرالڈہائڈ تیزی سے شامل کیا گیا۔ اس کے بعد، خلیات کو جمع کیا گیا اور راتوں رات 4oC پر نئے 2.5 فیصد گلوٹرالڈہائیڈ کے ساتھ فکس کیا گیا۔ فکسیشن، ڈی ہائیڈریشن اور ایمبیڈنگ کے بعد، خلیات کو HT7800 ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ (ہٹاچی، ٹوکیو، جاپان) کے ساتھ دیکھا گیا۔

RNA-Seq اور بایو انفارمیٹک ڈیٹا تجزیہ

BV{{{{10}}}} سیلز سے کل RNA Trizol reagent (Vazyme Biotech، China) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ تمام تجزیاتی نمونے RNA ترتیب پرکھ کے لیے Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) کو بھیجے گئے تھے۔ ڈیٹا کا تجزیہ Majorbio Cloud Platform10 کے آن لائن پلیٹ فارم پر کیا گیا تھا۔ RSEM11 کا استعمال جین کی کثرت کو درست کرنے کے لئے کیا گیا تھا۔ بنیادی طور پر، تفریق اظہار خام ڈیٹا کو MassHunter Workstation سافٹ ویئر ورژن B کے تحت چلایا گیا تھا۔{22}}7{5}} (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, United States)۔ خام ڈیٹا کو XCMS پلیٹ فارم کے ذریعہ پہلے سے پروسیس کیا گیا تھا۔ پرنسپل اجزاء کا تجزیہ (PCA) اور عام تجزیہ کا جزوی کم سے کم مربع امتیازی تجزیہ (PLS-DA) Q قدر 0.05 کے ساتھ DESeq2/DEGseq/EdgeR کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ DEGs کے ساتھ|log2FC| > 1 اور Q قدر 0.05 (DESeq2 یا EdgeR)/Q قدر 0.001 (DEGseq) کو نمایاں طور پر مختلف اظہار شدہ جین سمجھا جاتا تھا۔ اس کے علاوہ، GO اور KEGG سمیت فنکشنل افزودگی کا تجزیہ کیا گیا تاکہ یہ شناخت کیا جا سکے کہ پورے ٹرانسکرپٹوم بیک گراؤنڈ کے مقابلے میں بونفیرونی-تصحیح شدہ p-value 0.05 پر GO کی شرائط اور راستوں میں کون سے DEGs کو نمایاں طور پر افزودہ کیا گیا تھا۔ اصل ترتیب کا ڈیٹا NCBI Sequence Read Archive کے ڈیٹا بیس میں جمع کر دیا گیا ہے۔

مقداری ریئل ٹائم پولیمریز چین ری ایکشن

BV-2 سیلوں کے کل RNA کی کٹائی RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech، China) کے ذریعے کی گئی تھی، اور ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech، China) کے ساتھ کیا گیا تھا۔ کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق رد عمل کا مظاہرہ کیا گیا۔ سی ڈی این اے کو مخصوص پرائمر اور ٹرانس اسٹارٹ ٹاپ گرین کیو پی سی آر سپر مکس (ٹرانسجن بائیوٹیک، چین) کے ساتھ مقداری ریئل ٹائم پولیمریز چین ری ایکشن (qRT-PCR) اسسیس کا نشانہ بنایا گیا۔ پرائمر ضمنی جدول 1 میں درج ہیں اور ایکٹین کو اندرونی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ مقداری تجزیہ کے لیے 2-AA CT طریقہ استعمال کیا گیا تھا۔

ویسٹرن بلاٹ تجزیہ

BV-2 خلیوں کو RIPA lysis بفر (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) کے ذریعے لیس کیا گیا تھا جس میں کل پروٹین حاصل کرنے کے لیے 1 فیصد پروٹیز انہیبیٹر کاک ٹیل (تھرمو فشر) شامل تھا۔ پروٹین کو 10 فیصد SDS-PAGE کے ذریعہ الگ کیا گیا تھا اور NC جھلیوں میں منتقل کیا گیا تھا۔ 5 فیصد سکمڈ دودھ/BSA کے ساتھ بلاک کرنے کے بعد، جھلیوں کو AMPKa (Proteintech)، p-AMPKa (Afnity Biosciences)، PGC-1a (Proteintech)، NF-kB (پروٹینٹیک)، p-NF- سے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ رات بھر 4oC پر 5 فیصد TBST میں kB (ABclonal)، یا GAPDH (ABclonal) اینٹی باڈیز۔ جھلیوں کو 1 گھنٹہ کے لئے کمرے کے درجہ حرارت پر سیکنڈری ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز کنجوجٹیڈ اینٹی باڈی (ABclonal) کے ساتھ سینکایا گیا تھا۔ ہائی-سِگ ای سی ایل ویسٹرن بلوٹنگ سبسٹریٹ (ٹینن، چائنا)، جیل امیجنگ سسٹم (ٹینن، چائنا) اور امیج جے سافٹ ویئر کو تصور اور مقدار کے لیے استعمال کیا گیا۔

