حصہ 1: انٹیگریٹڈ نیٹ ورک فارماکولوجی اور زیبرا فش ماڈل آسٹیوپوروسس اور الزائمر کی بیماری دونوں کے علاج کے لیے Cistanche Tubulosa کے دوہری اثرات کے اجزاء کی تحقیقات کے لیے

رابطہ:joanna.jia@wecistanche.com/ واٹس ایپ: 008618081934791

Ying-Qi Li 1، Yi Chen 1، Jia-Yi Fang 1، Si-Qi Jiang 1، Ping Li 1، * اور Fei Li 1، 2، *

خلاصہ

ایتھنوفارماکولوجیکل مطابقت:آسٹیوپوروسس (OP) اور الزائمر کی بیماری (AD) عام جراثیمی بیماریاں ہیں، اور بہت سے مطالعات ان کے روگجنن کے تعلق کی نشاندہی کرتے ہیں۔ Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) ایک وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والی روایتی چینی دوا ہے اور بالترتیب OP اور AD کے علاج کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال کی گئی ہے۔ تاہم، بیک وقت اور بنیادی میکانزم دونوں سمورتی بیماریوں کے لیے فعال اجزاء محدود ہیں۔

مطالعہ کا مقصد:اس کام کا مقصد CT میں دوہری اثرات والے مرکبات تلاش کرنے کے لیے ایک موثر اور قابل اعتماد نیٹ ورک اسکریننگ کا طریقہ قائم کرنا ہے جو بیک وقت AD اور OP کی حفاظت کر سکے۔ اور یہ مالیکیولر میکانزم پر OP اور AD کے درمیان رابطے کے نئے تناظر فراہم کرے گا۔

مواد اور طریقے:نیٹ ورک فارماسولوجی کی سطح پر ایک سے زیادہ ڈیٹا بیس اور وسیع تجزیہ کو مربوط کرکے CT کے دوہری اثرات کا منظم طریقے سے تجزیہ کیا گیا۔ مختلف قسم کے مرکبات کے درمیان اثرات میں فرق کو ظاہر کرنے کے لیے ایک درجہ بند منشیات کے ہدف کے تعامل کا نیٹ ورک بنایا گیا تھا۔ اس نیٹ ورک کی تاثیر کو ثابت کرنے کے لیے، کچھ مرکبات کا انتخاب کیا گیا تھا تاکہ ٹوپولوجیکل پیرامیٹرز کے مطابق زیبرا فش کے پری-انڈسڈ OP ماڈل اور AlCl3-حوصلہ افزائی AD ماڈل میں تصدیق کی جا سکے۔

مطلوبہ الفاظ:نیٹ ورک فارماکولوجی؛ آسٹیوپوروسس؛ایک دماغی مرض کا نام ہے; Cistanche tubulosa؛ زیبرا فش۔

Cistanche میں الزائمر مخالف فعل ہے۔

1. تعارف

آبادی کے عمر رسیدہ رجحان کے نتیجے میں آسٹیوپوروسس (OP) اور الزائمر کی بیماری (AD) کے بڑھتے ہوئے پھیلاؤ میں سالوں میں اضافہ ہوتا ہے (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018)۔ آج کل OP اور AD دونوں کو صحت عامہ کے لیے بڑے خطرات کے طور پر تسلیم کیا گیا ہے کیونکہ وہ علامات کے بغیر ترقی کر سکتے ہیں اور بہت بڑا سماجی بوجھ لا سکتے ہیں (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018)۔ عمر سے متعلقہ بیماریوں کے طور پر، وہ اکثر کلینیکل پریکٹس میں ایک اعلیٰ معذوری اور اموات کی شرح (Dengler-Crish and Elefteriou, 2019) کے ساتھ ساتھ ہوتے دیکھے جاتے ہیں۔ او پی ایک سیسٹیمیٹک کنکال کی بیماری ہے جس کی خصوصیت ہڈیوں کے کم ماس اور ہڈیوں کے بافتوں کے خراب مائیکرو آرکیٹیکچر سے ہوتی ہے، جس میں ہڈیوں کی نزاکت میں اضافہ اور فریکچر کا خطرہ بڑھ جاتا ہے (ریزولی، 2018)۔ AD دماغ کا سب سے عام انحطاط ہے جس کی خصوصیت یادداشت اور دیگر علمی افعال کے بڑھتے ہوئے نقصان سے ہوتی ہے (Bondi et al., 2017)۔ اب تک، ان کے پیچیدہ ایٹولوجی اور روگجنن کی دو بیماریوں کو روکنے یا علاج کرنے کے لئے ابھی تک کوئی کافی طاقتور اختیارات نہیں ہیں. اور سب سے بری بات یہ ہے کہ مریض کو اکثر ضمنی اثرات ہوتے ہیں (براؤن، 2017؛ ہوانگ اور مکی، 2012)۔

