حصہ 1 UPLC-QTOF/MS اور DNA بارکوڈنگ پر مبنی Cistanches Herba کا کیمیائی اور جینیاتی امتیاز

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

خلاصہ

Cistanches Herba(رو کانگ رونگ)، جسے ''جینسنگ آف دی ڈیزرٹ'' کے نام سے جانا جاتا ہے، طاقت اور غذائیت پر خاص طور پر یانگ کو مضبوط کرنے کے لیے گردوں کی مضبوطی میں ایک شاندار علاج کا اثر رکھتا ہے۔ تاہم، Cistanches Herba کے دو پودوں کی اصل، Cistanche deserticola اور Cistanche tubulosa، فارماسولوجیکل عمل اور کیمیائی اجزاء کے لحاظ سے مختلف ہوتی ہیں۔ Cistanches Herba کے پودوں کی اصل میں امتیاز کرنے کے لیے، سب سے پہلے اس مطالعہ میں کیمیائی اور جینیاتی -UPLC-QTOF/MS ٹیکنالوجی اور DNA بارکوڈنگ کا ایک مشترکہ طریقہ کار استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ تین ممکنہ مارکر مرکبات (کیمپنیوسائیڈ II، cistanoside C، اور cistanoside A کا ایک isomer) PCA اور OPLS-DA کے تجزیوں کے ذریعہ دو اصلوں میں امتیاز کرنے کے لیے حاصل کیے گئے تھے۔ ڈی این اے بارکوڈنگ نے دو اصلوں کو درست طریقے سے فرق کرنے کے لیے فعال کیا۔ NJ درخت نے دکھایا کہ دو اصل دو کلیڈز میں کلسٹر ہیں۔ ہمارے نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ Cistanches Herba کے دو ماخذ مختلف کیمیائی مرکبات اور جینیاتی تغیرات کے مالک ہیں۔ Cistanches Herba کے دو ماخذوں کے بارے میں یہ پہلی رپورٹ شدہ تشخیص ہے، اور یہ تلاش کوالٹی کنٹرول اور اس کے طبی استعمال میں سہولت فراہم کرے گی۔

