فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز مائٹوکونڈریا پر منحصر راستے کے ذریعے Eca-109 سیلوں میں اپوپٹوس کی حوصلہ افزائی کرتے ہیں۔

تعارف

غذائی نالی کا کینسر کینسر کی سب سے عام اقسام میں سے ایک ہے جس میں 11ویں سب سے زیادہ بیماری کی شرح ہے اور عالمی سطح پر 6ویں سب سے زیادہ شرح اموات ہے، اور 2015 میں ~439،000 اموات کا سبب بنی ہے۔ غذائی نالی کے کینسر کے واقعات خاص طور پر مختلف علاقوں میں مختلف ہوتے ہیں، مشرقی علاقوں کے ساتھ۔ ایشیا اور مشرقی اور جنوبی افریقہ میں واقعات کی سب سے زیادہ شرح اور مغربی افریقہ 2012 میں سب سے کم شرح کی نمائش کر رہے ہیں۔ چین میں تخمینہ شدہ غذائی نالی کے کینسر کے کیسز اور اموات بالترتیب 477،000 اور 375،000 تھیں۔ 2015 میں۔ اگرچہ 2005 اور 2015 کے درمیان درمیانی اور اعلی درمیانی سماجی آبادیاتی انڈیکس والے ممالک میں غذائی نالی کے کینسر کی بیماری کی شرح میں کمی آئی ہے، لیکن خراب تشخیص کی وجہ سے شرح اموات زیادہ ہے۔ کیموتھریپی یا ریڈیو تھراپی کے ساتھ جراحی سے نکالے جانے والے مرکب کو غذائی نالی کے کینسر کے علاج کے لیے استعمال کیا گیا ہے، تاہم، یہ بتایا گیا ہے کہ 2003 اور 2014 کے درمیان 5- سال کی بقا کی شرح برقرار رہی<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyاس کا مظاہرہ کیاCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) وٹرو اور ویوو (24) میں میلانوما B16-F10 خلیوں کی نشوونما کو روک سکتا ہے۔ تاہم، پہلے استعمال شدہ CTPG کی ناقص پانی میں حل پذیری منشیات کی نشوونما کو محدود کرتی ہے۔ لہذا، پانی میں گھلنشیل CTPG (CTPG-W) کا استعمال کیا گیا اور غذائی نالی کے کینسر کے خلیات (Eca-109) پر اینٹیٹیمر اثر کی تحقیقات کی گئیں۔ یہ طے کیا گیا تھا کہ CTPG-W خوراک پر منحصر Eca-109 خلیوں کی عملداری کو مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کے ذریعے apoptosis کی شمولیت کے ذریعے روک سکتا ہے۔

جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%

مواد اور طریقے

جانور۔

مادہ C57BL/6 چوہے (6-8 ہفتے، ~25 گرام) بیجنگ لیبارٹری اینیمل ریسرچ سینٹر (بیجنگ، چین) سے خریدے گئے تھے اور درجہ حرارت پر قابو پانے والے (25˚C)، ہلکے سائیکل (12// 12) سنکیانگ یونیورسٹی (ارومچی، چین) کی جانوروں کی سہولت۔ تمام جانوروں کو روگزن سے پاک پانی اور کھانا ملا۔

سیل لائن اور ثقافت۔

انسانی غذائی نالی کے کارسنوما سیل لائن (Eca-109) کو سنکیانگ کلی لیبارٹری آف بائیولوجیکل ریسورسز اینڈ جینیٹک انجینئرنگ (کالج آف لائف سائنس اینڈ ٹیکنالوجی، سنکیانگ یونیورسٹی، ارومچی، چین) نے محفوظ کیا تھا اور RPMI{{1} } میڈیم (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 10% ہیٹ ان ایکٹیویٹڈ فیٹل بوائین سیرم (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China) کے ساتھ ضمیمہ، 1% L -گلوٹامین (100 ایم ایم)، 100 U/ml پینسلن اور 100 µg/ml streptomycin ایک مرطوب ماحول میں 37˚C پر جس میں 5% CO2 ہوتا ہے۔

