Sidt2 Autophagy-lysosomal Degradation Pathway میں ایک کلیدی پروٹین ہے اور گردے کی ساخت اور فلٹریشن فنکشن کی بحالی کے لیے ضروری ہے۔

اعضاء کی شکل اور افعال کو برقرار رکھنے کے لیے آٹوفیجی کا ضابطہ اور ہومیوسٹاسس ضروری ہے۔ ایک lysosomal جھلی پروٹین کے طور پر، کا اثرSidt2پرگردے کی ساختاوررینل آٹوفجیابھی تک نامعلوم ہے. اس تحقیق میں، ہم نے پایا کہ گردےSidt2-/-چوہوں نے تہہ خانے کی جھلی کے گاڑھے ہونے، پاؤں کے عمل کے فیوژن، اور مائٹوکونڈریل سوجن میں تبدیلیاں ظاہر کیں، جو تجویز کرتی ہیں کہگردے کی ساخت کو نقصان پہنچا تھا. 24 گھنٹے میں پیشاب کی پروٹین میں اضافہ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے۔گردے کی تقریببھی نقصان پہنچا تھا. ایک ہی وقت میں، کی غیر موجودگیSidt2تیزابیت والے لائزوزوم کی تعداد میں کمی، لیسوزوم میں تیزابی ہائیڈرولیز کی سرگرمی اور اظہار میں کمی، اور لائزوزوم میں پی ایچ میں اضافہ، یہ تجویز کرتا ہے کہ لیسوسومل فنکشن خراب ہونے کے بعدSidt2حذف کرنا آٹوفاگولیسومز کا جمع ہونا، LC3-II اور P62 پروٹین کی سطح میں اضافہ، اور P62 mRNA کی سطح میں کمی نے اشارہ کیا کہSidt2جین غیر معمولی آٹوفجی راستے کی وجہ سےflاوہ کلوروکین کا تجربہ، امیونوfluorescence autophagosome، lysosome فیوژن پرکھ، اور Ad-mcherry-GFP-LC3B نے مزید اشارہ کیا کہ، بعد میںSidt2حذف کرنے سے، آٹوفاگوسوم کی پیداوار میں اضافہ نہیں ہوا، لیکن آٹوفاگوسومز اور لائزوزوم کا فیوژن اور آٹوفاگولیسومز کا انحطاط خراب ہوا۔ جب انکیوبٹنگSidt2-/-آٹوفجی ایکٹیویٹر ریپامائسن والے خلیات، ہم نے پایا کہ یہ آٹوفجی کو چالو کر سکتا ہے، جو آٹوفیگوسوم میں اضافے کے طور پر ظاہر ہوتا ہے، لیکن یہ آٹوفاگولیسوم انحطاط کو بہتر نہیں بنا سکتا۔ دریں اثنا، یہ مزید واضح کرتا ہے کہSidt2جین آٹوفاگولیسوسوم کے عمل کی ہموار ترقی میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے۔ خلاصہ میں، کی غیر موجودگیSidt2جین کی وجہ سے لیزوزوم کے افعال میں خرابی اور تیزابیت والے لائزوزوم کی تعداد میں کمی واقع ہوئی، جس کی وجہ سے آٹوفاگولیسومز کی تشکیل اور انحطاط کی خرابی پیدا ہوتی ہے، جو کہ آخر کار ظاہر ہوتا ہے۔غیر معمولی گردے کی ساخت اور کام. Sidt2lysosomes کے معمول کے کام اور گردوں کے جسمانی استحکام کو برقرار رکھنے کے لیے ضروری ہے۔

حاصل کرنے کے لیے ہماری دکان پر جائیں۔گردے کے لیے 25% ایکیناکوسائیڈ اور 9% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ قدرتی آرگینک سیسٹانچ ایکسٹریکٹ

تعارف

روایتی نظریہ یہ ہے کہ لیزوزوم خلیات کے کوڑے کو ٹھکانے لگانے کا ذریعہ ہیں جو خلیات [1-3] کے ذریعہ تیار کردہ فضلہ کو ہٹاتے ہیں۔ تاہم، بہت سے مطالعات سے یہ ظاہر ہوا ہے کہ لائزوزوم کا کردار کہیں زیادہ پیچیدہ ہے، اور اس میں سیل سگنل کی منتقلی، ٹیومرجینیسیس، نشوونما، اور دیگر پہلو شامل ہو سکتے ہیں جو جسم کی زندگی کی سرگرمیوں کو متاثر کرتے ہیں [4-10]۔ Lysosomes عام طور پر جگر اور گردے جیسے ٹشوز میں افزودہ ہوتے ہیں [11]۔ لہذا، lysosomal dysfunction جگر اور گردے کے بافتوں کی بیماریوں سے بھی گہرا تعلق رکھتا ہے، جیسے گاؤچر کی بیماری [12]، mucopolysaccharidosis [13]، Niemann-Pick disease [14]، تاخیر سے glomerulosclerosis [15]، idiopathic membranous nephropathic [16] , وغیرہ۔ Lysosomal membrane proteins (LMPs) وہ جھلی کے اجزاء ہیں جن کا کام نہ صرف lysosome کی سالمیت کو برقرار رکھنا ہے بلکہ یہ مختلف پہلوؤں جیسے کہ انٹرا سیلولر سگنل کی نقل و حمل اور ریگولیشن میں بھی شامل ہیں جو lysosome کے کام کو برقرار رکھنے کے لیے ضروری ہیں۔ اور سیل زندگی کی سرگرمیاں [17-19]۔

