حصہ Ⅰ پیشاب میں این جی اے ایل کا پتہ لگانے اور گردے کی شدید چوٹ کی تشخیص کے لیے یوروپیم نینو پارٹیکلز لیٹرل فلو امیونوسے کی ترقی

خلاصہ

1. پس منظر

AKI کا تعلق کورونا وائرس بیماری 2019 (COVID-19) کے مریضوں میں شدید منفی نتائج اور اموات سے ہے، اس لیے جلد تشخیص اور مداخلت ناگزیر ہے۔ نیوٹروفیل جیلیٹنیز سے وابستہ لیپوکلین (این جی اے ایل) گردے کی شدید چوٹ (AKI) کا پتہ لگانے کے لیے سب سے زیادہ امید افزا بائیو مارکر ہے، لیکن موجودہ پتہ لگانے کے طریقے ناکافی ہیں، اس لیے جلد تشخیص کے لیے NGAL کا پتہ لگانے کے لیے زیادہ تیز، آسان اور درست طریقوں کی ضرورت ہے۔ AKI کے اس کے ساتھ، ہم نے انسانی پیشاب کے نمونوں میں NGAL کا پتہ لگانے کے لیے یوروپیم نینو پارٹیکلز (EU-NPS) پر مبنی ایک تیز، قابل بھروسہ، اور درست لیٹرل فلو امیونوسے (LFIA) قائم کیا۔

2. طریقے

یوروپیم ڈوپڈ نینو پارٹیکلز کا استعمال کرتے ہوئے ایک ڈبل اینٹی باڈی سینڈویچ امیونو فلوروسینٹ پرکھ کا استعمال کیا گیا تھا اور NGAL مونوکلونل اینٹی باڈیز (MAbs) کنجوگیٹ بطور لیبل الیکٹرک فیوژن پیرامیٹرز کو بہتر بنا کر تیار کیے گئے تھے۔ اس طریقہ کار کی کلینیکل ایپلی کیشن کی کارکردگی کا جائزہ لینے کے لیے پیشاب کے 83 نمونے استعمال کیے گئے۔

3. نتائج

AKI میں NGAL کی مقداری پتہ لگانے کی حد {{0} ng/mL تھی، اور پتہ لگانے کی حساسیت 0.36 ng/mL تھی۔ انٹرا پرکھ اور انٹر پرکھ کے تغیرات کا گتانک (CV) بالترتیب 2۔{6}}.98 فیصد اور 4۔{9}}.83 فیصد تھا۔ دریں اثنا، یوروپیم نینو پارٹیکلز پر مبنی لیٹرل فلوروسینس امیونوساز (EU-NPS-LFIA) اور آرکیٹیکٹ تجزیہ کار کے درمیان ارتباط کا گتانک اہم تھا (R2=0.9829, n=83, p <0.01)۔

4. نتائج

اس طرح، AKI کے لیے NGAL کا ایک تیز اور آسان آپریشن مقداری پرکھ قائم کیا گیا ہے، جو AKI کی ابتدائی تشخیص کے لیے بہت اہم اور معنی خیز ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ پرکھ بیماری کے نتائج کی ابتدائی وارننگ فراہم کر سکتی ہے۔

مطلوبہ الفاظ

نیوٹروفیل جیلیٹنیز سے وابستہ لیپوکلین (این جی اے ایل)، مونوکلونل اینٹی باڈی، لیٹرل فلو امیونوسے، گردے کی شدید چوٹ (AKI)،Cistanche کے اثرات.