اعلی کارکردگی مائع کرومیٹوگرافی (HPLC)۔

CTPG-W (cat. no. SGJG20170410) Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (شنگھائی، چین) سے خریدا گیا تھا۔ ہمارے پچھلے مطالعہ (24) کے مطابق CTPG کے بڑے مرکبات HPLC کے ذریعہ اہل اور مقدار کے مطابق تھے۔ مختصراً، HPLC کو ZORBAX SB‑C18 کالم (250x4.6 mm; 5 µm) پر 30˚C پر کیا گیا اور 0.2% فارمک ایسڈ محلول اور 23% سے شروع ہونے والے میتھانول کے میلان کے ساتھ تیار کیا گیا، کیونکہ ہر منٹ میں 1 ملی لیٹر شامل کیا جاتا تھا۔ 31% تک پہنچنے تک 45 منٹ تک۔ کل 10 μl نمونہ انجکشن کیا گیا تھا اور 330 nm پر پتہ چلا تھا۔ echinacoside معیار کو Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (شنگھائی، چین) سے خریدا گیا تھا، اور ایکٹیوسائیڈ اسٹینڈرڈ کو سگما-الڈرچ (Merck KGaA، Darmstadt، Germany) سے خریدا گیا تھا۔ معیارات CTPG-W کے اجزاء کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔

ایم ٹی ٹی پرکھ۔

سیل کے پھیلاؤ کو ایم ٹی ٹی پرکھ سے ماپا گیا۔ Eca{{0}} خلیات کو 100 µl RPMI{{5 میں 5x1 کی کثافت پر 96-کنویں پلیٹوں میں ٹیکہ لگایا گیا03 خلیات }} درمیانہ/اچھا اور 24 گھنٹے کے لیے 37˚C پر مہذب، پھر 24 کے لیے CTPG-W کے مختلف ارتکاز (0, 200, 400, 600, اور 800 µg/ml) یا 0.4% dimethyl سلفوکسائیڈ (DMSO) کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے، 48 اور 72 ح. DMSO کو سالوینٹ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا (800 µg/ml CTPG-W جس میں 0.4% DMSO شامل ہے)۔ سسپلٹین (20 µg/ml) کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے 225 xg پر سینٹرفیوگریشن کے بعد سپرنٹنٹ کو ضائع کر دیا گیا اور 100 μl MTT محلول (0.5 mg/ml RPMI-1640 میڈیم میں FBS کے بغیر) ہر کنویں میں شامل کیا گیا اور 3 کے لیے 37˚C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ h تشکیل شدہ فارمازان کرسٹل 200 μl DMSO میں تحلیل ہوگئے تھے۔ آپٹیکل کثافت (OD) کی قدروں کو 490 nm کی طول موج پر ایک 96- ویل مائکروپلیٹ ریڈر (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) کے ذریعے ناپا گیا۔ متعلقہ سیل کی قابل عملیت کا حساب اس فارمولے کے مطابق کیا گیا تھا: سیل ویبلٹی (%)=(ODtreated/ODuntreated)x100%۔ Eca-109 خلیوں کی شکل کو الٹی فلوروسینس مائکروسکوپ (میگنیفیکیشن، x200) (نیکون ایکلیپس Ti‑E؛ نیکن کارپوریشن، ٹوکیو، جاپان) کے ساتھ دیکھا گیا۔

splenocytes کے پھیلاؤ کے لئے، C57BL/6 چوہوں کو گریوا کی سندچیوتی کے ذریعہ خوش کیا گیا تھا، اور تلیوں کو الگ تھلگ کردیا گیا تھا۔ سنگل سیل سسپینشن بنایا گیا اور اسپلینوسائٹس کو 1x1 کی کثافت پر 96-کنویں پلیٹوں0100 µl RPMI-1640 میڈیم میں 5 سیل/کنویں میں سیڈ کیا گیا، اور پھر مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج کیا گیا۔ CTPG-W کا (0, 200, 400, 600, اور 800 µg/ml) 24, 48 اور 72 h کے لیے 37˚C پر 5% CO2 کے ساتھ۔ مذکورہ بالا پروٹوکول کے مطابق، splenocytes کے پھیلاؤ کی پیمائش MTT پرکھ کے ذریعے کی گئی تھی۔ محرک انڈیکس{{20}ODtreated/ODuntreated.

