حصہ 2: تھرمل پروسیسنگ کے دوران آئرن کی موجودگی اور غیر موجودگی میں Ascorbic Acid، 5-Caffeoylquinic Acid، اور Quercetin-3-Rutinoside کا تعامل اور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی پر اثر

مزید معلومات کے لیے۔ رابطہ:tina.xiang@wecistanche.com

حصہ 1 کی تفصیلات جاننے کے لیے لنک پر کلک کریں:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. بحث

3.1.Ascorbic ایسڈ،5-Caffeoylquinic ایسڈ، اور Quercetin-3-Rutinoside کا ساختی سرگرمی کا رشتہ

AOA کا پہلا اشارے، ساخت اور سرگرمی کے تعلق کے لحاظ سے مختلف مادوں کے لیے ماپا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں فنکشنل گروپس کی تعداد ہوتی ہے۔ تینوں تجزیہ شدہ مادوں کا موازنہ کرتے ہوئے، ascorbic ایسڈ میں سب سے کم AOA تھا، اس کے بعد 5-caffeoylquinic ایسڈ، جبکہquercetin-3-rutinosideسب سے زیادہ AOA تک پہنچ گیا۔ Csepregi et al. [14] ان تین مرکبات کے AOA کا موازنہ کرتے وقت ایک ہی ترتیب پایا۔ اس درجہ بندی کی وضاحت ہائیڈروکسی گروپس کی کل مقدار سے کی جا سکتی ہے: quercetin-3-rutinoside میں دس، 5-caffeoylquinic acid میں پانچ ہیں، اورascorbic ایسڈچار ہیں. کے لیےflavonoids، ہائیڈروکسی گروپس کی کل مقدار اور AOA کے میکانزم پر ان کے اثرات کو پہلے برڈا اور اولیسزیک نے دکھایا تھا[15]۔ ہائیڈروکسی گروپس خاص طور پر انڈیول ڈھانچے میں قابل قدر ہیں، کیونکہ وہ آسانی سے ڈیکیٹونز میں آکسائڈائز کر سکتے ہیں [8]۔ تجزیہ شدہ مادوں میں اینڈیول ڈھانچہ دھاتی آئنوں [16-18] کے ساتھ کمپلیکس بنانے کی صلاحیت کے لیے بھی اہم ہے۔ اینڈیول ڈھانچہ فینائل رنگ میں quercetin-3-rutinoside اور 5-caffeoylquinic acid مالیکیولز میں پایا جاتا ہے، جو ان مرکبات کے مضبوط AOA کو بھی متاثر کر سکتا ہے۔ مزید مطالعات سے پتہ چلا کہ AOA دیگر مالیکیول ڈھانچے سے بھی متاثر ہو سکتا ہے۔ فینولک ایسڈ ممکنہ طور پر کاربو آکسیلک ایسڈ گروپس سے متاثر ہوتے ہیں، مثال کے طور پر، ہائیڈروکسی فینائل ایسٹک ایسڈ (R-CH=CH-COOH) ایک کمزور الیکٹران نکالنے والا گروپ ہے، جس کے مقابلے میں ہائیڈروکسی سنامک ایسڈ (R-CH،-COOH) جیسے کیفیک ایسڈ کے طور پر 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ [19]۔ flavonoids میں، aglycones میں متعلقہ glycosides [20,21] سے زیادہ AOA ہوتا ہے، quercetin-3-rutinoside کی صورت میں، a glycoside، aglycone کا AOAquercetinاس کے نتیجے میں زیادہ ہے [14]. بہت سے مختلف فنکشنل گروپس ہیں جو AOA پر اثرانداز ہو سکتے ہیں اور اس کے نتیجے میں، یہ ضروری ہے کہ مختلف طریقہ کار کے ساتھ مختلف ٹیسٹ اسسیس استعمال کریں، جیسے کہ سنگل الیکٹران ٹرانسفر (SET)، ہائیڈروجن ایٹم ٹرانسفر (HAT)، اور ترتیب وار پروٹون نقصان الیکٹران۔ پتہ لگانے کے لیے منتقلی (SPLET)۔ ہر میکانزم اور یہاں تک کہ استعمال شدہ پرکھ ریجنٹ بائیو ایکٹیو مرکبات کے مختلف ڈھانچے کا پتہ لگا سکتا ہے [22]۔

3.2.معدنی آئرن کی عدم موجودگی میں اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی پر ساختی طور پر مختلف اینٹی آکسیڈینٹ کے تھرمل پروسیسنگ اور تعامل کا اثر

