ٹیومر کے خلیات کے خلاف جڑی بوٹیوں کے مادہ ایکٹیوسائیڈ کی منتخب سائٹوٹوکسیٹی اور اس کی میکانکی بصیرت

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

کرسٹینا چیمونیڈی وغیرہ

خلاصہ

قدرتی مصنوعات انتہائی ساختی تنوع کی خصوصیت رکھتی ہیں اور اس طرح وہ نوول اینٹی ٹیومر ایجنٹوں کی شناخت کے لیے ایک منفرد ذریعہ پیش کرتی ہیں۔ یہاں، ہم رپورٹ کرتے ہیں کہ ہربل مادہایکٹیوسائیڈLippia citriodora کے پتوں سے جدید فائٹو کیمیکل طریقوں سے الگ تھلگ ہونے سے میٹاسٹیٹک ٹیومر سیلز کے خلاف سائٹوٹوکسٹی میں اضافہ ہوا؛ مختلف سائٹوٹوکسک ایجنٹوں اور حساس کیموریسسٹنٹ کینسر کے خلیوں کے ساتھ ہم آہنگی میں کام کیا۔ایکٹیوسائیڈجسمانی سیلولر سیاق و سباق میں زہریلا نہیں تھا، جبکہ اس نے آکسیڈیٹیو بوجھ میں اضافہ کیا، پروٹیوسٹیٹک ماڈیولز کی سرگرمی کو متاثر کیا، اور ٹیومر سیل لائنوں میں میٹرکس میٹالوپروٹیناسز کو دبایا۔ میلانوما ماؤس ماڈل میں انٹرا پیریٹونیل یا زبانی (پینے کے پانی کے ذریعے) ایکٹیوسائڈ کی انتظامیہ نے ٹیومر میں اینٹی آکسیڈینٹ ردعمل کو بڑھاوا دیا۔ اس کے باوجود، صرف انٹراپریٹونیل ڈیلیوری نے ٹیومر کی نشوونما کو دبایا اور ٹیومر مخالف رد عمل کے مدافعتی ردعمل کی حوصلہ افزائی کی۔ ماس سپیکٹرومیٹری کی شناخت/مقدار کے تجزیوں سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ انٹراپریٹونیل ڈیلیوریایکٹیوسائیڈاس کے نتیجے میں نمایاں طور پر زیادہ، بمقابلہ زبانی انتظامیہ، علاج شدہ چوہوں کے پلازما اور ٹیومر میں مرکب کا ارتکاز، یہ تجویز کرتا ہے کہ اس کا ان ویوو اینٹی ٹیومر اثر انتظامیہ کے راستے اور ٹیومر میں حاصل شدہ ارتکاز پر منحصر ہے۔ آخر میں، مالیکیولر ماڈلنگ اسٹڈیز اور انزیمیٹک ایکٹیویٹی اسسز نے یہ ظاہر کیا۔ایکٹیوسائیڈپروٹین کناز سی کو روکتا ہے۔ حتمی طور پر، ایکٹیوسائیڈ نئے اینٹی ٹیومر ایجنٹوں کی نشوونما کے لیے کیمیائی سہاروں کے طور پر وعدہ کرتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ:ایکٹیوسائیڈ، کینسر، قدرتی مرکب، آکسیڈیٹیو تناؤ، پروٹیوسٹاسس، امیونو موڈولیشن

cistanche acteoside

1. تعارف

Carcinogenesis کئی سیل سگنلنگ راستوں کی ڈی ریگولیشن کی طرف سے خصوصیات ہے اور سیلولر آکسیڈیٹیو، replicative، میٹابولک، genotoxic، اور proteotoxic کشیدگی کے ساتھ منسلک ہے [1]. ان تناؤ کے فینوٹائپس کو ڈھالنے اور ان پر قابو پانے کے لیے، مہلک خلیے (آنکوجینز کے علاوہ) کئی غیر آنکوجینک راستے اپ گریڈ کرتے ہیں جن کا مقصد جاری تناؤ کو دبانا یا (کم از کم) کم کرنا ہے۔ ٹیوموریجینیسیس کے دوران اکثر اپریگولیٹ کیے جانے والے مختلف غیر آنکوجینک راستوں میں سے سیلولر اینٹی آکسیڈینٹ ردعمل [2,3] کے ساتھ پروٹیوسٹاسس نیٹ ورک (PN) کے ماڈیولز ہیں۔