آج تک، 100 سے زیادہ LMPs دریافت ہو چکے ہیں، لیکن ان میں سے اکثر کے افعال ابھی تک نامعلوم ہیں [20]۔ ٹرانس میبرن 7 سپر فیملی ممبر 1 (TM7SF1) رینل پوڈوسیٹ فنکشن کی بحالی کے لیے ضروری ہے [21] اور گردے کی نشوونما کے عمل میں اہم کردار ادا کرتا ہے [22]۔ کلورائیڈ وولٹیج گیٹڈ چینل 5 (ClC-5) ایک کلورائد آئن (Cl(−)) چینل ہے جس کا اظہار گردوں کی نالیوں میں ہوتا ہے، جو کہ عام رینل ٹیوبلر فنکشن کے لیے ضروری ہے [23]؛ جب یہ بدل جاتا ہے، تو یہ ڈینٹ کی بیماری کا سبب بن سکتا ہے [24]۔ کلورائیڈ وولٹیج گیٹڈ چینل 7 (ClC-7) کا اوور ایکسپریشن خراب ریڈوکس حالت کی وجہ سے گردوں کے نلی نما اپکلا خلیوں کے اپوپٹوسس کو روکتا ہے [25]۔ یہ مطالعات یہ ظاہر کرتے ہیں کہ، lysosome سے افزودہ گردے کے ٹشو کے اجزاء کے طور پر، LMPs معمول کے کام کو برقرار رکھنے کے لیے ضروری ہیں، لیکن ان کے متعلقہ روگجنکیت کا مخصوص طریقہ کار ابھی تک واضح نہیں ہے۔

SID1 ٹرانس میبرین فیملی، ممبر 2 (Sidt2) ایک نئی دریافت شدہ LMP ہے جو جگر اور گردے کے ٹشوز میں بہت زیادہ ظاہر ہوتی ہے [26]۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ Sidt2 کو حذف کرنا جگر سے متعلقہ بیماریوں کا سبب بن سکتا ہے، جو جگر کی سٹیٹوسس اور جگر کے لپڈ میٹابولزم کی خرابی کے طور پر ظاہر ہوتا ہے [11، 18]۔ ایک حالیہ تحقیق میں، ہم نے پایا کہ Sidt2-/-چوہوں کے گردوں کو بھی نقصان پہنچا، لیکن مخصوص طریقہ کار واضح نہیں ہے۔ لائسوسومز آٹوفجی کے لیے اہم ایگزیکٹو آرگا نیلس ہیں [10]۔ کیا آٹوفجی ریگولیشن شامل ہے؟ اس مطالعہ میں، ہم نے lysosomal فنکشن (autophagy) اور بیماری کے درمیان تعلق کا جائزہ لیا اور Sidt2 پر مشتمل بنیادی میکانزم کو دریافت کیا جو گردے کو نقصان پہنچاتا ہے، جو LMP اور بیماری کے درمیان تعلق کے مطالعہ کے لیے بہت مددگار ثابت ہوگا۔

نتائج

Sidt2-/- ماڈل یہ ظاہر کرتا ہے۔گردے کا نقصانautophagolysosome جمع کے ساتھ منسلک ہے

