حصہ 1 Echinacoside چوہے کے دماغی اعصاب کے ٹرمینلز میں وولٹیج پر منحصر Ca2 پلس انٹری اور پروٹین کناز سی کو دبا کر گلوٹامیٹ کے اخراج کو روکتا ہے۔

چینگ وی لو 1,2، زو یو لن 1,2، شو کیوئی ہوانگ 1 اور سو جین وانگ 3،*

1 ڈپارٹمنٹ آف اینستھیسیولوجی، فار ایسٹرن میموریل ہسپتال، پین چیاؤ ڈسٹرکٹ، نیو تائی پے سٹی 22060، تائیوان؛ drluchengwei@gmail.com (CWL)؛ drlin1971@gmail.com (TYL);nskh9450n@yahoo.com.tw (SKH)

2 شعبہ مکینیکل انجینئرنگ، یوآن زی یونیورسٹی، تاؤیوان 32003، تائیوان

3 سکول آف میڈیسن، فو جین کیتھولک یونیورسٹی، نمبر 510، Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Taiwan.

خلاصہ:گلوٹومیٹرجک نظام نیوروپروٹیکنٹ علاج کے اثرات میں شامل ہوسکتا ہے۔ Echinacoside، ایک phenylethanoid glycoside دواؤں کی چینی جڑی بوٹیوں سے نکالا جاتا ہےہربا سیستانچے،neuroprotective اثرات ہیں. اس مطالعہ نے چوہے کے دماغی اعصاب کے ٹرمینلز (Synaptosomes) میں 4-امینوپائریڈائن سے پیدا ہونے والے گلوٹامیٹ کے اخراج پر ایچیناکوسائیڈ کے اثرات کی تحقیقات کی۔ Echinacoside inhibited Ca^{2 پلس}- منحصر، لیکن Ca نہیں^{2 پلس}-آزاد، 4-امینوپیرائڈائن سے پیدا ہونے والا گلوٹامیٹ ارتکاز پر منحصر انداز میں رہا کرتا ہے۔ Echinacoside نے سائٹوپلاسمک فری Ca میں 4-امینوپیریڈین سے پیدا ہونے والے اضافے کو بھی کم کیا^{2 پلس}ارتکاز لیکن Synaptosomal جھلی کی صلاحیت کو تبدیل نہیں کیا۔ امائنوپائرائڈائن سے پیدا شدہ گلوٹامیٹ ریلیز 4- پر ایچیناکوسائیڈ کے روکنے والے اثر کو cu-conotoxin MVIIC، Cav2.2 (N-type) اور Cav2.1 (P/Q-type) چینلز کے وسیع اسپیکٹرم بلاکر کے ذریعے روکا گیا تھا۔ ، لیکن انٹرا سیلولر Ca سے غیر حساس تھا۔^{2 پلس}ریلیز روکنے والے ڈینٹرولین اور 7-کلورو-5-(2-کلوروفینائل)-1،5-ڈائی ہائیڈرو-4،1-بینزوڈیازپائن{{ 8}}(3H)-one (CGP37157)۔ مزید برآں، echinacoside نے پروٹین kinase C کے 4-امینوپیریڈین سے حوصلہ افزائی شدہ فاسفوریلیشن کو کم کیا، اور پروٹین کناز سی انحیبیٹرز نے گلوٹامیٹ کے اخراج پر ایچیناکوسائڈ کے اثر کو ختم کردیا۔ ان نتائج کے مطابق، ہم تجویز کرتے ہیں کہ پیدا شدہ گلوٹامیٹ کی رہائی پر echinacoside کا روکنے والا اثر کم وولٹیج پر منحصر Ca سے وابستہ ہے۔^{2 پلس}پروٹین کناز سی کی سرگرمی کا اندراج اور اس کے نتیجے میں دبانا۔

مطلوبہ الفاظ:echinacoside گلوٹامیٹ کی رہائی؛ cerebrocortical اعصابی ٹرمینلز؛ وولٹیج پر منحصر Ca²پلس چینلز؛ پارکنسنز کی بیماری، الزائمر کی بیماری، اور درمیانی دماغی شریانوں کا پروٹین کناز سی[9-12]. تاہم، وہ طریقہ کار جس کے ذریعے echinacoside نیورو پروٹیکشن کو آمادہ کرتا ہے پوری طرح سے سمجھ میں نہیں آیا۔

