حصہ Ⅰ: نیفران نمبر پر ماحولیاتی حالات کے اثرات

مزید معلومات کے لیے:ali.ma@wecistanche.com

حصہ Ⅰ: نیفران نمبر پر ماحولیاتی حالات کے اثرات: گردے کی نشوونما میں ماں کی بیماری اور ایپی جینیٹک ریگولیشن کی ماڈلنگ

Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse & et al.

1. تعارف

بچہ دانی کے ماحول سے جنین کی نشوونما متاثر ہوتی ہے، اور ایک منفی ماحول بعد کی زندگی میں ہائی بلڈ پریشر، دل کی بیماری، اور گردے کی دائمی بیماری جیسی بیماریوں کا شکار ہو سکتا ہے [1-4]۔ انٹرا یوٹرن ڈسٹربنسز کی ایک رینج کے نتیجے میں نیفران اینڈومنٹ میں کمی اور اولاد میں رینل فنکشن میں سمجھوتہ ہو سکتا ہے۔ چوہوں میں، پیدائش کے وقت نیفران کی تعداد میں کمی کا باعث بننے والے حالات میں انٹرا یوٹرن گروتھ ریسٹریکشن (IUGR)، زچگی کی کم پروٹین والی خوراک، ادویات (بشمول کورٹیکوسٹیرائڈز یا نان سٹیرائیڈل اینٹی سوزش والی دوائیں)، مونوجنیٹک تغیرات، اور وٹامن اے کی کم سطح، نیز زچگی کی ذیابیطس شامل ہیں۔ اور آئرن کی کمی [5-10]۔ انسانوں میں، فی الحال نیفرون نمبروں کی پیمائش کا کوئی غیر حملہ آور طریقہ نہیں ہے۔ تاہم، پوسٹ مارٹل اسٹڈیز نے نیفران نمبرز اور بلڈ پریشر [4,11] کے درمیان منفی تعلق کو ظاہر کیا ہے۔ مزید برآں، کم نیفرون نمبروں سے منسلک انٹرا یوٹرن حالات جیسے کہ IUGR کے بارے میں جانا جاتا ہے کہ ہائی بلڈ پریشر اور CKD کی بڑھتی ہوئی شرحوں سے وابستہ ہیں[12]۔

ویوو کے تجربات میں جہاں حاملہ جانوروں میں مصنوعی طور پر رحم کے اندر پیدا ہونے والے منفی حالات پیدا ہوتے ہیں، اولاد میں ہونے والی گردوں کی تبدیلیوں کا پتہ لگانے اور ان کی وضاحت کے لیے انمول ثابت ہوئے ہیں۔ تاہم، حمل کے دوران کسی بھی تجرباتی مداخلت کے نتیجے میں زچگی، نال اور جنین کی فزیالوجی میں پیچیدہ تبدیلیاں آتی ہیں جو خود ترقی پذیر میٹینفروئی کے ماحول کو متاثر کر سکتی ہیں۔ ایکس ویوو ماڈلنگ کی تکنیکیں ماں کے جانور، نال، یا جنین کے دیگر اعضاء کے اثر و رسوخ سے مکمل طور پر الگ گردے کی نشوونما کی تحقیقات کو قابل بنا کر اس کو روکتی ہیں۔ درمیانی ہوا کے انٹرفیس پر metanephroi کی الگ تھلگ ثقافتوں کو ابتدائی طور پر 1950 میں Trowell نے انجام دیا تھا [13] اور بعد میں فلٹر جھلیوں پر گردوں کی کلچرنگ کے ذریعے بہتر کیا گیا ہے [14]، جو واحد متغیر ثقافتی حالات کی بنیاد فراہم کرتا ہے۔

