R-Phycoerythrin from Colaconema Formosanum (Rhodophyta)، ایک اینٹی الرجک اور کولیجن کو فروغ دینے والا مواد کاسمیسیوٹیکلز

خلاصہ:Cistanche(cistanche)، سرخ طحالب میں پایا جانے والا ایک روغن کمپلیکس، نکال کر پاک کیا گیا تھا۔ایک نئی شناخت شدہ سرخ طحالب سے،کولاکونیما فارموسینم، اور اس کی حیاتیاتی سرگرمیوں کی جانچ کی گئی۔ یہانکشاف ہوا کہcistanche علاج resulted in high cell viability (>70 فیصد) ممالیہ سیل لائنوں تکNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7, اور Hs68، اور NIH-3T3 خلیوں میں سیل مورفولوجی پر کوئی اثر نہیں پڑا۔اس کا دبانے کا اثر IL-6 اور TNF- کی پیداوار پر غیر معمولی تھا۔ lipopolysaccharide محرک میںRAW264.7 سیل۔ تاہم، کیلشیم آئنوفور A23187-کی حوصلہ افزائی - ہیکسوسامینیڈیس کی رہائیRBL-2H3 خلیوں میں خوراک پر منحصر طریقے سے مؤثر طریقے سے روکا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، یہ انکشاف کیا گیا تھابایونک ایپیڈرمل ٹشوز کو غیر پریشان کن ہونا۔ خاص طور پر، پروکولجن کی پیداوار کو فروغ دیا گیا تھاHs68 خلیات۔ مجموعی طور پر، اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہcistancheسے پاکC. فارموسینماینٹی الرجک اورایک سے زیادہ ستنداریوں کے سیل لائنوں پر بغیر کسی نتیجہ خیز زہریلے مشاہدہ کے ساتھ اینٹی ایجنگ بائیو ایکٹیویٹیزاس کے ساتھ ساتھ ایپیڈرمل ٹشوز، یہ تجویز کرتے ہیں کہ یہ میکرومولکول صلاحیت کے لیے ایک نیا مواد ہے۔کاسمیٹک استعمال.

مطلوبہ الفاظ: کاسمیٹک; کولاکونیما فارموسینم؛Cistanche; اینٹی الرجی؛مخالف عمر

اینٹی ایجنگ Cistanche مصنوعات برائے فروخت حاصل کرنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