سنڈروم تفریق (Sucher، 2013) کی نظریاتی بنیاد پر، روایتی چینی ادویات (TCMs) ایک سے زیادہ اجزاء کے ساتھ ایک سے زیادہ پیتھو فزیولوجیکل میکانزم کو نشانہ بناتے ہیں کچھ واقف پیچیدہ بیماریوں کے علاج میں منفرد برتری رکھتے ہیں۔ گردے کی ٹانک جڑی بوٹی کے طور پر، Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) کو روایتی چینی معالجین (Fu et al. اس کی روایتی افادیت کے علاوہ، کافی تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ اس میں مختلف فارماسولوجیکل سرگرمیاں ہیں، جیسے علمی اور طرز عمل کے خسارے کو دور کرنا (وُو ایٹ ال۔، 2014)، اینٹی سوزش (فو ایٹ ال۔، 2018)، ہڈیوں کی تشکیل کو فروغ دینا، اور ہڈی کو دبانا۔ ریسورپشن (Li et al.، 2013؛ Li et al.، 2012)، نیز اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی (Zhang et al.، 2016)۔ لیکن اس کے فعال اجزاء اور میٹابولک عمل کی پیچیدگی نے انسانی بافتوں میں اہداف کو تلاش کرنے اور عمل کے طریقہ کار کی وضاحت دونوں میں مشکلات پیدا کیں۔

سب سے بڑھ کر، OP/AD کے علاج کے اہداف کی ایک قابل اعتماد بحث ضروری ہے۔ خاص طور پر TCMs میں "مختلف بیماریوں کے لیے ایک ہی علاج" کی سوچ، اور "کثیر اجزاء علاج، حیاتیاتی نیٹ ورک" نیٹ ورک فارماکولوجی کے طریقہ کار کی بنیاد پر، دونوں بیماریوں کے درمیان اہم مشترکہ اہداف تلاش کرنے کی کوششیں خاص طور پر عملی ہو سکتی ہیں۔ OP اور AD کی روک تھام اور کنٹرول کے لیے رہنمائی فراہم کرنے کا مطلب۔ زیبرا فش میں ممالیہ جانوروں اور انسانوں کے لیے انتہائی ہم جنس جینز میں ان کے کنکال کی فزیالوجی میں مضبوط مماثلت ہے۔ یہ OP اور AD تحقیق کے لیے vivo میں جانوروں کا ایک دستیاب اور پرکشش ماڈل ہے (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014)۔ اس طرح، اس نیٹ ورک فارماکولوجی ریسرچ کا مقصد CT کے دوہری اثرات کے فعال اجزاء کی اسکریننگ کرنا، OP اور AD کے مشترکہ ممکنہ اہداف کو تلاش کرنا، اور ساتھ ہی ساتھ دو بیماریوں کے علاج کے لیے CT کے استعمال کے امکان کو بے نقاب کرنا تھا۔ اس مطالعہ میں، سی ٹی ایکٹو اجزاء، جینومز، اور OP اور AD کے پروٹومکس کی معلومات کو بالترتیب مختلف ڈیٹا بیس سے اکٹھا کیا گیا تاکہ ایک انٹرایکٹو نیٹ ورک قائم کیا جا سکے، اور OP اور AD کے علاج کے لیے CT کے ہم آہنگی کے طریقہ کار کو دریافت کرنے کے لیے افزودگی کا تجزیہ بنایا گیا۔ . مزید برآں، ہم نے بالترتیب OP اور AD زیبرا فش ماڈلز کی حوصلہ افزائی کی، اور نیٹ ورک میں کلیدی مرکبات کو پکڑا تاکہ ان کی افادیت اور دو بیماریوں کے اہداف کی تصدیق کی جا سکے۔

Cistanche sclerotin کی ترقی کو فروغ دیتا ہے.