خلاصہ طور پر، شواہد کا ایک بڑھتا ہوا جسم یہ بتاتا ہے کہ کم نیفران نمبروں سے منسلک قبل از پیدائش کی توہین ہائی بلڈ پریشر اور CKD کے خطرے والے عوامل سے متعلق ہے۔ پیدائش کے وقت مناسب نیفران انڈومنٹ کو یقینی بنانے کے لیے روک تھام کی حکمت عملی تیار کرنے کے لیے، گردوں کی نشوونما اور نیفروجنسیس کو متاثر کرنے والے عوامل کی میکانکی سمجھ ضروری ہے۔ موجودہ کام میں، میٹا نیفرک آرگن کلچر کو ماحولیاتی ضابطے کے مختلف پہلوؤں کو ماڈل بنانے کے لیے استعمال کیا گیا تاکہ گردوں کی نشوونما پر ان کے اثرات اور طویل مدتی رینل فنکشن کے ممکنہ مضمرات کا مطالعہ کیا جا سکے اور ایف ڈی اے سے منظور شدہ چھوٹے مرکبات کا استعمال کرتے ہوئے ایپی جینیٹک ریگولیٹرز کی اسکریننگ کے لیے استعمال کیا جائے۔

گردے کے کام کے لیے Cistanche herba مصنوعات پر کلک کریں۔

2. نتائج

2.1 گردے کی نشوونما پر ماحولیاتی حالات کے اثر کا مطالعہ کرنے کے لیے میٹا نیفرک آرگن کلچر کا استعمال

منفی ماحولیاتی حالات کو ماڈل کرنے کے لیے، برانن دن (E) 12.5 ایمبریو کے گردے درمیانے فضائی انٹرفیس (شکل 1A) پر کلچر کیے گئے تھے۔ نیفران اور گلوومیریولر ڈیولپمنٹ کی نگرانی کو آسان بنانے کے لیے، سکس2۔ کری اور پوڈ۔ کری ڈوئل فلوروسینٹ رپورٹر چوہوں کو بالترتیب استعمال کیا گیا تھا (شکل 1B، C)۔ حمل کے دوران ایک عام حالت بخار ہے، جو حمل کے پہلے 16 ہفتوں کے دوران 10 فیصد سے زیادہ حمل کو متاثر کرتی ہے [15]گرمی ایک اچھی خاصیت والا ٹیراٹوجن ہے، اور حمل کے دوران ہائپر تھرمیا جنین اسقاط حمل، ترقی میں رکاوٹ، اور نشوونما کے نقائص، جیسے گردوں کی ایجینیسیس، ہائپوپلاسیا اور کئی پرجاتیوں میں پیدائش کا کم وزن [16-21]۔ گردے کی نشوونما اور نیفرون کی تشکیل پر طویل، بخار کی حد کے ہائپر تھرمک حالات کے اثرات کا جائزہ لینے کے لیے، گردوں کو الگ تھلگ کیا گیا اور 37 یا 40 ڈگری (شکل 1D) پر رکھا گیا۔ 7 دن کی ثقافت کے بعد، 40C پر کلچر کیے گئے گردے، جسمانی حالات میں کلچر کیے گئے اپنے ہم منصبوں سے اوسطاً 18.36 فیصد چھوٹے تھے (شکل 1E)۔ تاہم، گروپوں (شکل 1F) کے درمیان فی گردے گلوومیرولی کی تعداد میں کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا۔ بہر حال، گردوں کی مجموعی ترقی میں کمی میٹینفرک نمو پر بڑھتے ہوئے درجہ حرارت کے منفی اثر کو ظاہر کرتی ہے۔

