حصہ 1: گردے کے اسکیمیا ریپرفیوژن کے بعد غیر نامیاتی نائٹریٹ کے رینوواسکولر اثرات

مزید معلومات کے لیے۔ رابطہtina.xiang@wecistanche.com

خلاصہ

پس منظر: رینل اسکیمیا ریپرفیوژن (IR) کی چوٹکی ایک عام وجہ ہےشدید گردے کی چوٹ(AKI)، جو آکسیڈیٹیو تناؤ اور کم نائٹرک آکسائیڈ (NO) بایو ایکٹیویٹی، اور ترقی کے بڑھتے ہوئے خطرے سے وابستہ ہے۔دائمی گردے کی بیماری(CKD) اور قلبی امراض (CVD)۔ ریڈوکس بیلنس کو بحال کرنے والی نئی حکمت عملیوں کے AKI اور اس سے منسلک پیچیدگیوں کے دوران علاج کے مضمرات ہو سکتے ہیں۔

مقصد: IR-حوصلہ افزائی گردوں اور قلبی dysfunction کی نشوونما کے دوران نائٹریٹ-نائٹریٹ-NO کے راستے کو بڑھانے کے علاج کی قدر کی چھان بین کرنا۔

طریقے: مرد C57BL/6 J چوہوں کو سوڈیم نائٹریٹ (10 mg/kg,ip) یا گاڑی کو بائیں گردے کے گرم اسکیمیا (45 منٹ) سے 2 گھنٹے پہلے دیا گیا تھا جس کے بعد پینے کے پانی میں سوڈیم نائٹریٹ کی اضافی خوراک دی گئی تھی (1 mmol/kg/ دن) مندرجہ ذیل 2 ہفتوں کے لئے۔ بلڈ پریشر اور گلوومیرولر فلٹریشن کی شرح کی پیمائش کی گئی اور خون اور گردے جمع کیے گئے اور بائیو کیمیکل اور ہسٹولوجیکل تجزیوں کے ساتھ ساتھ گردوں کے برتنوں کے رد عمل کے مطالعے کے لیے استعمال کیے گئے۔ انجیوٹینسن Ⅱ کے ساتھ یا اس کے بغیر ہائپوکسیا-ری آکسیجن کے سامنے آنے والے گلومیرولر اینڈوتھیلیل خلیات میکانکی مطالعات کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔

نتائج: IR گردوں کی چوٹوں، سوزش، endothelial dysfunction، Ang Ⅱ کی سطح میں اضافہ، اور Ang II- ثالثی vasoreactivity کے ساتھ مل کر، گردوں کے کام میں کمی اور بلڈ پریشر میں قدرے بلند ہونے کے ساتھ منسلک تھا، جو سب نائٹریٹ کے ذریعے بہتر ہوئے تھے۔ مزید برآں، نائٹریٹ (ان ویوو) اور نائٹریٹ (ان وٹرو) کے ساتھ علاج نے NO بائیو ایکٹیویٹی کو بحال کیا اور مائٹوکونڈریل آکسیڈیٹیو تناؤ اور چوٹوں کو کم کیا۔

نتائج: رینل اسکیمیا سے پہلے غیر نامیاتی نائٹریٹ کے ساتھ شدید علاج AKI اور CKD کو روکنے کے لیے ایک نئے علاج کے طریقہ کار کے طور پر کام کر سکتا ہے اور اس کی نشوونما کے متعلقہ خطرے کوقلبی dysfunction.