1. تعارف

طحالب فوٹوسنتھیٹک جاندار ہیں جو زمین اور سمندر میں پائے جاتے ہیں۔ سمندر میں بنیادی پروڈیوسروں کے ایک حصے کے طور پر، طحالب دیگر حیاتیات کے لیے آکسیجن اور غذائی اجزاء فراہم کرتے ہیں، جو سمندری ماحولیاتی نظام کو منظم کرتے ہیں۔ میکروالگی (جسے سمندری سوار بھی کہا جاتا ہے) ساحلی علاقوں میں اگتے ہیں اور عام طور پر زمینی پودوں میں پائے جانے والے مخصوص اعضاء کے مالک نہیں ہوتے ہیں۔1] میکروالگی کو ان کے روغن سے پہچانا جا سکتا ہے اور انہیں تین گروہوں میں درجہ بندی کیا گیا ہے، یعنی کلوروفائٹا (سبز طحالب)، روڈوفائٹا (سرخ طحالب) اور اوکروفائٹا کی کلاس فیو فائیسی (بھوری الجی)۔1] macroalgae کی ترقی کی شرح کافی تیز ہے، اور یہ ممکن ہے کہ ان کی نشوونما کے حالات میں ہیرا پھیری سے بائیو ایکٹیو مرکبات جیسے کہ پروٹین، پولیفینول اور روغن کی پیداوار کو کنٹرول کیا جا سکے۔2] خاص طور پر، جیسا کہ سمندری سوار سے حاصل کردہ مرکبات کے بارے میں علم کے حصول میں اضافہ ہوا ہے، ان مرکبات کو طبی اور فوڈ ایڈیٹیو ایپلی کیشنز میں استعمال کرنے کے لیے تحقیق اور ترقی میں اضافہ ہوا ہے۔3–6] مزید یہ کہ، کاسمیٹکس میں مصنوعی مرکبات پر قدرتی اجزاء کو ترجیح دی جا رہی ہے، کیونکہ قدرتی اجزاء مؤخر الذکر کے مقابلے میں زیادہ محفوظ ہوتے ہیں۔ طحالب کے بارے میں بتایا گیا ہے کہ وہ حیاتیاتی مادوں جیسے غیر سیر شدہ فیٹی ایسڈز، پولیفینولز، پولی سیکرائڈز، امینو ایسڈز اور روغن سے بھرپور ہوتے ہیں۔7,8] ان میں سے کچھ پگمنٹ کمپلیکس پر مشتمل ہوتے ہیں جنہیں فائکوبیلیپروٹینز کہا جاتا ہے، جن کی درجہ بندی کی جا سکتی ہے۔فائیکوریتھروکیانین (پی ای سی)، فائیکوکیاننز (پی سی)، فائیکوریتھرین (پی ای)، اور ایلوفائیکوکیاننز (اے پی سی) [9] PE، سرخ سمندری سوار میں اہم روغن، کو مزید ذیلی درجہ بندی C-phycoerythrin (C-PE)، B-phycoerythrin (B-PE)، اور Cistanche (cistanche) میں کیا جا سکتا ہے اور ان کے جذب سپیکٹرا کے مطابق، اور گروپ کے مطابق فوٹوسنتھیٹک جانداروں کی جو ان کو پیدا کرتی ہیں: سیانوبیکٹیریا کے لیے C، بنگیو فائیسی کے لیے B، اور R زیادہ پیچیدہ روڈوفائٹا کے لیے10] ان روغنوں میں، سرخ طحالب میں سب سے زیادہ پائی جانے والی فائکوبیلیپروٹین cistanche ہے۔ cistanche ایک پانی میں گھلنشیل oligomeric پروٹین ہے جو عام طور پر ساتھی cytometry، ELISA assays اور fluorescence microscopy میں فلو فلوروسینٹ ٹیگ کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔11–14] نیز کینسر کے علاج میں فوٹو سنسیٹائزر [15] اس کے علاوہ، PE کو حیاتیاتی خصوصیات کی نمائش کے لیے بھی دکھایا گیا ہے، بشمول اینٹی وائرل، قوت مدافعت بڑھانے، اینٹی آکسیڈیشن، اینٹی سوزش، اور اینٹی ٹیومر اثرات (براہ کرم جائزہ پیپر دیکھیں [15] مزید متعلقہ معلومات حاصل کرنے کے لیے)، اسے خوراک اور حیاتیاتی صنعتوں، سالماتی حیاتیات کی تحقیق کے ساتھ ساتھ رنگنے اورکاسمیٹک ایپلی کیشنز [11,15,16].