جاننے کے لیے یہاں کلک کریں۔Cistanche کے کیا فوائد ہیں؟

تعارف

کورونا وائرس کی بیماری 2019 (COVID-19) سنگین آفات کے ساتھ دنیا بھر میں بڑے پیمانے پر پھیل چکی ہے [1]۔ شدید گردے کی چوٹ (AKI) میں سنگین بیماریوں کی عام پیچیدگیوں میں مریض اور اموات کی شرح زیادہ ہوتی ہے اور یہ دنیا میں ہسپتال میں داخل مریضوں کا تقریباً 5-7 فیصد شمار ہوتا ہے[2]۔ کئی مطالعات نے AKI کی ترقی کا جائزہ لیا سختی سے COVID-19 کے بدتر نتائج اور شرح اموات سے متعلق ہے، جس میں AKI کے واقعات کی وضاحت کی گئی ہے جو COVID-19 کے مریضوں میں بڑے پیمانے پر 0.5 سے 36.6 فیصد تک ہوتے ہیں[3]۔ AKI کا جلد پتہ لگانے اور درست علاج بہتر حفاظتی حکمت عملیوں پر عمل درآمد کر سکتا ہے اور گردوں کے کام کو بگڑنے اور گردوں کی خرابی کو روک سکتا ہے، جس میں مؤثر طریقے سے COVID-19 ہسپتال میں داخل مریضوں کی ترقی[4] ہوتی ہے۔ ان میں سے، نیوٹروفیل جیلیٹنیز سے وابستہ لیپوکلین (این جی اے ایل) کو اے کے آئی کی کھوج کے لیے بایو مارکر امیدواروں میں سے ایک کے طور پر تسلیم کیا گیا ہے۔ این جی اے ایل ایک 25 کے ڈی اے گلائکوپروٹین ہے جو نیوٹروفیل سے جیلیٹنیز سے وابستہ ہے اور عام طور پر انسانی ٹشوز جیسے معدہ، بڑی آنت اور گردے میں نچلی سطح پر موجود ہوتا ہے، لیکن اس کا اظہار سیرم اور پیشاب میں ڈرامائی طور پر بڑھ جاتا ہے جب گردہ اسکیمک یا نیفروٹوکسک چوٹ کے ساتھ ہوتا ہے۔ [5]۔

لیٹرل فلو امیونوساز (LFIA) کو ان کی سادگی، حالات کے اندر تجزیہ، اور کام میں آسانی کی وجہ سے مطلوبہ اسکریننگ اسیس کے طور پر شمار کیا گیا ہے[6]۔ فلوروسینٹ مائیکرو پارٹیکلز کے ساتھ ایل ایف آئی اے پہلے ہی مختلف مائکروبیل پیتھوجینز اور کئی سوزش کے نشانات کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا چکا ہے[7, 8]۔ LFIA کی حساسیت کو بہتر بنانے کے لیے عام طور پر کئی نئے نینو پارٹیکلز کا اطلاق کیا گیا ہے، جن میں کاربن نینو پارٹیکلز، کوانٹم ڈاٹس، فلوروسینٹ رنگ، مقناطیسی نینو لیبلز، اور یوروپیم نینو پارٹیکلز (EU-NPS)[9] شامل ہیں۔ EU-NPS بطور کیریئر LFIA[10] میں لیبل والے کولائیڈل گولڈ نینو پارٹیکلز کے ساتھ 100- گنا حساسیت کے برعکس کو بہتر بنا سکتا ہے۔ EU-NPS ایک طویل فلوروسینس لائف ٹائم ہے اور یہ 75–100 nm رینج کے اوسط ذرہ سائز کے ساتھ بھی دستیاب ہے، بڑی اسٹوکس شفٹ جو کہ عام طور پر 200 nm سے زیادہ ہوتی ہے جوش کی روشنی کی پیمائش کی وجہ سے پھیلی ہوئی روشنی کی مداخلت سے بچنے کے لیے موزوں ہے۔ EU-NPS میں ایک وسیع حوصلہ افزائی بینڈ ہے لہذا یہ جوش کی توانائی، تیز اخراج کی چوٹی، کم پس منظر، اور اعلی ریزولوشن کو بڑھانے کے لیے فائدہ مند ہے، جو حال ہی میں طبی تشخیص کے سینڈوچ قسم کے امیونوساز میں استعمال کیے گئے ہیں[11]۔

یہاں، ہم نے EU-NPS کے ساتھ LFIA کے لیبل کے طور پر ایک نیا طریقہ قائم کیا ہے جو کہ پیشاب میں NGAL کی تیز، حساس اور ابتدائی پیمائش کے لیے دو مونوکلونل اینٹی باڈیز (MAbs) 1G1 اور 2F4 پر مبنی ہے جو ہماری لیب نے دریافت کی ہیں۔ یہ طریقہ ایک ڈبل اینٹی باڈی سینڈویچ امیونو فلوروسینٹ پرکھ ہے جو EU-NPS اور MAbs کنجوگیٹ کو بطور لیبل استعمال کرتے ہیں۔ mAb 1G1 کو EU-NPS کے ساتھ جوڑ دیا گیا تھا اور mAb 2F4 کو T-لائن میں EU-NPS-1G1-اینٹیجن کمپلیکس کیپچر کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ EU-NPS-LFIA کو پیشاب میں NGAL کی ابتدائی شناخت کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے اور AKI کے مریضوں کے علاج میں بہتری کی اجازت دیتا ہے۔