اپوپٹوسس اور سیل سائیکل کی پیمائش۔ Eca{{0}} خلیات کو 2.5x1 کی کثافت پر 60 ملی میٹر ڈشز میں کلچر کیا گیا تھا }, 200, 400, 600, اور 800 µg/ml) CTPG-W یا 0.4% DMSO 24 گھنٹے کے لیے 37˚C پر 5% CO2 کے ساتھ۔ مینوفیکچررز کے پروٹوکول کے مطابق سیلز کو Annexin V‑fluorescein isothiocyanate (FITC)/Propidium iodide (PI) Apoptosis Detection kit (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) کے ساتھ اکٹھا اور داغ دیا گیا تھا۔ نمونے فلو سائٹومیٹری (BD FACSCalibur؛ BD بایو سائنسز، فرینکلن لیکس، NJ، USA) کے ذریعے جمع کیے گئے اور FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ سیل سائیکل پر CTPG-W کے اثر کا تجزیہ کرنے کے لیے، 2.5x105 Eca-109 سیلز کو 60 ملی میٹر کلچر ڈشز میں سیڈ کیا گیا اور CTPG-W (0, 100, 200, اور 400 µg/ml) یا 0.4 کے ساتھ علاج کیا گیا۔ %DMSO 24 گھنٹے کے لیے 37˚C پر 5% CO2 کے ساتھ۔ تمام خلیوں کی کٹائی اور دو بار آئس کولڈ پی بی ایس (گبکو؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ) کے ساتھ دھویا گیا، پھر 30 منٹ کے لیے 4˚C پر 70٪ آئس کولڈ ایتھنول میں طے کیا گیا۔ آئس کولڈ پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھونے کے بعد، کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے 300 μl PI/RNase سٹیننگ بفر (BD Biosciences، San Jose، CA، USA) میں خلیات کو دوبارہ معطل کر دیا گیا۔ سیل سائیکل کی تقسیم کا تجزیہ ModFit LT 3.0 سافٹ ویئر کے ذریعے بہاؤ cytometry (BD FACSCalibur) کے ذریعے کیا گیا۔

نیچرل سیسٹینچ ٹبلوسااینٹی تھکاوٹجگر کی حفاظت کریں PHGS75% ECH 30% ACT 12%

مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت (Δψm) اور رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کا تجزیہ۔Δψm کا تجزیہ کرنے کے لیے، Eca{{0}} سیلز کا علاج CTPG-W (0، 400، 600، اور 800 µg/ml) یا 0.4% DMSO سے کیا گیا۔ 5% CO2 کے ساتھ 37˚C پر 24 گھنٹے، اور JC-1 (بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی، شنگھائی، چین) کے ساتھ مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل پرکھ کٹ کے ساتھ داغدار، مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، 37˚ پر 20 منٹ کے لیے سی۔ JC-1 واشنگ بفر (Beyotime Institute of Biotechnology) کے ساتھ دو بار دھونے کے بعد، نمونے 300 µl JC-1 واشنگ بفر کے ساتھ دوبارہ معطل کیے گئے اور فلو سائٹومیٹری (BD FACSCalibur) کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ Eca-109 خلیوں میں JC-1 ڈائی کا فلوروسینس بھی ایک الٹی فلوروسینس مائکروسکوپ (میگنیفیکیشن، x200؛ Nikon Eclipse Ti‑E) کے ساتھ دیکھا گیا۔ ROS کے تجزیہ کے لیے، Eca-109 خلیوں کا علاج CTPG-W (0, 400, 600, اور 800 µg/ml) کے ساتھ 2, 4, 6, 12 اور 24 h کے لیے کیا گیا، اور Reactive Oxygen Species Assay سے داغدار کیا گیا۔ کٹ (بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی)، مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، 37˚C پر 20 منٹ کے لیے۔ آئس کولڈ پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھونے کے بعد، فلو سائٹومیٹری (BD FACSCalibur) کے ذریعے نمونے جمع کیے گئے اور FlowJo 7.6 سافٹ ویئر کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔

شکل 1. CTPG-W کا اہل کنٹرول۔ CTPG-W کے اجزاء کو اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی کے ذریعے قابلیت اور مقداری تجزیہ کیا گیا اور echinacoside اور acteoside کے معیارات کے ساتھ موازنہ کیا گیا۔ CTPG-W، پانی میں گھلنشیل phenylethanoid glycosides ofC. tubulosa.

2,2‑ڈفینائل‑1‑picrylhydrazyl (DPPH) ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی۔ CTPG-W کی آزاد ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی کا تعین DPPH فری ریڈیکل پرکھ کے ساتھ شائع شدہ پروٹوکول کے مطابق ایک معمولی ترمیم کے ساتھ کیا گیا تھا، کیونکہ DPPH (25,26) کو تحلیل کرنے کے لیے میتھانول کو ایتھنول سے بدل دیا گیا تھا۔ مستحکم حالت کی پیمائش کے لیے، ایتھنول میں 150 µl DPPH (100 mmol/l) کو CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400، 500 اور 600 µg/ml) 50 µl PBS میں، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک اندھیرے میں انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ CTPG-W کی موجودگی اور غیر موجودگی میں 517 nm پر جاذبیت کا پتہ چلا۔ مجموعی طور پر 50 μl وٹامن سی کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ ڈی پی پی ایچ ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی کا حساب اس فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا: سکیوینگنگ (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100، جہاں Ablank کنٹرول کا جذب ہے (DPPH کے بغیر)، Asample نمونے کی جاذبیت ہے اور A0 DPPH کے ساتھ PBS کی جاذبیت ہے۔