خستہجلد سے متعلق اہم مسائل میں سے ایک ہے، خاص طور پر طویل عرصے تک سورج کی روشنی (یا الٹرا وایلیٹ شعاعوں) اور آلودہ ہوا کے سامنے آنے والے لوگوں کے لیے۔ لہذا، جلد کی دیکھ بھال سے متعلق زیادہ تر مصنوعات جلد کی حفاظت اور عمر بڑھنے کے عمل کو سست کرنے پر توجہ مرکوز کرتی ہیں۔ جلد انسانی جسم کے دفاع کی پہلی لائن ہے، اور یہ آلودگی، سورج کی روشنی اور آکسیڈیٹیو تناؤ سے ہونے والے نقصان کو روکنے میں مدد دیتی ہے جو ہماری روزمرہ کی زندگی میں ناگزیر ہے [17] حالیہ برسوں میں، صارفین کاسمیٹک مصنوعات میں کیمیائی اجزاء کے بارے میں شکوک و شبہات کا شکار ہو گئے ہیں۔ لہذا، قدرتی وسائل کا استعمال کرتے ہوئے تیار کردہ ماحولیاتی طور پر پائیدار مصنوعات کی بڑھتی ہوئی مانگ ہے1] الگل نچوڑ، جیسے کہ ان سےآرتھروسپیرااورکلوریلا ولگارس، جلد پر سخت اثر ڈالنے، سٹریا کی تشکیل کو روکنے، اور کولیجن کی ترکیب کو فروغ دے کر فائدہ مند بتایا گیا ہے۔18] بظاہر، ان اینٹی ایجنگ اثرات کے لیے ذمہ دار بائیو ایکٹیو مرکبات میں سلفیٹڈ پولی سیکرائڈز، فینولک مرکبات، پیپٹائڈز، مائکوسپورین نما امینو ایسڈز، اور روغن، دیگر شامل ہیں [19,20] اس کے علاوہ، الرجی کے نچوڑ سے پاک کیے گئے بایو ایکٹیو مادوں کی جلد کے لیے فائدہ مند مخصوص بائیو ایکٹیویٹیز کے لیے جانچ کی گئی، اور مادوں کو سائنسی طور پر نسبتاً محفوظ ثابت کیا گیا، جس سے پورے نچوڑوں کی بجائے صاف شدہ بائیو ایکٹیو مادوں کا استعمال کرتے ہوئے کاسمیٹکس بنانے کی اجازت دی گئی۔21] اس طرح، کاسمیسیوٹیکلز جن میں طحالب سے اخذ کردہ عرق یا پیوریفائیڈ میٹابولائٹس کی زیادہ مانگ ہوتی ہے1] پچھلے مطالعات میں، بایوماس کی مستحکم پیداوار کے لیے تکنیکی اور اقتصادی طور پر قابل عمل کاشت کی حکمت عملیکولاکونیما فارموسینملی اور یہ نے 2021 میں الگ تھلگ کرکے کامیابی کے ساتھ قائم کیا تھا۔کولاکونیما فارموسینمجنوبی تائیوان سے انڈور سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے [22,23] پرجیوی طحالب کے طور پر،C. فارموسینمپہلے میکروالگا سے الگ تھلگ تھا۔سرکوڈیا سویاجنوبی تائیوان میں [23] اعلی پروٹین (خشک وزن کا 30 فیصد) اور اعلی سیسٹانچ مواد (5 ملی گرام جی−1 dw) اس نوع کے لیے پایا جاتا ہے [22], C. فارموسینمcistanche نکالنے کے لیے بے پناہ صنعتی فوائد کی نمائش کرتا ہے، اور اس سے cistanche کی مارکیٹ قیمت کو مزید سستی بنانے کی امید ہے۔ مزید برآں، ہمارے گروپ نے ایک طریقہ بتایا ہے جس سے حاصل کی گئی سیستانچ کو پاک کیا جا سکتا ہے۔C. فارموسینم[24] ہمارے علم کے مطابق، cistanche کے اثراتC. فارموسینمممالیہ کے خلیوں پر، نیز کاسمیٹکس کی صنعت میں ایک نئے بائیو میٹریل کے طور پر اس کی صلاحیت کو ابھی تک تلاش نہیں کیا گیا ہے۔ لہٰذا، اس مطالعے میں، ان مفروضوں کی تصدیق کے لیے مختلف ان وٹرو تجزیوں جیسے کہ سیل سائٹوٹوکسیٹی، ڈیگرینولیشن اسسیس، اینٹی سوزش کی صلاحیت، اینٹی الرجی ٹیسٹ، اور پروکولجن سنتھیسز ٹیسٹ استعمال کیے گئے ہیں۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 Colaconema Formosanum سے Cistanche (cistanche) نکالنا