تھرمل پروسیسنگ کے 40 منٹ کے توسیعی وقت پر مستحکم AOA اشارہ کرتا ہے کہ تھرمل انحطاط ابتدائی قیاس سے کم اہمیت کا حامل ہے۔ مزید برآں، HPLC ڈیٹا نے ظاہر کیا کہ خالص 5-caffeoylquinic acid اور quercetin-3-rutinoside مستحکم تھے، تھرمل پروسیسنگ کے دوران زیادہ سے زیادہ 20 فیصد انحطاط کے ساتھ۔ پچھلے مطالعات نے پانی کے عام ابلتے مقام تک5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ کی استحکام کو ثابت کیا تھا [23]، جب کہ ڈیوڈوِکز اور ٹائپک[24] نے 9 اخذ کرنے والے مرکبات پائے تھے، 5-کیفیوائلکوئنک ایسڈ کو 5 گھنٹے تک گرم کرنے کے بعد ریفلکس ascorbic ایسڈ کے ارتکاز کے لیے، کھانا پکانے کے 40 منٹ کے بعد انحطاط پایا گیا۔ اثر انداز کرنے والے عوامل، جس کے نتیجے میں پانی کے محلول میں آئرن کے بغیر ascorbic ایسڈ کا انحطاط ہوتا ہے، pH قدریں، روشنی کی نمائش، آکسیکرن، درجہ حرارت، اور مختلف ارتکاز ہو سکتے ہیں [25,26]۔ اس مطالعے میں، زیادہ تر ممکنہ طور پر درجہ حرارت اور ارتکاز کے عوامل نے مرکزی کردار ادا کیا، کیونکہ مائکرو ٹیوبز میں گیس کی کم سے کم جگہ کی وجہ سے آکسیڈیٹیو عمل کو کم سے کم کر دیا گیا تھا۔ یہ ممکن ہے کہ باقی گیس کا مرحلہ بھی ایروبک حالات میں انحطاط کے لیے کافی ہو۔ مختلف حالات کا نتیجہ مختلف مصنوعات میں ہوتا ہے [27,28]، لہذا اس تحقیق میں، کھانا پکانے کے 40 منٹ کے بعد، دونوں حالتوں کی مصنوعات مل سکتی ہیں۔ یوآن اور چن [28] نے رپورٹ کیا کہ furfural، 2-furoic acid، 3-hydroxy-2-pyrrone، اور ایک نامعلوم مادہ pH قدر کے لحاظ سے ایک آبی محلول میں ascorbic ایسڈ کے بڑے انحطاط کی مصنوعات ہیں۔ . شینودا وغیرہ۔ [29,30] سنگترے کے جوس میں پائے جاتے ہیں فرفورل، 2-فیوروک ایسڈ، 5-ہائیڈروکسیمالٹول، {{23}ہائیڈروکسی-2-پائرون، اور 5-(ہائیڈروکسی میتھائل) ) furfural. Hsu et al. [31] ایتھانولک محلول میں ascorbic ایسڈ کا تجزیہ کیا اور 2-furoic acid اور 3-hydroxy-2-pyrrone کا پتہ چلا۔ ایروبک یا اینیروبک حالات پر منحصر ہے، پتہ چلا ایسکوربک ایسڈ ڈیریویٹوز (چوٹی 3 اور 4) فرفورل، 2-فیوروک ایسڈ، یا 3-ہائیڈروکسی-2-پائرون یا انٹرمیڈیٹس ہو سکتے ہیں۔ خوراک کے ردعمل کے سلسلے میں ascorbic ایسڈ میں کمی واقع ہوئی، اور ascorbic acid کی زیادہ تعداد نے کھانا پکانے کے دوران تنزلی کا تناسب کم ظاہر کیا۔ ایسا لگتا ہے کہ ایسکوربک ایسڈ اپنے آپ کو زیادہ ارتکاز میں مستحکم کرتا ہے، غالباً ہائیڈروجن بانڈز اور وین ڈی والز توانائی کی وجہ سے [32]۔

بائنری اور ٹرنری مرکب میں، بنیادی طور پر AOA پر اضافی اثرات پائے گئے۔ بائنری مرکب میں، اگر زیادہ AOA والا مادہ اس کے ارتکاز میں بڑھتا ہے، تو ان کے مرکب کا AOA بھی بڑھ جاتا ہے۔ دیگر مطالعات میں اسکوربک ایسڈ (50-200 mg/L)[33] کے ساتھ ( Plus)-catechin (200 um) کے درمیان اور مختلف monoterpenes کے بائنری مرکب کے درمیان بھی اضافی اثرات پائے گئے[34]۔ صرف DPPH پرکھ میں، مخالف اثرات 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ کے ساتھ مل کر quercetin-3-rutinoside میں اور دوگنا quercetin-3-rutinoside کے ارتکاز کے ساتھ ٹرنری مرکب میں پائے گئے۔ یہ خلا میں مالیکیولز کی سمت بندی کی وجہ سے ہو سکتا ہے، خاص طور پر quercetin-3-rutinoside، ایک کافی بڑے مالیکیول کے طور پر، اور DPPH ریڈیکل مالیکیول کی سٹیرک رسائی [35]۔ TPC پرکھ میں، ascorbic acid اور 5-caffeoylquinic ایسڈ کے امتزاج کے نتیجے میں 1:2 کے تناسب میں مضبوط مخالفانہ اثرات مرتب ہوئے، جبکہ 2:1 کے تناسب کے ساتھ الٹ مرکبات کے نتیجے میں مضبوط ہم آہنگی کے اثرات مرتب ہوئے، متعلقہ AOAs دوہری ارتکاز ascorbic ایسڈ، ان حالات کے تحت، AOA کو ایک اضافی فروغ دے سکتا ہے، جس کی وجہ سے خود اسٹیبلائزیشن کے بعد دیگر مالیکیولز کا استحکام ہوتا ہے، اس تجربے میں 5-caffeoylquinic ایسڈ کے ذریعہ ظاہر کیا گیا ہے۔ انار کے نیکٹیرین جوس میں، قدرتی فینول اور ایسکوربک ایسڈ کے درمیان ایک ہی تعامل پایا گیا، جب کہ انگور کے رس میں ascorbic ایسڈ کی ارتکاز میں اضافے سے مخالفانہ اثرات میں اضافہ دیکھا گیا [36]۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ascorbic acid، 5-caffeoylquinic، اور quercetin-3-rutinoside کے مرکب اس وقت سب سے زیادہ AOA صلاحیت حاصل کرتے ہیں جب سب سے زیادہ طاقتوراینٹی آکسیڈینٹوافر مقدار میں دستیاب ہیں۔

