حصہ 1 سیستانچے ڈیزریٹیکولا پولی سیکرائڈ چوہوں اور رینک ایل سے متاثرہ اوسٹیوکلاسٹوجینیسیس میں او وی ایکس سے متاثرہ ہڈیوں کے نقصان کو روکتا ہے

1. تعارف

آسٹیوپوروسس—ایک بیماری جس کی خصوصیت ہڈیوں کی کمی، غیر معمولی ہڈیوں کے ٹشو مائیکرو سٹرکچر، ہڈیوں کی کمزوری میں اضافہ اور فریکچر (ڈی مارٹینیس، دی بینیڈیٹو، مینگولی، اور گنالڈی، 2006)- اس وقت دنیا بھر میں 200 ملین سے زائد افراد کو متاثر کرتا ہے اور جدید معاشرے پر کافی طبی اور سماجی اقتصادی بوجھ پیش کرتا ہے (سٹروم ایٹ ال،2011)۔ آسٹیوپوروسس کا طبی علاج بنیادی طور پر ہارمون کی تبدیلی، بسفاسفونیٹ، یا ڈینوسومب تھراپی پر مرکوز ہے۔ یہ طریقے مؤثر ہیں لیکن طویل مدتی ضمنی اثرات پیدا کرتے ہیں جیسے چھاتی کے سرطان کا ممکنہ خطرہ اور غیر معمولی فیمر فریکچر (بلیک، باؤر، شوارٹز، کمنگز، اور روزن، 2012؛ رچنر، کھوسلا، اور ہوف باؤر، 2011). لہذا، ایسی ادویات کی تلاش کی اشد ضرورت ہے جو نہ صرف روک سکیںآسٹیوپوروسسلیکن اس کے کم ناپسندیدہ ضمنی اثرات بھی ہیں۔

سیستانچے صحرائی کولا(سی ڈی) چین میں وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والی ٹانک اور ادویاتی غذا ہے جسے "صحرائی جن سینگ" کہا جاتا ہے، یہ خشک رسدار تنا ہے جس کے پیمانے کے پتے ہیں۔سی ڈیزیریکولاوائی سی ما (گو، یانگ، اور ہوانگ، 2016) اور متنوع اور موثر ہےمثالسرگرمیوںجیسے مدافعتی ضابطہ، اینٹی آکسیڈیشن اور اینٹیآسٹیوپوروسسخصوصیات (ہو ایٹ ال، 2020؛ لی ایٹ ال، 2012؛ ژانگ ایٹ ال،2014). آسٹیوپوروسس کے علاج پر سی ڈی کے فعال مادوں پر پچھلے مطالعات بنیادی طور پر پر مرکوز تھےفینیلیتھانوئیڈچبوا(لی، جیانگ، اور گو، 2018؛ ژو، ژانگ، وانگ، یاو، اور ما، 2017). تاہم، سی ڈی میں دیگر موثر اجزاء جیسے ایریڈوئڈز، لیگنن، بھی شامل ہیں،کثیر الاضلاع(وانگ، ژانگ، اور کسی، 2012). روایتی چینی دوا (ٹی سی ایم) کا طبی اطلاق بنیادی طور پر پانی کی ڈیکوٹنگ ہے۔کثیر الاضلاعپانی میں حل ہونے والے اجزاء ہیں اور سب سے زیادہ امکان ہے کہ یہ ٹی سی ایم کے اہم فارماکوڈائنامک اجزاء ہوں گے۔ ٹی سی ایم سے نکالے گئے پولی سیکرائڈز کے بارے میں بے دریغ اطلاع ملی تھی کہ ان میں اینٹی ہے۔آسٹیوپوروسساثر اور چند ناپسندیدہ ضمنی اثرات، جو عام طور پر کلینکوں میں استعمال کیے جاتے رہے ہیں (جیسے ایپی میڈیم بریویکورنم (ژینگ، ہی، وو، کئی، اور وی، 2020)، اچیرنتھیس بائیڈنٹا (ژانگ، ژانگ، ژانگ، وانگ، اور یان، 2018) اور مورینڈا آفیسینالیس (یان ایٹ ال، 2019)۔ لہذا، ہم نے اس کا تصور کیاسیستانچے صحرائی کولاکثیر السکرائڈسی ڈی سے نکالی گئی (سی ڈی پی) آسٹیوپوروسس کے علاج کے لئے ممکنہ طور پر محفوظ دوا ہوسکتی ہے۔