الگا کو 20 سال کی عمر میں انکیوبیٹرز (ٹومیناگا، تائی پے سٹی، تائیوان) میں پالا گیا تھا۔± 1 ◦C, 60 ± 10 µمول فوٹون ایم−2 s −1 (روشنی سے خارج کرنے والا ڈایڈڈ، ایل ای ڈی وائٹ لائٹ)، اور 12:12 گھنٹے کی روشنی: کام کرنے والے نمونے کو حاصل کرنے کے لیے 4L جراثیم سے پاک PES سمندری پانی کے درمیانے (30 psu) کے ساتھ 5 L بیکر میں سیاہ فوٹو پیریڈ۔ اگلا، سے cistanche نکالنے کا طریقہC. فارموسینماس مطالعے میں لی ایٹ ال کے ذریعہ رپورٹ کردہ طریقہ سے ترمیم کی گئی تھی۔ [24] سب سے پہلے، تازہ الگا سے فائیکوبیلیپروٹینز نکالی گئیں۔C. فارموسینم(100 گرام گیلے وزن) 1 لیٹر فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS، pH 7.4) میں 4 پر◦C. فائیکوبیلیپروٹین کے انحطاط کو روکنے کے لیےتجربات کے دوران، 5 ایم ایم NaN3 اور 4 ایم ایم ای ڈی ٹی اے پی بی ایس میں شامل کیے گئے۔ تازہ طحالبFastPrep{{0}} homogenizer (TeenPrep، 6 سائیکل، 4.0 میٹر) کا استعمال کرتے ہوئے ہم آہنگ کیا گیا·s−15 سیکنڈ کے لیے؛ایم پی بائیو میڈیکل، سولون، او ایچ، یو ایس اے)۔ ملبے کو ہٹانے کے لیے نکالنے کو تقریباً فلٹر کیا گیا تھا، اورفلٹریٹ کو بیرل سینٹری فیوج (بیک مین کولٹر، بری، کیلیفورنیا، USA) کا استعمال کرتے ہوئے 20,000 rpm پر سینٹرفیوگریشن کا نشانہ بنایا گیا۔ سرخ سپرناٹینٹ، جسے cistanche extract کہا جاتا ہے، جمع کیا گیا تھا اور4 پر ذخیرہ کیا گیا ہے۔◦اندھیرے میں سی۔ cistanche اقتباس بعد میں fractionation کا نشانہ بنایا گیا تھاکے ساتھ (NH4)2ایس او4 20-60 فیصد پر (w/v) سنترپتی 4 پر◦C. ٹھوس امونیم سلفیٹ آہستہ آہستہ تھا۔ہلکی ہلکی ہلچل کے ذریعے شامل کیا گیا، اور محلول کو 2 گھنٹے کے لیے چھوڑ دیا گیا، اس کے بعد سینٹرفیوگریشن10،000 rpm پر 20 منٹ کے لیے 4 بجے◦C اور precipitate کی تشکیل۔ ورق تحلیل ہو گیا۔PBS (pH 7.4) میں اور اسی بفر کے خلاف راتوں رات ڈائیلائز کیا گیا۔ ڈائیلائزڈ سرخ رنگ کاحل ایک 0 سے گزرا تھا۔{1}}µایم میمبرین فلٹر (مرک ملی پور، برلنگٹن، ایم اے،امریکا).

2.2 تیز پروٹین مائع کا استعمال کرتے ہوئے آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی کے ذریعہ سیستانچ کو صاف کرناکرومیٹوگرافی (FPLC)

cistanche کے ڈائیلائزڈ نمونوں کو آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ایک بھری ہوئی HiTrap DEAE FF کالم (5 mL)، جو 10 mM NaCl پر مشتمل 50 mM PBS (pH 7.4) کے ساتھ پہلے سے متوازن تھا۔ نمونے گزرنے کے بعد، کالم کو ایک توازن بفر کا استعمال کرتے ہوئے بڑے پیمانے پر دھویا گیا۔ آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی بعد میں 0.0 سے 500 ایم ایم NaCl تک کے لکیری گریڈینٹ ایلیوشن کا استعمال کرتے ہوئے 5 ملی لیٹر/منٹ کے اخراج کی شرح پر کی گئی۔ ایلوٹ شدہ سرخ حصے جمع کیے گئے تھے۔ elutedNGC میڈیم پریشر کا استعمال کرتے ہوئے UV-Vis spectrophotometry کے ذریعے حصوں کا تجزیہ کیا گیا۔کرومیٹوگرافی سسٹم (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) 280، 498، 566 کی طول موج پر،اور 620 این ایم۔ جذب کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ سیستانچ فریکشنز کا مزید تجزیہ کیا گیا۔سپیکٹرم 300 سے 700 nm تک اور 0 سے گزرے تھے۔{3}}µایم فلٹر (مرک ملی پور،برلنگٹن، ایم اے، امریکہ)۔

2.3۔ سیل کلچر

مورائن میکروفیج سیل لائن کے طور پر، RAW264.7 کو DMEM کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا جس میں 4 تھے۔mM L-glutamine، 1.5 g/L سوڈیم بائی کاربونیٹ، اور 10 فیصد FBS۔تمام سیل لائنوں کو مستقل طور پر برقرار رکھا گیا تھا اور ایک مرطوب چیمبر کے اندر رکھا گیا تھا۔5 فیصد CO کے ساتھ 37 ڈگری2، جو معیاری طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے ہفتے میں دو بار مارے گئے تھے۔