مصنوعات کے بارے میں مزید جاننے کے لیے کلک کریں۔

3.3 معدنی لوہے کا اثر

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>ascorbic ایسڈ. تاہم، مرکب میں آئرن کے اضافے کا اثر TEAC اور DPPH پرکھ کے نتائج پر پڑا، جبکہ TPC اسیس بڑے پیمانے پر غیر متاثر ہوئے۔ اس وجہ سے، لوہے سے بھرپور نمونوں کے ساتھ کام کرتے وقت مختلف کام کرنے والے میکانزم کے ساتھ مختلف ٹیسٹ اسیس استعمال کرنا ضروری ہے۔

صرف DPPH پرکھ میں خالص quercetin-3-rutinoside کا AOA، اور ascorbic acid کے ساتھ، equimolar یا non-equimolar کے ساتھ دگنی quercetin-3-rutinoside کے ارتکاز میں، آئرن کی موجودگی میں کم قدریں تھیں۔ بولیگن وغیرہ۔ [351 نے وضاحت کی کہ DPPH پرکھ چھوٹے اینٹی آکسیڈنٹس کا بہتر طور پر پتہ لگاتا ہے، ان ریڈیکلز کی سٹیرک رسائی کی وجہ سے۔ ممکنہ طور پر، quercetin-3-rutinoside دو بائنڈنگ سائیڈز کے ساتھ لوہے کے ساتھ کافی بڑے کمپلیکس بنا سکتے ہیں، اور اس طرح پرکھ کے لیے ناقابل رسائی ہو سکتے ہیں۔ جیسا کہ Kejic et al نے ذکر کیا ہے۔ [8]، اس کی وضاحت دھاتی آئنوں کے ہم آہنگی کے ذریعے سپرمولیکولر کمپلیکس کی تشکیل سے کی جا سکتی ہے۔ ascorbic ایسڈ کے ساتھ مل کر، جو 1:2 کے تناسب میں مخلوط ویلنس کمپلیکس بنانے کے قابل ہے [12]، غالباً، یہ بڑے مخلوط کمپلیکس DPPH ریڈیکل کے ساتھ تعامل نہیں کر سکتے۔ اس مطالعے کے نتائج کے برعکس، دیگر مطالعات [18,37,38] نے DPPH پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے پایا کہ quercetin-3-rutinoside کمپلیکس خالص quercetin-3-rutinoside سے زیادہ موثر اینٹی آکسیڈنٹس ہیں۔ یہ معلوم ہے کہ فلیوونائڈز اور دھاتی آئنوں کے چیلیٹ کمپلیکس پیچیدہ دھاتی آئنوں کی بنیاد پرست سرگرمی کی نفی کر سکتے ہیں [39]۔ فرق صرف یہ تھا کہ اس مطالعے میں امونیم آئرن (II) سلفیٹ استعمال کیا گیا تھا، آئرن (ⅡI) کلورائیڈ یا سلفیٹ کی بجائے، جو Symonowics اور Kolandek [39] کے کام میں استعمال ہوتا تھا۔

2:1 کے تناسب میں آئرن کی موجودگی میں ascorbic acid اور 5-caffeoylquinic acid کے درمیان ہم آہنگی کے اثرات اور 1:2 کے تناسب میں مخالف اثرات پائے گئے۔ vivo [6] میں آئرن کے ساتھ caffeoylquinic acid کا 5- امتزاج تجویز نہیں کیا گیا تھا۔ تاہم، اس مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ، وٹرو میں، 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ کے مقابلے میں ascorbic ایسڈ کی دگنی مقدار AOA پر بھی ہم آہنگی کے اثرات مرتب کر سکتی ہے۔ تناسب کے بارے میں مزید تحقیقات یہ ظاہر کر سکتی ہیں کہ آیا Vivo میں بھی مثبت اثرات حاصل کیے جا سکتے ہیں۔