cistanche کے تجربے کے لیے سپلائر تک پہنچنے کے لیے کلک کریں۔

1. تعارف

گردے کی اسکیمیا ریپرفیوژن (IR) کی چوٹ، جو ٹرانسپلانٹیشن، کارڈیک بائی پاس سرجری، اور جھٹکا سے وابستہ ہے، گردے کی شدید چوٹ (AKI) اور اس کے نتیجے میں گردے کی دائمی بیماری (CKD) پیدا ہونے کا ایک بڑا خطرہ ہے [1]۔ بنیادی میکانزم پیچیدہ ہیں اور ان میں ریفرفیوژن سے وابستہ آکسیڈیٹیو تناؤ، نائٹرک آکسائیڈ کی کمی، اور مدافعتی خلیوں کی ایکٹیویشن شامل ہے، جو مل کر اینڈوتھیلیل dysfunction کا باعث بنتے ہیں [2, 3]۔ جاری تحقیق میں AKI کی روک تھام اور علاج اور CKD میں اس کی ترقی کے لیے نئے اور موثر علاج تلاش کرنے پر توجہ مرکوز کی گئی ہے، جیسے کہ ریموٹ اسکیمک پری کنڈیشننگ، عارضی مقامی ہائپوتھرمیا کے ساتھ ساتھ نئی فارماسولوجیکل مداخلتیں [3,4]۔

گیسی سگنلنگ مالیکیول نائٹرک آکسائیڈ (NO) قلبی اور گردوں کے ہومیوسٹاسس کے ضابطے میں اہم کردار ادا کرتا ہے اور اسے IR کی چوٹوں کے دوران حفاظتی کردار ادا کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے [5,6]۔ تاہم، اسکیمک ایونٹ کے دوران، آکسیجن کی کمی اینڈوتھیلیل NO سنتھیس (eNOS) کے کام سے سمجھوتہ کرتی ہے، جو ریپرفیوژن مرحلے کے دوران اسکیمک ٹشو میں "نو ریفلو رجحان" میں حصہ ڈال سکتی ہے۔ اس کے نتیجے میں اینڈوتھیلیل اور نلی نما اپیتھیلیل سیل کی چوٹوں کو پھیلایا جاتا ہے [7]، جو گردے کے افعال کو کم کرنے میں معاون ہوتے ہیں۔ اسکیمک مدت کے دوران ہائپوکسیا کے علاوہ، ریپرفیوژن مرحلے کے دوران نیکوٹینامائڈ ایڈنائن ڈائنوکلیوٹائڈ فاسفیٹ (NADPH) آکسیڈیز اور مائٹوکونڈریا کے ذریعہ اضافی طور پر پیدا ہونے والی رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کی ضرورت سے زیادہ پیداوار NO [8] کو ختم کرتی ہے۔ نئے طریقے جو آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کرتے ہیں اور NO بایو ایکٹیویٹی کو برقرار رکھتے ہیں وہ IR کی حوصلہ افزائی گردے کی ناکامی کے خلاف جنگ میں علاج کی اہمیت رکھتے ہیں۔

غیر نامیاتی نائٹریٹ (NO3) اور نائٹریٹ (NOZ) کو پہلے NO میٹابولزم سے اخذ کردہ نسبتاً غیر فعال مصنوعات کے طور پر دیکھا جاتا تھا۔ تاہم، دو دہائیوں سے زائد عرصے تک کی جانے والی تحقیق نے یہ ظاہر کیا ہے کہ یہ اینونز بایو کنورژن سے گزر سکتے ہیں، سیریل کمی کے ذریعے، اور دوبارہ NO اور دیگر بائیو ایکٹیو نائٹروجن آکسائیڈ پرجاتیوں کو تشکیل دے سکتے ہیں [9]۔ اس متبادل نائٹریٹ-نائٹریٹ-NO راستے کی سرگرمی ہائپوکسیا اور کم پی ایچ کے حالات کے دوران بڑھ جاتی ہے جب کلاسیکی NOS سسٹم غیر فعال ہو سکتا ہے [10]۔