ایک اندازے کے مطابق 19 فیصد حاملہ خواتین جو آئرن کی کمی کے خون کی کمی کا شکار ہیں [22]، آئرن کی کمی سب سے زیادہ وسیع حالات میں سے ایک ہے جس میں گردوں کی نشوونما میں خلل پڑنے کی صلاحیت ہے [23]۔ ویوو کے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ زچگی میں آئرن کی کمی سے متاثر ہونے والے حمل کے دوران گردوں کی نشوونما، گلوومیریولر نمبرز، اور رینل آئرن کی مقدار کم ہو جاتی ہے [24]۔ گردے کی نشوونما اور نیفروجنیسیس پر ٹرانسفرن سے منسلک آئرن کی سپلائی میں کمی کے اثرات کا جائزہ لینے کے لیے، ایکسپلانٹس کو ایک میڈیم میں کلچر کیا گیا جس میں 50 ug/mL لوہے سے سیر شدہ ہولو-ٹرانسفرین یا 50 ug/mL لوہے کی کمی شدہ apo-transferrin، بالترتیب آئرن پر پابندی والے گردے اپنے آئرن کے لیے کافی ہم منصبوں کے مقابلے میں بہت چھوٹے رہے اور ureteric بڈز میں بڑھتی ہوئی apoptosis اور ureteric بڈ برانچنگ اور پھیلاؤ کو کم کیا (شکل 1G، سپلیمنٹری فگر S1A-F)۔ جب کہ نیفران کی آبادی مورفولوجیکل طور پر غیر متاثر تھی، نیفران کے ترقی پذیر دور دراز حصے کے ساتھ ساتھ ڈسٹل نلیاں میں کمی دیکھی جا سکتی ہے (شکل 1H,I، ضمنی شکل S1G-J)۔ آئرن کی کمی والے گردے اوسطاً اپنے ہولو ٹرانسفرین کلچرڈ ہم منصبوں کے سائز کا 47.9 فیصد تھے (شکل 1) اور کلچر میں 7 دنوں کے بعد فی گردہ گلوومیرولی کی مجموعی تعداد میں 69.9 فیصد کمی ظاہر کی (شکل 1K) . اس طرح، اپو-ٹرانسفرین کے ذریعہ لوہے کی کمی نے گردے کی نشوونما پر ایک تمام قربت والے نیفروجینیسیس فینوٹائپ کے ساتھ شدید اثرات دکھائے۔

شکل 1. گردوں کی نشوونما پر ماحولیاتی حالات کے اثر کا مطالعہ کرنے کے لیے میٹا نیفرک آرگن کلچرز کا استعمال۔(A) E12.5 ماؤس ایمبریوز (بائیں پینل) سے یوروجینیٹل رج کو مائیکرو سرجیکل طور پر نکالا گیا (دوسرا پینل)، اور گردے الگ تھلگ (تیسرے پینل) اور ٹرانس ویل انسرٹس (دائیں پینل) پر رکھے گئے۔ اسکیل بارز∶ 1 ملی میٹر （بائیں پینل）، 500 μm（تیسرا پینل）۔ (B) دوہری ٹماٹر/ای جی ایف پی اظہار کے ساتھ ٹرانسجینک چوہوں کو چھ2-مثبت خلیات اور ان کی اولاد کو Six2 کا استعمال کرتے ہوئے مشروط لیبلنگ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ Pod کا استعمال کرتے ہوئے Cre یا (C) پوڈوسن-مثبت خلیات۔ کری چوہا۔ (D) ایک ہی ایمبریو کے ایکسپلانٹس کو 7 دن تک 37 یا 40 ڈگری پر کلچر کیا گیا تھا۔ اسکیل بارز ∶ 500 μm۔ (E）) 37 یا 40 ڈگری پر 7 دنوں تک اگنے والے ایکسپلانٹس کے سطحی حصے۔ n=40 جوڑے، جوڑا ٹی-ٹیسٹ، مطلب ±SD۔ (F) 7 دنوں کے بعد ایکسپلانٹ گروپوں میں گلومیرولی کی تعداد۔ 17}} جوڑے، جوڑا ٹی-ٹیسٹ، مطلب ±SD۔ （G） ایک ہی ایمبریو کے ایکسپلانٹس کو 7 دن تک ایک میڈیم میں کلچر کیا گیا جس میں holo-Tf یا apo-Tf تھا۔ اسکیل بارز ∶ 500 μm۔ (H) کلچر کے 48 گھنٹے کے بعد SIX2 اور E-cadherin کے خلاف داغدار holo-Tf اور apo-Tf کلچرڈ ایکسپلانٹ جوڑے کی وائیڈ فیلڈ امیجز نارمل پروجینیٹر سیل پول اور ابتدائی نیفران مورفولوجی میں نقائص کو ظاہر کرتی ہیں۔ اسکیل بار∶100 μm۔ اسکیل بارز∶100 μm۔ （） 7 دنوں کے بعد holo-Tf اور apo-Tf کلچرڈ ایکسپلانٹس کے سطحی علاقے۔ =17 جوڑے، جوڑا ٹی-ٹیسٹ، مطلب ± SD۔