مغربی دھبے کا تجزیہ۔ Eca{{0}} خلیوں کا علاج CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) یا 0.4% DMSO کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے 37˚C پر 5% CO2 کے ساتھ کیا گیا۔ PBS، خلیات کے ساتھ دو بار مندرجہ ذیل دھونے 

شکل 2. Eca-109 خلیوں اور splenocytes کی نشوونما پر CTPG-W کا اثر۔ (A) Eca-109 خلیوں کا علاج CTPG-W کی مختلف ارتکاز کے ساتھ 24، 48، اور 72 h کے لیے کیا گیا، اور پھر MTT پرکھ کے ساتھ سیل کی قابل عملیت کا پتہ چلا۔ (B) 24 گھنٹے پر CTPG-W کے علاج پر Eca-109 خلیوں کی شکلیاتی تبدیلیاں۔ (C) C57BL/6 چوہوں کے Splenocytes کا علاج CTPG-W کے مختلف ارتکاز کے ساتھ 24، 48، اور 72 h کے لیے کیا گیا، اور پھر MTT پرکھ کے ساتھ پھیلاؤ کا تجزیہ کیا گیا۔**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

برف پر 20 منٹ تک Radioimmunoprecipitation Assay Lysis بفر (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd.، بیجنگ، چین) میں لیس کیا گیا۔ 10،000 xg پر 10 منٹ کے لیے 4˚C پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، سپرنٹنٹس کو اکٹھا کیا گیا، اور مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق ایک بائی سینچونینک ایسڈ کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ) کے ساتھ پروٹین کی تعداد کا پتہ چلا۔ مغربی بلٹ تجزیہ ہماری پچھلی تفصیل (24) کے مطابق کیا گیا تھا۔ کیسپیس کے خلاف اینٹی باڈیز-7 (بلی نمبر D120077)، کیسپیس-8 (کیٹ نمبر D155240)، کیسپیس-9 (بلی نمبر D220078)، بی سیل لیمفوما-7 {13}} (Bcl-2) سے وابستہ X (Bax) (cat. no. D220073) اور Bcl-2 (cat. no. D260117)، اور اینٹی ماؤس IgG-horseradish peroxidase (HRP) ) (بلی نمبر D111050) اور اینٹی خرگوش IgG-HRP (بلی نمبر D110058) بی بی آئی لائف سائنسز (شنگھائی، چین) سے خریدے گئے تھے۔ کیسپیس کے خلاف اینٹی باڈیز-3 (بلی نمبر E-AB-10050) اور ایکٹیو کیسپیس-3 (بلی نمبر E-AB-22115) Elabscience سے خریدے گئے تھے۔ ووہان، چین)۔ کیسپیس کے خلاف دیگر اینٹی باڈیز-7 (بلی نمبر 9492)، پولی (ADP-ribose) پولیمریز (PARP) (cat. no. 9542)، cytochrome c (cat. no. AC909) c-Jun NH{ {37}}ٹرمینل کناز (JNK) (cat. no. 9252S) اور -actin (cat. no. 58169) Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ تمام پرائمری اور سیکنڈری اینٹی باڈیز کو 1:1،000 پر گھٹا دیا گیا تھا۔ پرائمری اینٹی باڈیز کو راتوں رات 4˚C پر انکیوبیٹ کیا جاتا تھا اور ثانوی اینٹی باڈیز کو 37˚C پر 1 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔

شکل 3. Eca-109 خلیوں کا apoptosis CTPG-W کے ذریعے حوصلہ افزائی۔ خلیوں کو 24 گھنٹے کے لئے CTPG-W کی مختلف حراستی کے ساتھ علاج کیا گیا۔ (A) اپوپٹوٹک اور نیکروٹک Eca-109 خلیوں کا بہاؤ سائٹوومیٹری کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا۔ اوپری پینل انفرادی ڈاٹ پلاٹوں کو ظاہر کرتا ہے اور نچلا پینل سمری ڈیٹا کو ظاہر کرتا ہے۔ *پی<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، ٹارگٹ پروٹینز کو ایک بہتر کیمیلومینیسینس پرکھ کٹ (بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیو ٹیکنالوجی) کا استعمال کرتے ہوئے پتہ چلا۔

شماریاتی تجزیہ۔ شماریاتی اہمیت کا اندازہ ٹکی کے پوسٹ ہاک ٹیسٹ کے ساتھ تغیر کے یک طرفہ تجزیہ سے لگایا گیا تھا اور علاج اور کنٹرول گروپس کے درمیان گراف پیڈ پرزم 5{2}} سافٹ ویئر (گراف پیڈ سافٹ ویئر، لا جولا، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے نتائج کا تجزیہ کیا گیا تھا۔ تمام اعداد و شمار کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر پیش کیا گیا تھا۔ پی<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