خوراک، NOS نظام کے علاوہ، نائٹریٹ اور نائٹریٹ گردش کرنے کا ایک اہم ذریعہ ہے، مثال کے طور پر سبز پتوں والی سبزیوں میں نائٹریٹ کی اعلی سطح کی وجہ سے۔ غیر نامیاتی نائٹریٹ اور نائٹریٹ کے ساتھ ضمیمہ سازگار قلبی اثرات کے ساتھ منسلک کیا گیا ہے، بشمول بلڈ پریشر میں کمی، تجرباتی اور طبی مطالعہ [11]۔ اعضاء کے حفاظتی اثرات جگر [12]، دماغ [13]، پھیپھڑوں [14]، اور دل [12,15] کے تجرباتی IR چوٹ کے ماڈلز میں بھی دکھائے گئے ہیں۔ تاہم، گردے کے IR کی چوٹ میں غیر نامیاتی نائٹریٹ اور نائٹریٹ کی ممکنہ علاج کی قدر متنازعہ ہے۔ جیسا کہ حال ہی میں جائزہ لیا گیا ہے [5]، IR ماڈلز میں متغیر نتائج، نائٹریٹ تھراپی کا استعمال کرتے ہوئے، شاید استعمال شدہ خوراک، انتظامیہ کے راستے، علاج کی مدت، نیز تجرباتی ماڈل خود [16,17] میں فرق کی وجہ سے۔ کئی تجرباتی مطالعات نے قلبی بیماری کے ماڈلز میں غذائی نائٹریٹ کی تکمیل کے حفاظتی اثرات کو ظاہر کیا ہے، ایسے میکانزم کے ذریعے جس میں آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کرنا اور NO بائیو ایکٹیویٹی میں بہتری کے ساتھ ساتھاشتعال انگیز ردعمل[5]۔ آج تک، گردوں کی IR کی چوٹ میں غیر نامیاتی نائٹریٹ تھراپی کے اثرات کے بارے میں محدود معلومات ہیں۔ ہم نے پہلے یہ ظاہر کیا ہے کہ نائٹریٹ کے ساتھ دائمی غذائی علاج سے بعد میں آئی آر کی حوصلہ افزائی گردوں کی چوٹوں کو کم کیا جاتا ہے [18]۔ تاہم، AKI اور CKD کی ترقی کے خطرے کو کم کرنے کے لیے IR کے آغاز میں نائٹریٹ-نائٹریٹ-NO کے راستے کو بڑھانے کی ممکنہ قدر کے بارے میں کم علم ہے۔ اگر حفاظتی ہے، تو اس سے AKI کی نشوونما کے خطرے والے مریضوں میں وسیع کلینیکل ایپلی کیشنز ہو سکتی ہیں، مثال کے طور پر جو بڑی سرجری سے گزر رہے ہیں۔

اس مطالعہ میں، ہم نے اسکیمک واقعہ سے فوراً پہلے شدید نائٹریٹ علاج کے ممکنہ فوائد کی چھان بین کے لیے گردوں کی IR کی چوٹ کے ماؤس ماڈل کا استعمال کیا۔ اس کو میکانسٹک ایکس ویوو ویسل اسٹڈیز اور ان وٹرو سیل کلچر تجربات کے ساتھ نائٹریٹ ٹریٹمنٹ کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ ہم نے قیاس کیا کہ نائٹریٹ-نائٹریٹ-NO پاتھ وے کو بڑھانا آکسیڈیٹیو تناؤ اور NO بائیو ایکٹیویٹی کے ساتھ ساتھ مائٹوکونڈریل فنکشن میں ترمیم کے ذریعے IR چوٹ کے خلاف گردے کے تحفظ کو فروغ دے گا۔

2. طریقے

2.1۔ریجنٹس

جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا جائے، تمام ریجنٹس سگما-الڈرچ، سویڈن سے حاصل کیے گئے تھے۔

2.2 جانور اور گردے کی اسکیمیا ریپرفیوژن ماڈل

C57BL/6 J چوہے (مرد، 10 ہفتے) جانویئر لیبارٹریز (فرانس) سے حاصل کیے گئے تھے اور کیرولنسکا انسٹی ٹیوٹ میں ہمارے جانوروں کی سہولیات میں آب و ہوا کے زیر کنٹرول حالات میں 12-گھنٹہ روشنی/تاریک چکر کے ساتھ رکھا گیا تھا اور فراہم کیا گیا تھا۔ معیاری چوہا چاؤ اور نلکے کے پانی کے ساتھ۔ جانوروں کے تمام طریقہ کار کو علاقائی اخلاقی کمیٹی برائے جانوروں کے تجربات (پروٹوکول ID: N139/15) کے ذریعے منظور کیا گیا تھا اور یہ نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ (NIH) کے رہنما خطوط کے مطابق اور EU کے ہدایت نامہ 2010/63/EU کے مطابق کیے گئے تھے۔ جانوروں میں تجربات.