HPLC ڈیٹا کے مطابق، نمونے میں آئرن کو شامل کرنے سے اس کی اتپریرک سرگرمی پر کم سے کم اثر پڑے گا، کیونکہ صرف 0 منٹ کے پکے ہوئے نمونوں میں ascorbic ایسڈ کی حراستی میں کمی واقع ہوئی ہے۔ پکے ہوئے ایسکوربک ایسڈ کے نمونوں میں، آئرن کے بغیر نمونوں کے برعکس، ایسکوربک ایسڈ کی زیادہ مقدار انحطاط کے تناسب کا باعث بنتی ہے۔{1}}کیفیوولکوینک ایسڈ اور کوئرسیٹن-3-رٹینوسائیڈ کو اضافی عوامل درجہ حرارت اور وقت کی ضرورت ہوتی ہے، ساتھ ہی مرکب میں تعاملات، لوہے کی عمل انگیز سرگرمی کے کام کرنے کے لیے۔ Quercetin-3-rutinoside، آئرن کی موجودگی میں، تھرمل پروسیسنگ کے بعد صرف ascorbic acid کے ساتھ بائنری مرکب میں کمی واقع ہوئی۔ یہ اس حقیقت کی وجہ سے ہو سکتا ہے کہ flavonoid ایک بنیادی اینٹی آکسیڈنٹ کے طور پر کام کرتا ہے اور پھر اس کے نتیجے میں مرکب ریڈیکل ایسکوربک ایسڈ کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتا ہے، اصل مرکب کو دوبارہ پیدا کرتا ہے [18]۔ 5-Caffeoylquinic ایسڈ خاص معلوم ہوتا ہے، کیونکہ یہ quercetin-3-rutinoside کی حفاظت کرتا ہے، جبکہ ascorbic acid quercetin-3-rutinoside کی حفاظت کرنے کے قابل نہیں ہے۔ اس لیے، 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ آئرن اور تھرمل پروسیسنگ کے ساتھ مل کر نظام کو مستحکم کرنے کے لیے کلیدی مالیکیول ہو سکتا ہے۔ ایک مستحکم مالیکیول کے طور پر 5-caffeoylquinic ایسڈ کے اس مفروضے کی ٹرنری مرکب میں مزید تصدیق ہوئی۔ یہاں، quercetin-3-rutinoside کو ہمیشہ 5-caffeoylquinic acid کے ذریعے مستحکم کیا جاتا تھا، تاکہ ascorbic acid کی موجودگی میں بھی quercetin-3-rutinoside کے ارتکاز میں کوئی کمی نہیں دیکھی گئی۔ ایک اور تحقیق میں، 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ نے ایک کو پیگمنٹیشن میکانزم کے ذریعے اینتھوسیاننز کے انحطاط کے خلاف حفاظتی خصوصیات کا مظاہرہ کیا [40]۔ انحطاط کی نئی مصنوعات، ممکنہ طور پر زیادہ AOA کے ساتھ، تینوں مادوں سے آئرن کی موجودگی میں ظاہر ہوئیں۔ کیفیک ایسڈ (چوٹی 6) کی شناخت ایک 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ کی خرابی کی مصنوعات کے طور پر کی گئی تھی (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ اس سے یہ قیاس پیدا ہوا کہ دوسرا مادہ کوئینک ایسڈ ہو سکتا ہے یا ان نو ممکنہ مشتقات میں سے ایک ہو سکتا ہے جسے Dawidowicz اور Typek [24] نے بیان کیا ہے: کوئینک ایسڈ؛(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24] }}(3،4-ڈائی ہائیڈروکسی فینائل)-2-ہائیڈروکسائپروپینائل]-1,4،5-ٹرائی ہائیڈروکسی سائکلوہیکسین کاربو آکسیلک ایسڈ؛(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxypropanoyl]-1,4,5 trihydroxycyclohex-anecarboxylic acid; ٹرانس 3-O-caffeoylquinic ایسڈ ٹرانس 5-O-caffeoylquinic ایسڈ ٹرانس 4-O-caffeoylquinic ایسڈ کیفیک ایسڈ؛ cis-5-O-caffeoylquinic acid;4,5-dicaffeoylquinic acid. quercetin-3-rutinoside کے لیے، کرومیٹوگرام میں ایک انحطاطی پروڈکٹ ظاہر ہوتی ہے، جس کی شناخت نہیں ہو سکی۔

3.4 فیرک (Fe3 پلس) اور فیرس آئرن (Fe2 پلس) کے ساتھ چیلیٹس بنانے کی صلاحیت

ایسکوربک ایسڈ پر مشتمل تمام نمونوں میں، فیرک آئرن کو فیرس آئرن میں کم کر دیا گیا تھا۔ اس عمل میں،ascorbic ایسڈفیرک آئرن سے ایک الیکٹران لیتا ہے اور اسے فیرس آئرن میں کم کر دیتا ہے، اور خود ایک ریڈیکل بن جاتا ہے۔ غیر مستحکم ریڈیکل تیزی سے dehydroascorbic acid اور مزید انحطاط کی مصنوعات میں تبدیل ہوتا ہے [12]۔ ہائیڈروکسی پیرو آکسائیڈ کی کمی کی وجہ سے، فینٹن سائیکل کے ذریعے فیرک آئرن پر ردعمل ممکن نہیں ہے۔ 0 منٹ کے پکے ہوئے بائنری مکسچر میں، 20 فیصد سے زیادہ آئرن ایسکوربک ایسڈ کی موجودگی میں بندھا ہوا تھا۔ یہ جانا جاتا ہے کہ ایسکوربک ایسڈ 3-OH اور 2- سے ہائیڈروجن کی نقل مکانی کے بعد 3-O اور 2-O نیوکلی کے ذریعے چیلیشن کے ذریعے لوہے کی پرجاتیوں اور دیگر دھاتی آئنوں کے ساتھ کمپلیکس بناتا ہے۔ OH گروپس [16,17,41. یہ مخلوط ویلنس آئرن ایسکوربیٹ کمپلیکس بھی بنا سکتا ہے [42]۔ تاہم، ascorbic ایسڈ ایک کمزور چیلیٹنگ ایجنٹ ہے اور، کھانا پکانے کے بعد، جب ascorbic ایسڈ موجود تھا تو خالص اور مخلوط نمونوں میں صرف پابند آئرن کے نشانات پائے گئے۔ مزید برآں، کھانا پکانے کے عمل کی وجہ سے، ascorbic ایسڈ تنزلی کی مصنوعات میں ٹوٹ جاتا ہے، جو لوہے کے ساتھ چیلیٹ کرنے کے قابل نہیں لگتا ہے۔

