حصہ 1: Cistanche کے نچوڑ نئے اتپریورتی DJ-1-منتقلی نیوروبلاسٹوما سیلولر ماڈلز میں ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے ذریعے پیدا ہونے والی نیوروٹوکسیٹی کو بہتر بناتا ہے۔

رابطہ:joanna.jia@wecistanche.com

1. تعارف

اہم neurodegenerative بیماریوں میں شامل ہیںالزائمربیماری، پارکنسن کی بیماری (PD)، ہنٹنگٹن کی بیماری، اور دیگر۔ ان خرابیوں میں، PD کے واقعات کی شرح (پارکنسنز کی بیماری) دنیا میں دوسرے نمبر پر ہے اور 60 سال سے زیادہ عمر کے لوگوں میں 1 فیصد -2 فیصد حاصل کرتا ہے (برک اینڈ اومالی، 2013؛ ملارڈ، 2017؛ شین اینڈ جی، 2013)۔ PD کی اہم اعصابی خصوصیت کے طور پر، substantia nigra pars compacta میں dopaminergic نیوران ترقی پسند انحطاط پذیر ہیں (Glizer & MacDonald, 2016)، جو کہ Synuclein inclusions کی ظاہری شکل کے ساتھ ہے جسے Lewy Bodies (Zhang, Pu An, Zhang, Pu An,) کہا جاتا ہے۔ ، 2010)۔ PD کے روگجنن میں، آرام کے جھٹکے، سختی، بریڈیکنیزیا، اور کرنسی کی اسامانیتاوں کو کلینک میں PD کی اہم علامات کے طور پر تشخیص کیا جا رہا ہے۔ اگرچہ ڈوپیمینرجک نیورونز کے درست ترقی پسند انحطاطی میکانزم قابل فہم نہیں ہیں، یا تو ماحولیاتی وجوہات بشمول کیڑے مار ادویات، نیوروٹوکسک ایجنٹوں، اور بھاری دھاتوں کی نمائش، یا جینیاتی اسباب جیسے پارکن کے تغیرات (Kitada et al. ال. آج تک، DJ-1 جین کی تبدیلیوں کی وجہ سے غلط فہمی کی تبدیلیوں، فریم شفٹ میوٹیشنز، اور بڑے ٹکڑے کو حذف کرنے کی تعداد 10 سے تجاوز کر گئی ہے (Andres-Mateos et al.، 2007; Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003)۔ DJ-1 پروٹین کے اندر، Leucine166Proline (L166P) کا متبادل اہم ہے۔ اس کے علاوہ، یہ بھی دکھایا گیا ہے کہ آکسیڈیٹیو تناؤ PD میں پایا جاتا ہے (Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, & Sontakke, 2009) اور اس کے روگجنن میں ملوث ہے (Hague et al., 2003)۔

DJ-1 جین جس میں 24 kb سے زیادہ تقسیم شدہ آٹھ ایکسونز ہیں، انسانوں میں کروموسوم 1p36 پر پائے جاتے ہیں (Bonifati et al.، 2003)، اور 189 امینو ایسڈز پر مشتمل ایک انتہائی محفوظ پروٹین کو انکوڈ کرتا ہے۔ پروٹین کا تعلق ThiJ/PfpI خاندان سے تھا، ہوموڈیمر کی شکل میں موجود ہے۔ پرانتستا کے اندر گلیل خلیات اور سبسٹینٹیا نگرا اور سٹرائٹم ڈی جے-1 پروٹین کے علاقوں میں پائے جانے والے اہم ہیں (اولزمین ایٹ ال۔، 2007)۔ ان خلیوں میں، DJ-1 مندرجہ ذیل کردار ادا کرتا ہے، جیسے کہ oncogene (Nagakubo et al.، 1997)، نقلی ضابطہ (Kim et al.، 2005; Niki, Takahashi-Niki, Taira, Iguchi-Ariga, & Agria, 2003) )، اینٹی آکسیڈیٹیو تناؤ (طائرا ایٹ ال۔، 2004؛ زو اینڈ فریڈ، 2005)، چیپرون (شینڈیلمین، جوناسن، مارلینیٹ، لیٹی، اور ابیلیووچ، 2004؛ زو، زو، ویوسن، پیٹسکو، اور فنک، 2006)، اور پروٹیز (ابو سلیمان، ہیلی، کوئین، لیز، اور ووڈ، 2003)۔

نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کا علاج: سیستانچے کا عرق

Cistancheروایتی چینی طب ہے اور بنیادی طور پر عمر کے نیچے اینڈرولوجی بیماری کے علاج کے لیے استعمال ہوتی رہی ہے۔ کے اہم فعال اجزاءCistancheفینائل گلائکوسائیڈز ہیں جن میں 34 مرکبات شامل ہیں، جیسے کہ ایکٹیوسائیڈ، ایکناکوسائیڈ وغیرہ۔ کے فارماسولوجیکل اثراتCistanche ارکجنسی فعل کو بہتر بنانا، اینٹی ایجنگ، سیکھنے اور یادداشت کی صلاحیت میں اضافہ، نیورو پروٹیکشن، امیونو موڈولیشن، اینٹی تھکاوٹ، اینٹی اسکیمک، اور جگر کی حفاظت (Tu et al.، 2011) شامل ہیں۔ کیفیک ایسڈ Cistanche (یان، 2018) کے بڑے میٹابولائٹس میں سے ایک ہے۔

PD کے عام طور پر استعمال ہونے والے سیلولر ماڈلز میں 1-methyl-4-phenyl pyridinium ion-induced PC12 خلیات (Abou-Sleiman et al.، 2003) اور ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (H2O2)-حوصلہ افزائی نیوروبلاسٹوما (SHY5 سیلز) شامل ہیں۔ .، 2009)۔ تاہم، PD کی مخصوص پیتھولوجیکل خصوصیات ان ماڈلز میں موجود نہیں ہیں۔ PD کا زیادہ جسمانی لحاظ سے متعلقہ سیلولر ماڈل تیار کرنے کے لیے، اس مطالعہ میں ہم نے H2O2 حوصلہ افزائی L166P اور C106S DJ-1-منتقلی SH-SY5Y خلیات قائم کیے، اور اس کے اثرات کی چھان بین کی۔Cistanche ارکاور کلیدی بایو ایکٹیو مرکبات، بشمول ایکٹیوسائیڈ، ایکناکوسائیڈ، کیفیک ایسڈ، اورCistanche کل گلائکوسائیڈزان دو ماڈلز پر، پہلی بار۔

Cistanche اقتباس اینٹی neurodegenerative امراض

2. مواد اور طریقہ

2.1|پلازمیڈ، ادویات، کیمیکلز اور خلیات

FLAG-L166P DJ-1، FLAG-C106S DJ-1 پلاسمیڈز، اور اینٹی-DJ-1 پولی کلونل اینٹی باڈیز برائے مہربانی ڈاکٹر ہیرویوشی اریگا، گریجویٹ سکول آف فارماسیوٹیکل سائنسز، ہوکائیڈو یونیورسٹی نے فراہم کیں۔ پانی کی کمی سے کم ضروری میڈیم (MEM) اور F-12 میڈیم Gibco سے خریدے گئے تھے۔ Lipofectin Invitrogen سے تھا۔ FastDigest Xho I اور FastDigest EcoR I کا تعلق Fermentas سے تھا۔ اینڈوٹوکسین فری پلازمیڈ تیاری کٹ بائیوٹیک سے تھی۔ SH-SY5Y سیل لائن چینی اکیڈمی آف میڈیکل سائنسز کے سیل بینک سے تھی۔ بی سی اے پروٹین پرکھ ریجنٹ کٹ پیئرس سے تھی۔ پی وی ڈی ایف جھلی ملی پور سے تھیں۔ اینٹی فلیگ پولی کلونل اینٹی باڈی جین ٹیکس سے تھی۔Cistanche ارکبشمول ایکٹیوسائیڈ، ایچیناکوسائیڈ، کیفیک ایسڈ، اور سیستانچے ٹوٹل گلائکوسائیڈز، محکمہ قدرتی ادویات، سکول آف فارماسیوٹیکل سائنسز، پیکنگ یونیورسٹی کی طرف سے فراہم کیے گئے تھے۔

2.2|پلاسمیڈ پروردن، نکالنے، اور صاف کرنا

Escherichia coli JM109 خلیات کو LB مائع میڈیم میں OD600=0.5 تک کلچر کرنے کے بعد، کیلشیم کلورائد طریقہ استعمال کرتے ہوئے قابل خلیات تیار کیے گئے۔ اس کے بعد قابل ای کولی کو ہیٹ شاک کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے پلازمڈ ڈی این اے کے ساتھ تبدیل کیا گیا، جس کے بعد ٹرانسفارمینٹس کو 37 ڈگری پر 16-24 گھنٹے کے لیے ایمپسلن والی ایل بی پلیٹوں پر کلچر کیا گیا۔ اس کے بعد ایک کامیابی کے ساتھ تبدیل شدہ مونوکلونل کالونی کا انتخاب کیا گیا اور اسے LB مائع میڈیم میں کلچر کیا گیا جس میں 50 ug/mL ampicillin 37 ڈگری پر اضافی 12 گھنٹے کے لیے ہے۔ پلاسمیڈ کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق اینڈوٹوکسین فری پلازمیڈ تیاری کٹ کا استعمال کرتے ہوئے نکالا اور صاف کیا گیا۔