ہم آہنگی کے 1 ہفتہ کے بعد، چوہوں کو بائیں گردے کے یکطرفہ اسکیمیا سے 2 گھنٹے پہلے پلیسبو (NaCl) یا سوڈیم نائٹریٹ (NaNO3) انٹراپریٹونی طور پر (10 ملی گرام/کلوگرام) دیا گیا۔ دائیں گردے کا معائنہ کیا گیا لیکن بصورت دیگر وہ برقرار ہے۔ شام کی سرجری بھی اسی طرح کی گئی، لیکن بائیں گردے کو بند کیے بغیر۔ چوہوں کو isoflurane کے ساتھ بے ہوشی کی گئی تھی اور جسم کا درجہ حرارت 37 ± 0.5 ڈگری پر رکھا گیا تھا ایک ہیٹنگ لیمپ اور ایک خود نگرانی شدہ ہیٹنگ پیڈ کا استعمال کرتے ہوئے پوری سرجری کے دوران۔ سرجری کے بعد، چوہوں کا علاج یا تو سوڈیم نائٹریٹ (1 ملی میٹر/کلوگرام/دن) یا پلیسبو سے 2 ہفتوں تک کیا گیا جب تک کہ وہ ختم نہ ہو جائیں۔

2.3۔ بلڈ پریشر کی پیمائش

چوہوں میں بلڈ پریشر کو ختم کرنے سے پہلے ایک غیر حملہ آور ٹیل-کف طریقہ استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ چوہوں کو 35 ڈگری سینٹی گریڈ پر 10 منٹ کے لیے گرم پلیٹ میں کنڈیشنڈ کیا گیا اور پھر پلاسٹک ریسٹرینرز میں رکھا گیا۔ نیومیٹک پلس سینسر والا کف دم کے ساتھ منسلک تھا، اور بلڈ پریشر کی قدریں CODA سسٹم (کینٹ سائنٹیفک، ٹورنگٹن، سی ٹی، یو ایس اے) کے ساتھ ریکارڈ کی گئیں۔ خون کے دباؤ کی ریکارڈنگ سے کم از کم تین دن پہلے جانوروں کو وارمنگ پلیٹ پر روکنے والوں کے ساتھ تربیت دی گئی تھی۔ سسٹولک، ڈائیسٹولک، اور اوسط آرٹیریل پریشر کو لگاتار 3 دنوں میں جمع کیا گیا تھا اور تمام قبول شدہ اقدار کے انفرادی میڈین کو تشخیص کے لیے مرتب کیا گیا تھا۔

2.4 ٹشو کی کٹائی

ختم ہونے سے پہلے، چوہوں کو میٹابولک پنجروں میں ڈال دیا گیا تاکہ گلوومیرولر فلٹریشن ریٹ (GFR) کے حساب سے پیشاب جمع کیا جا سکے۔ پھر جانوروں کو isoflurane کے ساتھ بے ہوشی کی گئی اور خون کے نمونے کمتر وینا کاوا کے ذریعے جمع کیے گئے۔ تمام نمونوں کو فوری طور پر 6000×g، 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر 5 منٹ کے لیے EDTA (Sigma-Aldrich، Stockholm، Sweden) کی موجودگی میں، 2 mM کی حتمی حراستی میں سینٹرفیوج کیا گیا۔ پلازما کے نمونوں کو نئی ٹیوبوں میں منتقل کیا گیا اور فوری طور پر خشک برف میں منجمد کیا گیا اور آخر میں -80 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا۔ سابق ویوو ویسکولر فنکشن تجربات (انٹرلوبار شریانوں اور ملحقہ شریانوں)، ہسٹولوجی (انٹرلوبار آرٹریز اور ایفیرینٹ آرٹیریولز) کے لیے گردوں کو نکالا اور کئی حصوں میں کاٹا گیا۔ HE اور PAS سٹیننگ)، اور اپوپٹوسس اور سوزش کی مقدار کا تعین (Tissue-Tek optimum cutting tempera-ture(OCT) کمپاؤنڈ ایمبیڈنگ اور TUNEL اور F4/80 سٹیننگ کے لیے منجمد)۔