Cistanche Herba

تعارف

Cistanches Herba(رو کونگ رونگ)، جسے ''صحرا کے جینسینگ'' کے نام سے جانا جاتا ہے، کی ابتداء کے خشک رسیلی تنوں سے ہوتی ہے۔Cistanche deserticolaYC Ma اورCistanche tubulosaچینی فارماکوپیا (2010 ایڈیشن) کے مطابق (Schrenk) وِگ، اور یہ گردے ین کو ٹانیفائی کرنے، زندگی کے جوہر کو فائدہ پہنچانے اور آنتوں کو آرام دینے کے لیے مشہور ہے۔ فی الحال،Cistanches Herbaبنیادی طور پر شمال مغربی چین میں خشک اور گرم صحراؤں میں تقسیم کیا جاتا ہے، خاص طور پر سنکیانگ اور اندرونی منگولیا صوبوں میں۔ تاہم، کے دو اصلCistanches Herbaان کی فارماسولوجیکل سرگرمی اور کیمیائی اجزاء کے لحاظ سے مختلف ہیں۔ Tu et al. تین Cistanche پرجاتیوں کے کاڑھی کی تحقیق کی (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche سالسا) اور یہ پایاC. tubulosaیانگ کی کمی ماؤس ماڈل [1] میں سب سے کم اثر دکھایا۔ Zhang et al. کے درمیان فارماسولوجیکل سرگرمی کا موازنہC. deserticola, C. tubulosaاورسی سالسا،اور پایا کہ ان پرجاتیوں میں دواؤں کے افعال تھے جیسے تھکاوٹ اور ہائپوکسیا رواداری، لیکن اسی حد تک نہیں [2]۔ پچھلی تحقیق نے کیمیائی جزو کی اطلاع دی اور پودوں کی ابتدا کے لیے کیمیائی اجزاء اور مواد کے فرق کی نشاندہی کی۔Cistanches Herba[3]۔ جہاں تک کلینیکل ایپلی کیشن اور مارکیٹ کی گردش کا تعلق ہے، بطور ٹانک،C. tubulosaروایتی طور پر خون کی گردش کو فروغ دینے والے ایجنٹ کے طور پر اور جاپان میں نامردی، بانجھ پن، لمباگو، جسم کی کمزوری کے علاج میں استعمال ہوتا رہا ہے [4-8]۔ نتیجتاً، دو اصلوں میں امتیاز کرنا بہت اہمیت کا حامل ہے۔Cistanches Herbaکوالٹی کنٹرول اور کلینیکل ایپلی کیشن کے لیے۔ تاہم، دو اصلوں کے امتیاز پر کوئی تحقیقی توجہ نہیں ہے۔Cistanches Herba. بہت سے تحقیق شدہ طریقے جن میں مائیکروسکوپی، الٹرا وائلٹ اور انفراریڈ کا پتہ لگانا، انٹر-سپل سیکونس ریپیٹ کا طریقہ استعمال کیا گیا ہے۔سیستانچس، لیکن نہ صرف دو اصلوں کے لئے خاص طور پر [9-20]۔ یہاں، ہم نے Cistanches Herba، UPLC QTOF/MS (الٹرا پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی اور کواڈروپول ٹائم آف فلائٹ ماس سپیکٹرومیٹری کے ساتھ مل کر) اور DNA بارکوڈنگ کے دو ماخذوں میں فرق کرنے کے لیے مشترکہ طور پر کیمیائی اور سالماتی تکنیکوں کا استعمال کیا۔ UPLC-QTOF/MS دیگر تکنیکوں کے مقابلے میں زیادہ تیزی اور مؤثر طریقے سے معلومات فراہم کرتا ہے۔ UPLC-QTOF/MS کی اعلیٰ انتخابی صلاحیت اور حساسیت کے نتیجے میں مقداری اور کوالٹیٹیو دونوں تجزیوں کے ساتھ ساتھ میٹابولائٹ تجزیہ اور روایتی چینی طب [21-22] میں پیچیدہ مرکبات کی شناخت کے لیے اس کا اطلاق ہوا ہے۔ پرنسپل جزو تجزیہ (PCA) اور آرتھوگونل پروجیکشن ٹو لیٹنٹ ڈھانچے کے امتیازی تجزیہ (OPLSDA) کو بھی ممکنہ مارکر مرکبات کی شناخت کے لیے تیار کیا گیا ہے۔ DNA بارکوڈنگ، ایک آسان اور زیادہ عالمگیر مالیکیولر مارکر ٹیکنالوجی، انواع یا نسل کی شناخت کے لیے DNA کے ٹکڑے کا استعمال کرتی ہے۔ روایتی شناخت کے طریقوں اور دیگر مالیکیولر مارکر ٹیکنالوجیز کے مقابلے یہ معروضی، زیادہ درست اور انجام دینے میں آسان ہے۔ مزید برآں، ڈی این اے بارکوڈنگ کو جانوروں اور پودوں کی شناخت کے لیے کامیابی سے لاگو کیا گیا ہے، بشمول دواؤں کے پودے [23-26]۔ اس تحقیق کا مقصد UPLC-QTOF/MS اور DNA بارکوڈنگ کو ملا کر ایک سائنسی طریقہ کار کے نظام کو قائم کرنا ہےCistanches Herba.

سیستانچ پوری جڑیں

مواد اور طریقے

اخلاقیات کا بیان ہم تصدیق کرتے ہیں کہ فیلڈ اسٹڈیز میں خطرے سے دوچار یا محفوظ انواع شامل نہیں تھیں۔ نمونے کی معلومات میں GPS کوآرڈینیٹ شامل کیے گئے ہیں، براہ کرم جدول 1 دیکھیں۔"

پلانٹ مواد اور ری ایجنٹس

Cistanches Herba کے رسیلے تنوں کو مئی 2012 میں اندرونی منگولیا، چنگھائی صوبوں، سنکیانگ ایغور خود مختار علاقہ، عوامی جمہوریہ چین (ٹیبل 1) کے جنگلی صحرائی علاقوں سے جمع کیا گیا تھا۔ تحقیق کے نمونے سبھی جنگلی صحرائی علاقوں میں جمع کیے گئے تھے، نہ کہ نجی زمین میں، جہاں کسی خاص اجازت کی ضرورت نہیں تھی۔ تنوں کی نباتاتی شناخت کی تصدیق ڈاکٹر لن فانگ ہوانگ نے کی۔ واؤچر کے نمونے انسٹی ٹیوٹ آف میڈیسنل پلانٹ ڈویلپمنٹ میں جمع کیے گئے تھے۔ ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (HPLC) گریڈ ایسٹونیٹرائل (Merck KGaA، Darmstadt، Germany) اور فارمک ایسڈ (Tedia، USA) کو UPLC تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا۔ ڈیونائزڈ پانی کو ملی-کیو سسٹم (ملی پور، بیڈفورڈ، ایم اے، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا گیا۔ باقی تمام کیمیکل تجزیاتی گریڈ کے تھے۔