PN کے کلیدی اجزاء دو اہم انحطاطی مشینری ہیں، یعنی Autophagy- Lysosome پاتھ وے (ALP) اور Ubiquitin-Proteasome Pathway (UPP) کے ساتھ ساتھ سیلولر مالیکیولر چیپیرونز کے نیٹ ورک۔ ALP بنیادی طور پر پروٹین کے مجموعوں اور تباہ شدہ آرگنیلز [4] کے انحطاط میں ملوث ہے، جب کہ UPP عام قلیل المدتی پروٹینوں اور ناقابل مرمت غلط فولڈ یا کھولے ہوئے پروٹینز [5–8] کو کم کرتا ہے۔ 26Seukaryotic پروٹیزوم 19S ریگولیٹری پارٹیکلز (RP) اور 20 سکور پارٹیکل (CP) سے بنتا ہے۔ مؤخر الذکر چار اسٹیکڈ ہیپٹامریک حلقوں پر مشتمل ہے (دو قسم کے دو کے ارد گرد -ٹائپ کے دو) جو ایک بیرل نما ڈھانچہ بناتے ہیں۔ کیموٹریپسن نما (CT-L)، ٹرپسن نما (TL)، اور کیسپیس نما (CL) پروٹیزوم پیپٹائڈیس سرگرمیاں بالترتیب 5، 2، اور 1 پروٹیزومل ذیلی یونٹس میں واقع ہیں [6]۔ مختلف ہیماتولوجک خرابیوں کے خلاف پروٹیزوم انحیبیٹرز بورٹیزومیب (ویلکیڈ®؛ جسے PS-341 بھی کہا جاتا ہے) اور کارفیفلزومیب کی طبی افادیت کا مظاہرہ کیا گیا ہے [9] نے یو پی پی کو نشانہ بنانے کا "ثبوت تصور" فراہم کیا ہے کینسر کا علاج. سیلولر اینٹی آکسیڈینٹ دفاعی راستوں کا پیچیدہ نیٹ ورک جو کارسنوجنیسیس [3,10] کے دوران اکثر اپ گریڈ ہوتا ہے اس میں اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کے ساتھ ساتھ متعدد ٹرانسکرپشن عوامل شامل ہیں جو سائٹو پروٹیکٹو جینومک ردعمل کو متحرک کرتے ہیں۔ ان میں فورک ہیڈ باکس O (Foxo) اور نیوکلیئر فیکٹر erythroid 2-related factor (Nrf-2) شامل ہیں۔ Nrf-2 آکسیڈیٹیو اور/یا xenobiotic نقصان کے خلاف خلیوں کے تحفظ میں مرکزی حیثیت رکھتا ہے کیونکہ یہ اینٹی آکسیڈینٹ اور فیز II جینز [11-13] کے اظہار کو متحرک کرتا ہے۔

ہم نے اور دوسروں نے حال ہی میں تجویز کیا ہے کہ ان ٹیومر انحصار کو نشانہ بنانا (یعنی پروٹوسٹیٹک ماڈیولز اور/یا اینٹی آکسیڈینٹ رسپانس پاتھ ویز) یا تبدیل شدہ جین ٹائپ کے تناظر میں ROS کی سیلولر لیول میں اضافہ ٹیومر سیلز کے منتخب قتل کے لیے ممکنہ علاج کی ونڈو پیش کرتا ہے۔ ,14]; سپورٹ میں، ایک چھوٹے مالیکیول کے ذریعے کینسر کے خلیوں کے منتخب قتل کی اطلاع دی گئی ہے جس نے سیلولر ROS کی سطح کو بڑھا دیا ہے [2]۔ یہ توقع کی جاتی ہے کہ مشترکہ نقطہ نظر بشمول اینٹی ٹیومر-ری ایکٹیو مدافعتی ردعمل کو چالو کرنا [15] ممکنہ طور پر PN اور اینٹی آکسیڈینٹ ردعمل کو روکنے اور/یا سیلولر ROS کی سطح کو بلند کرکے پیش کردہ علاج ونڈو کو زیادہ سے زیادہ بنائے گا۔

مختلف ذرائع (پودے، سمندری جاندار، مائکروجنزم وغیرہ) سے قدرتی مصنوعات (عرق یا خالص مرکبات) (NPs) کو ان کے انتہائی ساختی تنوع اور کیمیائی پیچیدگی کی وجہ سے اینٹی ٹیومر ایجنٹ کے طور پر کام کرنے کی صلاحیت کے لیے جانچا جاتا ہے۔ وہ متعدد سیلولر سگنلنگ راستوں کو pleiotropically ماڈیول کرتے ہوئے کام کرتے ہیں [16]۔ اطلاعات کے مطابق، NPs اینٹی سوزش، اینٹی ٹیومر اور/یا اینٹی میٹاسٹیٹک ردعمل کو چالو کرتے ہیں [16,17] اور ملٹی ڈرگ مزاحمت [18,19] سے بھی بچتے ہیں۔ ان میں سے، فینولک مرکبات (بشمول فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز) نے مختلف انسانی بیماریوں کی روک تھام اور/یا علاج میں ان کے مبینہ کردار کی وجہ سے خاصی دلچسپی حاصل کی ہے۔