2.5 نائٹریٹ، نائٹریٹ، سی جی ایم پی، کریٹینائن، بلڈ یوریا نائٹروجن (BUN) اور انجیوٹینسن II کی پیمائش

نائٹریٹ اور نائٹریٹ کا تجزیہ HPLC(ENO-20) نے کیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے 【19】۔ پلازما کے نمونے (10 ul کو ہیملٹن سرنج کے ساتھ HPLC سسٹم میں انجکشن لگایا گیا تھا۔ اس کے بعد، نائٹریٹ اور نائٹریٹ کو ریورس فیز/آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی کے ذریعے الگ کیا گیا جس کے بعد کیڈمیم کے ذریعے نائٹریٹ میں کمی اور تانبے کو کم کیا گیا۔ نائٹرائٹ کو ڈیازو مرکبات بنانے کے لیے گریس ری ایجنٹ کا استعمال کرتے ہوئے اخذ کیا گیا تھا اور 540 این ایم پر پتہ چلا تھا۔ cGMP کے انحطاط کو روکنے کے لیے، پلازما کو PDE inhibitor، BMX(3-Isobutyl-1methylxanthine؛ Sigma-Aldrich #I5879）) پر مشتمل ٹیوبوں میں منتقل کیا گیا تاکہ حتمی حراستی （10 μM）۔ نمونے تھے۔ اس کے بعد مینوفیکچررز کی ہدایات کے مطابق، ELISA کٹ (GE Healthcare #RPN226) کے ساتھ cGMP کا تجزیہ کرنے سے پہلے{10}} ڈگری پر منجمد اور ذخیرہ کیا جاتا ہے۔

پلازما اور پیشاب میں کریٹینائن کی سطحوں کا پتہ کریٹینائن کلوریمیٹرک آسے کٹس (کیمین کیمیکل، #700460 اور #500701) کے ذریعے کیا گیا۔ کریٹینائن کلیئرنس فارمولہ (CLcr =Urinecrx پیشاب کا بہاؤ/Plasmacr) GFR کا تخمینہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ BUN Colorimetric Detection Kit (Invitrogen,#EIA-BUN) کے ذریعے پلازما BUN کی سطح کا پتہ لگایا گیا۔ پلازما اور گردے کے ٹشوز میں Ang کی سطح Ang ⅡI ELISA kit (Cloud-Clone Corp.,# CEA005Mu) کا استعمال کرتے ہوئے مینوفیکچررز کی ہدایات کے مطابق ماپا گیا۔ تاہم، ٹشو ایکسٹریکٹ کی تیاری سفارش سے تھوڑا مختلف تھی۔ 50 فیصد EtOH میں 10 والیوم 50 mM HCl کو ٹشو میں شامل کیا گیا اور 10 منٹ کے لیے 100 ڈگری پر گرم کیا گیا، سینٹرفیوجڈ 10 000×g 10 منٹ۔ اس کے بعد نمونوں کو منجمد کر دیا گیا اور تجزیہ کرنے سے پہلے-80 ڈگری پر محفوظ کر لیا گیا۔ تمام جاذب ریڈنگ مالیکیولر ڈیوائسز سے SpextraMax iD3 میں کی گئیں۔