مزید معلومات کے لیے رابطہ کریں:Joanna.jia@wecistanche.com

Echinacosidecistanche میں بہت سے افعال ہیں

1. تعارف

Echinacosideمیں موجود ایک اہم phenylethanoid glycoside ہے۔Herba Cistanche، ایک معروف روایتی چینی طب جو بھولپن، نامردی اور دائمی قبض کے علاج کے لیے استعمال ہوتی ہے [1]۔Echinacosideمختلف بایو ایکٹیویٹیز جیسے اینٹی آکسیڈیشن، اینٹی سوزش، اینٹی کینسر، ہیپاٹو پروٹیکشن، اور مدافعتی ماڈیولیشن [2–4]۔ خاص طور پر،echinacosideنیورو پروٹیکٹو اثرات ہیں؛ مثال کے طور پر، یہ پرائمری چوہا کارٹیکل نیوران، انسانی نیوروبلاسٹوما SH-SY5Y خلیات، اور فیوکروموسیٹوما (PC12) خلیات [5–8] میں آکسیڈیٹیو تناؤ- یا نیوروٹوکسن سے متاثرہ نیوروٹوکسیٹی سے حفاظت کر سکتا ہے۔ مزید برآں،echinacosideدماغی نقصان کو کم کرتا ہے اور پارکنسنز کی بیماری، الزائمر کی بیماری، اور درمیانی دماغی شریانوں کی روک تھام [9–12] کے جانوروں کے ماڈلز میں علمی فعل کو بہتر بناتا ہے۔ تاہم، جس طریقہ کار کے ذریعےechinacosideنیورو پروٹیکشن کو آمادہ کرتا ہے پوری طرح سے سمجھا نہیں جاتا ہے۔

نیورو پروٹیکشن زہریلے توہین پر نیورونل ڈھانچے اور کام کو محفوظ رکھنے کا ایک پیچیدہ عمل ہے۔ Glutamate excitotoxicity میں کمی کو دماغی نیورو پروٹیکشن میں شامل ایک ممکنہ طریقہ کار سمجھا جاتا ہے۔ گلوٹامیٹ، ایک حوصلہ افزا امینو ایسڈ نیورو ٹرانسمیٹر، دماغ کے کئی افعال میں ایک اہم کردار رکھتا ہے [13]۔ تاہم، اعلی گلوٹامیٹ ارتکاز کے تحت گلوٹامیٹ ریسیپٹرز کی اوور ایکٹیویشن انٹرا سیلولر Ca2 پلس اوورلوڈ، مائٹوکونڈریل dysfunction، آزاد بنیاد پرست پیداوار، اور نیورونل موت [14,15] کا سبب بنتی ہے۔ یہ پیتھولوجیکل عمل دماغی اسکیمیا، تکلیف دہ دماغی چوٹ، مرگی، اور نیوروڈیجینریٹو بیماری [16,17] سمیت دماغ کے متعدد عوارض میں ملوث ہے۔ لہذا، پیتھوفزیولوجیکل گلوٹامیٹرجک ٹرانسمیشن کو روکنے والے روکنے والے ممکنہ نیورو پروٹیکٹو دوائیں سمجھے جاتے ہیں۔ ان کی قابل ذکر مثالیں گلوٹامیٹ ریسیپٹر مخالف ہیں [18,19]؛ تاہم، ان ادویات کے کلینیکل ٹرائلز کم تاثیر اور ناپسندیدہ، یا یہاں تک کہ سائٹوٹوکسک ضمنی اثرات [20,21] کی وجہ سے ناکام رہے ہیں۔ براہ راست گلوٹامیٹ ریسیپٹر ناکہ بندی کے علاوہ، گلوٹامیٹ کی رہائی کی روک تھام نیورو پروٹیکشن کے لئے ایک مؤثر حکمت عملی ہوسکتی ہے۔ کئی نیورو پروٹیکٹینٹس (مثال کے طور پر، میمینٹائن اور ریلوزول) چوہے کے دماغ کے بافتوں میں گلوٹامیٹ کے اخراج کو کم کر سکتے ہیں [22-24]۔

excitotoxicity اور neuroprotective پروفائل میں گلوٹامیٹ کے کردار پر غور کرناechinacoside، موجودہ مطالعے میں چوہے کے دماغی پرانتستا سے پاک ہونے والے الگ تھلگ اعصابی ٹرمینلز (Synaptosomes) کا استعمال کیا گیا ہے۔echinacosideگلوٹامیٹ کی رہائی اور مزید دریافت شدہ ممکنہ میکانزم پر۔ الگ تھلگ اعصابی ٹرمینل کی تیاری کسی بھی پوسٹ سینیپٹک اثرات کی غیر موجودگی میں منشیات کے ذریعہ نیورو ٹرانسمیٹر کی رہائی کے presynaptic ریگولیشن کا مطالعہ کرنے کے لئے ایک اچھی طرح سے قائم کردہ ماڈل ہے [25]۔ اس ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے کے اثر کا اندازہ کیاechinacosideگلوٹامیٹ کی رہائی پر، جھلی کی صلاحیت، presynaptic Ca2 پلس آمد، اور پروٹین کناز سی سرگرمی۔ لٹریچر کے ہمارے جائزے کے مطابق، یہ پہلی رپورٹ ہے جس کے ذریعے میکانزم کی دستاویز کی گئی ہے۔echinacosidepresynaptic سطح پر اینڈوجینس گلوٹامیٹ کی رہائی کو روکتا ہے۔