نمونے کی تیاری

Cistanches Herba نمونے (10 g, 65-mesh) کو ایک 50-mL مخروطی فلاسک میں منتقل کیا گیا، اور 50 mL 70 فیصد میتھانول شامل کیا گیا۔ 30 منٹ تک بھگونے کے بعد، الٹراسونیکیشن (35 کلو ہرٹز) کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک کی گئی۔ 10 منٹ کے لیے 10،{10}} rev/min پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، سپرنٹنٹ کو 4uC پر اسٹور کیا گیا اور تجزیہ کے لیے UPLC-QTOF/MS سسٹم میں انجیکشن لگانے سے پہلے 0{14}mm میمبرین کے ذریعے فلٹر کیا گیا۔

UPLC-QTOF/MS

UPLC تجزیہ کے لیے، درج ذیل سسٹمز/پیرامیٹر استعمال کیے گئے: واٹر ایکویٹی سسٹم (واٹر) بائنری سالوینٹ ڈیلیوری پمپ سے لیس، آٹو سیمپلر اور پی ڈی اے ڈیٹیکٹر جو واٹر ایمپاور 2 ڈیٹا اسٹیشن سے منسلک ہے۔ الٹراسونکیشن (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, China) اور ایک الیکٹرانک تجزیاتی بیلنس ماڈل AB135-2 (Metler Toledo., Greifensee, Zurich, Switzerland)۔ ایک واٹر ایکویٹی UPLC BEH C18 کالم (1.7 mm, 2.16100 mm, Waters) اور Waters C18 گارڈ کالم (ایک ہی مواد، پانی) استعمال کیا گیا اور 30uC پر برقرار رکھا گیا۔ موبائل فیز 0.1 فیصد فارمک ایسڈ آبی محلول (A) اور acetonitrile (B) تھا جس میں گریڈینٹ پروگرام درج ذیل ہے: 0-3 منٹ، 10-22 فیصد B؛ 3–4 منٹ، 22–23 فیصد B؛ 4–6 منٹ، 23–35 فیصد B؛ 6–8 منٹ، 35–37 فیصد B؛ 8–11 منٹ، 37–42 فیصد B؛ 11– 12 منٹ، 42–48 فیصد B؛ 12–15 منٹ، 0.3 ملی لیٹر/منٹ کی بہاؤ کی شرح پر 48 فیصد –50 فیصد B۔ انجیکشن کا حجم 5 ملی لیٹر تھا۔

UPLC/MS تجزیہ QTOF Synapt G2 HDMS سسٹم (Waters, Manchester, UK) پر کیا گیا جو الیکٹرو سپرے آئنائزیشن (ESI) ذریعہ سے لیس ہے جو منفی آئن موڈ میں چل رہا ہے۔ N2 کو ڈیسولیشن گیس کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔ 800 L/h کے بہاؤ کی شرح سے تحلیل کا درجہ حرارت 45{{10}}uC پر سیٹ کیا گیا تھا، اور ماخذ کا درجہ حرارت 120uC پر سیٹ کیا گیا تھا۔ کیپلیری اور شنک وولٹیج بالترتیب 2500 اور 40 V پر سیٹ کیے گئے تھے۔ ڈیٹا 50–1200 Da کے درمیان 01-s اسکین ٹائم اور 001-s interscan delay کے ساتھ 15-min analysis time میں اکٹھا کیا گیا تھا۔ آرگن کو 7.06661023 Pa کے دباؤ پر تصادم گیس کے طور پر استعمال کیا گیا۔ تمام MS ڈیٹا کو لاک سپرے سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے جمع کیا گیا تاکہ بڑے پیمانے پر درستگی اور تولیدی صلاحیت کو یقینی بنایا جا سکے۔ [MH] - m/z 554.2615 پر leucine-enkephalin کا ​​آئن منفی ESI موڈ میں لاک ماس کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