2.2 Ex Vio ہائی گلوکوز کی نمائش ذیابیطس نیفروپیتھی سے وابستہ تبدیلیوں کا باعث بنتی ہے ترقی پذیر گردے میں

حمل کے دوران زچگی کی ذیابیطس ایک اور عام حالت ہے، جس میں حمل میں ہائپرگلیسیمیا کا عالمی پھیلاؤ ~ 17 فیصد ہے اور ہر سال 20 ملین سے زیادہ زندہ پیدائشیں ہوتی ہیں [25]۔ ماؤس اور چوہوں کے ماڈلز میں ذیابیطس کو کم نیفران نمبر [10,26,27] کے ساتھ اولاد پیدا کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ گردوں کی نشوونما پر ہائی گلوکوز کے اثرات کا مطالعہ کرنے کے لیے پہلے میٹا نیفرک آرگن کلچر کا استعمال کیا جاتا رہا ہے [27-29]۔ اس سے پہلے، ہم نے 55 ایم ایم [30] کے اعلی گلوکوز کے حالات میں سائز، نیفرون نمبر، اور ڈی این اے میتھیلیشن میں کمی کی اطلاع دی تھی۔ شائع شدہ اعداد و شمار کے برعکس [28]، ہمارے نمونوں میں ایکسپلانٹ سائز یا گلوومرولر نمبر پر کوئی اثر نہیں دیکھا گیا جب 7 دن کے بعد 5 ایم ایم کنٹرول کنڈیشنز کے مقابلے میں مختلف 30 ایم ایم گلوکوز میڈیا میں کلچر کیا گیا (ضمنی شکل S2A، B)۔ مزید برآں، لائن-1 اور بڑی سیٹلائٹ سائٹس پر ڈی این اے میتھیلیشن میں کوئی کمی نہیں پائی جا سکتی ہے (ضمنی اعداد و شمار S2C، D)۔ 7- دن کی مدت کے کلچر کے بعد گردوں کی نشوونما پر 55 ایم ایم ہائی گلوکوز کے اثر کا مزید تجزیہ کیا گیا، جو کلچر میں دن 3 سے شروع ہونے والی شرح نمو میں کمی کو ظاہر کرتا ہے (شکل 2A، B)۔ امیونو فلوروسینس داغوں نے SIX2-مثبت پروجنیٹر سیل پول (فگر 2C) کے کوئی مورفولوجیکل نقائص نہیں دکھائے لیکن پوڈو سائیٹ مارکر پوڈوکلیکسن (PODXL، شکل 2D) کے کم داغ دکھائے۔ گلوومیرولی میں ایک گاڑھا گلومیرولر بیسمنٹ میٹرکس پایا گیا جو ہسٹولوجیکل داغوں میں دکھائی دیتا ہے (شکل 2E)۔ الیکٹران مائیکروسکوپی میں بھی اسی طرح کے نتائج سامنے آئے ہیں، جس میں گلوومیرولر تہہ خانے کی جھلی کی موٹائی (شکل 2F) میں اضافہ دکھایا گیا ہے، جو پری ذیابیطس اور ذیابیطس نیفروپیتھی (DN) [31,32] کے ابتدائی نشانوں میں سے ایک ہے، چھ میں سے پانچ گردوں میں اور کوئی بھی نہیں۔ سات لیٹر میٹ کنٹرول گردے کی. ٹرانسکرپٹوم میں مزید تبدیلیوں کو کھولنے کے لیے، تین لیٹروں سے گردے کے کلچرز کا جوڑے کے حساب سے ڈیفرینشل جین ایکسپریشن (DGE) تجزیہ کیا گیا، جس میں ہر جنین کا ایک گردہ ہائی گلوکوز کے ساتھ اور دوسرا کنٹرول میڈیم کے ساتھ اور گردے تجزیہ کے لیے جمع کیے گئے ( n=3)۔ڈی جی ای نے ایکسٹرا سیلولر میٹرکس اجزاء کے اپ گریجولیشن کی تصدیق بنیادی اپریگولیٹڈ حیاتیاتی عمل (ضمنی جدول S1) کے طور پر کی۔ ڈاؤن ریگولیٹڈ جین بنیادی طور پر (مدافعتی) سیل ایکٹیویشن اور exocytosis/ سراو (ضمنی جدول S1) میں شامل تھے۔ ممالیہ فینوٹائپ آنٹولوجی نے گردے کے غیر معمولی کارٹیکس اور رینل کارپسکل مورفولوجی کی نشاندہی کی جس کی وجہ Pdgfb، Podxl، Ren، Ptpro، Mafb، اور Vegfa (ضمنی جدول S1) جیسے گھٹے ہوئے جینوں کی وجہ سے ہے۔ کئی جینز، جیسے Angptl4، Spon2 (Mindin)، Pappa، اور Txnip، جو ذیابیطس نیفروپیتھی [33-36] میں اپ ریگولیٹ ہوتے دکھایا گیا ہے، کا رینل ایکسپریشن ہائپرگلیسیمک حالات میں بڑھا ہوا پایا گیا۔ ہائی گلوکوز کڈنی کلچر جین ایکسپریشن پروفائل کا انسانی ڈی این سے موازنہ کرنے کے لیے، ڈی جی ای ڈیٹا کو یورپی رینل سی ڈی این اے بینک (ERCB) سے ذیابیطس نیفروپیتھی کے مریض کے بایپسیوں سے مائیکرو ڈسیکٹڈ گلوومیرولی اور ٹیوبلز کے انسانی ڈیٹا سے ملایا گیا۔ بیچ کے تجزیے کے بعد مماثل 216 امتیازی طور پر ریگولیٹڈ جینز میں سے، 94 جینوں کو گلوومیرولر اور/یا نلی نما فریکشن (شکل 2G) میں اسی طرح سے الگ الگ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ ہمارے ماڈل اور انسانی DNgenes کے اوورلیپ نے 95 میں سے 40 جین گلوومیرولی میں اور 34 جین نلیوں میں (25 جین مشترک) (شکل 2H) کو ظاہر کیا۔ جین زیادہ تر ایکسٹرا سیلولر میٹرکس تنظیم (COL4A5، COL4A6، COL8A2، LAMB3، LAMC3) اور سیل آسنجن (ITGBL1، CLDN15) میں شامل تھے۔ مزید برآں، ذیابیطس سے وابستہ جین جیسے TXNIP، SPON2، اور PAPPA کو الگ کر دیا گیا تھا۔ گردے کی ثقافتوں میں سے 120 میں سے 22 کو گرے ہوئے جینز کو گلوومیرولی میں بھی کم کیا گیا تھا اور 39 کو نلیوں میں بھی کم کیا گیا تھا (16 کامن میں (شکل 2I)۔ یہ جین اینڈوجینس محرک (BMP2، KLF15) کے ردعمل میں شامل تھے۔ JUNB، CTSB)، نیفرون اپیتھیلیم ڈویلپمنٹ (PTPRO، PODXL، VEGFA)، اور اینڈوتھیلیل سیل کیموٹیکسس (LGMN، P2RX4، VEGFA) کا مثبت ضابطہ۔ مزید برآں، ذیابیطس سے وابستہ جینز جیسے RASGRP3، SIRPA، GATM، اور ESM1 میں کمی آئی۔ 37-39]۔ ERCB ڈیٹا کے ساتھ متفرق طور پر ریگولیٹڈ جینز بھی ذیابیطس سے وابستہ تبدیلیوں کی عکاسی کرتے ہیں، جیسے ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) یا حمل ذیابیطس (LAT2, HP, CXCL10, CD{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1) اس طرح، اعلی گلوکوز کے حالات میں گردوں کی نشوونما نے انسانی بالغ ذیابیطس نیفروپیتھی کے ساتھ نمایاں مماثلت ظاہر کی۔