Echinacoside مخالف آکسیکرن کر سکتے ہیں

2. نتائج

2.1. EchinacosideVesicular Exocytosis کو کم کرکے Rat Cerebrocortical Nerve Terminals سے Aminopyridine-Evoked Glutamate کے اخراج کو روکتا ہے 4-

شکل 1 کے ارتکاز پر منحصر اثر کو واضح کرتا ہے۔echinacoside{{0}} پر پیوریفائیڈ چوہوں کے سیریبروکارٹیکل سینیپٹوسومس سے امینوپائریڈائن سے پیدا شدہ گلوٹامیٹ کا اخراج۔ 1 mM CaCl2 کے ساتھ انکیوبیٹڈ Synaptosomes میں، 1 mM 4-امینوپیرائڈائن نے 7.4 ˘ 0.1 nmol/mg/5 منٹ کی گلوٹامیٹ ریلیز کو جنم دیا، جس میں 1, 5, 10, 30, اور 50 µM کی کمی واقع ہوئی تھی۔echinacosideسے 6.5 ˘ 0.2، 5.8 ˘ 0.3، 4.8 ˘ {{10}}.2، 4.1 ˘ 0.1، یا 2.3 ˘ 0.4 nmol/mg/5 منٹ، بالترتیب (F(5,24)=67.1، p=0۔{26}})۔ کے لیے IC50 قدرechinacosideثالثی کی روک تھام 4-امینوپیریڈائن سے پیدا شدہ گلوٹامیٹ ریلیز، جو خوراک کے جواب کے منحنی خطوط سے ماخوذ ہے، 24 µM تھی۔ مزید برآں، گلوٹامیٹ کی رہائی 1 mM 4-امینوپائریڈائن کے ذریعے ایک خلوی Ca2 پلس فری محلول میں ہوتی ہے جس میں 300 µM ایتھیلین گلائکول bis(-aminoethyl ether)-N,N,N1,N{{ 13}}ٹیٹراسیٹک ایسڈ (EGTA) تھا 2.1 ˘ 0.2 nmol/mg/5 منٹ (F(2,12)=310.65, p=0.000)، اور یہ Ca2 4-امینوپیریڈین سے پیدا ہونے والے گلوٹامیٹ کی رہائی کے علاوہ آزاد جزو 20 µM سے متاثر نہیں ہوا تھا۔echinacoside(1.8 ˘ 0.2 nmol/mg/5 منٹ؛ p=0.58؛ شکل 1)۔ Synaptosomes میں 0.1 µM bafifilomycin A1 کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے، ایک vesicular ٹرانسپورٹر روکنے والا [26]، 4-aminopyridine-evoked glutamate کی رہائی کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا (2.2 ˘ 0.2 nmol/mg/ 5 منٹ؛ F (2,12)=249.518، p=0۔{24}})۔ bafifilomycin A1 کی موجودگی میں، 20 µM echinacoside گلوٹامیٹ (2.1 ˘ 0.2 nmol/mg/5 منٹ; p=0.94; شکل 1)۔ اس کے برعکس، 10 µM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA، ایک گلوٹامیٹ ری اپٹیک روکنے والا) [27]، 4-امینوپیرائڈائن سے پیدا ہونے والے گلوٹامیٹ کی رہائی کو 11.8 ˘ 0.4 nmol/min/m تک بڑھا دیا گیا t(8)=´11.31، p=0۔{54}})۔ یہاں تک کہ DL-TBOA کی موجودگی میں، 20 µMechinacosideروکا ہوا {{0}}امینوپائرڈائن سے پیدا شدہ گلوٹامیٹ ریلیز نمایاں طور پر (7.7 ˘ 0.2 nmol/mg/5 منٹ؛ F(2,12)=87.23, p=0۔{{ 12}}؛ شکل 1)