Cistanche tubulosa

طریقے

1. NGAL کا اظہار اور تزکیہ

Genbank (NP{{0}}.2) سے انسانی NGAL جین کی ترتیب بیجنگ انسٹی ٹیوٹ آف جینومکس (BGI) کے ذریعہ ترکیب کی گئی تھی اور دونوں سروں پر پابندی والے خامروں HindIII اور XhoI کو شامل کیا گیا تھا۔ پلازمیڈ کو HindIII اور XhoI کے ساتھ ہضم کیا گیا اور پھر pSecTag2A ویکٹر میں کلون کیا گیا۔ تعمیر شدہ پلازمیڈ کو بغیر کسی تغیر کے تصدیق کرنے کے لیے ترتیب دیا گیا اور پھر LipofectamineTM2000 کے ذریعے چینی ہیمسٹر اووری (CHO) خلیوں میں تبدیل کر دیا گیا۔ 8 دن کے بعد، سیل سپرنٹنٹ کو 0.45 μm فلٹر فلٹر کرنے کے بعد جمع کیا گیا۔ اظہار کردہ NGAL-6×اس کے پروٹین کو نکل نائٹریلوٹریاسیٹک ایسڈ (Ni-NTA) کالم سے پاک کیا گیا تھا، اور مختلف حصوں کو جمع کیا گیا تھا اور سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس (SDS-PAGE) کے ذریعے ان کا اندازہ لگایا گیا تھا۔ بائیسنچونینک ایسڈ (BCA) پروٹین کوانٹیفیکیشن کٹ نے پروٹین کی حراستی کی پیمائش کی۔

پیوریفائیڈ ریکومبیننٹ پروٹین کو 12 فیصد SDS-PAGE کا نشانہ بنایا گیا، پھر اسے پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ (PVDF) جھلی میں جذب کیا گیا۔ جھلی کو ٹرائس بفر میں 1 فیصد ٹوین-20 (TBST) محلول کے ساتھ بلاک کرنے کے بعد کمرے کے درجہ حرارت (RT) پر 5 فیصد سکمڈ دودھ پر مشتمل 2 گھنٹے کے لیے، HRP- conjugated anti-6×His tag کے ساتھ انکیوبیٹڈ اینٹی باڈی (1:5000) RT پر 1 گھنٹے کے لیے اندھیرے میں، TBST سے دھونے کے بعد بینزیڈائن کے ساتھ تصور کیا جاتا ہے اور Bio-Rad ویسٹرن بلاٹنگ ڈیٹیکشن سسٹم (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Israel) کے ذریعے تصور کیا جاتا ہے۔

2. MAbs کی تخلیق اور تطہیر

پہلی امیونائزیشن میں، مادہ BALB/c چوہوں (6 ہفتے کی عمر، کل 10) کو 50 µg NGAL-6×ان کے دوبارہ پیدا ہونے والے پروٹین کو مکمل فرونڈ کے معاون کی مساوی خوراک میں ایملیس کیا گیا تھا۔ اور Accessional حفاظتی ٹیکوں کو نامکمل فرونڈ کے معاون میں ایملسیفائیڈ پروٹین کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔ چوہوں کی پشت پر دو ہائپوڈرمک انجیکشن اور اس کے بعد انٹراپریٹونیل انجیکشن 21 دن کے وقفے سے۔ سیرم کے نمونے تیسرے انجیکشن کے ایک ہفتے بعد جمع کیے گئے تھے، اور اینٹی سیرم کے ٹائٹر کا تعین بالواسطہ انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) سے کیا گیا تھا[12]۔ فیوژن سے تین دن پہلے، چوہوں نے 50 µg NGAL-6×اس کی 0.9 فیصد NaCl کے ساتھ بوسٹر امیونائزیشن کی۔