مالیکیولر ڈاکنگ

مالیکیولر ڈاکنگ تجزیہ آٹوڈاک سافٹ ویئر (ورژن 4.2) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ ACT اور پروٹین کے درمیان تعلق AutodockTools سافٹ ویئر کے ذریعے دیکھا گیا۔ AMPKa (PDB ID: 5g5j) اور NF-kB (PDB ID: 4q3j) کے تین جہتی (3D) پروٹین ڈھانچے کو پروٹین ڈیٹا بینک 12 سے بازیافت کیا گیا تھا۔

شماریاتی تجزیہ

تمام ڈیٹا کو اوسط معیاری انحراف کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے اور گراف پیڈ پرزم سافٹ ویئر (ورژن 8۔{1}}.1) کے ذریعے تجزیہ کیا جاتا ہے۔ گروپوں کے درمیان فرق کا تجزیہ یک طرفہ تجزیے کے تغیر (ANOVA) کے ذریعے کیا گیا، اس کے بعد ٹوکی کا متعدد موازنہ ٹیسٹ۔ p < 0.05="" کو="" شماریاتی="" لحاظ="" سے="" اہم="" سمجھا="" جاتا="">

الزائمر کی بیماری کے لئے Cistanche سپلیمنٹ

نتائج

ACT-AD انٹرایکشن نیٹ ورک اور پاتھ وے کی پیشن گوئی کو ٹارگٹ کرتا ہے۔

متعدد ڈیٹا بیسز کے استحکام کے ذریعے، ACT کے 253 اہداف حاصل کیے گئے، جب کہ AD سے متعلق کل 1,697 اہداف اکٹھے کیے گئے۔ ٹارگٹ نیٹ ورک میپنگ کے بعد، کل 70 اہداف کو ACT-AD ٹارگٹ انٹریکشن نیٹ ورک (شکل 1A) میں جذب کیا گیا۔ KEGG افزودگی کے تجزیے کا مطلب یہ ہے کہ ACT کا ایک وسیع اسپیکٹرم اور ایک سے زیادہ ہدف کا اثر ہوسکتا ہے (شکل 1B)۔ اس نے یہ بھی تجویز کیا کہ ACT کے پاس AD میں متعدد راستے، ہدف پوائنٹس اور عناصر ہیں۔(ایک دماغی مرض کا نام ہے)علاج. میکانزم کی درست تشریح حاصل کرنے کے لیے ان راستوں کی درجہ بندی کریں۔ AD کے خلاف تصادم کا کردار ادا کرنے کے لیے ACT بنیادی طور پر سگنل کی منتقلی، اینڈوکرائن سسٹم، مدافعتی نظام، اور خلیوں کی نشوونما اور موت کے ساتھ تعلق رکھتا ہے۔(ایک دماغی مرض کا نام ہے)(شکل 1C)۔ یہ بات قابل غور ہے کہ ان راستوں کی اکثریت کا تعلق سوزش کے رد عمل سے ہے۔ یہ قیاس کیا جاتا ہے کہ ACT کی سوزش آمیز کارروائی AD کے خلاف اس کے تصادم کے کردار کا ایک اٹوٹ حصہ ہو سکتی ہے۔(ایک دماغی مرض کا نام ہے).

ACT نے Dyskinesia کو ختم کیا اور AD میں Cholinergic سسٹم کے فنکشن کو بہتر کیا۔(ایک دماغی مرض کا نام ہے)زیبرا فش لاروا

نیٹ ورک ماڈل کی تصدیق کرنے کے لیے، AlCl3-کی حوصلہ افزائی AD(ایک دماغی مرض کا نام ہے)زیبرا فش لاروا کا ماڈل ACT کے اثر کو ظاہر کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ روشنی/تاریک چکروں کے اندر زیبرا فش لاروا کی نقل و حرکت دیکھی گئی، اور ان کے تیراکی کے راستے ریکارڈ کیے گئے (شکل 1D)۔ نتائج سے ظاہر ہوا کہ ACT نے زیبرا فش کے AS اور AS کو مؤثر طریقے سے بڑھایا، اور خوراک کے اضافے کے ساتھ ہم آہنگی کا اثر بڑھ گیا (شکل 1E)۔ DRR اور RE نے ACT اور DPZ (شکل 1F) کا زیادہ بدیہی موازنہ دریافت کیا۔ اس کے مطابق، ACT نے dyskinesia کو ختم کیا، DPZ پر اسی طرح کے اثرات کی نمائش کی۔