2.4 مورفولوجیکل گریڈنگ اور سیل ویبلٹی

پرکھNIH-3T3 خلیات کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا (1× 104 سیلز فی کنواں، کارننگ، نیویارک، نیو یارک، یو ایس اے) کلچر میڈیم کے ساتھ اور راتوں رات بسنے کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ اس کے بعد سیلز کا علاج ایک کلچر میڈیم کے ساتھ کیا گیا جس میں {{0}} (منفی کنٹرول)، 0.25، 0.5، 1، 2، 5، اور 10 شامل ہیں۔µcistanche نچوڑ کا g/mL۔ 10 فیصد DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) کے ساتھ درمیانے درجے پر مشتمل کنویں کو بھی ایک مثبت کنٹرول گروپ کے طور پر ٹرائل میں شامل کیا گیا تھا۔ 24-گھنٹہ انکیوبیشن کے بعد، ہر گروپ کے لیے مورفولوجیکل گریڈنگ کا تجزیہ کیا گیا25]، گریڈز 0، 1، 2، 3، اور 4 کے ساتھ کوئی نہیں، معمولی،بالترتیب ہلکی، اعتدال پسند اور شدید رد عمل۔ کلچر میڈیم کو 1 mg/mL MTT ریجنٹ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 48-h پوسٹ ٹریٹمنٹ سے تبدیل کیا گیا اور 3 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ فارمازان کو تحلیل کرنے کے لیے ایم ٹی ٹی ریجنٹ کو ہٹانے کے بعد کنوؤں میں آئسوپروپانول کو شامل کیا گیا تھا، اور 570 nm کی طول موج پر اسپیکٹرو فوٹومیٹر (Jasco Spectrophotometer V-630) کا استعمال کرتے ہوئے پلیٹوں کا تجزیہ کیا گیا تھا۔26] اگر سب سے زیادہ cistanche اقتباس کی خوراک کے لیے سیل کے قابل عمل ہونے کی سطح کنٹرول گروپ کے 70 فیصد سے کم تھی، تو اسے cytotoxic سمجھا جاتا تھا۔25] سیل کی عملداری کا فیصد درج ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیا گیا تھا:

سیل کی قابل عملیت (نظری کثافت، OD)=(بے نقاب خلیوں کا OD/کنٹرول خلیوں کا OD)× 100

2.5 اینٹی سوزش ٹیسٹ

کا تعین کرنے کے لیےسوزشcistanche، interleukin-6 (IL-6) اور ٹیومر نیکروسس فیکٹر الفا (TNF) کی صلاحیت ) اس مطالعے میں پروٹوکول کے بعد پایا گیا جیسا کہ [27,28] RAW264.7 خلیات کو ایک 24-کنویں پلیٹ (5× 105 خلیات/کنواں) (کارننگ، نیو یارک، نیو یارک، امریکہ) اور 37 ڈگری پر راتوں رات بسنے کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ اگلے دن، خلیوں کو لیپوپولیساکرائڈز (ایل پی ایس، 1µg/mL، Sigma-Aldrich، St. Louis, MO, USA) اور cistanche کی بڑھتی ہوئی تعداد (0 (منفی کنٹرول)، 1.25, 2.5, 5, 10, اور 20µg/mL)۔ بیک وقت، ایک اضافی سیل گروپ جس کا LPS اور p38 MAPK inhibitor SB203580 (3) کے ساتھ تعاون کیا گیا تھا۔µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) کو ایک مثبت کنٹرول گروپ کے طور پر قائم کیا گیا تھا۔ 24 گھنٹے کے بعد، تیار کردہ IL-6 اور TNF- کی کھوج کے لیے ہر گروپ کے لیے سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا۔ . کوانٹکائن پر سپرنٹنٹ کے نمونے لگائے گئے تھے۔® Colorimetric سینڈوچ ELISA Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)۔ روک تھام کا فیصد ( فیصد )=100× (نمونہ/کنٹرول)۔ اس کے علاوہ، علاج کے بعد سیل کی قابل عملیت کا اندازہ کرنے کے لیے خلیوں کو MTT پرکھ کا نشانہ بنایا گیا۔