عام طور پر ہڈیوں کی ریسورپشن اور ہڈیوں کی تشکیل کئی اقسام کے خلیوں کے ساتھ ہم آہنگی سے ہڈیوں کی ری ماڈلنگ کے دوران متحرک توازن برقرار رکھتی ہے، جن میں اوسٹیوکلاسٹس، اوسٹیوبلاسٹس، ہڈیوں کی لائننگ کے خلیات اور اوسٹیوسائٹس (کلر، ٹکنر، چیم، اور ژو، 2012) شامل ہیں۔ اس توازن میں وقفے کے نتیجے میں ہڈیوں کی میٹابولک بیماریاں پیدا ہوسکتی ہیں، جیسےآسٹیوپوروسس(زو ایٹ ال، 2018) اور اوسٹیوسکلیروسس (ایہدے ایٹ ال، 2011)۔ اوسٹیوکلاسٹس، بطور اختتامی- مختلف خلیات جو مونونیوکلیئر/میکروفیج سلسلہ سے ماخوذ ہیں، ہڈیوں کے ریسورپشن فنکشن کے ساتھ واحد خلیات ہیں (ٹیٹلباؤم، 2000)۔ دو اہم سائٹوکینز ہیں جو اوسٹیوکلاسٹ تفریق اور پختگی (کوگا ایٹ ال، 2004) میں حصہ لیتے ہیں: میکروفیج کالونی کو متحرک کرنے والا عنصر (ایم سی ایس ایف) اور جوہری عنصر κB (این ایف-κB) لیگنڈ (آر این سی ایل) کا ریسیپٹر ایکٹیویٹر۔ ایم سی ایس ایف ہیماٹوپوئیٹک سٹیم سیلز کی اوسٹیوکلاسٹ پروجینیٹرز میں تفریق میں ثالثی کرتا ہے اور رینک ریسیپٹر (تاکایاناگی، 2007) کے اظہار کو اپ ریگولیٹ کرکے اوسٹیوکلاسٹس کی تفریق کو فروغ دیتا ہے۔ اوسٹیوکلاسٹ سیل کی سطح پر آر این اے سی ایل اور رینک کی بائنڈنگ کے نتیجے میں درج ذیل ہیں: (1) سگنلنگ اڈاپٹر مالیکیولز جیسے ٹی این ایف ریسیپٹر سے وابستہ عنصر 6 (ٹی آر اے ایف 6)؛ (2) متعدد ڈاؤن اسٹریم اہداف کو فعال کرنا، بشمول این ایف- κB اور مائٹوجن ایکٹیویٹڈ پروٹین کیناز (ایم اے پی کے)؛ اور (3) فعال ٹی سیلز، سائٹوپلازمک 1 (این ایف اے ٹی سی 1) (لیو ایٹ ال، 2019) کے جوہری عنصر کے اظہار کی سطح کو اپ ریگولیشن؛ یاماشیتا ایٹ ال، 2007). ان سگنلنگ راستوں کی فعالیت براہ راست اوسٹیوکلاسٹ جینز کے اظہار کو منظم کرتی ہے، جس میں تیزاب فاسفیٹاسے 5 (اے سی پی 5) [انکوڈنگ ٹارٹریٹ مزاحم ایسڈ فاسفیٹاسے (ٹی آر اے سی پی)]، میٹرکس میٹالوپروٹینس 9 (ایم ایم پی 9) اور کیتھیپسن کے (سی ٹی ایس کے) (بوئل، سیمونٹ، لیسی، 2003) شامل ہیں۔ لہذا، آر اے این سی ایل کی وجہ سے اوسٹیوکلاسٹ تفریق سے متعلق سگنلنگ راستوں کی روک تھام آسٹیوپوروسس کے لئے ایک ممکنہ علاج کا طریقہ ہے۔