2.2. Echinacosideسائٹوسولک Ca کو کم کرتا ہے۔²پلسارتکاز لیکن Synaptosomal کو تبدیل نہیں کرتا ہے۔

میم برین پوٹینشل

Synaptosome depolarization کی وجہ سے 1 mM 4- aminopyridine Ca میں اضافہ ہوا²علاوہ حراستی(p= 0۔{1}}; جدول 1)۔ 20 |vM کا اطلاقechinacosideنمایاں طور پر baral Ca کو متاثر نہیں کیا۔²جمع ارتکاز (t(8) = 0.06, p= 0.95) لیکن نمایاں طور پر کم کر دیا 4-امینوپیریڈین کی حوصلہ افزائی میں اضافہ iia Ca²جمع ارتکاز (t(10) = 6.16, p =0۔{1}})۔ اس کے علاوہ، 1 ایم ایم 4-امینوپیرائڈائن 3',3',3'-ڈائپروپلتھیاڈی کاربوسائنائن آئوڈائڈ [DiSC میں اضافہ ہوا₃(5)] فلوروسینس (p= 0۔{1}})۔ اضافہ o⁽20 fdM echinacoside نے آرام کرنے والی جھلی کی صلاحیت کو تبدیل نہیں کیا (t(8)=0.976،p= 0.36) یا ڈی ایس سی میں 4-امینوپیریڈین کی ثالثی میں اضافہ کو نمایاں طور پر تبدیل کریں₃(5) فلوروسینس (t(8) = —0.014, p= 0.99; جدول 1)۔

Cistancheechinacosideگردے کی بیماری کا علاج کر سکتے ہیں

2.3. کم شدہ- CO2 پلسCav2.2 (N-Type) اور Cav2.1 (P/Q-Type) چینلز کے ذریعے آمد کو 4-Aminopyridine-Evoked Glutamate کی رہائی کی روک تھام سے منسلک کیا جا سکتا ہےEchinacoside

اعداد و شمار 2 ظاہر کرتا ہے کہ 2 cu-conotoxin MVIIC، ایک N-اور P/Q-type Ca²پلس چینل بلاکر،

7.4 土 0.2 سے 2۔{8}} 土 0.1 nmol/mg/5 منٹ (t(9) = 25.35, p{{0}}۔{1}})۔ cu-conotoxin MVIIC کی موجودگی میں، 20 pM echinacoside کا اثر 4- aminopyridine-evoked glutamate کے اخراج پر غیر اہم تھا (1.8 土 0.2 nmol/mg/5 منٹ;t(8) = 1.06, p= 0.32)۔ ڈینٹرولین (10 ^M)، انٹرا سیلولر Ca کا ایک روکنے والا²پلس جاری کروم دی اینڈوپلاسمک ریٹیکولم [28]، کم کیا گیا 4-امینوپیریڈین سے پیدا شدہ گلوٹامیٹ ریلیز (5.6 土 0.3 nmol/mg/5 منٹ؛ F(2,14)=104۔ 95،p= 0۔{1}})۔ تاہم، ڈینٹرولین کی موجودگی میں، 20 پی جے ایمechinacosideاب بھی گلوٹامیٹ کے اخراج کو نمایاں طور پر روک سکتا ہے (3.3 土 0.2 nmol/mg/5 منٹ؛p= 0۔{1}})۔ اسی طرح کے نتائج 100 pM 7-chloro-5-(2-chloropheny)-1,5-dihydro-4,1-benzothiazepin کا ​​استعمال کرتے ہوئے دیکھے گئے -2(3H)-one (CGP37157)، مائٹوکونڈریل نا کا ایک جھلی-پرمیاوی بلاکر^پلس/ca²علاوہ تبادلہ. پانچ معائنہ شدہ synaptosomal تیاریوں میں، 20 pMechinacoside100 pM CGP37157 کے ساتھ مل کر 4-امینوپیرائڈائن سے پیدا ہونے والی گلوٹامیٹ ریلیز میں 48.3 فیصد 土 5.2 فیصد (F(2,13) ​​= 136.79،p= 7۔{1}})، اکیلے ایکناکوسائیڈ کی طرف سے روک تھام کی طرح (46.2 فیصد 土 2.3 فیصد ;p = 0.89;