2.6۔ انٹرلوبار شریانوں کی تنہائی اور پرفیوژن

قربانی کے بعد گردوں کی کٹائی کی جاتی تھی اور اسے برف کے ٹھنڈے جسمانی نمک کے محلول (PSS) میں رکھا جاتا تھا جب تک کہ انٹرلوبار شریانوں کو الگ نہ کیا جائے۔ رینل انٹرلوبار شریانوں کو الگ کیا گیا تھا (لمبائی میں 2 ملی میٹر) اور اے میں نصب کیا گیا تھا۔

myograph چیمبر (ماڈل 620 M, Danish Myo Technology, Danmark) PSs کے ساتھ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [20]۔ Isometric تناؤ کو پاور لیب سسٹم (Powerlab 4/30، AD Instruments, Australia) کے ساتھ ریکارڈ کیا گیا تھا۔ نصب ہونے کے بعد، برتنوں کو 20 منٹ کے لیے پی ایس ایس میں کاربوجن (95 فیصد O2؛ 5 فیصد CO2) کے ساتھ 37 ڈگری، پی ایچ 7.4 پر متوازن کیا گیا۔ مولوی کے معمول کے طریقہ کار کے مطابق [22]۔ دوسرے توازن کے بعد، 0.1 mol/L KCl آرٹیریل رِنگ کی قابل عملیت کا اندازہ لگانے کے لیے لاگو کیا گیا۔

2.7۔ افرینٹ شریانوں کی تنہائی اور مائیکرو پرفیوژن

C57BL/6 J چوہوں کو سانس میں لی جانے والی isoflurane کے ساتھ اینستھیٹائز کیا گیا اور گردے نکال کر جلدی سے کاٹ دیے گئے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [23-25]۔ گردے کے ٹکڑوں کو آئس کولڈ ڈلبیکو کے ترمیم شدہ ایگل میڈیم (DMEM) میں رکھا گیا تھا۔ منسلک گلوومیرولس کے ساتھ ایک واحد افرینٹ آرٹیرول کو سٹیریومیکروسکوپ کے تحت مائیکرو ڈسیکٹ کیا گیا تھا اور اسے منتقل کیا گیا تھا۔

الٹی خوردبین کے اسٹیج پر درجہ حرارت کو منظم کرنے والا چیمبر۔ گلوومیرولس کو ایک ہولڈنگ مائکروپیپیٹ کے ساتھ طے کیا گیا تھا اور افرینٹ آرٹیرول کو کینول کیا گیا تھا اور مائکروپیپیٹس کے ایک سیٹ سے پرفیوز کیا گیا تھا۔ تجربات کے دوران پرفیوزڈ ایفیرنٹ آرٹیرول کا انٹرا لومینل پریشر 60 mmHg پر برقرار رکھا گیا۔ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے ماؤس کی قربانی کے بعد ڈسیکشن اور مندرجہ ذیل مائکرو پرفیوژن کا وقت 120 منٹ تک محدود تھا۔ 37 ڈگری پر 30 منٹ کے توازن کی مدت کے بعد، Ang II (10-12 سے 10-8 mol/L) کے لیے مجموعی خوراک کے ردعمل کے منحنی خطوط حاصل کیے گئے۔ Ang II کی ہر حراستی کو 2 منٹ کے لئے پرفیوز کیا گیا تھا، محدود ردعمل کو ریکارڈ کیا گیا تھا اور پھر افرینٹ آرٹیرول کا قطر ناپا گیا تھا۔

2.8۔ ہسٹولوجیکل معائنہ

گردے کے نمونے 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ محلول میں حاصل کیے گئے تھے۔ گردے کے فکسڈ ٹشوز کو پیرافین میں سرایت کیا گیا تھا اور اس کے بعد ہسٹولوجیکل اسسمنٹ کے لیے ہیماتوکسیلین-ایوسین (H&E) یا پیریڈک ایسڈ شِف (PAS) کے ساتھ کاٹا اور داغ دیا گیا تھا۔ ہر تجرباتی گروپ سے تصادفی طور پر منتخب کردہ چار جانور تجزیہ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ ہر سیکشن سے تصادفی طور پر منتخب کیے گئے دس فیلڈز 400× میگنیفیکیشن کے تحت حاصل کیے گئے تھے۔ تمام مورفومیٹرک تجزیے اندھے انداز میں کیے گئے تھے۔