5-Caffeoylquinic ایسڈ نسبتاً ناقص کم کرنے والا ہے۔ فیرک آئرن کو 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ سے کم کیا گیا تھا، اور طویل کھانا پکانے کے ساتھ، کمی میں اضافہ ہوا تھا۔{2}}کیفیوئلکوئنک ایسڈ ایک لیگینڈ میں فیرک آئرن کے ساتھ چیلیٹس میٹل چارج ٹرانسفر [17]۔{4}}کیفیویلکوئنک ایسڈ کیفیک ایسڈ کے 3,4 اینڈیول ڈھانچے پر ایک ممکنہ پابند پہلو رکھتا ہے۔ یہ اس بات کا اشارہ ہو سکتا ہے کہ کیفیک ایسڈ کیوں 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ کا بائیو ایکٹیو حصہ ہے، جبکہ کوئینک ایسڈ میں تقریباً کوئی AOA نہیں ہے [43]۔ ایک سے ایک کے تناسب [44,45] میں ایک لوہے کے کمپلیکس[41]کی تشکیل کی وجہ سے Endiols OH کی تشکیل کو روکتے ہیں۔ لیمی وغیرہ۔ [47] oligomeric پرجاتیوں کو پایا. پچھلے مطالعات کے برعکس [17,48]، صرف پابند آئرن کے نشانات 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ پری اور پوسٹ تھرمل پروسیسنگ کی موجودگی میں پائے گئے۔ اس کی وضاحت اس مطالعے میں غیر جانبدار pH حالات سے کی جا سکتی ہے، جب کہ دیگر مطالعات نے تیزابیت والے میڈیم میں کام کیا، جو کہ انسانی معدے میں 1-2.5 سے pH قدر کی بنیاد پر ہے [48]۔ ذخیرہ کیے گئے نمونوں میں کئی گھنٹوں کے بعد ایک کالا ورن ملا، جو کہ 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ-فیرک آئرن کمپلیکس کا اشارہ ہے۔ حال ہی میں مخلوط نمونے تجزیہ کے لیے استعمال کیے گئے تھے، لہٰذا غیر جانبدار پی ایچ پر ان کمپلیکس کی تشکیل کے لیے طویل مدت درکار ہوتی ہے۔ کیفیک ایسڈ کے ساتھ آئرن کمپلیکس نے بہت کم صفائی کی سرگرمی دکھائی [49]۔ مزید برآں، کوئینک ایسڈ اور فیرک آئرن [48] کے درمیان ردعمل کا کوئی سپیکٹرو فوٹومیٹرک ثبوت نہیں ہے۔ 5-caffeoylquinic acid کے برعکس، quercetin-3-rutinoside نمونے میں، پابند آئرن پایا گیا، یہاں تک کہ تھرمل پروسیسنگ کے بعد بھی۔

Quercetin-3-rutinoside نے کھانا پکانے کے طویل وقت میں کم از کم اضافے کے ساتھ فیرک آئرن کو فیرس آئرن تک کم کر دیا۔ quercetin-3-rutinoside کی اس اعتدال پسند سرگرمی کو پہلے Mira et al نے بیان کیا تھا۔ [50]۔ quercetin-3-rutinoside کی فیرک کو کم کرنے والی سرگرمی 3-rutinoside, 5,7,3',4'-OH [50] میں پائی گئی۔ فیرک آئرن کے ساتھ اعتدال پسند تعامل کی وضاحت -OH گروپوں کی کم تعداد سے کی جا سکتی ہے، جس کے نتیجے میں چیلیشن سائیڈ پر منفی چارج کی کثافت کم ہوتی ہے [50]۔ فلیوونائڈز دھاتی آئنوں کے ساتھ تین ممکنہ ہم آہنگی والے اطراف میں چیلیٹ کر سکتے ہیں: (i) 5-ہائیڈروکسی اور 4-کاربونیل گروپوں کے درمیان، (ii) 3-ہائیڈروکسی اور 4-کاربونیل گروپوں کے درمیان، اور (ii) Bring [39] میں 3'، A'-ہائیڈروکسی گروپس کے درمیان۔ Quercetin-3-rutinoside بائنڈنگ سائیڈز (i) اور (i)[9] کا استعمال کرتا ہے، اور 3-ہائیڈروکسی گروپ میں، rutinoside منسلک ہوتا ہے۔ اسپیکٹرل ڈیٹا نے یہاں تک ظاہر کیا کہ دھاتی آئن صرف 3' A'-hydroxy گروپ [18] کے پابند ہیں۔ چیلیٹس اس کی دوطرفہ شکل میں آئرن کے ساتھ زیادہ موثر ہیں [50]۔ ثنائی مرکب میں، quercetin-3-rutinoside کمپلیکس بنانے کے قابل نہیں ہوتا جب ascorbic acid موجود ہوتا ہے، اس کے برعکس ternary mixtures میں۔ اگر 5-caffeoylquinic ایسڈ موجود ہے تو، پابند آئرن کی تھوڑی مقدار پائی جاتی ہے۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ 5-caffeoylquinic ascorbic ایسڈ کی موجودگی میں quercetin-3-rutinoside مالیکیولز کی حفاظت کرتا ہے، لہذا quercetin-3-rutinoside لوہے کے ساتھ کمپلیکس بنا سکتا ہے۔