اس مطالعے میں، ہمارا مقصد سی ڈی پی علاج کے اثرات کا تعین کرنا تھا جو اوویریکٹومیزڈ (او وی ایکس) کی وجہ سے ہواآسٹیوپوروسسویوو میں اور آر اے این سی ایل سے متاثرہ اوسٹیوکلاسٹ سرگرمی ان ویٹرو پر ماؤس ماڈل، جس میں اوسٹیوکلاسٹ مخصوص جینز کے اظہار اور این ایف اے ٹی سی 1 اور این ایف κB اور ایم اے پی کے سگنلنگ راستوں کی فعالیت پر توجہ مرکوز کی گئی ہے۔ ہمارے نتائج آسٹیوپوروسس کے علاج کے لئے ایک محفوظ اور موثر دوا کے طور پر سی ڈی پی کی صلاحیت کے بارے میں نئی بصیرت فراہم کرسکتے ہیں۔

مزید معلومات کے لیے براہ کرم رابطہ کریں:Joanna.jia@wecistanche.com

پولی سیکرائڈ سیستانچے ڈیزیٹریکولا کے آسٹیوپوروسس میں بہت سے اثرات ہیں، مزید جاننے کے لیے یہاں کلک کریں

2۔ مواد اور طریقے

2.1. کیمیکلز اور نمونہ جمع

سی ڈی (نمبر 180801) انہوئی جسون روایتی چینی میڈیسن کمپنی لمیٹڈ (انہوئی، چین) سے خریدی گئی تھی اور اس کی شناخت گوانگژو یونیورسٹی آف چائنیز میڈیسن، گوانگ ژو، چین کے اسکول آف فارماسیوٹیکل سائنسز سے پروفیسر ہائیبو ہوانگ نے کی تھی۔ ایسٹراڈیول ویلیریٹ ٹیبلٹس بائر (لیورکوسن، نارتھ رائن ویسٹفلیا، جرمنی) سے خریدے گئے تھے۔ الفا ترمیم شدہ کم سے کم ضروری ذریعہ

(α-ایم ای ایم) اور فیٹل بووائن سیرم (ایف بی ایس) گیبکو (تھرمو فشر سائنٹفک، والتھم، ایم اے، امریکہ) سے حاصل کیے گئے تھے۔ پینیسیلین/اسٹریپٹومائیسن اور ٹی آر اے سی پی سٹیننگ کٹ سولربائیو (بیجنگ، چین) سے حاصل کی گئی تھی۔ ریکمبینینٹ ماؤس ایم سی ایس ایف اور ری کمبینینٹ ماؤس رینک ایل آر ڈی سسٹمز (منیاپولس، ایم این، امریکہ) سے شفا یاب ہوئے۔ ہائیڈروکسیاپیٹائٹ کوٹیڈ پلیٹیں کارننگ لائف سائنسز (سینٹ لوویل، ایم اے، امریکہ) سے خریدی گئیں۔ این ایف اے ٹی سی 1 اور سی ٹی ایس کے (سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی، سانتا کروز، سی اے، امریکہ) کے لئے بنیادی اینٹی باڈیز؛ IκB-α، پی 65، پی پی 65، پی 38، پی پی 38، ای آر کے 1/2، پی-ای آر کے 1/2، جے این کے، اور پی جے این کے (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈین ورس، ایم اے، امریکہ)؛ اور β ایکٹن (سی ڈبلیو بی آئی او، بیجنگ، چین) بھی حاصل کیا گیا۔ اس مطالعے میں استعمال ہونے والے دیگر ری ایجنٹ تجزیاتی گریڈ کے تھے اور پانی کو ملی کیو پانی کی تطہیر کے نظام (ملی پور، بیڈفورڈ، ایم اے، امریکہ) نے صاف کیا تھا۔