چترا 2۔ ایکس ویوو ہائی گلوکوز کی نمائش سے نشوونما پذیر گردے میں ذیابیطس نیفروپیتھی سے وابستہ تبدیلیاں آتی ہیں۔(A) Pod.Cre سے ایمبریونک گردے؛ ٹماٹر/ای جی ایف پی جانور کم گلوکوز (ایل جی، 5.5 ایم ایم -ڈی-گلوکوز، 55 ایم ایم مینیٹول) یا زیادہ گلوکوز (ایچ جی، 55 ایم ایم -ڈی-گلوکوز) کی حالتوں میں 7 دن تک پالتے ہیں۔ اسکیل بار: 500 um.(B)HG اور LG حالات کے گردے کی سطح کا رقبہ۔*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">

2.3۔ سابق Vivo ہائی گلوکوز کی نمائش DNA میتھیلیشن کے ذریعے طویل مدتی میموری کی تشکیل پر اثر انداز ہوتی ہے۔

ہائپرگلیسیمک ماحول کے ذریعے ہونے والی مالیکیولر تبدیلیوں کو مزید سمجھنے کے لیے، گردے کی ثقافتیں 3.5 دن کے لیے ہائی گلوکوز کی حالت میں اگائی گئیں اور پھر اسی وقت کے لیے کم گلوکوز کی حالت میں تبدیل ہوئیں (شکل 3A)۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ ہائی گلوکوز میڈیم میں انکیوبیشن کی مختصر مدت کے بعد جسمانی حالات میں انکیوبیشن نے کلچر میں 7 دن کے بعد ترقی میں کمی کو ریورس نہیں کیا اور ثقافتیں اسی شرح سے بڑھ رہی ہیں جیسے مسلسل ہائی گلوکوز ٹریٹمنٹ (شکل 3B) کے تحت۔ مزید برآں، ڈی این اے میتھیلیشن نے لائن-1 عنصر اور بڑے سیٹلائٹ لوکی (فگر 2C، D) کے ہائپو میتھیلیشن کے ساتھ ساتھ Ppargcla پروموٹر کے پائیدار DNA ہائپرمیتھیلیشن کو دکھایا، دونوں ہائی گلوکوز اور الٹ حالات (شکل 3E) کے تحت ڈی این اے میتھیلیشن کے ذریعے میٹابولک میموری کی تشکیل جنین پروگرامنگ کے ذریعہ پہلے کے منفی ماحولیاتی حالات کی وجہ سے۔

شکل 3۔ ایکس ویوو ہائی گلوکوز کی نمائش DNA میتھیلیشن کے ذریعے طویل مدتی میموری کی تشکیل کو متاثر کرتی ہے۔(A) کم گلوکوز میڈیم (5.5 ایم ایم)، ہائی گلوکوز میڈیم (55 ایم ایم)، یا ہائی گلوکوز میڈیم میں دن 0 سے لے کر 7ویں دن تک E12.5 ایمبریونک گردوں کی امیجنگ اور کم گلوکوز میڈیم میں تبدیل باقی دنوں کے لیے۔ اسکیل بار: 500 ام۔ (B) گردے کی سطح کا رقبہ 7 دنوں سے زیادہ۔ مطلب ± SD۔ n=36 گردے۔ LG، کم گلوکوز علاج؛ HG، ہائی گلوکوز کا علاج؛ HG سے LG، 3.5 دن زیادہ اور 3.5 دن کم گلوکوز کا علاج۔***,LG-HG (بغیر جوڑا ٹی-ٹیسٹ):p=0.0004;**,LG-HG سے LG (جوڑا ٹی-ٹیسٹ) :p<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">

2.4.Ex Vivo Small Compound Screen Renal Development کے Epigenetic Regulators کی شناخت کرتی ہے