4. مواد اور طریقے

4.1.کیمیکل

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 فیصد)، فیرک امونیم سلفیٹ ڈوڈیکاہائیڈریٹ، اور فیرس امونیم سلفیٹ ہیکساہائیڈریٹ کارل روتھ (کارلسروہے، جرمنی) سے خریدے گئے تھے۔

4.2 نمونے

ascorbic acid، {{0}}caffeoylquinic acid، اور quercetin-3-rutinoside کے مستند معیارات کے آبی محلول اور مرکب مختلف تناسب میں خالص محلول اور مرکب کے طور پر تیار کیے گئے تھے۔ تمام ممکنہ بائنری مکسچر مساوی تناسب میں بنائے گئے تھے، اور ایک مرکب کے ساتھ غیر مساوی تناسب دوگنا ہو گئے تھے۔ ٹرنری مکسچر بھی مساوی تناسب کے ساتھ ساتھ غیر مساوی تناسب میں بھی تیار کیے گئے تھے جن میں بالترتیب ایک یا دو مرکبات دوگنا تھے۔ ہر ٹیسٹ کے حل کے لیے اینٹی آکسیڈینٹس کی حتمی تعداد 0.3 mM تھی۔ مزید برآں، تمام تجربات کو کل فی مرکب میں 0.3 mM آئرن ({{10}}.15 mM فیرس آئرن اور 0.15 mM فیرک آئرن) کے اضافے کے بعد دہرایا گیا۔ اینٹی آکسیڈنٹس اور آئرن کی منتخب شدہ مقداریں جسمانی یا خوراک کی سطح پر مبنی نہیں ہیں، وہ مالیکیولر تعامل کے اثر کا مطالعہ کرنے کے لیے داڑھ ماس پر مبنی ہیں۔ اس کے نتیجے میں، کل اینٹی آکسیڈینٹس اور آئرن کے درمیان ایک مساوی تناسب قائم کیا گیا تھا. تمام مکسچر کو ابلتے ہوئے پانی میں 0، 10، 20 اور 40 منٹ تک پکایا گیا، اور بعد میں گرم کرنے کے عمل کو روکنے کے لیے برف پر ٹھنڈا کیا گیا۔ یہ تین آزاد نقلوں کے لیے کیا گیا تھا۔

4.3 فوٹو میٹرک پیمائش

اینٹی آکسیڈنٹس(خالص یا ملا ہوا) لوہے کی عدم موجودگی اور موجودگی میں ان کی کل کم کرنے والی سرگرمی اور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کے لیے تین آزاد تکنیکی نقلوں میں ماپا گیا 96- ویل پلیٹوں میں ہائی تھرو پٹ طریقہ استعمال کرتے ہوئے (SynergyTM HTX ملٹی موڈ مائکروپلیٹ ریڈر، بائیو ٹیک انسٹرومینٹس، ونوسکی، وی ٹی، یو ایس اے)۔ مختلف ری ایکشن میکانزم کی وجہ سے مختلف ٹیسٹ اسسیس استعمال کیے گئے: سنگل الیکٹران ٹرانسفر (SET) اور ہائیڈروجن ایٹم ٹرانسفر (HAT)۔ جبکہ TEAC اور TPC پرکھ SET [17,18] پر مبنی ہے، DPPH ٹیسٹ پرکھ کے لیے، لٹریچر بالکل واضح نہیں ہے کہ آیا یہ SET، HAT، یا یہاں تک کہ ان دو میکانزم کے مجموعہ پر مبنی ہے [{{6} }] فوٹی[51] کے ایک حالیہ مطالعہ نے دریافت کیا ہے کہ فینول ڈی پی پی ایچ کے ساتھ ترتیب وار پروٹون-لوس الیکٹران ٹرانسفر (SPLET) کے ذریعے رد عمل ظاہر کر سکتے ہیں، جو دو میکانزم کا مجموعہ ہے۔ عوامل، جیسے درمیانی قطبیت اور آئنائزیشن کی صلاحیت، غالب میکانزم کو متاثر کرتی ہے۔

4.3.1 کل فینولک مواد (TPC)

کل فینول مواد (TPC) کا تعین Folin-Ciocalteu طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے ایک 96-کنویں پلیٹ میں کیا گیا تھا، جو پہلے Bobo-Garcia et al نے بیان کیا تھا۔[52] کچھ ترامیم کے ساتھ۔

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99)۔ اس ٹیسٹ کا عام نام گمراہ کن ہے کیونکہ Folin-Ciocalteu reagent غیر فینولکس پر بھی رد عمل ظاہر کرتا ہے، جیسے کہ وٹامنز اور منرلز [22]۔ یہ بایو ایکٹیو مرکبات کی "کل کم کرنے والی سرگرمی" کو بہتر طور پر بیان کرتا ہے۔