2.2. سی ڈی پی نکالنا

سی ڈی کو ایک باریک پاؤڈر میں گراؤنڈ کیا گیا تھا اور اسے شکست دینے کے لئے تین بار پیٹرولیم ایتھر کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ ٹھوس باقیات کو فلٹریشن کے ذریعہ جمع کیا گیا تھا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر خشک کیا گیا تھا۔ کثیر الاضلاعپہلے سے علاج شدہ نمونوں سے تین بار پانی کے ساتھ 2 ایچ کے لئے نکالا گیا تھا، مرتکز، 80 فیصد (وی/ وی) کے آخری ارتکاز میں اینہائیڈروس ایتھنول کے اضافے سے تیز، اور 24 گھنٹہ کے لئے 4 ◦ سی پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔ یہ تخفیف اتصال 20 منٹ کے لئے 3000 آر پی ایم پر سینٹریفیوجیشن کے ذریعے جمع کیا گیا تھا، جو ڈسٹلڈ پانی میں تحلیل کیا گیا تھا، اور سیوگ طریقہ (ژاؤ ایٹ ال، 2019) کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا گیا تھا (مفت پروٹین کو ہٹانا)۔ برآمدکثیر الاضلاعڈائلیز کیا گیا، خشک کیا گیا اور مزید استعمال تک ذخیرہ کیا گیا۔ مزید برآں کیمیائی ترکیب کے نتائج سے پتہ چلا کہ سی ڈی پی کی کل چینی، یورونک ایسڈ، سلفیٹ اور پروٹین کے مواد میں 67.63 0.98 فیصد، 21.05 0.49 فیصد، 1.90 0.24 فیصد اور 8.81 0.36 فیصد تھے۔

مونوسیکرائیڈ کمپوزیشن اور فوریر ٹرانسفارم انفراریڈ تجزیہ سی ڈی پی کے سپلیمنٹری انجیر 1 اور 2 میں دکھایا گیا تھا۔

2.3. او وی ایکس سے متاثرہ آسٹیوپوروسس ماؤس ماڈل

جانوروں کے تمام تجربات کو گوانگ ژو یونیورسٹی آف چائنیز میڈیسن (منظور شدہ ایس وائی ایکس کے 2019-0202) کی جانوروں کی اخلاقیات کمیٹی نے منظوری دی۔ گوانگ ژو یونیورسٹی آف چائنیز میڈیسن کے ایکسپیریمنٹ اینیمل سینٹر کی جانب سے 36 ہفتوں کی مادہ سی 57 بی ایل/6 چوہوں کو فراہم کیا گیا۔ 1 ہفتے تک مطابقت اختیار کرنے کے بعد چوہوں کے ایک گروپ کو شیم آپریشن (شام گروپ) دیا گیا جبکہ باقی چوہوں کو اوویریکٹمی آپریشن (او وی ایکس گروپ) کا نشانہ بنایا گیا۔ سرجری کے بعد چوہوں کو 1 ہفتے تک صحت یاب ہونے کی اجازت دی گئی۔ پھر، کامیابی سے ماڈل کیے گئے چوہوں کو بے ترتیب طور پر 5 گروپوں میں تقسیم کیا گیا، فی گروپ 6 چوہوں کے ساتھ:

(1) شام گروپ: ڈسٹلڈ پانی سے علاج کیا جاتا ہے، (2) او وی ایکس گروپ: ڈسٹلڈ پانی سے علاج کیا جاتا ہے، (3) او وی ایکس ای 2 گروپ (ای 2): 0.13 ملی گرام/کلو گرام ایسٹریڈیول ویلیریٹ ٹیبلٹس کے ساتھ علاج کیا گیا، (4) او وی ایکس سی ڈی پی کم خوراک گروپ (سی ڈی پی-ایل): 300 ملی گرام/کلو گرام سی ڈی پی کے ساتھ علاج کیا گیا، (5) او وی ایکس سی ڈی پی ہائی ڈوز گروپ (سی ڈی پی- ایچ): 600 ملی گرام/کلو گرام سی ڈی پی کے ساتھ علاج کیا گیا۔ ڈسٹلڈ واٹر، ای 2 یا سی ڈی پی روزانہ ایک بار گاویج کے ذریعہ چلایا جاتا تھا۔ 12 ہفتوں کے علاج کی مدت (انجیر 1اے) کے بعد تمام چوہوں کی قربانی دی گئی۔ رحم جمع کیا گیا اور تولا گیا اور بعد کے معائنے کے لئے بائیں ٹبیاس جمع کیا گیا۔ خون کے پورے نمونے جمع کیے گئے اور 5000 آر پی ایم پر سنٹرفیوز کیے گئے

4 ◦ سی پر 15 منٹ. سیرم سپرنیٹنٹس کو اسپائریٹ کیا گیا تھا اور اس میں ذخیرہ کیا گیا تھا

—80 ◦سی مزید تجزیے تک.

2.4۔ مائیکرو کمپیوٹیڈ ٹوموگرافی (مائیکرو سی ٹی) تجزیہ اور ہڈی ہسٹومورفومیٹری

بائیں ٹبیاس کو 48 ایچ کے لئے 4 فیصد پیرافارمالڈیہائیڈ کے ساتھ مقرر کیا گیا تھا اور اس کے بعد عام نمکین پر مشتمل سنٹرفیوز ٹیوبوں میں رکھا گیا تھا۔ مقررہ نمونوں کو اسکائیسکین 1172 مائیکرو سی ٹی آلات (بروکر مائیکرو سی ٹی، اسکائیسکین، کونٹیچ، بیلجیم) کے ساتھ درج ذیل ترتیبات کا استعمال کرتے ہوئے اسکین کیا گیا: وولٹیج، 80 کے وی؛ ماخذ کرنٹ، 100 μA؛ ال، 0.5 ملی میٹر فلٹر؛ دانہ

سائز، 9.76 μm؛ اور گردش قدم, 0.6◦. کے کئی پیرامیٹرز

ٹربیکلر ہڈی، بشمول ہڈیوں کی معدنی کثافت (بی ایم ڈی)، ہڈیوں کا حجم کسر (بی وی/ٹی وی)، ہڈیوں کی سطح فی کل حجم (بی ایس/ٹی وی)، ٹریبیکلر نمبر (ٹی بی این) اور ٹریبیکلر اسپیسنگ (ٹی بی ایس پی) کو سی ٹی اینالائزر® سافٹ ویئر (بروکر مائیکرو سی ٹی، اسکائیسکین) کا استعمال کرتے ہوئے ناپا گیا۔ سی ٹی وول سافٹ ویئر (بروکر مائیکرو سی ٹی) کا استعمال کرتے ہوئے سہ جہتی تصاویر تیار کی گئیں۔ اسکائیسکین).