الگ تھلگ مدافعتی چوہوں کے تلی کے خلیے اور SP2/0 مائیلوما خلیے 3:1 کے تناسب سے مل کر پلاٹینم الیکٹروڈ LF498-3 فیوژن چیمبر (BEX Co., Ltd, Japan) میں فیوز ہو جاتے ہیں جیسا کہ بیان کیا گیا ہے۔ ادب میں[13]۔ مختصراً، مخلوط سیل کو 10 mL الیکٹرو فیوژن بفر (0.3 M mannitol, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, pH) کے ساتھ دو بار دھویا گیا تھا۔ 7.2)، اور 2 × 107 خلیات/ ایم ایل کے ارتکاز پر دوبارہ معطل کر دیا گیا۔ فیوژن کو 20 s کے لیے 0.8 میگاہرٹز پر 50 V کے متبادل کرنٹ وولٹیج کا استعمال کرتے ہوئے مکمل کیا گیا، 0.5 s کے لیے 2 تکرار کے 450 V کا براہ راست کرنٹ پلس وولٹیج، اور پوسٹ فیوژن کے لیے 0.8 میگاہرٹز پر 50 V تھا۔ 7 سیکنڈ آخر میں، الیکٹرک ٹریٹڈ سیل سسپنشن کو فیوژن چیمبر سے 4.5 ملی لیٹر پہلے سے گرم RPMI 1640 (20 فیصد فیٹل بووائن سیرم) میں 30 منٹ کے لیے 37 ڈگری پر منتقل کیا گیا، پھر 96- کنویں کی پلیٹوں میں کلچر کیا گیا اور 5 فیصد کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ CO2 37 ڈگری پر۔ 24 گھنٹے کے بعد، ہر کنویں میں ہائپوکسینتھائن-امینوپٹیرن-تھائیڈائن (HAT) کی تکمیل کی گئی۔ سیل کلچر سپرنٹنٹس کو ELISA نے 9 دن کے فیوژن کے بعد اسکرین کیا، اور ہائبرڈوما کلون کی گنتی کی گئی تعداد تھی۔ BALB/c چوہوں کو جو پہلے سے پیرافن آئل کے ساتھ انجیکشن لگائے گئے تھے ان کو NGAL ہائبرڈوما سیلز کے 1 × 106 کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا تھا، اسکائٹس کو پروٹین A کالم سے پاک کیا گیا تھا۔

3. MAbs کی شناخت

اینٹی باڈیز کے امیونوگلوبلین ذیلی طبقات کا اینٹی باڈی سب کلاس شناختی کٹ کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔ بالواسطہ ELISA نے پیوریفائیڈ ریکومبیننٹ NGAL{{0}×His پروٹین اور PCT- 6×His پروٹین کا استعمال کرکے مخصوص MAbs کی اسکریننگ کی۔ اینٹیجن اور اینٹی باڈیز کے درمیان تعامل کا تعین HBS-EP بفر (0.005 فیصد سرفیکٹنٹ P20، 10 mM ہیپس، pH 7.4، 3 mM EDTA، 150) میں BIAcore T200 نظام (GE Healthcare, Stockholm, Sweden) کے ساتھ کیا گیا تھا۔ mM NaCl)۔ این جی اے ایل اینٹیجن کو ایک امائن کپلنگ کٹ کے ذریعہ 400–480 رسپانس یونٹس (RU) تک پہنچنے والے CM5 بائیو سینسر چپس پر جذب کیا گیا تھا۔ HBS-EP بفر میں اینٹی باڈیز (2F4 اور 1G1) کو آہستہ آہستہ 5 منٹ کے لیے 50 µL/min کے ساتھ چپ کے اوپر سے گزارا گیا، اور اس کے بعد HBS-EP بفر کو چپ کے اوپر انجکشن لگایا گیا تاکہ 4 منٹ تک علیحدگی کے مرحلے کی نگرانی کی جا سکے۔ . سینسر چپس کو الگ کرنے کے مرحلے کے بعد Glycine محلول (pH 3.0) کے ساتھ دوبارہ تخلیق کیا گیا تھا۔ چپ کے اوپر سے گزرنے والے ہر تجزیہ کار کے لیے، اینٹیجن فلو چینل کے مخصوص ردعمل کنٹرول فلو چینل سے غیر مخصوص ردعمل کو گھٹا سکتے ہیں۔ KD کا حساب لگانے کے لیے توازن بائنڈنگ ردعمل کے لیے تجزیے کے ارتکاز کی بنیاد پر فٹ شدہ سنترپتی بائنڈنگ منحنی خطوط تیار کیے گئے تھے۔