ڈیٹا کا تجزیہ

UPLC-QTOF/MS ڈیٹا برائے Cistanches Herba نمونوں کا تجزیہ کیا گیا تاکہ ممکنہ امتیازی متغیرات کی نشاندہی کی جا سکے۔ ES خام ڈیٹا کی چوٹی کی تلاش، سیدھ اور فلٹرنگ مارکر لنکس ایپلی کیشنز مینیجر، ورژن 4.1 (واٹرز، مین چیسٹر، یو کے) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ استعمال شدہ پیرامیٹرز حسب ذیل تھے: برقرار رکھنے کا وقت (tR) 0–15 منٹ، ماس 50–1200 Da، برقرار رکھنے کا وقت 0.02 منٹ، اور بڑے پیمانے پر رواداری 0.02 Da ہر جغرافیائی مقام سے جمع کیے گئے تین نقلی نمونے استعمال کیے گئے (n=3)۔ ماڈل بنانے کے لیے کل 6,339 متغیرات استعمال کیے گئے۔

ڈی این اے بارکوڈنگ: ڈی این اے نکالنا، پی سی آر پرورش اور ترتیب

C. deserticola اور C. tubulosa (30 mg) کے خشک مانسل تنوں سے لیے گئے نمونوں کو 30 r/s کی فریکوئنسی پر 2 منٹ تک رگڑا گیا۔ ڈی این اے کارخانہ دار کی ہدایات (ٹیانجن) کے مطابق نکالا گیا تھا۔ خاص طور پر، پروٹوکول میں اس طرح ترمیم کی گئی تھی کہ کلوروفارم کو کلوروفارم کے مرکب سے تبدیل کیا گیا تھا: isoamyl الکحل (24:1 اسی حجم میں)، اور بفر حل GP2 کے ساتھ isopropanol (ایک ہی حجم)۔ رگڑے ہوئے پاؤڈر کو 1.5 ملی لیٹر ایپینڈورف ٹیوبوں میں ڈالا گیا، 700 ملی لیٹر 65 یو سی پہلے سے گرم GP1 اور 1 ملی لیٹر بی مرکاپٹوتھانول ملا کر 10-20 سیکنڈ تک بھنور کا استعمال کرتے ہوئے ملایا گیا، اور 65 یو سی پر 60 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ کلوروفارم کا 700 ملی لیٹر مرکب شامل کرنا: آئسوامیل الکحل (24:1)، 12000 rpm (134006g) پر 5 منٹ کے لیے سینٹری فیوج؛ ایک نئی ٹیوب میں پائپیٹ سپرنٹنٹ، 700 ملی لیٹر آئسوپروپینول شامل کرتے ہوئے، 15-20 منٹ تک بلینڈ کرنا؛ تمام مکسچر کو اسپن کالم CB3 میں پائپ کرنا اور 12000 rpm پر 40 s کے لیے سینٹری فیوج؛ فلٹریٹ کو خارج کرنا اور 500 ایم ایل جی ڈی شامل کرنا (استعمال سے پہلے مقداری اینہائیڈروس ایتھنول شامل کرنا)، 40 سیکنڈ کے لیے 12000 rpm پر سینٹری فیوج؛ فلٹریٹ کو ضائع کرنا اور جھلی کو دھونے کے لیے 700 ملی لیٹر پی ڈبلیو (استعمال سے پہلے مقداری اینہائیڈروس ایتھنول شامل کرنا) شامل کرنا، 12000 rpm پر 40 سیکنڈ کے لیے سینٹری فیوج؛ فلٹریٹ کو خارج کرنا اور 500 ملی لیٹر پی ڈبلیو شامل کرنا، 12000 rpm پر 40 سیکنڈ کے لیے سینٹری فیوج؛ 12000 rpm پر 2 منٹ کے لیے فلٹریٹ اور سینٹری فیوج کو ضائع کرنا تاکہ واش بفر PW کو ہٹایا جا سکے۔ اسپن کالم CB3 کو صاف 1.5 ملی لیٹر ایپینڈورف ٹیوب میں منتقل کرنا، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 3-5 منٹ تک خشک کرنا؛ کل ڈی این اے حاصل کرنے کے لیے 12000 rpm پر 2 منٹ تک سینٹری فیوج کریں۔ پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) کے لیے پرائمر پہلے کی اطلاع کردہ ترتیب پر مبنی تھے [4,5]۔ PCR ردعمل کے مرکب میں 2-mL DNA ٹیمپلیٹ، 85- mL ddH2O، 12۔{54}}mL 26Taq PCR ماسٹر مکس (بیجنگ ٹرانسجن بائیوٹیک کمپنی، چین)، 1/{{57} }}mL فارورڈ/ریورس (F/R) پرائمر (2.5 mM)، 25 mL کے آخری حجم میں۔ پی سی آر پرورش کی گئی تھی جیسا کہ کریس ایٹ ال نے بیان کیا ہے۔ [4]۔ PCR ردعمل کے پرائمر fwd PA تھے: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) اور rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACACAATCC (59-39)۔ پی سی آر مصنوعات کو 1 فیصد ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ الگ کیا گیا اور ان کا پتہ لگایا گیا۔ پی سی آر مصنوعات کو مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے بعد صاف کیا گیا تھا اور براہ راست ترتیب سے مشروط کیا گیا تھا۔