Sidt2-/- چوہوں کی تعمیر کا طریقہ تصویر 1A میں دکھایا گیا ہے۔ حاصل کردہ ہوموزائگس ماؤس ٹیل ڈی این اے کو ترتیب دیا گیا تھا اور ترتیب کا نتیجہ یکساں تھا (تصویر 1B)، اور دوسرے ایکسون میں 199 bp فریگمنٹ کا نقصان ہوا۔ PCR جینی ٹائپ کی شناخت کے ذریعے، ہم نے پایا کہ Sidt2+/+(Wild Type, WT) چوہوں میں 685 bp DNA سیگمنٹ تھے، جبکہ Sidt2−/− چوہوں میں 486 bp (تصویر 1C) تھے۔ جیسا کہ تصویر 1D میں دکھایا گیا ہے، Sidt2 پروٹین کا پتہ WT کے مقابلے Sidt2−/− چوہوں میں مشکل سے پایا جا سکتا ہے، جس نے تجویز کیا کہ ماڈل کامیابی کے ساتھ بنایا گیا تھا۔ پیشاب کے ٹیسٹ سے، یہ پتہ چلا کہ 24 گھنٹے کے پیشاب میں پروٹین Sidt2−/− چوہوں میں WT (تصویر 1E) کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھ گئی تھی، جس سے پتہ چلتا ہے کہ Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد گردے کی فلٹریشن رکاوٹ خراب ہو گئی تھی۔ ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپی مشاہدات (تصویر 1F) سے پتہ چلتا ہے کہ، WT چوہوں (a–f) کے مقابلے میں، Sidt2−/− ماؤس کے گردے پاؤں کے عمل کے پھیلے ہوئے فیوژن کی نمائش کرتے ہیں، گلوومیرولر تہہ خانے کی جھلی (g، h) کا گاڑھا ہونا، گردوں کے نلی نما اپکلا سیل کا ورم، مائکروویلی نقصان (i، j)، mitochondrial edema، vacuole جیسی تبدیلیاں، اور ریڑھ کی ہڈی کا غائب ہونا (k، l)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ Sidt2−/− چوہوں نے بھی بڑی تعداد میں autophagolysosome کے جمع ہونے کی نمائش کی ہے (سرخ تیر، m، n کے ذریعے دکھایا گیا ہے) اور یہ تعداد کنٹرول کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی (تصویر 1G)۔ سیلولر سطح پر، ہم نے پایا کہ Sidt2 گردے کے خلیوں کی بقا کے لیے بھی ضروری ہے۔ Sidt2 جین کے حذف ہونے سے پھیلاؤ میں کمی اور MPC5 اور SV40 MES 13 خلیوں کے apoptosis میں اضافہ ہوتا ہے (ضمنی شکل 1)۔

Sidt2 جین کے خاتمے سے ماؤس کے گردے کے خلیوں میں تیزابی لائزوزوم کی تعداد اور کام میں تبدیلی آتی ہے۔

Crispr-Cas9 ٹیکنالوجی کا استعمال MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز میں Sidt2 جین کو ناک آؤٹ کرنے کے لیے سیل ماڈلز حاصل کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ mRNA اور پروٹین کی سطح کی تصدیق (تصویر 2A–C) بالترتیب کیو آر ٹی پی سی آر اور ویسٹرن بلوٹنگ کے ذریعے کی گئی، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ماڈلز کامیابی کے ساتھ تعمیر کیے گئے تھے۔ lysosome-ثالثی انحطاط کا نظام آٹوفجی انحطاط میں ایک اہم قدم ہے۔ ایک ناگزیر LMP کے طور پر، کیا Sidt2 کا ناک آؤٹ lysosome سے متعلق پروٹین کے اظہار کو متاثر کرے گا؟ ہم نے بڑے LMP lysosomal سے وابستہ جھلی پروٹین 1 (LAMP1) کی پیمائش کی۔ نتائج سے ظاہر ہوا کہ MPC5 اور SV40 MES 13 خلیات (تصویر 2D، E) میں Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد LAMP1 کا اظہار کم ہوا۔ ہم نے مزید تیزابیت والے لائزوزوم کو لیبل کرنے کے لیے LysoTracker کا استعمال کیا اور پایا کہ دونوں قسم کے خلیات (تصویر 2F، G) میں Sidt2 کے حذف ہونے کے بعد تیزابی لائسوزوم کی تعداد میں کمی واقع ہوئی ہے۔ اس کے بعد، ہم نے لیسوسومل کیتھیپسن B (CTSB) کی پیمائش کی اور پایا کہ ماؤس کے گردے کے ٹشو (تصویر 2H، I)، MPC5 خلیات (تصویر 2J، K) اور SV40 MES 13 خلیات (تصویر 2L، M) میں تاثرات ہیں۔ Sidt2-/- ماڈلز میں CTSB کے سبھی کو کم کر دیا گیا تھا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ جب Sidt2 جین کو حذف کر دیا گیا تھا تو لائوسومز میں پروٹولیٹک انزائم کی سرگرمی کم ہو گئی تھی۔ اسی طرح، Sidt2-/- گروپ کے دو قسم کے خلیات میں پیشگی CTSB کا اظہار نمایاں طور پر کم ہو گیا تھا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد CTSB بھی متاثر ہوا تھا۔ ہم نے لائسوسومز کے تیزابی ماحول کا پتہ لگانے کے لیے لائسو سینسر کا مزید استعمال کیا۔ فلوروسینس کی شدت کا تناسب جتنا کم ہوگا، لائزوزوم میں پی ایچ کی قدر اتنی ہی زیادہ ہوگی۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد، pH قدر میں اضافہ ہوا (تصویر 2N، O) اور تیزابیت غیر معمولی تھی۔ مزید یہ جاننے کے لیے کہ آیا مندرجہ بالا لائسوسومل اسامانیتاوں کی وجہ لیسوسومز کی غیر معمولی تعداد تھی یا غیر معمولی لائسوسومل افعال، ہم نے الیکٹران مائیکروسکوپی (تصویر 2 پی) کے ذریعے خلیات کی چھان بین کی۔ ہم نے پایا کہ Sidt2 کو حذف کرنے (تصویر 2Q) کے بعد پرائمری لائزوزوم کی تعداد اور لائزوزوم کی کل تعداد (بشمول پرائمری اور سیکنڈری لائزوزوم) میں کوئی واضح تبدیلیاں نہیں ہیں۔