2.3|پلازمیڈ کی شناخت

نکالے گئے پلازمیڈ کو انزیمیٹک ہاضمے کا نشانہ بنایا گیا، جس کے بعد 1 فیصد ایگروز جیل الیکٹروفورسس کا استعمال کرتے ہوئے پلازمیڈ اور ہضم شدہ ٹکڑوں کی جانچ کی گئی۔ نتیجے میں جیل کو EB محلول میں کمرے کے درجہ حرارت پر 20–25 منٹ کے لیے داغ دیا گیا اور تصویر کھنچوائی گئی۔

2.4|SH-SY5Y خلیوں میں پلازمڈ کی منتقلی

پیوریفائیڈ پلاسمڈ ڈی این اے کو MEM/F-12 میڈیم میں کلچر شدہ SH-SY5Y خلیوں میں تبدیل کیا گیا تھا جس میں 10 فیصد فیٹل بووائن سیرم تھا۔ اس کے بعد منتقلی شدہ خلیوں کو 400 ug/mL G418 پر مشتمل میڈیم میں منتخب کیا گیا تھا، جس کے بعد 200 ug/mL G418 کو مستحکم طور پر منتقلی سیل لائن کو برقرار رکھنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

2.5|مغربی دھبے کے ذریعہ منتقلی خلیوں کی شناخت

منتقلی شدہ SH-SY5Y خلیوں کو RIPA بفر میں لیس کیا گیا تھا۔ لیسیٹ کے سینٹرفیوگریشن کے بعد، سپرنٹنٹ میں پروٹین کی کل تعداد کا تعین BCA پروٹین پرکھ ریجنٹ کٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ پروٹین کے عرق کی مساوی مقدار کو پھر 12.5 فیصد SDS-polyacrylamide جیل الیکٹروفورسس کا نشانہ بنایا گیا اور PVDF جھلی پر منتقل کیا گیا۔ پی وی ڈی ایف جھلی کو ٹی بی ایس ٹی محلول میں 5 فیصد نان فیٹ خشک دودھ کے ساتھ بلاک کیا گیا اور امیونو ڈیٹیکشن کے لیے کارروائی کی گئی۔ اینٹی FLAG اور اینٹی-DJ-1 کو بنیادی اینٹی باڈیز کے طور پر استعمال کیا گیا تھا، اور HRP-conjugated IgG ثانوی اینٹی باڈی تھی۔ ٹارگٹ پروٹینز کا پتہ لگانے کے لیے ایک بہتر کیمیلومینیسینس کا پتہ لگانے کا نظام لاگو کیا گیا تھا۔

2.6|منتقلی خلیوں کی امیونوسیٹو کیمیکل شناخت

منتقلی شدہ SH-SY5Y خلیات کو 4 فیصد پیرافارمیلڈہائڈ محلول کے ساتھ طے کیا گیا، 0.3 فیصد ٹریٹن X-100 محلول کے ساتھ پارمیبلائز کیا گیا، اور 10 فیصد بکرے کے سیرم کے ساتھ بلاک کیا گیا۔ اس کے بعد بلاک شدہ خلیوں کو پہلے اینٹی FLAG اور اینٹی-DJ-1 پولی کلونل اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا، اور پھر FITC- conjugated goat antirabbit سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ۔ سیل نیوکلی کو ہوچسٹ 33342 کے ساتھ داغ دیا گیا تھا، اور خلیوں کو الٹی فلوروسینس مائکروسکوپ (IX-71، اولمپس) کے تحت دیکھا گیا تھا۔

2.7|سیل وابستگی پرکھ

غیر منتقلی اور منتقلی شدہ SH-SY5Y خلیوں کو 96-ایکسٹریکٹس میں چڑھایا گیا تھا، بشمول ایکٹیوسائڈ، ایچیناکوسائڈ، کیفیک ایسڈ، اور سیستانچے کل گلائکوسائیڈز (تمام 10، 20، اور 40 ug/mL، بالترتیب)، شامل کیے گئے اور اضافی 1 گھنٹہ کے لئے 0.2 ایم ایم H2O2 کے ساتھ علاج سے پہلے خلیوں کو 6 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ میڈیم کو ضائع کر دیا گیا تھا، اور اوپر بیان کردہ MTT کا استعمال کرتے ہوئے سیل کی قابل عملیت کا اندازہ لگایا گیا تھا۔