عام طور پر اس بات پر اتفاق کیا جاتا ہے کہ کولنرجک نظام سیکھنے اور یادداشت کے عمل میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ اس طرح، ACHE اور CHAT کی سرگرمیاں ACT کے اثر کو ظاہر کرنے کے لیے استعمال کی گئیں۔ زیبرا فش میں AlCl3 کی نمائش کو دماغی کولینرجک تبدیلی (شکل 1G) کے ساتھ پیش کیا گیا تھا۔ یہ اہم تھا کہ ACT علاج نے ACHE کی سرگرمی کو دبا دیا۔ اس کے علاوہ، ACT کے علاج کے بعد CHAT کی سرگرمی میں کمی واقع ہوئی۔ لہذا، ACT نے AlCl3-حوصلہ افزائی AD میں گہرا اثر دکھایا(ایک دماغی مرض کا نام ہے)زیبرا فش لاروا.

ACT نے M1 پولرائزیشن کو دبایا اور LPS سے حوصلہ افزائی BV-2 سیلز میں M2 پولرائزیشن کو فروغ دیا

نیٹ ورک کی مزید تصدیق کرنے کے لیے، BV-2 مائیکروگلیئل سیلز کا استعمال کرتے ہوئے ACT کے اینٹی سوزش اثر کا مطالعہ وٹرو میں کیا گیا۔ 24 گھنٹے تک ایل پی ایس کے علاج کے بعد، BV-2 خلیوں کی عملداری میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ خوش قسمتی سے، ACT نے LPS-حوصلہ افزائی BV-2 خلیات (شکل 2A) کی سیل کی عملداری میں اضافہ کیا۔ اس کے علاوہ، BV-2 خلیوں کی مورفولوجی کا مشاہدہ کیا گیا۔ LPS محرک کے 24 گھنٹے کے بعد، اس نے ظاہر کیا کہ BV-2 خلیات M1 پولرائزیشن حالت سے گزرے ہیں۔ مورفولوجیکل تبدیلیوں کو ACT شریک علاج (شکل 2B) کے ذریعہ روکا گیا تھا۔

مزید برآں، نتائج نے اشارہ کیا کہ، LPS کے ذریعے متحرک BV-2 خلیات کے برعکس، BV-2 خلیات جو ACT کے ساتھ مل کر علاج کیے گئے TNF-a، IL-1، اور NO (شکل 2C) سیل سپرنٹنٹ میں اظہار۔ یہ M1 مائکروگلیہ پولرائزیشن کے اشارے کے طور پر کلاسیکی سوزش والی سائٹوکائنز ہیں۔ ELISA کے نتائج کی طرح، qPCR کے نتائج نے دریافت کیا کہ TNF-a، نائٹرک آکسائیڈ سنتھیس (iNOS)،

IL-1، اور CD86 mRNA اظہار کو LPS گروپ (شکل 2D) کے مقابلے میں ACT کے علاج سے نمایاں طور پر روکا گیا تھا۔

مزید برآں، ہم نے ELISA (Figure 2C) اور qPCR (Figure 2E) کے ذریعے M2 مائیکروگلیہ پولرائزیشن لیول کی پیمائش کی، اور نتائج نے اشارہ کیا کہ ACT نے M2 مائیکروگلیہ سے متعلق مارکر ایکسپریشن لیولز (IL-10، CD206، TGF-، اور Arg-1)۔ ایک لفظ میں، ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ACT نے M1 مائکروگلیہ پولرائزیشن کو دبایا اور M2 فینوٹائپ کو فروغ دیا۔

ACT ریگولیٹڈ M1/M2 پولرائزیشن NF-kB پاتھ وے کی روک تھام کے ذریعے

ٹرانسکرپٹومک تجزیہ RNA-seq کے ذریعے BV-2 خلیوں میں مجموعی سطح سے ACT کے طریقہ کار کو دریافت کرنے کے لیے کیا گیا۔ پی سی اے نے واضح کیا کہ کنٹرول، ایل پی ایس، اور ایکٹ گروپس کو اچھی طرح سے پہچانا جا سکتا ہے (شکل 3A)۔ اس نے کنٹرول گروپ اور LPS گروپ کے درمیان 899 مختلف جینز (DEGs) اور LPS گروپ اور ACT کے درمیان 49 DEGs کا انکشاف کیا۔