گردے کے فنکشن کو بہتر بنانے کے لیے CISTANCHE TUBULOSA EXTRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

نتائج

CTPG-W Eca-109 خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے۔

CTPG-W کے اجزاء HPLC (تصویر 1) کے ذریعہ اہل اور مقدار کے مطابق تھے، جن کا موازنہ echinacoside اور acteoside کے معیارات سے کیا گیا تھا۔ چوٹی برقرار رکھنے کے اوقات اور چوٹی کے علاقوں کے مطابق، CTPG-W میں 39.16% echinacoside اور 2.44% acteoside شامل ہیں۔ سب سے پہلے، Eca-109 خلیات کی عملداری پر CTPG-W کے اثر کا تعین MTT پرکھ سے کیا گیا تھا۔ CTPG-W کو DMSO میں 200 mg/ml پر تحلیل کیا گیا تھا اور RPMI-1640 میڈیم کے ساتھ پتلا کیا گیا تھا جس میں 10% حرارت سے غیر فعال FBS اشارہ شدہ ارتکاز میں تھا۔ Eca-109 سیلز کا علاج CTPG-W کے ساتھ کیا گیا تھا اور سیل کی قابل عملیت کا MTT پرکھ کے ساتھ اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس پر تجزیہ کیا گیا تھا۔ CTPG‑W علاج نے خوراک اور وقت پر منحصر انداز میں Eca-109 خلیوں کی عملداری کو نمایاں طور پر کم کیا (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

شکل 4. Eca-109 خلیات میں سیل سائیکل کی تقسیم پر CTPG-W کا اثر۔ CTPG-W کے مختلف ارتکاز کو Eca-109 خلیوں کے علاج کے لیے 24 گھنٹے تک استعمال کیا گیا اور سیل سائیکل کی تقسیم کا بہاؤ سائٹومیٹری کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ *پی<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W Eca-109 خلیوں میں apoptosis کو اکساتا ہے۔ اس بات کی تحقیق کرنے کے لیے کہ آیا CTPG-W نے apoptosis یا necrosis کی شمولیت کے ذریعے Eca-109 خلیات کی نشوونما کو دبایا، خلیوں کا علاج CTPG-W کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے بعد، Eca-109 خلیوں کے apoptosis اور necrosis کا پتہ Annexin V/PI سٹیننگ کے ساتھ ہوا۔ جیسا کہ تصویر 3A میں دکھایا گیا ہے، Annexin V- /PI+ خلیوں کو necrotic خلیات کے طور پر گیٹ کیا گیا تھا، اور Annexin V+ /PI+ اور Annexin V+ /PI- خلیوں کو اپوپٹوٹک خلیوں کے طور پر گیٹ کیا گیا تھا۔ CTPG-W نے بنیادی طور پر Eca-109 خلیوں کے apoptosis کو خوراک پر منحصر انداز میں اکسایا، حالانکہ necrotic Eca-109 خلیات میں بھی 600 اور 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W Eca-109 خلیوں میں S مرحلے میں سیل سائیکل گرفتاری کو اکساتا ہے۔ کینسر سیل سائیکل کی خرابی سیل کی ترقی کو دبائے گی اور apoptosis کو فروغ دے گی (27). Eca-109 خلیوں میں سیل سائیکل کی تقسیم کا پتہ 24 گھنٹے کے لیے CTPG-W کے علاج کے بعد PI داغ کے ساتھ پایا گیا۔ یہ دیکھا گیا کہ S مرحلے میں خلیات میں اضافہ ہوا اور G0/G1 مراحل میں خلیات نے CTPG-W علاج (P) پر مجموعی طور پر نمایاں کمی کی نشاندہی کی۔<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W Δψm کو کم کرتا ہے اور cytochrome c کی رہائی کو اکساتا ہے۔ اپوپٹوس کو مائٹوکونڈریل پر منحصر راستہ (28,29) کے ذریعہ متاثر کیا جاسکتا ہے۔ BCL-2 پروٹین فیملی کے حامی اور اینٹی اپوپٹوٹک اراکین مائٹوکونڈریل میمبرین کی سالمیت (30,31) کے ضابطے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ 24 گھنٹے کے لئے CTPG-W علاج کے بعد، Δψm کا اندازہ JC-1 سٹیننگ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ JC-1 مجموعی (FL‑2 میں سرخ فلوروسینس کا پتہ چلا) monomer میں ٹوٹ جائے گا (FL-1 میں سبز فلوروسینس کا پتہ چلا) جب Δψm کم ہو رہا ہو (32)۔ جیسا کہ تصویر 5A میں دکھایا گیا ہے، FL-1+ FL-2-/+ خلیوں کی تعدد خوراک پر منحصر انداز میں نمایاں طور پر بڑھی ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ Eca-109 خلیوں کے Δψm میں کمی واقع ہوئی ہے۔ Eca-109 خلیوں میں فلوروسینس تبدیلیوں کو بھی الٹی فلوروسینس مائکروسکوپ (تصویر 5B) کے ساتھ دیکھا گیا۔ CTPG-W کی بڑھتی ہوئی ارتکاز کے ساتھ، سرخ فلوروسینس میں کمی واقع ہوئی اور سبز فلوروسینس میں اضافہ ہوا، جو کہ فلو سائٹومیٹری کے ڈیٹا سے مطابقت رکھتا ہے۔ یہ بھی دیکھا گیا کہ cytosol میں cytochrome c کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا (تصویر 5C)، جو Δψm کی کمی کا نتیجہ ہے۔ یہ FL-1+ FL-2-/+ خلیوں کی بڑھتی ہوئی تعداد سے اخذ کردہ نتیجے کو تقویت دیتا ہے جو CTPG-W علاج کے نتیجے میں Δψm کم ہوئے ہیں۔ یہ اطلاع دی گئی ہے کہ JNK BCL-2 پروٹین فیملی کے ایکٹیویشن کو ریگولیٹ کر سکتا ہے جس سے سائٹوکوم سی (33-35) کی رہائی ہوتی ہے۔ یہ بھی طے پایا کہ CTPG-W علاج (تصویر 5C) کے بعد JNK کی سطح کو نمایاں طور پر بڑھا دیا گیا تھا۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ CTPG-W مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کے ذریعے Eca-109 خلیوں کے apoptosis کو آمادہ کر سکتا ہے۔