2. مواد اور طریقہ

2.1 ریجنٹس

جینسٹین (GE)، quercetin (QU)، ابیٹک ایسڈ (AA)، -sitosterol (BSS) (پاکیزگی 98 فیصد سے زیادہ یا اس کے برابر) کے کیمیائی معیار Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China) سے خریدے گئے تھے۔ کلچر پلیٹس Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, China) سے حاصل کی گئیں۔ Prednisolone (Pre)، Etidronate Disodium (Ed)، Donepezil HCL (DPZ)، AlCl3·6H2O کو علاءالدین ریجنٹ انکارپوریشن سے خریدا گیا تھا۔ زیبرا فش الکلائن فاسفیٹیس (ALP)، ٹارٹریٹ ریزسٹنٹ ایسڈ فاسفیٹیس (TRAP)، acetylcholinesterase (AChE)، اور acetyltransferase (CHAT) انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کٹ شنگھائی اینزائم سے منسلک بائیو ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (شنگھائی، چین) نے فراہم کی تھی۔ Trizol Nanjing KeyGen Biotech سے حاصل کیا گیا تھا۔ کمپنی، لمیٹڈ (نانجنگ، چین)۔ Transtar Top Green qPCR SuperMix TransGen Biotech سے خریدا گیا تھا۔ کمپنی، لمیٹڈ (بیجنگ، چین)۔

cistanche اقتباس

2.2 جانور

بالغ زیبرا فش (AB سٹرین، 4 ماہ پرانی) کو میٹھے پانی کے تبادلے کے ساتھ فراہم کردہ ایکویریم میں 14/10 گھنٹے روشنی/تاریک چکر کے تحت 28 ڈگری پر برقرار رکھا گیا۔ انہیں روزانہ دو بار ایک نئی ہیچڈ برائن جھینگا کی خوراک کے ساتھ رکھا جاتا تھا (چن ایٹ ال۔، 2018)۔ عام طور پر فرٹیلائزڈ ایمبریوز کو ہلکے نمو کے انکیوبیٹر میں 3 دن کے بعد فرٹیلائزیشن (dpf) تک منتخب کیا جاتا تھا۔ جانوروں کے تمام تجربات جانوروں کے تجربات کے لیے ادارے اور حکومت کی ہدایات کے مطابق تھے۔

2.3 نیٹ ورک فارماکولوجیکل عمل

2.3.1 کیمیکل اسپیس کیلکولیشن اور امیدواروں کے مرکبات کی اسکریننگ

CT کے تمام کیمیائی اجزاء کا ڈیٹا روایتی چائنیز میڈیسن سسٹم فارماکولوجی ڈیٹا بیس اور تجزیہ پلیٹ فارم سے جمع کیا گیا تھا۔ TCMSP چینی جڑی بوٹیوں کی دوائیوں کا ایک نظام فارماکولوجی پلیٹ فارم ہے جو ادویات، اہداف اور بیماریوں کے درمیان تعلقات کو پکڑتا ہے (Ru et al., 2014)۔ دریں اثنا، TCMSP میں فارماکولوجی سے متعلق چار ضروری پیرامیٹرز پرنسپل کمپوننٹ انیلیسس (PCA) کے لیے حاصل کیے گئے، جن میں مالیکیولر ویٹ (MW)، اوکٹانول اور واٹر (AlogP) کے درمیان پارٹیشن گتانک، ہائیڈروجن ڈونر کاؤنٹ (Hdon)، اور ہائیڈروجن قبول کرنے والے شمار (Hdon) شامل ہیں۔ Hacc)۔ CT کی کیمیائی تقسیم کو SIMCA سافٹ ویئر (ورژن 14.1، Umetrics) کا استعمال کرتے ہوئے مندرجہ بالا پیرامیٹرز کے ساتھ بنایا گیا تھا۔ اور ڈرگ بینک سے AD/OP کے لیے منظور شدہ چھوٹی مالیکیول ادویات پر اسی کورس میں کارروائی کی گئی۔ CT کے اجزاء کو منشیات کی مشابہت (DL) کے ذریعہ فلٹر کیا گیا تھا۔ DL ایک قابلیت کا تصور ہے جو منشیات کے ڈیزائن میں اس بات کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے کہ ممکنہ مرکب کس طرح "منشیات جیسا" ہے۔ اس اہم خاصیت کو روایتی چینی جڑی بوٹیوں میں "منشیات نما" مرکبات کے انتخاب کے معیار کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے اور یہ دواسازی اور دواسازی کی خصوصیات کو بہتر بنانے میں مدد کرتا ہے (Tao et al., 2013)۔ ادب اور TCMSP میں تجاویز کی بنیاد پر، ہم نے DL کو فلٹر کی شرائط کے طور پر 0.18 سے بڑا یا اس کے برابر منتخب کیا۔ حالت کے مطابق اجزاء کو بعد میں تجزیہ کے لیے برآمد کیا گیا۔ ان کے 2-جہتی (2D) اور 3D ڈھانچے کو ChemDraw Professional 16.0 سافٹ ویئر نے پینٹ کیا تھا۔ اور 3D ڈھانچے کو Chem3D 16.0 میں توانائی کو کم سے کم کرنے کے فنکشن کے ذریعے بہتر بنایا گیا تھا۔