2.4. Echinacosideروکتا ہے 4-Aminopyridine-Evoked (Protein Kinase C کے ذریعے سگنلنگ کے ذریعے گلوٹامیٹ کی رہائی

جیسا کہ شکل 3 میں دکھایا گیا ہے، 10 ڈگری jlM 2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) maleimide (GF109203X)، ایک جنر ال پروٹین کناز سی انحیبیٹر [29]، reduc ed 4-aminopyridine-evoked glutamate release (F(2,13) ​​= 19.46, p=0 {17}})۔ GF109203X-علاج شدہ synaptosomes میں، 20 pM echinacoside نے 4-aminopyridine-evoked glutamate کے اجراء میں صرف 5.5 فیصد 土 1.8 فیصد (p=0.89) کی کمی کی، اکیلے echinacoside سے اس سے کم (42.4 فیصد 土4) فیصد؛ p=f000)۔ اسی طرح کے نتائج 5,6,7،13-ٹیٹراہائیڈرو-13-میتھائل-5-آکسو-12ایچ-انڈولو[2،3-a]پائرولو[3 کے ساتھ حاصل کیے گئے تھے۔ ,4-c]carbazole-12-propanenitrile (Go6976), Ca2 پلس پر منحصر پروٹین کناز C isoforms (a, |3I, |3II, y) [29] کے لیے ایک سلیکٹیو۔ 3 pM Go6976 کی موجودگی میں، 20 pMechinacosideگلوٹامیٹ کی رہائی میں 11.9 فیصد 土 2.9 فیصد (p=0.59) کی کمی، جو کہ اکیناکوسائیڈ (42.4 فیصد 土 2.3 فیصد؛ p=0 کے مقابلے میں نمایاں کمی کی نشاندہی کرتی ہے۔ تصویر 3)۔ اس کے برعکس، 3 پی ایم روٹلرین، ایک Ca2 پلس آزاد پروٹین کناز C6 روکنے والا [30]، نمایاں طور پر 4-امینوپیرائڈائن (1 ایم ایم) سے پیدا شدہ گلوٹامیٹ ریلیز (p=0.45) کو تبدیل نہیں کرتا ہے۔ بہر حال، روٹلرین کی موجودگی میں، 20 pM echinacoside مؤثر طریقے سے 37.1 فیصد 土 5.6 فیصد ریلیز (F(2,13) ​​= 19.72, p=0 کی اوسط روک تھام کا سبب بنی۔ }})، اسی طرح اکیناکوسائیڈ کے ذریعے (p=0.41؛ شکل 3)۔ اس کے علاوہ، mitogen-activated protein kinase inhibitor 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one) (PD98059 ) (50 pM) اور پروٹین کناز A inhibitor N-[2-(p-bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide (H89) (100 pM) نے کم کر دیا 4-امینوپیریڈین سے پیدا شدہ گلوٹامیٹ ریلیز (p=0۔{55}})۔ PD98059 یا H89 کی موجودگی میں بھی، 20 pMechinacosideریلیز کو مؤثر طریقے سے کم کیا (F(2,13) ​​= 52.3، p=0۔{5}}؛ شکل 3)۔

شکل 4 سے پتہ چلتا ہے کہ tha11 mM 4-امینوپائرڈائن نے synaptosomes میں پروٹین کناز C کے فاسفوریلیشن میں اضافہ کیا (t(4) = —6.871, p= 0.002)۔ جب Synaptosomes کو 20 pM echinacoside کے ساتھ 4-aminopyridine کے اضافے سے پہلے 10 منٹ کے لیے پہلے سے علاج کیا گیا تھا، 4-امینوپائریڈائن انڈسڈ فاسفوریلیشن پروٹین کناز سی میں کافی حد تک کمی آئی (F(2)_a6) = 29.202, p = 0.00 1).

Echinacosideمیںcistancheکو بڑھا سکتا ہے۔قوت مدافعت

2.5. Echinacoside- گلوٹامیٹ کی رہائی کی ثالثی روکنا گاما-امینوبٹیرک ایسڈ کی قسم A (جی اے بی) کو شامل نہیں کرتا ہے۔³A_A) رسیپٹر

شکل 5 میں، SR95531 (GABA کا مخالف_Aریسیپٹر) کا موازنہ کیا گیا۔ اس کے علاوہ، 100 pM SR95531 نے نمایاں طور پر 4-امینوپیریڈین (1 ایم ایم) سے پیدا ہونے والی گلوٹامیٹ ریلیز کو تبدیل نہیں کیا۔ میں

SR95531- کا علاج کیا گیا synaptosomes، 20 pM echinacoside کے اطلاق کے نتیجے میں 4- aminopyridine-evoked glutamate کی رہائی (F(2,12)=42.63 پر 43 فیصد روکنا،p= 0۔{1}})، جو کہ اکیناکوسائیڈ (40 فیصد ;p= 0۔{1}})۔ اسی طرح کا نتیجہ ایک اور GABAa ریسیپٹر مخالف، بائیوکولائن (50 پی ایم) کے ساتھ حاصل کیا گیا تھا۔ رہائی bicuculine کی موجودگی میں ماپا اور