ایکٹیوسائیڈ، جسے استعمال یا ورباسکوسائیڈ بھی کہا جاتا ہے [20]، ایک فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈ ہے جو بہت سے ڈائی کوٹائلڈنز سے الگ تھلگ ہے۔ اطلاعات کے مطابق، ایکٹیوسائیڈ کچھ دلچسپ حیاتیاتی سرگرمیاں انجام دیتا ہے، بشمول اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی سوزش، اور سیل اپوپٹوس کو ریگولیٹ کرنے والی خصوصیات [21,22]۔ اس کے باوجود، اس کی ممکنہ اینٹی ٹیومر سرگرمی پر توجہ نہیں دی گئی ہے۔ ہم یہاں رپورٹ کرتے ہیں کہ ایکٹیوسائیڈ نے ممالیہ جانوروں کے کینسر کے خلیوں کے خلاف بڑھتی ہوئی سائٹوٹوکسیٹی ظاہر کی جس کے جسمانی سیلولر سیاق و سباق میں کوئی واضح زہریلے اثرات نہیں ہیں۔ مزید برآں، ایکٹیوسائیڈ نے ویوو ماؤس ماڈل میں میلانوما ٹیومر کی نشوونما کو دبایا، (دوسروں کے درمیان) اینٹی ٹیومر-ری ایکٹیو مدافعتی ردعمل کو چالو کرکے۔

کے اثراتcistanche acteoside

2. مواد اور طریقہ

2.1 پلانٹ مواد اور نکالنے

خشک Lippia citriodora (Lamiaceae) کے پتے (4.5 کلوگرام) ایتھنز، یونان کی مقامی مارکیٹ سے خریدے گئے۔ میتھانول (2 × 20 L) کے ساتھ 12 گھنٹے کے لیے مکینیکل ہلچل کے ذریعے پتوں کو چکنا اور نکالا گیا۔ میتھانولک نچوڑ کو خشک ہونے پر بخارات بنا کر CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L) کے مرکب سے دھویا گیا۔ ناقابل حل اوشیشوں کو الگ کر کے خشک کر دیا گیا، جس سے سبز پیلے رنگ کا پاؤڈر (450 گرام) بنتا ہے۔

2.2 ایکٹیوسائیڈ اور UPLC-HRMS تجزیہ کی صفائی

مذکورہ بالا باقیات کا ایک حصہ (10 جی) تیز سینٹری فیوگل پارٹیشن کرومیٹوگرافی (FCPC) اپریٹس (کرومٹن، فرانس) کا استعمال کرتے ہوئے کاؤنٹر کرنٹ کرومیٹوگرافی کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ EtOAc/EtOH/H2O کا ایک مرکب 5/0.5/4.5 کے تناسب پر بائفاسک سالوینٹ سسٹم کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ جمع شدہ حصوں کو پتلی پرت کی کرومیٹوگرافی کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ پھر کرومیٹوگرامس کو ایک UV لیمپ (254 اور 365 nm) کے نیچے دیکھا گیا اور میتھانول وینلن سلفیٹ کے ساتھ چھڑکنے کے بعد دو منٹ کے لیے گرم کرکے ان کا تصور کیا گیا۔ کل 2.1 جی ایکٹیوسائیڈ (90 فیصد سے زیادہ یا اس کے برابر) مذکورہ بالا عمل سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ ایکٹیوسائیڈ کی شناخت جوہری مقناطیسی گونج (NMR) اور ماس اسپیکٹومیٹری (MS) سپیکٹرا کے ذریعے کی گئی تھی، جبکہ اس کی پاکیزگی UPLC-MS اور NMR تجزیہ کے ذریعے قائم کی گئی تھی۔ تفصیلات کے لیے Suppl دیکھیں۔ مواد اور طریقے.