2.3.2 OP اور AD سے وابستہ اہداف کا مجموعہ

OP اور AD کے لیے تمام جین ایسوسی ایشنز آزادانہ طور پر DisGeNET اور GeneCards سے جمع کی گئیں۔ DisGeNET ڈیٹا بیس انسانی بیماریوں سے وابستہ جینز اور مختلف حالتوں کے عوامی طور پر دستیاب دریافت پلیٹ فارمز میں سے ایک ہے (Pinero et al., 2017)۔ GeneCards انسانی جینوں کا ایک مربوط ڈیٹا بیس ہے جس میں جینومک، ٹرانسکرپٹومک، پروٹومک، جینیاتی، طبی، اور فنکشنل معلومات شامل ہیں (Safran et al., 2010)۔

2.3.3 مرکب اہداف کا مجموعہ اور الٹا ڈاکنگ پیشین گوئی

جین کارڈز ڈیٹا بیس اور سوئس ٹارگٹ پریڈکشن ڈیٹا بیس کو CT میں فعال اجزاء کے متعلقہ اہداف کی پیش گوئی کرنے کے لیے ملایا گیا تھا۔ جین کارڈز مرکبات کے معلوم فعال اہداف کی نشاندہی کرتا ہے، جبکہ سوئس ٹارگٹ پریڈکشن ڈیٹا بیس چھوٹے مالیکیولز کے سب سے زیادہ ممکنہ میکرو مالیکولر اہداف کا اندازہ لگا سکتا ہے (Daina et al.، 2019)۔ پیشین گوئی سے پہلے، امیدوار مالیکیولز کے ڈھانچے کو اوپن بیبل (ورژن 2.4.1) کا استعمال کرتے ہوئے mol2 فارمیٹ سے SMILES فارمیٹ میں تبدیل کیا گیا تھا۔

2.3.4 پروٹین-پروٹین کے تعامل کا تجزیہ

STRING ڈیٹا بیس کا اطلاق CT-OP-AD کے مشترکہ اہداف کے گروپ کے درمیان تعاملات کو دریافت کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ "Homo sapiens" کے پیٹرن کے تحت تلاش کرنے کے بعد، پروٹین-پروٹین انٹریکشن (PPI) نیٹ ورک کو Cytoscape (ورژن 3.7.2) سافٹ ویئر کے ذریعے تصور کیا گیا۔ STRING معلوم اور پیشن گوئی شدہ PPI کا ایک ڈیٹا بیس ہے، جو جینومک سیاق و سباق کی پیشین گوئیوں، اعلی تھرو پٹ لیب تجربات، (محفوظ) شریک اظہار، خودکار ٹیکسٹ مائننگ، اور ڈیٹا بیس میں سابقہ ​​علم سے ماخوذ ہے (Szklarczyk et al., 2017)۔