cistanche کا اہم مؤثر مرکب: ایکٹیوسائیڈ

نتائج

UPLC-QTOF/MS کی طرف سے عارضی چوٹی کی تفویض مختلف پیداواری علاقوں سے C. deserticola اور C. tubulosa کے نمائندہ کرومیٹوگرامس کو شکل 1 میں دکھایا گیا ہے۔ فنگر پرنٹ کرومیٹوگرام نے Cistanches Herba نمونوں میں مماثلت کی نشاندہی کی۔ مجموعی طور پر 23 کوالیفائیڈ ماس چوٹیوں کا پتہ چلا اور 16 چوٹیوں کی شناخت برقرار رکھنے کے اوقات اور ماس سپیکٹرا کے ساتھ جو پہلے کی اطلاع دی گئی تھی (ٹیبل 2) [29–35] کے ساتھ کی گئی۔ چوٹی 2، 3، 5، 6، 7، 8، 9، 11، 12، 15، 16، 17، 20، 21، 22، اور 23 کی شناخت عارضی طور پر cistanoside F، mussaenoside acide، cistanbuloside C1/C2، campneoside II کے طور پر کی گئی تھی۔ , کیمپنیوسائیڈ II کا isomer, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-39-aL-rhamnopyranoside, cistanoside C, 29-acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, tubuloside A, cistanoside A, tubuloside B . کیمیائی اجزاء بنیادی طور پر فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز (پی ایچ جی) ہونے کے لیے پرعزم تھے، جب کہ ایک کمپاؤنڈ، مسینوسائیڈ ایسڈ، ایک آئیریڈائڈ پولی سیکرائیڈ تھا۔ پی ایچ جی گردے کی کمی کے علاج اور اینٹی آکسیڈینٹ اور نیورو پروٹیکٹو اثرات کے لحاظ سے اہم فعال مرکبات ہیں [36]

C. deserticola اور C. tubulosa کا PCA

پی سی اے کو پودوں کی مختلف انواع کے نمونوں میں فرق کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ پی سی اے ایک غیر زیر نگرانی ملٹی ویریٹ ڈیٹا تجزیہ کا طریقہ ہے جس کا مقصد ثانوی میٹابولائٹ کمپوزیشن [37] کے ملٹی ویریٹ ڈیٹا میں مماثلت اور/یا فرق کو تصور کرنا ہے۔ دو اجزاء والے PCA ماڈل نے مجموعی طور پر تغیرات کا 46.04 فیصد حصہ لیا (PC1، 36.43 فیصد؛ PC2، 9.61 فیصد)۔ شکل 2 سے پتہ چلتا ہے کہ 24 نمونوں کو PCA اسکور میں دو گروپوں میں کلسٹر کیا گیا تھا جو پرجاتیوں کی اصل کے مطابق بنائے گئے تھے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ C. deserticola اور C. tubulosa کی کیمیائی ساخت میں نمایاں فرق ہے۔

cistanche کا اہم مؤثر مرکب: Echinacoside