2.9 TUNEL داغ

TUNEL داغدار ہونے کے لیے OCT- ایمبیڈڈ گردے کے نمونے استعمال کیے گئے تھے۔ 6-μm موٹے حصوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لیے 20ug/mL proteinase K کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا، اور مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے Click-iTTM Plus TUNEL Assay (Invitrogen C10618, USA) کا استعمال کرتے ہوئے TUNEL کے رد عمل کا مظاہرہ کیا گیا۔ پروٹوکول کے اختتام پر، ڈی اے پی آئی اسٹیننگ کی گئی۔ مقدار کے تعین کے لیے، تصویر کے تین جانوروں اور تین فیلڈ ایریاز (200 ×) کو تصادفی طور پر منتخب کیا گیا اور Zeiss LSM800-Airy confocal microscope کا استعمال کرتے ہوئے تصویر کشی کی گئی، ImageJ/Fiji سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے مثبت سگنلز کی مقدار درست کی گئی، اور ان کا حساب DAPI میں مثبت سگنلز کا تناسب۔

2.10 ٹشو امیونو فلوروسینس سٹیننگ اور کنفوکل مائکروسکوپی (F4/80)

OCT (ٹشو-ٹیک، ٹورینس، CA، USA) میں گردے منجمد کیے گئے تھے اور سیکشن (6 μm) تیار کیے گئے تھے اور مزید کارروائی کی گئی تھی۔ منجمد حصوں کو 1× PBS سے دھویا گیا اور PBS میں 2 فیصد BSA کے ساتھ 30 منٹ کے لیے بلاک کر دیا گیا اور پھر اینٹی F4/80 (1:50، BIO-RAD Cl: A3-1) کے ساتھ راتوں رات 4 ڈگری میں انکیوبیٹ کیا گیا۔ ٹھنڈا کمرہ، اور اس کے بعد ثانوی اینٹی باڈی (1:200 سیل سگنلنگ ٹیک #4417) کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے، اس کے بعد 300 nmol/L DAPI(4'6-diamidino-2-فینائل کے ساتھ کاؤنٹرسٹیننگ -انڈول، ڈائی ہائڈروکلورائیڈ، انویٹروجن) 3 منٹ کے لیے۔ امیونو فلوروسینس سگنلز زیس LSM800-ایری کنفوکل مائکروسکوپ کے تحت دیکھے گئے تھے۔ تصویر کے تین جانور اور تین فیلڈ ایریا (200×) تصادفی طور پر منتخب کیے گئے تھے۔ F4/80 مثبت سگنل امیج جے/فجی سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کیے گئے اور DAPI کے مثبت سگنلز کے تناسب کے طور پر شمار کیے گئے۔

2.11۔ سیل کلچر

چوہے کے گلوومیرولر اینڈوتھیلیل سیلز (جی ای سی) (DSMZ ACC262، جرمنی) RPMI1640 (Gibco 21870-076) میڈیم میں 10 فیصد فیٹل بوائین سیرم اور 2 m ML-Glutamine (Gibco 25030-082)، پینسلن اور سٹریپٹومائسن کے ساتھ کلچر کیے گئے تھے۔ (50 mg/L، Gibco 15140-122)۔ 5 فیصد CO2 کے مرطوب ماحول میں خلیوں کو 37 ڈگری پر برقرار رکھا گیا۔ ہائپوکسیا کے تجربات میں، خلیات کو سیرم فری میڈیم کے بجائے HBSS(Gibco 14025-092) میں ایک چیمبر میں 1 فیصد آکسیجن کے ساتھ 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ خلیوں کو ہائپ آکسیا سے 30 منٹ پہلے نائٹریٹ （10 μM، xanthine oxidoreductase (XOR) inhibitor febuxostat (100 nM کے بغیر) کے ساتھ پہلے سے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ سیل کی قابل عملیت کا اندازہ PrestoBlue⑧ پرکھ (انویٹروجن، A13261، اور A13262) کے ذریعے کیا گیا، اور خلیے کی اموات کا اندازہ ٹریپن بلیو اخراج پرکھ (سگما، T8154-20 ML) کے ذریعے کیا گیا۔