شکل 5. Δψm کی کمی اور سائٹوکوم c اور JNK کی اپ گریجشن۔ Eca-109 خلیوں کا علاج CTPG-W کے مختلف ارتکاز کے ساتھ 24 گھنٹے تک کیا گیا۔ (A) Δψm کا پتہ JC-1 داغ لگانے سے ہوا اور نمونوں کا بہاؤ سائٹوومیٹری کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا۔ انفرادی ڈاٹ پلاٹ JC-1 فلوروسینس میں تبدیلیوں کو ظاہر کرتے ہیں۔ FL-1+ FL-2-/+ سیلز کی فریکوئنسی کو نچلے پینل میں دکھایا گیا ہے۔ ***پی<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

شکل 6. CTPG-W کے علاج اور CTPG-W کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی پر Eca-109 خلیوں میں ROS کی سطح۔ (A) Eca-109 خلیوں کا علاج CTPG‑W کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا تھا اور ROS کی سطحوں کا تجزیہ وقتی پوائنٹس پر فلو سائٹومیٹری کے ذریعے کیا گیا تھا۔ *پی<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

انٹرا سیلولر ROS جنریشن پر CTPG-W کا اثر۔ROS apoptosis (36) کو دلانے کے لئے Δψm کو کم کرسکتا ہے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا CTPG-W ROS کی پیداوار میں اضافہ کر سکتا ہے، Eca-109 خلیوں کا علاج CTPG-W کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ سیلز کو اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس پر جمع کیا گیا تھا اور DCFH-DA سے داغ دیا گیا تھا۔ Eca-109 خلیوں میں انٹرا سیلولر ROS کی پیداوار کا تعین بہاؤ سائٹومیٹری کے ذریعے کیا گیا تھا۔ جیسا کہ تصویر 6A میں دکھایا گیا ہے، 800 µg/ml CTPG-W نے ROS کی پیداوار کو 2-6 h سے نمایاں طور پر بڑھایا، اور 12-24 h سے کم ہوا۔ مزید برآں، 400 µg/ml CTPG‑W نے ROS کی پیداوار میں 12-24 h سے نمایاں اضافہ کیا۔ مزید برآں، 200 µg/ml CTPG-W نے ROS کی پیداوار کو خاص طور پر تبدیل نہیں کیا۔ ROS کی پیداوار میں متحرک تبدیلیاں Eca-109 سیل اپوپٹوس سے وابستہ ہو سکتی ہیں۔ یہ بھی طے کیا گیا تھا کہ CTPG-W میں آزاد ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی (تصویر 6B) تھی، جو 12 گھنٹے کے بعد 800 µg/ml CTPG-W کے ساتھ علاج کیے جانے والے Eca-109 خلیوں میں ROS کی پیداوار میں کمی سے منسلک ہو سکتی ہے۔