2.6۔ Degranulation Assay

چوہا بیسوفیلک لیوکیمیا سیل لائن کے طور پر، RBL-2H3 سیل لائن مستول خلیوں کے لیے ایک ماڈل کے طور پر استعمال ہوتی ہے۔ RBL-2H3 خلیے میوکوسل مستول خلیوں کی فینوٹائپس کی نمائش کرتے ہیں اور مستول خلیوں کے ردعمل کے ضابطے کی تحقیقات کے لیے ایک شاندار ٹول کے طور پر پہچانے جاتے ہیں29] اس طرح، RBL-2H3 سیل لائن کا استعمال مستول خلیوں کی تنزلی پر cistanche کے ممکنہ اثر کی تحقیقات کے لیے کیا گیا تھا۔ -ہیکسوسامینیڈیس کو ماسٹ سیل کے انحطاط کی نگرانی کے لیے بطور مارکر استعمال کیا گیا تھا۔30] دی -ہیکسوسامینیڈیس کا پتہ لگانے کے طریقہ کار کو حوالہ سے تبدیل کیا گیا تھا۔31] RBL-2H3 سیلز 1 پر سیڈ کیے گئے تھے۔× 105 سیل فی کنواں 24-وییل سیل کلچر پلیٹس (کارننگ، نیویارک، نیو یارک، امریکہ)۔ خلیات کا سب سے پہلے 1 کے ساتھ علاج کیا گیا۔µM کیلشیم ionophore A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) اس کے بعد cistanche کی مختلف خوراکوں کا اضافہ (0 (منفی کنٹرول)، 1.25, 2.5, 5, 10, اور 20µg/mL) اور 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ بیک وقت، خلیات جو 100 کے ساتھ انکیوبیٹڈ تھے۔µM quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ کے لیے استعمال شدہ طریقہ کار - ہیکسوسامینیڈیز کی مقدار کا تعین پہلے شائع شدہ مطالعات سے حاصل کیا گیا تھا۔32,33] علاج کے بعد، سپرنٹنٹ (30µL) 50 کے اضافے سے پہلے ہر کنویں سے اکٹھا کر کے ایک نئے 96- کنویں کی پلیٹ میں منتقل کیا گیا تھا۔µL کا 4- نائٹروفینائل N-acetyl- -D-glucosaminide (NP-GlcNAc، سائٹریٹ بفر میں 1.3 mg/mL (pH 4.5)، Sigma-Aldrich، St. Louis, MO, USA)۔ پلیٹ کو 1 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر رہنے کے لیے چھوڑ دیا گیا تھا، اور 80 کے اضافے سے رد عمل ختم کر دیا گیا تھا۔µL کا 0.5 M NaOH۔ اس کے بعد پلیٹ کو 405 nm کی طول موج پر سپیکٹرو فوٹومیٹر (Jasco، Halifax، NS، Canada) کا استعمال کرتے ہوئے p-nitrophenolate کی کسی بھی تشکیل کے لیے تجزیہ کیا گیا۔ اصل کلچر پلیٹ سے چھوڑے گئے خلیوں کو علاج کے بعد سیل کی عملداری کی جانچ کرنے کے لیے MTT پرکھ میں استعمال کیا گیا تھا۔