پیوریفائیڈ اینٹی این جی اے ایل MAbs کا تجزیہ 12 فیصد SDS-PAGE میں غیر کم کرنے اور کم کرنے والی شرائط کے تحت کیا گیا۔ مختصراً، نمونہ کو 5 x نان کم کرنے والے بفر یا 5 x پروٹین لوڈنگ بفر کے ساتھ ملایا گیا اور 12 فیصد SDS-PAGE پر لوڈ کیا گیا۔ اینٹی NGAL MAbs کی خصوصیت کا تعین مغربی بلاٹ کے ذریعے کیا گیا تھا۔ NGAL پروٹین کو 12 فیصد SDS-PAGE پر کیا گیا، پھر PVDF جھلی پر جذب کیا گیا جو 15 s کے لیے میتھانول میں بھگو کر چالو کیا گیا، اور پھر 2 گھنٹے کے لیے 100 V پر الیکٹروفورسس کے حالات کا نشانہ بنایا گیا۔ Tris-HCl بفر میں 1 فیصد Tween-20 محلول (TBST) کے ساتھ RT پر 5 فیصد سکمڈ دودھ پر مشتمل 2 گھنٹے تک بلاک کرنے کے بعد، جھلی کو 4 ڈگری پر بنیادی اینٹی باڈیز کے طور پر ماؤس اینٹی این جی اے ایل ایم اے بی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ اگلے دن، جھلی کو TBST سے دھویا گیا اور RT پر 1.5 گھنٹے کے لیے اندھیرے میں اینٹی ماؤس کنجوگیٹڈ HRP IgG کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ آخر میں، جھلی کو ویسٹرن بلٹ ڈیٹیکشن سسٹم آف اینہانسڈ کیمیلومینیسینس (ECL) کے ذریعے تصور کیا گیا۔

4. مسابقتی انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ اسسیس (ELISA)

CELISA کے ذریعے NGAL پر منفرد epitopes کو پہچاننے کی صلاحیت کے لیے دو MAbs کا تجربہ کیا گیا۔ MAb کو HRP اینٹی باڈی لیبلنگ کٹ (شنگھائی YSRIBIO صنعتی کمپنی، LTD) کا استعمال کرتے ہوئے HRP کے ساتھ جوڑ دیا گیا تھا، جس کے کام کرنے والے ارتکاز کو براہ راست ELISA کے ذریعے جانچا گیا تھا۔ {{0}}اچھی طرح سے مائیکرو ٹائٹر پلیٹوں کو 2 µg/mL NGAL اینٹیجن کے ساتھ راتوں رات 4 ڈگری پر لیپ کیا گیا تھا، پھر بغیر لیبل والے MAb (0.2 µg/ well، 2 µg/ well) کو مسابقتی طور پر زیادہ سے زیادہ کم کرنے کے تناسب کے ساتھ پابند کیا گیا تھا۔ HRP نے MAb کا لیبل لگایا اور 37 ڈگری پر 1 گھنٹہ تک انکیوبیٹ کیا۔ انزیمیٹک رد عمل ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ کے ساتھ سبسٹریٹ 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidine (TMB) کے ساتھ ظاہر ہوا اور تمام کنوؤں پر 2 M سلفیورک ایسڈ کے ذریعے رک گیا۔ جاذبیت (OD450 nm) کا تعین Bio-Rad مائکروپلیٹ ریڈر (Bio-Rad Laboratories, Inc) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ MAbs کے مسدود اثرات کا حساب درج ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا: 100×[1-OD_{450 این ایم}کا (HRP-MAb پلس MAb)/OD450 nm of HRP-MAb]۔ اگر 40 فیصد سے زیادہ میں بلاکنگ اثرات دیکھے گئے تو دو MAbs نے مختلف ایپیٹوپس کو تسلیم کیا۔