شکل 7. CTPG-W علاج کے بعد کلیویڈ-کیسپیسز اور کلیویڈ-PARP کی سطح۔ پروٹینز کو CTPG-W کے ساتھ علاج کیے گئے Eca-109 خلیوں سے 24 گھنٹے کے لیے الگ تھلگ کیا گیا تھا اور کلیویڈ-کیسپیسز اور کلیویڈ-PARP کی سطحوں کا مغربی دھبے کے تجزیہ سے پتہ چلا تھا۔ DMSO، dimethyl سلفوکسائڈ؛ CTPG-W، پانی میں گھلنشیل phenylethanoid glycosides ofC. tubulosa; PARP، پولی (ADP-ribose) پولیمریز۔

CTPG‑W caspase‑3، caspase‑7، caspase‑9 اور PARP کی سرگرمی کو اپ گریڈ کرتا ہے۔ Δψm کی کمی کی وجہ سے سائٹوکوم سی کی رہائی اپوپٹوسس (29,30,37) کو دلانے کے لئے کیسپیس پروٹیز کو متحرک کرسکتی ہے۔ 24 گھنٹے کے لیے CTPG-W کے علاج کے بعد، کیسپیس-3، 7، 8، 9، اور PARP کے فعال ہونے کا پتہ مغربی بلاٹ تجزیہ کے ذریعے پایا گیا۔ کنٹرول کے مقابلے میں، کلیویڈ-کیسپیس-9، کلیویڈ-کیسپیس-7، کلیویڈ-کیسپیس-3 اور کلیویڈ-PARP کی سطحیں، لیکن کلیویڈ-کیسپیس کی سطحیں نہیں{{20 }}، خوراک پر منحصر طریقے سے CTPG علاج کے ذریعے اپ ریگولیٹ کیے گئے تھے (تصویر 7)۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ CTPG-W نے Δψm کو کم کیا اور کیسپیسز کو چالو کرنے کے لیے سائٹوکوم سی ریلیز کو فروغ دیا جو Eca-109 خلیوں کے apoptosis کو اکساتے ہیں۔

بحث

روایتی CHM مختلف راستوں کے ذریعے غذائی نالی کے کینسر کے خلیوں کے اپوپٹوس کو آمادہ کر سکتا ہے، بشمول خارجی موت کے رسیپٹر، اور اندرونی مائٹوکونڈریل اور اینڈوپلاسمک ریٹیکولم تناؤ کے راستے (29)۔ ہمارے پچھلے مطالعے نے یہ ظاہر کیا کہ CTPG، C. tubulosa کے بڑے جزو کے طور پر، میلانوما B16-F10 خلیوں کی افزائش کو روکتا ہے جس کے ذریعے apoptosis کی شمولیت مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے (24) کے ذریعے ہوتی ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، Eca-109 خلیوں پر CTPG-W کے اینٹی ٹیومر اثر کی تحقیق کی گئی اور یہ طے پایا کہ CTPG-W نے Eca-109 خلیوں کی نشوونما، حوصلہ افزائی apoptosis، اور سیل سائیکل گرفتاری کو دبایا، کم Δψm، سائٹوکوم سی کی رہائی میں اضافہ اور چالو کیسپیسز۔ CTPG اور CTPG-W کینسر کے خلیوں میں apoptosis اور سیل سائیکل گرفتاری کو آمادہ کر سکتے ہیں۔ تاہم، CTPG (26.64% echinacoside، 10.19% acteoside، اور 1.71% isoacteoside) اور CTPG-W (39.16% echinacoside اور 2.44% acteoside) کے مختلف اجزاء کی وجہ سے درست طریقہ کار مختلف ہیں۔ CTPG نے B16-F10 سیلز کو G0/G1 مراحل میں گرفتار کیا، لیکن CTPG-W نے Eca-109 سیلز کو S فیز (24) میں گرفتار کیا۔ ROS کی پیداوار میں خوراک پر منحصر اضافہ CTPG کے ذریعے کیا گیا تھا، لیکن اس نے CTPG-W کی ایک اعلی خوراک کے ذریعے وقت پر منحصر انداز میں تبدیلی کی نشاندہی کی، جس میں CTPG-W علاج کے آغاز میں نمایاں اضافہ ہوا (2-6 h) اور کنٹرول کے مقابلے میں 12 گھنٹے کے بعد نمایاں کمی آئی۔ ایک ممکنہ وجہ یہ ہے کہ CTPG-W کا بڑا جزو echinacoside ہے۔ متعدد مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ ایکناکوسائیڈ ROS کی پیداوار اور ROS کی حوصلہ افزائی اپوپٹوسس کو اپنے نیوروپروٹیکٹو اور اینٹی ایجنگ اثرات (38-40) کو استعمال کرنے کے لیے روک سکتا ہے۔ اسی طرح، موجودہ مطالعہ میں آزاد ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمی دیکھی گئی۔ لہذا، یہ قیاس کیا گیا تھا کہ CTPG-W کی زیادہ مقدار میں verbascoside، iso-verbascoside، اور salidroside سمیت کچھ اجزاء Eca-109 خلیات (41,42) کے اپوپٹوسس کا سبب بننے کے لیے فوری طور پر ROS کی نسل کو آمادہ کر سکتے ہیں۔ ROS کو echi کے ذریعہ صاف کیا گیا تھا۔nacoside. CTPG اور CTPG-W کے ذریعہ ROS کی پیداوار میں فرق کی ایک اور ممکنہ وجہ یہ ہے کہ اس مطالعہ اور پچھلے مطالعہ (24) میں مختلف سیل لائنوں کا استعمال کیا گیا تھا۔ ڈونگ ایٹ ال (43) نے اطلاع دی ہے کہ ایچیناکوسائڈ آر او ایس کی سطح میں اضافے کے بغیر آکسیڈیٹیو ڈی این اے کو نقصان پہنچانے کے ذریعے انسانی SW480 کولوریکٹل کینسر کے خلیوں کے اپوپٹوسس کو آمادہ کرسکتا ہے۔