گروپ (شکل 3B)۔ مستقل طور پر، GO (Figure 3C) اور KEGG افزودگی تجزیہ (Figure 3D) نے انکشاف کیا کہ ACT کا اثر NF-kB پاتھ وے میں شامل تھا۔ NF-kB پاتھ وے سے وابستہ جینوں کے سیٹ کی مزید تصدیق کی گئی تھی، اور ان کا ہومیوسٹاسس یقینی طور پر LPS سے متاثر ہوا تھا۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، ACT نے ان کے تاثرات کو نمایاں طور پر متاثر کیا (شکل 3E)۔

NF-kB پاتھ وے سوزش کے بڑھنے کو منظم کرنے کا ایک کلاسیکی راستہ ہے، جس کے نتیجے میں بالآخر سوزش کے حامی عوامل کی رہائی ہوتی ہے۔ میکانکی مدد حاصل کرنے کے لیے، NF-kB پاتھ وے کے کلیدی پروٹین کی جانچ مغربی بلاٹ کے ذریعے کی گئی۔ LPS محرک NF-kB کو چالو کرنے کا باعث بنا، جو M1 پولرائزیشن کو فروغ دینے سے وابستہ ہے۔ RNA-seq تجزیہ سے ہم آہنگ، ACT نے LPS-حوصلہ افزائی NF-kB فاسفوریلیشن کو روکا (شکل 3F)۔ لہذا، ACT BV-2 سیلز میں NF-kB پاتھ وے کے ذریعے LPS سے حوصلہ افزائی M1 پولرائزیشن کو دور کر سکتا ہے۔

ACT کی خرابی ارجنائن بایو سنتھیسس کے ساتھ ساتھ پینٹوتھینیٹ اور CoA بایو سنتھیسس

ACT کے نیٹ ورک کی پیشن گوئی نے انکشاف کیا کہ اس کا تعلق ارجنائن (Arg) اور پرولین میٹابولزم (شکل 1B) سے تھا۔ RNA-seq نے یہ ظاہر کیا کہ ACT سے متاثر ہونے والے راستوں میں Arg biosynthesis کے ساتھ ساتھ pantothenate اور CoA biosynthesis (شکل 3D) بھی شامل ہے۔ یہ تجویز کیا گیا ہے کہ BV-2 خلیات کی میٹابولزم کی خرابی جو LPS محرک سے پیدا ہوتی ہے M1 پولرائزیشن سے وابستہ ہے (Orihuela et al., 2016)۔ اس طرح،

HPLC-Q-TOF-MS کے ذریعہ غیر ہدف شدہ سیل میٹابولوم کا استعمال سیل میٹابولزم پر ACT کے اثر کی نشاندہی کرنے کے لئے کیا گیا تھا۔ PCA اور PLS-DA (شکل 3G) نے واضح کیا کہ کنٹرول، LPS، اور ACT گروپوں کو انٹرا سیلولر میٹابولائٹس کی بنیاد پر اچھی طرح سے پہچانا جا سکتا ہے۔ ایل پی ایس کی حوصلہ افزائی BV-2 خلیوں میں مختلف میٹابولائٹس کی سطحیں ACT علاج کے بعد تبدیل کردی گئیں (شکل 3H)۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، ایل پی ایس گروپ (ضمنی جدول 2) میں 11 میٹابولائٹس نمایاں طور پر تبدیل ہوئے، جبکہ 14 میٹابولائٹس کو ACT (ضمنی جدول 3) کے علاج کے بعد واضح طور پر تبدیل کیا گیا، جس میں 11 میٹابولک راستے شامل ہیں (شکل 3I)۔ ACT کا اثر بنیادی طور پر امینو ایسڈ میٹابولزم، نیوکلیوٹائڈ میٹابولزم، انرجی میٹابولزم، اور کوفیکٹرز اور وٹامنز کے میٹابولزم کو منظم کرنے پر مشتمل ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ میٹابولوم کے ذریعہ حاصل کردہ میٹابولک راستے نیٹ ورک کی پیشن گوئی اور RNA-seq کے ساتھ مطابقت رکھتے تھے، بشمول Arg biosynthesis کے ساتھ ساتھ pantothenate اور CoA biosynthesis۔ مندرجہ بالا سے پتہ چلتا ہے کہ ACT LPS-حوصلہ افزائی BV- 2 خلیوں میں Arg biosynthesis کے ساتھ ساتھ pantothenate اور CoA بایو سنتھیسس کو بھی منظم کر سکتا ہے۔

Cistanche اقتباس مخالفایک دماغی مرض کا نام ہے

براہ کرم حصہ 2 کے لیے یہاں کلک کریں۔