Cistanche اقتباس

5. EU-NPS کا جوڑ

اینٹی این جی اے ایل مونوکلونل اینٹی باڈیز 1G1 اور 2F4 کو بانگس لیبارٹریز کے معیاری طریقہ کار کے ساتھ ہم آہنگی سے EU-NPS کے ساتھ جوڑ دیا گیا تھا۔ مختصراً، 100 µL EUNPS کو 900 µL 0 میں شامل کیا گیا۔{25}}5 M MES (pH 7.{{ 32}}) اور الٹراساؤنڈ کے ذریعے منتشر، RT پر 15 منٹ کے لیے {{40}.08 M N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) اور 0.05 M 1- ({{19}) کی موجودگی میں وائبریٹڈ }}Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC)۔ فعال EUNPS کو کپلنگ بفر (0.05 mM H3BO3، 0.04 mM Na2B4O7، pH 7.5) سے دھویا گیا اور RT پر 2.5 گھنٹے کے لیے 0.3 mg اینٹی باڈی کے ساتھ رد عمل ظاہر کیا۔ یوروپیم کنجوگیٹڈ کمپاؤنڈ کو 1000 µL بلاکنگ بفر (10 فیصد BSA، 20 فیصد درمیان-20، 0.05 M Tris-HCl) میں 1 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا تھا، 1000 µL اسٹاک سلوشنز میں شامل کیا گیا تھا (10 فیصد BSA، 20 فیصد، 20 فیصد، 20 فیصد) فیصد درمیان-20، 0.05 M Tris-HCl ) 4 ڈگری پر ذخیرہ کرنے کے لیے۔

6. ایل ایف آئی اے کی ترقی

LFIA سٹرپس ایک نائٹروسیلوز جھلی، کنجوگیٹ پیڈ، نمونہ پیڈ، اور جذب کرنے والے پیڈ پر مشتمل تھیں۔ شیشے کی فائبر جھلیوں کو بلاک کرنے والے بفر (20 فیصد ٹریہالوز، 10 فیصد BSA، 20 فیصد درمیان-20، 0.05 M Tris، 3.2 mM EDTA.Na2، pH 8.6) میں 1.5 گھنٹے تک بھگو دیا گیا تھا۔ 1 mg/mL MAbs (2F4 یا 1G1) کا ارتکاز نائٹروسیلوز جھلی کی ٹیسٹ لائن (TL) پر لیپت کیا گیا تھا، اور بکری مخالف ماؤس IgG 1 mg/mL اسی NC جھلی پر 4 ملی میٹر کے فاصلے پر لیپت کیا گیا تھا۔ کوالٹی کنٹرول لائن (CL) بنائیں، ڈسپنسر کے آلے کا سپرے والیوم 1 µL/cm پر سیٹ کیا گیا تھا۔ جھلی اور گلاس فائبر چٹائی کو جانچنے سے پہلے 45 ڈگری پر 48 گھنٹے تک خشک کیا گیا تھا۔ مختلف EU-NPS-1G1 اور EU-NPS-2F4 کنجوگیٹ پارٹیکلز کو کنجوگیٹ پیڈ پر لیپت کیا گیا تھا، اور فلوروسینس سگنل کو امیونو فلوروسینٹ تجزیہ کار (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd) سے ماپا گیا تھا۔