2.12۔ مائٹوکونڈریل ROS کا پتہ لگانا

فلوروجینک ڈائی (MitoSOXTM، Invitrogen M36008) کے ساتھ مائٹوکونڈریل سپر آکسائیڈ کی سطح کا پتہ چلا۔ علاج کے بعد، اینڈوتھیلیل سیلز کو کلچر میڈیم میں 2 μmol/L MitoSox کے ساتھ 37 ڈگری پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد خلیوں کو 1×HBSS سے دو بار دھویا گیا اور فلوروسینٹ سگنل کی پیمائش کی گئی (SpectraMax iD3 ریڈر، مالیکیولر ڈیوائسز، USA) اور سیل کی قابل عملیت کو معمول پر لایا گیا۔

2.13۔ امیونو بلاٹنگ تجزیہ

منجمد گردے کے نمونے یا اینڈوتھیلیل خلیوں کو بفر میں لیس کیا گیا تھا جس میں 10 mmol/L Tris-HCl pH 8، 150 mmol/L NaCl، 5 mmol/L EDTA، 60 mmol/L N-octyl-glucoside، 1 فیصد Triton X{{9 }}، protease inhibitor cocktail، اور protein phosphatase inhibitors. سیل یا ٹشو لائسیٹس کو 5 منٹ کے لیے 10،000×g 4 ڈگری پر سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ سپرنٹنٹس/پروٹینز کو نئی ٹیوبوں میں منتقل کیا گیا اور بائیو ریڈ کا استعمال کرکے ان کی مقدار درست کی گئی۔

پروٹین پرکھ. پروٹین کی مساوی مقدار پر مشتمل پروٹین کے نچوڑوں کا تجزیہ {{0} فیصد سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس (SDS-PAGE) کے ذریعے کیا گیا۔ پروٹین کو 300 ایم اے پر 1 گھنٹہ کے لیے اموبیلون پولی وینیلائیڈین ڈائی فلورائیڈ جھلی میں منتقل کیا گیا تھا۔ جھلیوں کو 20mM Tris-HCl(pH7.4)، 150mM NaCl، اور 0.1 فیصد ٹوین 20 (TBS-T) میں بلاک کیا گیا تھا جس میں 5 فیصد چکنائی تھی 1 گھنٹہ کے لیے دودھ کا پاؤڈر اور اینٹی ٹی ایف اے ایم (1:2000، ab131607)، اینٹی OXPHOS (1:1000، ab110413)، اینٹی ونکولن (1:5000، ab129002) (ابکم کیمبرج، یو کے) اور اینٹی باڈیز کے ساتھ امیونوڈیٹیکٹ کیا گیا۔ -کلیویڈ کیسپیس-3 (1:1000,#9664)(سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، بیورلی، MA، USA)۔ امیونو بلوٹ تجزیہ کے لیے تمام ثانوی اینٹی باڈیز سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی سے تھیں۔ مغربی دھبوں کے لیے، غیر تراشی ہوئی، تشریح شدہ، میگاواٹ مارکر کے ساتھ مکمل طوالت کی امیجز سپلیمنٹری فائل میں دکھائی گئی ہیں۔

2.14 شماریاتی تجزیہ

گروپوں کے درمیان متعدد موازنہوں کا تجزیہ ایک یا دو طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا گیا جس کے بعد تجویز کردہ پوسٹ ہاک ٹیسٹ کیا گیا۔ ڈیٹا کو اوسط ± SEM کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ تمام شماریاتی حسابات گراف پیڈ پرزم 8 کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تھے۔{4}}۔ شماریاتی اہمیت p کے طور پر بیان کی گئی تھی۔<>