2.8|سیل کی عملداری پر Cistanche ارک کے اثرات

ایکٹیوسائیڈ، ایچیناکوسائیڈ، کیفیک ایسڈ، اور سیستانچ کل گلائکوسائیڈز (تمام بالترتیب 10، 20، اور 40 ug/mL) سمیت عرقوں کو شامل کیا گیا اور 0.2 mM H2O2 کے ساتھ علاج سے پہلے خلیات کو 6 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اضافی 1 گھنٹے کے لیے۔ میڈیم کو ضائع کر دیا گیا تھا، اور اوپر بیان کردہ MTT کا استعمال کرتے ہوئے سیل کی قابل عملیت کا اندازہ لگایا گیا تھا۔

2.9|شماریاتی تجزیہ

ڈیٹا کو تین آزاد تجربوں کے اوسط ± SD کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ SPSS 22{1}} سافٹ ویئر کے ساتھ یکطرفہ ANOVA اور LSD طریقہ استعمال کرتے ہوئے گروپوں کے درمیان اختلافات کا تجزیہ کیا گیا۔ p < 0.05="" کی="" قدروں="" کو="" اہم="" سمجھا="" جاتا="">

Cistancheجڑی بوٹی

3|نتائج

3.1|پلازمیڈ کو کامیابی کے ساتھ تبدیل اور صاف کیا گیا۔ E. coli JM109 میں الگ الگ اظہار کے بعد، ایک پابندی والے انزائم (شکل 1) کے ساتھ عمل انہضام کے بعد 1 فیصد ایگروز جیل الیکٹروفورسس کا استعمال کرتے ہوئے پلازمیڈ کو نکالا اور جانچا گیا۔ 6.2-kb پلازمیڈز کو 5.4-اور 0.8-kb لکیری DNA کے ٹکڑوں میں تقسیم کیا گیا تھا، جس نے اس بات کی تصدیق کی کہ L166P اور C106S DJ-1 پلازمیڈ دونوں کامیابی کے ساتھ اظہار اور پاک ہو گئے تھے۔

3.2|مغربی بلوٹنگ کے ذریعہ منتقلی خلیوں کی شناخت۔ جیسا کہ شکل 2 میں دکھایا گیا ہے، ہم نے تقریباً 70 kDa پر FLAG-L166P DJ-1 اور FLAG-C106S DJ-1 بینڈ کا پتہ لگایا۔ منتقلی شدہ SH-SY5Y خلیوں میں FLAG-ٹیگ شدہ پروٹین کی اعلی سطح اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ L166P اور C106S DJ-1 اتپریورتیوں کا ان کے متعلقہ ٹرانسفیکٹینٹس میں سختی سے اظہار کیا گیا تھا۔

3.3|منتقلی خلیوں کی امیونوسیٹو کیمیکل شناخت۔ یہ اینٹی-DJ-1 یا اینٹی FLAG اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیشن کے بعد منتقلی SH-SY5Y خلیوں سے مضبوط فلوروسینٹ سگنل دکھاتا ہے۔ یہ L166P اور C106S DJ-1 کی اعلی سطح کی تصدیق کرتا ہے جس کا اظہار ٹرانسفیکٹنٹس میں ہوتا ہے۔

3.4|منتقلی شدہ خلیات غیر منتقلی خلیوں کے مقابلے H2O2 کے لیے زیادہ حساس تھے۔ H2O2 (0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0} کی درجہ بندی کی موجودگی میں 1 گھنٹے تک انکیوبیشن کے بعد }.5، اور 1 ایم ایم، بالترتیب)، L166P یا C106S DJ-1 کے ساتھ منتقلی شدہ SH-SY5Y خلیوں کی قابل عملیت کو غیر منتقلی خلیوں کے مقابلے خوراک پر منحصر طور پر کم کیا گیا تھا۔

3.5|Cistanche کے نچوڑوں نے H2O2 کی حوصلہ افزائی میں کمی کو روکا SH-SY5Y سیل وابستگی کی خوراک پر انحصار کے ساتھ علاج سے روکا گیاCistanche ارکبشمول ایکٹیوسائیڈ، ایچیناکوسائیڈ، کیفیک ایسڈ، اور سیستانچے کل گلائکوسائیڈز (تمام بالترتیب 10، 20، اور 40 ug/mL)۔

Cistanche