7. پیشاب کے نمونے جمع کرنا اور مریض

جیلین میڈیکل یونیورسٹی کے ملحقہ اسپتال سے AKI کے مریضوں کے کل 83 انسانی پیشاب کے نمونے حاصل کیے گئے۔ تجربات میں اخلاقی رہنما خطوط کی سختی سے تعمیل کی گئی تھی اور جیلین میڈیکل یونیورسٹی کے ملحقہ ہسپتال (نمبر۔{1}}LW029) کی طرف سے فراہم کیے گئے تھے۔ تمام مضامین نے پیشاب کے نمونوں کے مطالعہ کے لیے چینی زبان میں زبانی اور تحریری طور پر باخبر رضامندی حاصل کی۔ تمام تجربات ہیلسنکی کے اخلاقی اصولوں کے اعلان کے ذریعہ کئے گئے تھے۔ 62 سال کے مریضوں کی اوسط عمر 20 سے 80 سال کے درمیان تھی جو COVID-19 سے متاثر نہیں ہوئے تھے، اور AKI مرحلے 1–3 کو گردے کی بیماری کو بہتر بنانے والے عالمی نتائج AKI کے معیار کے مطابق درجہ بندی کیا گیا تھا[14]۔ AKI کی تشخیص سے پہلے 12 گھنٹے تک NGAL تجزیہ کے لیے پیشاب کے نمونے اکٹھے کیے گئے تھے اور مختلف ٹائم پوائنٹس (12, 24, 48 h) پر آپریشن کے بعد متواتر وقفوں پر۔ ممکنہ الجھنے والے عوامل کو کم کرنے کے لیے، پیشاب کے نمونوں کا کلینیکل کیمسٹری لیبارٹری میں تیزی سے تجزیہ کیا گیا جس میں پیشاب بائیو کیمسٹری (کل پروٹین کی تعداد <1 g/dL، یوریا <12 g/dL، گلوکوز <1 g/dL، پیشاب کریٹینائن <1 g/dL , albumin < 2.5 g/dL، pH 4۔{21}}.0) اور ڈپلیکیٹس میں انجام دیا گیا۔ نمونہ جمع کرنے کے 30 منٹ کے اندر، انہیں 3000 rpm پر 15 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ کم از کم 100 µL سپرناٹینٹ کو جراثیم سے پاک کنٹینرز میں تقسیم کیا گیا اور مزید تجزیوں کے لیے -80 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا، تاکہ بار بار منجمد پگھلنے کے چکر سے بچا جا سکے۔

این جی اے ایل کی سطحوں کی پیمائش ایک آرکیٹیکٹ پیشاب این جی اے ایل ریجنٹ کٹ (لیسنامک، لانگفورڈ، کمپنی لانگفورڈ، آئرلینڈ) کے ذریعے کی گئی تھی جس میں کیمیلومینسنٹ سگنل کا پتہ لگانے کے ساتھ غیر مسابقتی، سینڈوچ فارمیٹ کا استعمال کیا گیا تھا۔ پیشاب کی این جی اے ایل کو ایک اینٹی فنگل اینٹی باڈی کے ذریعہ پہچانا گیا تھا جو مائکرو پارٹیکل ریجنٹ میں پیرا میگنیٹک ذرات کے ساتھ ہم آہنگی سے منسلک تھا ، اور ایکریڈینیم سے وابستہ دوسرے اینٹی این جی اے ایل اینٹی باڈی کے کنجوگیٹ سے۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے بعد، انشانکن پرکھ 0- 1500 ng/mL کی حد میں کی گئی اور NGAL کی حراستی کی پیمائش کی گئی۔

8. طبی نمونے کی جانچ اور تجزیہ

NGAL معیارات کے اینٹیجن (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000, اور 3000 ng/mL) کے سیریل ارتکاز کو FBS کا استعمال کرتے ہوئے بائیو کنجوگیٹ کے مخصوص رد عمل کو مضبوط بنانے کے لیے تیار کیا گیا تھا، ہر ارتکاز نے تین نقلیں کیں۔ نمونے کے پیڈ پر طبی نمونے شامل کیے جانے کے بعد، ٹی لائن (HT) اور C لائن (HC) پر فلوروسینس کی شدت کے نتائج ریڈر کے ذریعہ ریکارڈ کیے گئے۔ سٹرپس (T اور C) کے فرق اور ریاضی کے نمونے کے معیاری میٹرکس اثرات کو مؤثر طریقے سے ختم کرنے کے لیے HT/HC تناسب کے ذریعے مقداری کھوج مکمل کی گئی تھی[15]۔ معیاری وکر کو NGAL اور HT/HC تناسب کے ہر ارتکاز کے خلاف پلاٹ کیا گیا تھا۔

9. شماریاتی تجزیہ

پاسنگ-بابلوک ریگریشن تجزیہ اور BlandAltman پلاٹ MedCalc اور SPSS 17 کے تغیر (ANOVA) کے تجزیہ کے ذریعے انجام دیا گیا۔{2}} سافٹ ویئر۔ تمام ڈیٹا کو معیاری انحراف (یعنی ± SD ) کے ساتھ اوسط قدروں کے طور پر دکھایا گیا تھا۔

Cistanche گولیاں

حوالہ جات

1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: Covid میں گردے کی شدید چوٹ-19: چینی تجربہ۔ نیفرالوجی 2020 میں سیمینارز، 40(5):430–442۔