2.7۔ جلد کی جلن کا ٹیسٹ

اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ ٹاپیکل ایپلی کیشن جلد میں جلن کا سبب نہیں بنے گی، ایک ایپیڈرmal ٹشو کا استعمال اس منظر نامے کی نقل کرنے کے لیے کیا گیا تھا جہاں ٹشو کی سطح پر cistanche لگایا گیا تھا۔ ایکایپیڈرمل جلن کی تشخیص کسی بھی طبی ڈیوائس یا کاسمیٹک مصنوعات کے لیے ایک کلیدی امتحان ہے تاکہ صارفین کو صرف جلد کے لیے محفوظ سمجھی جانے والی مصنوعات فراہم کی جائیں۔ روایتی جانوروں کے ٹیسٹ نہ صرف ٹیسٹ جانوروں کے لیے درد اور تکلیف کا باعث بنتے ہیں، لیکناس طرح کی جانچ ہمیشہ انسانوں میں پائے جانے والے اثرات کا نمائندہ نہیں رہی ہے۔ اس طرح، یہ سمجھا جاتا ہے کہ دوبارہ تعمیر شدہ بایونک ٹشو کا استعمال فائدہ مند ہے کیونکہ وہ مقامی مائیکرو ماحولیات سے گھرے ہوئے خلیوں کی متعدد اقسام رکھتے ہیں، جو vivo میں انسانی جلد کی نقالی کرتے ہیں۔34] بایونک ایپیڈرمل ٹشو EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) کو کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق اور حوالہ جات سے تبدیل شدہ طریقہ کار کے بعد تجربات کے ذریعے جلد کی جلن پر cistanche کے اثرات کا جائزہ لیا گیا۔35–37] EpiDerm نمونے پر مشتمل داخلوں کو ایک 6-وییل پلیٹ (کارننگ، نیویارک، نیو یارک، USA) میں داخل کیا گیا تھا جس میں پہلے سے گرم DMEM تھا۔ 100 کی رقمµL DMEM جس میں یا تو {{0}} (منفی کنٹرول) یا 1 mg/mL پیوریفائیڈ cistanche (حتمی ارتکاز 0.1 mg/mL) EpiDerm نمونے کے اوپر سیل کلچر داخل میں شامل کیا گیا تھا۔ ٹشو جس کا علاج 5 فیصد سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ (SDS) سے کیا گیا تھا وہ مثبت کنٹرول کے طور پر کام کرتا ہے۔ 37 کے مرطوب ماحول میں 1-گھنٹہ انکیوبیشن کے بعد◦C، 5 فیصد CO2 انکیوبیٹر، داخلوں کو ہٹا دیا گیا اور PBS (pH 7.4) کے ساتھ دو بار دھویا گیا، اس کے بعد 300 پر مشتمل ایک 24-کنویں پلیٹ میں جگہ دی گئی۔µ1 mg/mL MTT محلول کا L (DMEM میں)۔ 3-گھنٹہ انکیوبیشن کے بعد، ایم ٹی ٹی فارمازان کرسٹل کو تحلیل کرنے کے لیے آئسوپروپانول کا اطلاق کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں منتقل کیا گیا، اور نمونے کو سپیکٹرو فوٹومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے 570 nm کے OD پر ناپا گیا۔ سیکشن میں بیان کردہ مساوات کے بعد متعلقہ عملداری کا حساب لگایا گیا تھا۔2.4. کیمیکلز جب خلیے کی عملداری کو 50 فیصد سے کم کر دیتے ہیں (زمرہ 2)، اور ایسے کیمیکلز جن کے نتیجے میں خلیے کی عملداری 50 فیصد سے زیادہ ہوتی ہے اسے غیر اڑچن تصور کیا جاتا ہے (کوئی زمرہ نہیں)37]. 

2.8۔ پروکولاجن ترکیب

پرکھHs68 خلیوں کو ایک 24-کنویں پلیٹ میں ٹیکہ لگایا گیا تھا (2× 105 خلیات/اچھی طرح) اور راتوں رات آباد ہونے کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ بعد میں خلیوں کا علاج ایک کلچر میڈیم کے ساتھ کیا گیا جس میں {{0}}، 0.625، 1.25، 2.5، 5، اور 10 شامل ہیں۔µg/mL cistanche اقتباس۔ مثبت کنٹرول گروپ کا علاج 100 ng/mL ٹرانسفارمنگ گروتھ فیکٹر (TGF) کے ساتھ کیا گیا تھا۔ 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [38,39] اس کے بعد، 72- گھنٹے کے بعد علاج، ہر نمونے سے سپرنٹنٹ کو اکٹھا کیا گیا اور پروکولجن کا پتہ لگانے کا نشانہ بنایا گیا۔ مونوکلونل اینٹی ہیومن پروکولجن ٹائپ آئی سی پیپٹائڈ (پی آئی پی) (ٹاکارا بائیو، شیگا، جاپان)۔ (MK101) کو پروکولجن کا پتہ لگانے کے لیے کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق استعمال کیا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، علاج کے بعد سیل کی قابل عملیت کا جائزہ لینے کے لیے MTT پرکھ کا انعقاد کیا گیا۔

2.9 شماریاتی تجزیہ

IBM SPSS شماریات 22 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔{1}} (IBM Corp, Armonk, NY, USA)۔ ہم نے پہلے ہر گروپ کے ڈیٹا کو کولموگوروف – سمرنوف ٹیسٹ سے مشروط کیا تاکہ اس بات کی تصدیق کی جا سکے کہ وہ عام طور پر تقسیم کیے گئے تھے ( > 0.05) [40] طالب علم کاt-ٹیسٹ کا استعمال سیل کی قابل عملیت، IL-6، TNF- کا تجزیہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ , -ہیکسوسامینیڈیس روکنا، ایپیڈرمل ٹشوز، اور پروکولجن کی پیداوار۔ تمام اعداد و شمار کو ذرائع کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔± معیاری انحراف (SD)، ہر ایک تجربے کے ساتھ جو quintuplicate میں کیا جاتا ہے۔ اےp-value < 0.05 کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