CTPG-W علاج نے Δψm کو کم کیا اور سائٹوکوم c کی رہائی کا سبب بنا، جو کیسپیس کے کلیویج کو فروغ دیتا ہے-9 (28)۔ مستقل طور پر، CTPG-W علاج کے ذریعے کلیویڈ-کیسپیس-9 کی سطحوں کو اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، فعال کیسپیس-9 کیسپیس کو چالو کر سکتا ہے-3 اپوپٹوس (44) کو دلانے کے لیے۔ CTPG-W ٹریٹمنٹ کے ذریعے کلیویڈ کیسپیس کی سطحوں کو بھی اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ تاہم، کیسپیس-8 کو CTPG-W کے ذریعے چالو نہیں کیا گیا تھا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ CTPG-W کے ذریعے پیدا ہونے والے اپوپٹوسس میں خارجی موت کے رسیپٹر کا راستہ شامل نہیں تھا۔ یہ مشاہدات بتاتے ہیں کہ CTPG-W مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کو چالو کرنے کے ذریعے Eca-109 خلیوں کے apoptosis کو اکساتا ہے۔

PARP جینومک استحکام میں اہم کردار ادا کرتا ہے اور اسے فعال کیسپیسز، خاص طور پر کیسپیس-3 اور -7 (45) کے ذریعے صاف کیا جا سکتا ہے۔ یہ طے کیا گیا تھا کہ CTPG-W علاج نے کیسپیس کو چالو کیا ہے-3 اور -7، جو ڈی این اے کی مرمت کو روکنے اور اپوپٹوسس کا سبب بننے کے لیے PARP کو ​​بند کر سکتا ہے۔

CTPG-W خوراک اور وقت پر منحصر انسانی ہیپاٹو سیلولر کارسنوما BEL-7404 خلیات (غیر مطبوعہ ڈیٹا) کی نشوونما کو بھی روکتا ہے۔ اگرچہ CTPG-W Eca-109 اور BEL-7404 خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے، لیکن یہ splenocytes کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے، جو CTPG-W (46) میں پولی سیکرائڈز (~50%) کے مواد کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ )۔ اسی طرح، متعدد مطالعات نے اطلاع دی ہے کہ پولی سیکرائڈز اسپلینوسائٹس (46-49) کے پھیلاؤ کو فروغ دے سکتے ہیں۔ ماؤس ماڈل میں، یہ طے کیا گیا تھا کہ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں CTPG-W نے تلی کے انڈیکس میں نمایاں اضافہ کیا ہے، لیکن اس نے جسمانی وزن اور دل، جگر، گردے، اور پھیپھڑوں سمیت دیگر اعضاء کے اشاریہ جات کو متاثر نہیں کیا (غیر مطبوعہ ڈیٹا)، یہ بتاتا ہے کہ CTPG-W کا عام خلیوں پر کوئی سائٹوٹوکسک اثر نہیں ہے۔

اجتماعی طور پر، ڈیٹا نے اشارہ کیا کہ CTPG-W مائٹوکونڈریل پر منحصر راستے کے ذریعے اپوپٹوسس کی شمولیت سے Eca-109 خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے۔

جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%