4.3.2 ٹرولوکس مساوی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت (TEAC)

اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا تعین TEAC پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے کچھ ترمیم کے ساتھ ایک 96-کنویں پلیٹ میں کیا گیا تھا۔ 9.6 ملی گرام ABTS اور 1.66 ملی گرام پوٹاشیم پرسلفیٹ کے ساتھ ایک اسٹاک محلول H2O سے 25 ملی لیٹر تک بھرا ہوا تھا اور کمرے کے درجہ حرارت پر اندھیرے میں 12-16 گھنٹے کے لیے تیار کیا گیا تھا۔ اس اسٹاک سلوشن سے، ایک TEAC ورکنگ سلوشن تیار کیا گیا، جس میں 5mL اسٹاک سلوشن 100 فیصد MeOH کے ساتھ 25mL تک بھرا ہوا تھا۔

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3 ڈی پی پی ایچ * ریڈیکل اسکیوینگنگ

دیاینٹی آکسیڈینٹactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4 ہم آہنگی اور دشمنی

اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کے ہم آہنگی اور مخالفانہ اثرات کے تجزیے کے لیے، تجرباتی طور پر حاصل کردہ نتائج کا موازنہ نظریاتی اقدار کے ساتھ اسی ارتکاز پر انفرادی اجزاء کے اثرات کے مجموعہ سے کیا گیا [53]۔ Synergism دو یا دو سے زیادہ مادوں کے تعامل کو بیان کرتا ہے تاکہ مشترکہ عمل الگ الگ ہر عمل کے مجموعہ سے زیادہ ہو۔ اس کے برعکس، عداوت ایک ایسا رجحان ہے جہاں دو یا دو سے زیادہ مادوں کے باہمی تعامل کا مجموعی اثر ہوتا ہے جو ان کے انفرادی اثرات کے مجموعے سے کم ہوتا ہے۔

4.5.Ionic آئرن کا تعین

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99)۔ کل آئرن اور آئنک آئرن کے درمیان فرق، فیرس اور فیرک آئرن کا مجموعہ، پابند آئرن ہے۔

4.6.HPLC-DAD

اینٹی آکسیڈینٹ ascorbic ایسڈ، 5-caffeoylquinic acid، اور quercetin-3-rutinoside اور ان کے انحطاط کی مصنوعات کو انہی عرقوں میں مقدار درست کرنے کے لیے جو فوٹوومیٹرک کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） تیار کیے گئے تھے۔ اخذ شدہ مرکبات کو آئرن پری اور پوسٹ تھرمل پروسیسنگ کی موجودگی اور غیر موجودگی میں خالص معیارات کا تجزیہ کرکے عارضی طور پر شناخت کیا گیا تھا۔ لہذا، نئی چوٹی داخل کرنے کے معیار سے اخذ ہونی چاہیے۔ مزید برآں، مجوزہ ڈھانچے کی تصدیق کے لیے منتخب مرکب کو HPLC-MS کے ذریعے ماپا گیا۔

4.7 شماریاتی تجزیہ

مائیکروسافٹ ایکسل 2016 (مائیکروسافٹ، ریڈمنڈ، یو ایس اے) اور آر شماریات (ورژن 3.6.3، ہولڈنگ دی ونڈساک، 2020) کو بائیو سٹیٹسٹکس ٹیسٹ اور ڈیٹا کے نتائج پیش کرنے اور ڈرائنگ کے لیے استعمال کیا گیا۔ علاج کا اندازہ لگانے اور منسلک کرنے کے لیے تخمینی اعدادوشمار مختلف حالتوں کے تین طرفہ تجزیے (ANOVA)، ایک پوسٹ ہاک Tukey کے HSD ٹیسٹ، اور Pearson کے ارتباط کے ذریعے کیے گئے۔ استعمال شدہ R پیکیجز ggplot2 [55]، یعنی [56]، اور multcomp [57] تھے۔

5. نتائج

اوپر بیان کردہ نتائج کی بنیاد پر، ascorbic acid، 5-caffeoylquinic acid، اور quercetin-3-rutinoside کا AOA ان کے مالیکیول کی ساخت، ارتکاز، تناسب، اور دیگر اینٹی آکسیڈینٹس اور آئرن کے ساتھ تعاملات سے متاثر تھا۔ ایسا لگتا ہے کہ تعامل خاص طور پر AOA میں ایک کردار ادا کرتا ہے جب ascorbic acid اور 5-caffeoylquinic acid کو ملایا جاتا ہے۔ یہاں، ہم آہنگی اور مخالف اثرات کا پتہ چلا۔ درجہ حرارت کا AOA پر کم سے کم اثر تھا، جبکہ ایک ہی وقت میں درجہ حرارت کچھ مرکبات میں تمام اینٹی آکسیڈینٹس کے استحکام کو متاثر کرتا ہے، خاص طور پر آئرن کی موجودگی میں۔ طویل کھانا پکانے کے وقت کے ساتھ آئرن کی عدم موجودگی میں صرف ascorbic ایسڈ کا ارتکاز کم ہوا اور 5-caffeoylquinic ایسڈ کا ارتکاز صرف آئرن کی موجودگی میں کم ہوا، جبکہ quercetin-3-rutinoside کی ارتکاز میں صرف ascorbic ایسڈ کے ساتھ مل کر کمی واقع ہوئی۔ لوہے کی موجودگی. آئرن کے ساتھ مل کر، 5-کیفیوئلکوئنک ایسڈ تھرمک پروسیسنگ کے ذریعے دوسرے مالیکیولز کو ان کی حراستی میں کمی سے بچانے کے قابل تھا۔