2. منڈیلبام ٹی، سکاٹ ڈی، لی جے، مارک آر، ملہوترا اے، وائیکر ایس، ہاویل ایم، تلمور ڈی: شدید گردے کی چوٹ والے شدید بیمار مریضوں کا ایکیوٹ کڈنی انجری نیٹ ورک کے معیار کا استعمال کرتے ہوئے نتیجہ۔ کریٹیکل کیئر میڈیسن 2011، 39(12): 2659–2664۔

3. الحویش اے، محمد اے، ایلنوکیٹی ایم، الحویش اے، العودہ این، عصام ایس، عبدالرحمٰن اول: پیریٹونیل ڈائیلاسز کے ذریعے کووڈ کے ثانوی گردے کی شدید چوٹ والے تین مریضوں کا کامیابی سے علاج : کیس رپورٹ اور ادب کا جائزہ۔ پیریٹونیل ڈائلیسس انٹرنیشنل 2020، 40(5):496–498۔

4. Shabaka A، Rovirosa-Bigot S، Guerrero Marquez C، Alonso Riaño M، Fernández-Juárez G: شدید گردے کی چوٹ اور نیفروٹک سنڈروم کو کووڈ-19- سے وابستہ فوکل سیگمنٹل گلوومیرولوسکلروسیس کا ثانوی۔ نیفرولوجیا 2021۔

5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: AKI کی شدت کی پیشین گوئی کرنے کے لیے ایک ابھرتا ہوا ٹول کلینیکل پرکھ کے ذریعے آسانی سے معلوم کیا جا سکتا ہے۔ کریٹیکل کیئر 2010، 14(4): 318۔

6. Zuk R، Ginsberg V، Houts T، Rabbie J، Merrick H، Ullman E، Fischer M، Sizto C، Stiso S، Litman D: Enzyme immunochromatography–ایک مقداری امیونوسے جس میں کسی اوزار کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔ کلینیکل کیمسٹری 1985، 31(7): 1144–1150۔

7. Juntunen E، Myyryläinen T، Salminen T، Soukka T، Pettersson K: لیٹرل فلو بائیو ایفینٹی پرکھ میں فلوروسینٹ یوروپیم(III) نینو پارٹیکلز اور کولائیڈل گولڈ رپورٹرز کی کارکردگی۔ تجزیاتی بائیو کیمسٹری 2012، 428(1):31–38۔

8. Swanson C, D'Andrea A: ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کے لیے قریب اورکت رنگ کے ساتھ لیٹرل فلو پرکھ۔ کلینیکل کیمسٹری 2013، 59(4):641–648۔

9. چن وائی، فو کیو، زی جے، وانگ ایچ، تانگ وائی: زیارالینون کی کھوج کے لیے اعلیٰ حساسیت کوانٹم ڈاٹ پر مبنی فلوروسینٹ بجھانے والے لیٹرل فلو پرکھ کی ترقی۔ تجزیاتی حیاتیاتی کیمیا 2019، 411(10): 2169–2175۔

10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: Pantoea stewartii subsp کے تیزی سے پتہ لگانے کے لیے لینتھانائیڈ کے لیبل والے امیونوکرومیٹوگرافک سٹرپس۔ سٹیورٹ بایو سینسرز بائیو الیکٹرانکس 2014، 51:29–35۔

11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P: ligase detection react fluorescent microsphere assay کی توثیق برائے Plasmodium Fredism, P,,,,,,, یوگنڈا میں ملیریا جرنل 2014، 13:95۔

12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: مونوکلونل اینٹی باڈی کی پیداوار اور دودھ میں T-2 ٹاکسن کی اسکریننگ کے لیے بالواسطہ مسابقتی انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ کی ترقی۔ ٹاکسیکن 2018، 156:1–6۔

مولی ین 1، یوآن وانگ این آئی 2، ہاؤ لیو 2، لی لیو 1، لو تانگ 1، یوآن ڈونگ 2، چوان من ہو1 اور ہوان وانگ 1

1 جلن کولیبریٹو انوویشن سینٹر برائے اینٹی باڈی انجینئرنگ، جیلن میڈیکل یونیورسٹی، 132013 جیلن، پی آر چین۔

2 اکیڈمی آف لیبارٹری، جیلن میڈیکل یونیورسٹی، 132013 جلن، پی آر چین۔