Cistanche الزائمر کی بیماری کے لیے اچھا ہے۔

2.3.5 GO اور KEGG پاتھ وے کی افزودگی کا تجزیہ

جین اونٹولوجی (GO) افزودگی کا تجزیہ فنچ سافٹ ویئر پر کیا گیا تھا۔ FunRich (ورژن 3.1.3) ایک فعال سافٹ ویئر ہے جو بنیادی طور پر جینز اور پروٹین کی افزودگی کے تجزیہ کے لیے استعمال ہوتا ہے (Pathan et al., 2015)۔ ConsensusPathDB-انسانی ڈیٹا بیس کو راستے کی افزودگی کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ حاصل کردہ جین کی فہرست کو ڈیٹا بیس میں "p-value cutoff" کی ترتیب کے ساتھ 0.01 کے طور پر جمع کرایا گیا تھا۔ نتائج حاصل کرنے کے بعد، OP اور/یا AD سے متعلق صرف یہ راستے منتخب کیے گئے تھے اور KEGG فنکشن کیٹیگریز کے مطابق گروپس میں تقسیم کیے گئے تھے۔ CPDB ایک ہموار تعامل کا نیٹ ورک ہے جس میں بائنری اور پیچیدہ پروٹین-پروٹین، جینیاتی، میٹابولک، سگنلنگ، جین ریگولیٹری، اور منشیات کے ہدف کے تعاملات کے ساتھ ساتھ ہومو سیپینز میں بائیو کیمیکل راستے شامل ہیں (کمبورو ایٹ ال۔، 2013)۔

2.4 او پی زیبرا فش ماڈل کے لیے تجرباتی طریقہ کار

2.4.1 ماڈل گروپنگ

زیبرا فش لاروا کو کئی گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: کنٹرول گروپ، ماڈل گروپ، ماڈل پلس ایڈ گروپ، ماڈل پلس کمپاؤنڈ گروپس، جن میں سے ہر ایک میں 30 لاروا ہوتا ہے۔ کنٹرول گروپ کو 0.2 فیصد DMSO کے ساتھ درمیانے درجے میں برقرار رکھا گیا۔ ماڈل گروپ کے ساتھ پری (25 µM) کے ساتھ 3 dpf سے 8 dpf تک سلوک کیا گیا۔ ماڈل پلس ایڈ گروپ کا پری اور ایڈ (30 µg/mL) کے ساتھ مشترکہ علاج کیا گیا۔

2.4.2 الیزارین ریڈ سٹیننگ

مختلف مرکبات کے ساتھ کلچر کے 5 دن کے بعد، لاروا کو بے ہوشی، فکسڈ اور باری باری بلیچ کیا گیا۔ زیبرا فش کے سر کی ہڈیوں پر داغ لگانے کے لیے الزارین ریڈ استعمال کیا جاتا تھا۔ 1 فیصد KOH اور گلیسرول (3:1، 1:1 اور 1:3 کا تناسب) بالترتیب اضافی کو دور کرنے کے لیے لگایا گیا تھا۔ آخر میں، ایک سٹیریو مائکروسکوپ (Olympus SZX16) کا استعمال کیا گیا تھا تاکہ زیبرا فش کی داغدار تصاویر کو شکار کی پوزیشن کے نیچے حاصل کیا جا سکے۔ امیج-پرو پلس 6 کے ذریعے داغدار علاقے اور انٹیگریٹڈ آپٹیکل ڈینسٹی (IOD) کا حساب لگایا گیا۔{11}}۔

2.4.3 ALP اور TRAP سرگرمی کا تعین

3 dpf پر زیبرا فش لاروا کو کنویں کی پلیٹوں میں ذیلی کلچر کیا گیا تھا اور 5 دنوں تک مرکبات کی موجودگی یا غیر موجودگی میں پری کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ پھر انہیں ALP سرگرمی کی پیمائش کے لیے جمع کیا گیا۔ ALP سرگرمی کا تعین کارخانہ دار کے پروٹوکول کی بنیاد پر زیبرا فش ALP ELISA کٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ TRAP کی سرگرمی کا اندازہ کرنے کا طریقہ ALP جیسا ہی تھا۔

2.5 AD Zebrafish ماڈل کے لیے تجرباتی طریقہ کار

2.5.1 ماڈل گروپنگ

زیبرا فش لاروا کو کئی گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: کنٹرول گروپ، ماڈل گروپ، ماڈل پلس ڈی پی زیڈ گروپ، ماڈل پلس کمپاؤنڈ گروپس، جن میں سے ہر ایک میں 30 لاروا تھے۔ کنٹرول گروپ کو 0.2 فیصد DMSO کے ساتھ درمیانے درجے میں برقرار رکھا گیا۔ ماڈل گروپ کا علاج AlCl3 (150 µM، pH 5.8) سے 3 dpf سے 6 dpf تک کیا گیا۔ ماڈل پلس DPZ گروپ کا AlCl3 اور DPZ (8 µM) کے ساتھ مل کر سلوک کیا گیا۔