مائیکرو سی ٹی تجزیے کے بعد بائیں ٹبیاس کو 14 فیصد ای ڈی ٹی اے حل میں ڈیکلسیف کیا گیا اور سیکشننگ کے لئے پیرافین میں شامل کیا گیا۔ نمونوں کو ہیماٹوکسیلین اور ایوسن (ایچ ای) اور ٹی آر اے سی پی داغنے کے تجربات سے پہلے مائیکروٹوم کا استعمال کرتے ہوئے 5 μm حصوں میں کاٹ دیا گیا تھا۔ داغ دار حصوں کی جانچ کی گئی اور اولمپس سی ایکس 31 مائیکرو اسکوپ (اولمپس آپٹیکل کمپنی، لمیٹڈ، ٹوکیو، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے دستاویزی شکل دی گئی۔

سیستانچےہڈیوں کی کثافت کو بڑھا سکتا ہے اور آسٹیوپوروسس سے نجات دلا سکتا ہے

2.5. سیرم تجزیہ

کیلشیم (سی اے) اور فاسفورس (پی) کے ارتکاز کا تعین نانجنگ جیانچینگ بائیو انجینئرنگ انسٹی ٹیوٹ (نانجنگ، چین) کی ڈیزائن کردہ کٹ ہدایات کے مطابق کیا گیا تھا۔ سیرم میں ٹی آر اے سی پی-5 بی اور آر این اے سی ایل کی سطح کا تجزیہ بالترتیب ٹی آر اے سی پی-5بی ایلیسا کٹ (سی یو ایس اے بی آئی او، ووہان، چین) اور رینکل ایلیسا کٹ (کلاؤڈ کلون کارپوریشن، ووہان، چین) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

2.6. ان ویٹرو اوسٹیوکلاسٹوجینیسیس پرکھ

بی ایم ایم کو 6 ہفتوں کی مادہ سی 57 بی ایل/6 چوہوں کے ٹبیا اور فیمر سے الگ تھلگ کردیا گیا تھا۔ الگ تھلگ خلیوں کو α ایم ای ایم میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا جس میں 25 این جی/ایم ایل ایم سی ایس ایف، 10 فیصد ایف بی ایس اور 1 فیصد پینسلین/اسٹریپٹومائیسن شامل تھے۔ سنگم تک پہنچنے پر بی ایم ایم (1 104 خلیات/کنویں) کو 96 کنویں کی پلیٹوں میں بیج دیا گیا اور 50 این جی/ایم ایل آر این اے سی ایل کی موجودگی میں سی ڈی پی کے ساتھ علاج کیا گیا۔ میڈیم اور سی ڈی پی کو ہر ٢ دن میں تبدیل کیا جاتا تھا۔ 7 دن کے بعد، خلیوں کو 4 فیصد پیرافارمالڈیہائیڈ کے ساتھ ٹھیک کیا گیا اور ٹی آر اے سی پی کی موجودگی کے لئے داغ دار کیا گیا۔ تین یا اس سے زیادہ مرکزے والے ٹی آر اے سی پی مثبت خلیات کے طور پر تعریف کیے جانے والے اوسٹیوکلاسٹس کی تعداد کو شمار کیا گیا اور ہلکے خوردبین کا استعمال کرتے ہوئے دستاویزی شکل دی گئی۔

2.7۔ خلیات کے پھیلاؤ کی پرکھ

بی ایم ایم (1 × 104 خلیات/کنویں) کو 96 کنویں کی پلیٹ میں بیج دیا گیا اور راتوں رات انکوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد خلیوں کا علاج 48 گھنٹہ کے عوض سی ڈی پی (0، 0.625، 1.25، 2.5، 5، 10، 20 اور 40 μg/ایم ایل) کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ سیل سنگم کا پتہ لگایا گیا اور انکوسائٹ زوم® (ایسن بائیو سائنس، این آربر، ایم آئی، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا، جو ایک طویل مدتی، حقیقی وقت کا متحرک لائیو سیل امیجنگ سسٹم ہے۔