2.3۔ سیل لائنز

B16.F1، B16.F10، YAC-1، اور WEHI-164 ماؤس سیل لائنوں کے ساتھ انسانی پھیپھڑوں کے برانن فائبرو بلوسٹس (IMR90 خلیات) امریکن ٹشو کلچر کلیکشن (ATCC) سے حاصل کیے گئے تھے۔ U2 OS اور Sa OS انسانی آسٹیوسارکوما سیل لائنیں برائے مہربانی پروفیسر V. Gorgoulis (اسکول آف میڈیسن، نیشنل اینڈ کپوڈیسٹرین یونیورسٹی آف ایتھنز، یونان) نے عطیہ کیں، جبکہ KH OS آسٹیوسارکوما سیل اور chemoresistant osteosarcoma سیل لائنیں [23] تھیں۔ ڈاکٹر ای گونوس (نیشنل ہیلینک ریسرچ فاؤنڈیشن، یونان) کا عطیہ۔ ماؤس کینسر سیل لائنز C5N اور A5 کا تعلق ایک ملٹی اسٹیج ماؤس سکن کارسنوجنیسیس ماڈل [24,25] سے ہے اور انہیں پروفیسر اے بالمین (جامع کینسر سینٹر، یونیورسٹی آف کیلیفورنیا، USA) نے عطیہ کیا ہے۔ استعمال شدہ سیل لائنوں کی کلچرنگ کنڈیشنز Suppl میں رپورٹ کی گئی ہیں۔ مواد اور طریقے.

کا فائدہcistanche acteoside

2.4 میلانوما ماؤس ماڈل مرد

C57BL/6 چوہے (25–30 g وزن، 6–8 ہفتے کی عمر) Hellenic Pasteur Institute سے حاصل کیے گئے تھے اور انہیں کنٹرول شدہ درجہ حرارت (22 ڈگری) اور فوٹو پیریڈ (12 h light: 12 h تاریک) میں رکھا گیا تھا۔ پانی اور خوراک تک مفت رسائی کے ساتھ۔ چوہوں کو 105 B16.F1 میلانوما سیل (100 μL PBS میں) کے ساتھ ذیلی طور پر ٹیکہ لگایا گیا تھا اور تصادفی طور پر 3 گروپوں (n=5/گروپ) کو تفویض کیا گیا تھا۔ جب ٹیومر واضح ہو گئے (دن 11) چوہوں کو دو راستوں سے ایکٹیوسائیڈ موصول ہوا۔ یا تو انٹراپریٹونیلی (آئی پی) (1 ملی گرام/ماؤس 200 μL پی بی ایس میں پتلا؛ ہر دوسرے دن کل 6 خوراکیں دی جاتی ہیں) یا زبانی طور پر پینے کے پانی سے (یا) (2.5 ملی گرام/ماؤس؛ مسلسل 13 دنوں تک کل 13 خوراکوں میں)۔ کنٹرول چوہوں کو پی بی ایس کا انتظام کیا گیا تھا۔ ڈیجیٹل کیلیپر کے ساتھ تشکیل شدہ ٹیومر کے بڑے اور چھوٹے محوروں کی پیمائش کرکے ٹیومر کی نمو ہر 2 دن میں ریکارڈ کی گئی۔ پیمائش کو فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے ٹیومر کے حجم میں تبدیل کیا گیا: ٹیومر کا حجم (cm3)=بڑا محور × معمولی محور 2 × 0.5۔ 28 ویں دن، جانوروں کو گریوا کی سندچیوتی کی وجہ سے خوش کیا گیا تھا، اور تلیوں کو غیر محفوظ طریقے سے ہٹا دیا گیا تھا۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ تجربہ تین بار دہرایا گیا۔

Splenocytes کو انفرادی طور پر ہم آہنگ تلیوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا اور فوری طور پر ان کی cytotoxicity بمقابلہ B16.F1، YAC-1، اور WEHI-164 سیل اہداف کے لیے ٹیسٹ کیا گیا تھا۔ سیل کی سطح پر CD107 کی نمائش کے پتہ لگانے کی بنیاد پر سائٹوٹوکسائٹی کا اندازہ لگایا گیا تھا، انفیکٹر سیل ڈیگرینولیشن کے نتیجے میں۔ Splenocytes (105 خلیات/کنویں) کو 5 فیصد CO2 میں 37 ڈگری پر 100:1 کے انفیکٹر ٹو ٹارگٹ (E: T) تناسب پر 96-کنویں U نیچے مائکرو پلیٹس میں اہداف کے ساتھ مل کر کلچر کیا گیا تھا۔ FITC-conjugated anti-CD107a اور anti-CD107b مونوکلونل اینٹی باڈیز (25 μL/mL) اور مونینسن (6 μL/mL؛ سبھی BD بایوسینسز سے) ہر ایک کنویں میں شامل کیے گئے تھے۔ خلیوں کی کٹائی 6 گھنٹے بعد کی گئی اور FACSCanto II فلو سائٹو میٹر کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔ متوازی طور پر، ٹیومر کو ایکسائز کیا گیا تھا اور بہاو اسیس کے لیے پروسیس کیا گیا تھا جیسا کہ سپپل میں بیان کیا گیا ہے۔ مواد اور طریقے.

cistanche acteoside