پودوں میں، ascorbic acid، 5-caffeoylquinic acid، اور quercetin-3-rutinoside کے مجموعے نہ صرف ممکن ہیں بلکہ عام ہیں۔ لہذا، یہ نتائج سبزیوں کو پکانے کے دوران ہونے والے عمل کے بارے میں بنیادی معلومات فراہم کرتے ہیں۔ فوڈ میٹرکس زیادہ پیچیدہ ہوتے ہیں اور ان میں لاتعداد بایو ایکٹیو مرکبات ہوتے ہیں، بشمول انزائمز، دیگر معدنیات، یا تیزاب، جو رد عمل کی حالتوں کو تبدیل کرتے ہیں یا خود ری ایکٹنٹ ہوتے ہیں۔ وہ پیچیدہ تعاملات اس مطالعے کے دائرہ کار سے بہت باہر ہیں اور فائدہ مند ارتکاز اور تعاملاتاینٹی آکسیڈینٹپکی سبزیوں میں مستقبل میں خطاب کرنا ہوگا.

حوالہ جات

1. میلور، ڈی ڈی؛ Naumovski, N. ذیابیطس میں کوکو کا اثر: کلیدی ہدف کے اعضاء کے طور پر لبلبہ اور جگر کا امکان، اینٹی آکسیڈنٹ اثر سے زیادہ؟ انٹر جے فوڈ سائنس ٹیکنالوجی. 2016، 51، 829–841۔ [کراس ریف]

2. کروزر، اے. جگناتھ، آئی بی؛ کلفورڈ، ایم این فینول، پولیفینول اور ٹیننز: ایک جائزہ۔ پودوں میں ثانوی میٹابولائٹس: انسانی خوراک میں موجودگی، ساخت، اور کردار؛ Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; بلیک ویل پبلشنگ: ہوبوکن، NJ، USA، 2006؛ صفحہ 1-24۔ ISBN 1-4051-2509-8۔

3. ملر، D. "آٹو آکسیڈیشن" ری ایکشنز کے اتپریرک کے طور پر ٹرانزیشن میٹلز۔ فری ریڈک۔ بائول میڈ. 1990، 8، 95-108۔ [کراس ریف]

4. بکنر، این. Krumbein، A.؛ Rohn, S.; کروہ، فلاوونولس روٹین اور کوئرسیٹن پر تھرمل پروسیسنگ کا LW اثر۔ ریپڈ کمیون۔ ماس سپیکٹرم۔ 2006، 20، 3229–3235۔ [کراس ریف]

5. Layrisse، M.؛ گارسیا-کیسل، MN؛ سولانو، ایل. بارون، ایم اے؛ Arguello, F.; Llovera, D.; رامریز، جے؛ Leets, I.; ٹراپر، ای. آئرن بیس-گلائسین چیلیٹ، فائیٹس اور پولیفینول سے افزودہ ناشتے سے انسانوں میں آئرن کی حیاتیاتی دستیابی۔ جے نٹر 2000، 130، 2195–2199۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

6. ہریل، آر ایف؛ ریڈی، ایم. کک، جے ڈی پولی فینولک پر مشتمل مشروبات کے ذریعہ انسان میں غیر ہیم آئرن جذب کی روک تھام۔ Br جے نٹر 1999، 81، 289–295۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

7. کوسٹیوک، VA؛ پوٹاپووچ، سیلیکا-حوصلہ افزائی سیل کی چوٹ کے خلاف فلاوونائڈ تحفظ میں AI اینٹی ریڈیکل اور چیلیٹنگ اثرات۔ محراب بائیو کیم۔ بائیوفیس۔ 1998، 355، 43–48۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

8. Kejík، Z.؛ Kaplánek, R.; Masaˇrík، M.؛ بابولا، پی. Matkowski، A.؛ فلپینسکی، پی. Veselá, K.; گبریک، جے؛ Sýkora, D.; مارٹاسیک، پی. ET رحمہ اللہ تعالی. فلاوونائڈز کے آئرن کمپلیکسز-اینٹی آکسیڈینٹ کی صلاحیت اور اس سے آگے۔ انٹر جے مول سائنس 2021، 22، 646۔ [کراس ریف]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. مختلف پولیمرائزیشن طریقوں سے حاصل کردہ Monomeric اور Polymeric Polyphenols (Quercetin، Rutin اور Catechin) کے ڈھانچے کی سرگرمی کے تعلقات کا تجزیہ۔ کیم بایو ڈائیورز۔ 2019, 16, e1900426۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

10. Gullón، B.؛ Lú-Chau, TA; موریرا، ایم ٹی؛ لیما، جے ایم؛ Eibes, G. Rutin: نکالنے، شناخت اور صاف کرنے کے طریقوں، حیاتیاتی سرگرمیوں اور اس کی حیاتیاتی دستیابی کو بڑھانے کے طریقوں پر ایک جائزہ۔ رجحانات فوڈ سائنس. ٹیکنالوجی. 2017، 67، 220–235۔ [کراس ریف]