2.8. ہائیڈروکسیاپیٹائٹ ریسورپشن پرکھ

بی ایم ایم (1 104 خلیات/کنویں) کو ہائیڈروکسیاپیٹائٹ کوٹیڈ پلیٹ میں بیج دیا گیا تھا، جس کا علاج سی ڈی پی کے ساتھ اشارہ کردہ ارتکاز (0، 5 اور 10 μg/ایم ایل) پر کیا گیا تھا، اور 25 این جی/ایم ایل ایم سی ایس ایف اور 50 این جی/ایم ایل آر این سی ایل پر مشتمل مکمل α ایم ای ایم میں ثقافت کی گئی تھی۔ 7 دن کے بعد خلیات کو خلیات کے اجزاء کو ہٹانے کے لئے 10 فیصد بلیچ محلول سے دھویا گیا۔ ہائیڈروکسیاپیٹائٹ ریسورپشن علاقوں کی تصاویر انکوسائٹ زوم® کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئیں اور امیج جے سافٹ ویئر (این آئی ایچ، بیتھیسڈا، ایم ڈی، امریکہ) (ابراموف، میگلہیس، اور رام، 2003) کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔

2.9. آر این اے تنہائی اور حقیقی وقت ریورس ٹرانسکرپشن-مقداری پی سی آر (آر ٹی کیو پی سی آر) تجزیہ

بی ایم ایم (1 105 خلیات/کنویں) کو 6 کنویں کی پلیٹ میں بیج دیا گیا اور 5 دن تک مختلف ارتکاز (0، 5 اور 10 μg/ایم ایل) پر سی ڈی پی کی موجودگی میں آر اے این سی ایل اور ایم سی ایس ایف کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی۔ کل آر این اے کو ٹی آر آئی زول ری ایجنٹ (سگما الڈرچ) کا استعمال کرتے ہوئے چوہوں کے خلیوں یا ہڈیوں کے ٹشو سے الگ تھلگ کردیا گیا تھا۔ ایک ریورس ٹرانسکرپٹس کٹ (ٹرانس جین بایوٹیک، بیجنگ، چین) کا استعمال کرتے ہوئے 2 μg کل آر این اے سے تکمیلی ڈی این اے کو سنتھیسائز کیا گیا تھا۔ آر ٹی کیو پی سی آر رد عمل پرفیکٹ اسٹارٹ™ گرین کیو پی سی آر سپر مکس (ٹرانس جین بایوٹیک) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا اور اے بی آئی 7500 سسٹم (اپلائیڈ) کے ذریعہ اس کا پتہ لگایا گیا تھا

بائیو سسٹمز، تھرمو فشر سائنٹفک، انک، والتھم، ایم اے، امریکہ). پی سی آر کے لئے سائیکلنگ پیرامیٹرز درج ذیل تھے: 95 ◦سی برائے 5 منٹ، اس کے بعد 15 کے لئے 95 ◦ سی کے 40 سائیکل اور 30 کے لئے 60 ◦ سی۔ استعمال ہونے والے مخصوص پرائمر ز ٹیبل 1 میں دکھائے گئے ہیں، اور ہر ٹارگٹ جین کی مقدار کو جی اے پی ڈی ایچ (اندرونی کنٹرول) میں معمول پر لایا گیا تھا۔

2.10۔ مغربی داغ تجزیہ

بی ایم ایم (5 105 خلیات/کنویں) کو 6 اچھی پلیٹ میں بیج دیا گیا تھا۔ مختصر وقت کے کورس تجربات کے لئے، خلیوں کو 1 ایچ کے لئے سی ڈی پی (0، 5، اور 10 μg/ایم ایل) کے مختلف ارتکاز کے ساتھ پہلے سے انکوبیٹ کیا گیا تھا، اور پھر 30 منٹ کے لئے 50 این جی/ایم ایل آر این کے ایل کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ ایک طویل عرصے کے کورس کے لئے، خلیات کو سی ڈی پی (0، 5، اور 10 μg/ایم ایل) کی موجودگی میں 3، 5 اور 7 دن میں 50 این جی/ایم ایل آر این سی ایل کے ساتھ متحرک کیا گیا تھا۔ آر آئی پی اے لائسس بفر (سی ڈبلیو بی آئی او) کا استعمال کرتے ہوئے کل پروٹین نکالے گئے تھے۔ پروٹین کو 10 فیصد ایس ڈی ایس پیج سے الگ کیا گیا اور پی وی ڈی ایف جھلیوں میں منتقل کیا گیا۔ جھلیوں کو 2 ایچ کے لئے کمرے کے درجہ حرارت پر 5 فیصد سکیم دودھ کے ساتھ بلاک کیا گیا تھا، پرائمری کے ساتھ انکوبیٹ کیا گیا تھا