2.5.2 طرز عمل کا تجزیہ

منشیات کی ترسیل کے 3 دن کے بعد، لاروا کی نقل و حرکت ویوپوائنٹ رویے کے تجزیہ کار کے ذریعے ریکارڈ کی گئی۔ تمام تجربات 28˚C پر 60 منٹ میں مکمل کیے گئے، جس میں روشنی/تاریک مرحلے کے 3 چکر (روشنی اور اندھیرے کے لیے ہر ایک میں 10 منٹ) شامل ہیں۔ پچھلی رپورٹ کے طریقوں کے مطابق، اوسط رفتار (AS)، رفتار کی تبدیلی (∆S)، ڈسکینیشیا ریکوری ریٹ (DRR، مساوات a)، اور ردعمل کی کارکردگی (RE، equation b) کو اینٹی AD منشیات کی کارکردگی کے طور پر منتخب کیا گیا ہے۔ اس ماڈل میں تشخیصی اشاریہ (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016)۔

AS (mm/sec)=D / T، DRR (فیصد)=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel)، a

جہاں D 60 منٹ کے دوران زیبرا فش کی حرکت کا فاصلہ ہے، T تجرباتی وقت ہے۔

RE (فیصد)=100 × (∆SDrug - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel)، b

جہاں ∆S روشنی/تاریک چکروں میں زیبرا فش کی رفتار کی تبدیلی ہے۔

2.5.3 ACHE اور چیٹ سرگرمی کی پیمائش

3 ڈی پی ایف پر زیبرا فش لاروا کو 3 دن تک مرکبات کی موجودگی یا غیر موجودگی میں 6- کنویں کی پلیٹوں میں ذیلی کلچر کیا گیا اور AlCl3 کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ پھر انہیں ACHE سرگرمی کے لیے جمع کیا گیا۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول پر مبنی زیبرا فش ACHE ELISA کٹ کا استعمال کرتے ہوئے ACHE سرگرمی کا پتہ چلا۔ CHAT سرگرمی کا اندازہ کرنے کا طریقہ ACHE جیسا ہی تھا۔

2.6 مقداری ریئل ٹائم پی سی آر تجزیہ

زیبرا فش لاروا کو OP اور AD گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا۔ OP گروپس کنٹرول گروپ، پری گروپ، اور پری پلس کمپاؤنڈ گروپس پر مشتمل ہیں، جو 3 dpf سے 8 dpf تک مہذب ہیں۔ AD گروپوں میں کنٹرول گروپ، AlCl3 گروپ، اور AlCl3 پلس کمپاؤنڈ گروپس شامل ہیں، جو 3 dpf سے 5 dpf تک مہذب ہیں۔ ہر گروپ میں 30 لاروا تھے۔ کل RNA بالترتیب ان زیبرا فش لاروا کے نمونوں سے Trizol کے ذریعے نکالا گیا تھا۔ سی ڈی این اے کٹ کے مینوفیکچرر کی ہدایت کے مطابق آر این اے کے نمونوں کو سی ڈی این اے میں الٹا نقل کیا گیا تھا۔ mRNA اظہار کی سطح کا پتہ ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری PCR (Roche LightCycler96) کے ذریعہ کیا گیا تھا۔ نتائج کو -ایکٹین اظہار پر معمول بنایا گیا تھا اور تقابلی (2−∆∆Ct) طریقہ سے مقدار درست کی گئی تھی۔ استعمال شدہ فارورڈ اور ریورس پرائمر سنگون بائیوٹیک (شنگھائی، چین) کے ذریعہ ترکیب کیے گئے تھے اور ضمنی جدول S1 میں درج ہیں۔

cistanche اور Tongkat ali پاؤڈرقوت مدافعت کو بہتر بنانے میں مدد کرتا ہے۔

مزید معلومات کے لیے، براہ کرم یہاں کلک کریں۔

2.7 شماریاتی تجزیہ

گراف پیڈ پرزم ورژن 8۔{1}} وضاحتی شماریاتی تجزیوں کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ڈیٹا کو اوسط ± SD کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا اور P 0.05 سے کم یا اس کے برابر کو اہم سمجھتے ہوئے ہر ٹرائل کے درمیان تغیر کی جانچ کرنے کے لیے ANOVA طریقہ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا تھا۔

حصہ 2 کے لیے یہاں کلک کریں۔