اس کام کے ساتھ ساتھ پچھلے کام کے نتائج بتاتے ہیں کہ ایپی جینیٹک میکانزم گردے کی نشوونما میں کردار ادا کرتے ہیں [30, A40-45]۔ لہذا، ہم گردوں کی نشوونما پر مختلف انزائم کلاسوں کے ایپی جینیٹک ماڈیولٹرز کے اثر کا منظم انداز میں جائزہ لینا چاہتے تھے۔ اس کے لیے، ہم نے FDA سے منظور شدہ 22 چھوٹے مرکبات کی ایک لائبریری کا انتخاب کیا جس میں نمائشی روک تھام کی سرگرمی [46-56](شکل 4A) ہے۔ Nephron کی نشوونما کا جائزہ لینے کے لیے Six2.Cre-reporter چوہوں کا استعمال کرتے ہوئے، گردوں کے ڈھانچے کو درمیانے درجے میں روکنے والوں کے ساتھ 3 دن تک کلچر کیا گیا۔ لیٹر میٹ کنٹرول اعضاء کے مقابلے میں وقت کے ساتھ سائز میں اضافہ ہوتا ہے، اور مورفولوجی کو ترقی میں اسامانیتاوں کے لیے چیک کیا گیا تھا (شکل 4B)۔ کئی inhibitors کو عام سابق ویوو گردوں کی نشوونما میں مداخلت کرتے ہوئے دکھایا جا سکتا ہے۔ HDAC inhibitor entinostat، HDAC1,2 اور 3 [57] کے ساتھ اعلی تعلق کے ساتھ ایک بینزامائڈ ہسٹون ڈیسیٹیلیز انحیبیٹر، 3 دن کے بعد مسلسل ترقی میں کمی اور تفریق اور پھیلاؤ کی کمی کو ظاہر کرتا ہے (شکل 4C)۔ TH39 کو ایک منتخب HDAC8 inhibitor کے طور پر تیار کیا گیا ہے۔ HDAC8 88 nM، 26-HDAC1 کے خلاف فولڈ سلیکٹیو،28-HDAC6 کے خلاف فولڈ سلیکٹیو[56])، لیٹر میٹ کنٹرول اعضاء کے مقابلے میں ترقی کی اسی طرح شدید روک تھام کو ظاہر کرتا ہے۔ مزید برآں، JmJC deferasirox اور deferoxamine کے آئرن chelators اور inhibitors نے نمو میں کمی کو لوہے کی کمی والے میڈیم کے مطابق دکھایا۔ مزید برآں، SET7/9 inhibitor cyproheptadine [58,59] نے کنٹرول کڈنی (فگر 4D) کے مقابلے نمو میں کمی اور تفریق اور پھیلاؤ کی کمی کو ظاہر کیا لیکن ایسا لگتا ہے کہ Wnt سگنلنگ (ضمنی شکل S3) میں بھی مداخلت کرتا ہے۔ دیگر HDAC، HAT، HDM، اور HMT inhibitors، اور DNMT inhibitor 5-azacytidine نے نمو میں کمی یا ترقی کی بے ضابطگیوں کو ماپا وقت کے اندر نہیں دکھایا (شکل 4A)۔

شکل 4۔ سابق ویوو چھوٹی کمپاؤنڈ اسکرین گردوں کی نشوونما کے ماڈیولٹرز کی نشاندہی کرتی ہے۔(A)چھوٹے مرکبات کی فہرست، ان کے ایپی جینیٹک اہداف، اور استعمال شدہ ارتکاز entinostat، TH39، deferasirox، deferoxamine، اور cyproheptadine کے ساتھ کلچر میں 3 دن کے بعد 3 آزاد تجربوں سے زیادہ یا اس کے برابر میں گردوں کی نشوونما میں کمی کو ظاہر کرتا ہے۔ کنٹرول ثقافتوں کا علاج DMSO کے ساتھ کیا گیا۔ ***، پی ویلیو<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">

حصہ Ⅱ کے لیے یہاں کلک کریں۔