اینٹی باڈیز راتوں رات 4 ◦ سی پر، اور پھر متعلقہ ثانوی کے ساتھ

اینٹی باڈیز برائے 1.5 ایچ. یہ جھلیاں ای سی ایل ری ایجنٹس (ملی پور کارپوریشن، بلیریکا، ایم اے، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کی گئیں اور تصاویر ٹینون 5200 کیمیلومائنسینس امیجنگ سسٹم (ٹینون سائنس اینڈ ٹیکنالوجی، شنگھائی، چین) کا استعمال کرتے ہوئے لی گئیں۔

سیستانچےہڈیوں کی کثافت کو بڑھا سکتا ہے

2.11. ایمیونوفلوریسنس ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے این ایف اے ٹی سی 1 ٹرانسلوکیشن کا پتہ لگانا

بی ایم ایم کو 12 کنویں کی کور سلپس پر سیڈ کیا گیا، آر اے این سی ایل اور ایم سی ایس ایف کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی اور 5 دن تک 10 μg/ایم ایل سی ڈی پی کے ساتھ علاج کیا گیا۔ خلیوں کو 15 منٹ کے لئے 4 فیصد پیرافارمالڈیہائیڈ کے ساتھ ٹھیک کیا گیا تھا، پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھویا گیا تھا، اور 10 منٹ کے لئے 0.1 فیصد ٹرائیٹن ایکس-100 کے ساتھ پرمیبیلائز کیا گیا تھا۔ خلیوں کو 10 فیصد بکری سیرم (سی ڈبلیو بی آئی او) کے ساتھ ملایا گیا تھا اور 2 ایچ کے لئے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، خلیوں کو راتوں رات 4 ◦ سی پر پرائمری اینٹی باڈی کے ساتھ اور پھر الیکسا فلور 488 بکری اینٹی ماؤس سیکنڈری اینٹی باڈی (ابکام، کیمبرج، ایم اے، امریکہ) کے ساتھ 1 ایچ کے لئے اندھیرے میں انکوبیٹ کیا گیا۔ کور سلپس کو پی بی ایس کے ساتھ دھویا گیا، 4′، 6-ڈیامڈینو-2-فینائل ان ڈول (ڈی اے پی آئی) (سولر) کے ساتھ طویل گولڈ اینٹی فیڈ ریایجنٹ میں نصب کیا گیا، اور

ایریسکین کونفوکل مائیکرواسکوپ (کارل زیس، اوبرکوچن، جرمنی) کے ساتھ زیس ایل ایس ایم 800 کا استعمال کرتے ہوئے معائنہ کیا۔

2.12. شماریاتی تجزیہ

تمام تجرباتی ڈیٹا کا تجزیہ ایس پی ایس ایس 25.0 شماریاتی سافٹ ویئر (آئی بی ایم کارپوریشن، آرمونک، این وائی، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ جانوروں اور خلیات کے مطالعے کے اعداد و شمار کا اظہار بالترتیب ایس ای ایم ± ذرائع اور ایس ڈی ± کے معنی کے طور پر کیا جاتا ہے۔ نتائج میں فرق یا طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کا یک طرفہ تجزیہ استعمال کیا جا رہا ہے۔ اقدار پی< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

سیستانچےکم کر سکتا ہےاپوپٹوسساور ہڈی کو بڑھاناکثافت