Sidt2 کو ہٹانے کے بعد رینل آٹوفیجی کا راستہ غیر معمولی ہے۔

جیسا کہ اوپر ذکر کیا گیا ہے، Sidt2-/- چوہوں کے گردے کے خلیوں میں بڑی تعداد میں آٹوفاگولیسووم جمع دیکھے گئے، جس سے پتہ چلتا ہے کہ آٹوفجی کا راستہ غیر معمولی تھا۔ مغربی دھبے کے تجزیے کا استعمال کرتے ہوئے، یہ دکھایا گیا کہ Sidt2−/− کے گردے میں LC3-phosphatidylethanolamine conjugate (LC3-II) اور Sequestosome 1 (P62) کے پروٹین کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ چوہوں، اور آٹوفجی سے متعلقہ 5(Atg5)، Autophagy سے متعلق 7(Atg7)، اور Autophagy سے متعلق 12(Atg12) (تصویر 3A، B) کے آٹوفجی سے متعلق پروٹین اظہار میں اضافہ۔ تاہم، P62 mRNA کی سطح میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی (تصویر 3C)، جس سے پتہ چلتا ہے کہ Vivo میں Sidt2 کے خاتمے کے بعد آٹوفجی کا راستہ غیر معمولی تھا۔ پھر ہم نے پایا کہ آٹوفجی پروٹینز LC3-II, P62, Atg5, Atg7, اور Atg12 کے تاثرات بھی Sidt2 کے حذف ہونے کے بعد گردے کے دو قسم کے خلیات میں بڑھے تھے (تصویر 3D–G) جو کہ مستقل تھے۔ in vivo کے ساتھ۔ LC3-II میں اضافے نے Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد گردے کے خلیوں میں آٹوفاگوسوم میں اضافے کی نشاندہی کی، جو آٹوفجی کے فعال ہونے یا آٹوفاگوسومز کے بلاک شدہ انحطاط کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ P62 امیونو فلوروسینس (تصویر 3H) نے واضح طور پر Sidt2−/− خلیوں میں P62 مواد میں اضافہ دکھایا (تصویر 3I)۔ پروٹین کی سطح کے برعکس، qRT-PCR نے ظاہر کیا کہ P62 میں mRNA کی سطح (تصویر 3J) میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ P62 میں اضافہ ناکافی انحطاط سے متعلق تھا۔ Atg5، Atg7، اور Atg12 میں اضافے نے اشارہ کیا کہ آٹوفجی شروع ہوئی اور عام طور پر بنتی ہے، لیکن P62 کے جمع ہونے سے آٹوفجی کے عمل میں رکاوٹیں بھی پیش آتی ہیں، اور اس تضاد کی وجہ سے ہمیں آٹوفیجی فلوکس کی حقیقی صورتحال کو مزید دریافت کرنے کی ضرورت ہے۔

وٹرو میں، کلوروکین کا استعمال Sidt2 کے نقصان کے بعد آٹوفجی فلوکس میں کمی کی نشاندہی کرتا ہے کلوروکین کا تجربہ آٹوفجی فلوکس کے مشاہدے کے لیے کلاسک تجربات میں سے ایک ہے۔ Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد LC3-II اور P62 میں اضافے کی وجوہات کو سمجھنے کے لیے، ہم نے آٹوفجی کے بہاؤ کا مشاہدہ کرنے کے لیے خلیات پر عمل کرنے کے لیے کلوروکوئن (CQ)، جو آٹوفجی کا ایک بہاو روکنے والا ہے، استعمال کیا۔ سب سے پہلے، ہم نے اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے مختلف ارتکاز کے میلان کا استعمال کیا کہ MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز میں CQ کے ذریعے روکا ہوا سنترپتی ارتکاز 50 μM (تصویر 4A–F) تھا۔ اس ارتکاز کے اوپری حصے میں، جب CQ کا ارتکاز مسلسل بڑھتا رہا، LC3-II اور P62 نے سنترپتی تک پہنچنے کے لیے مزید اضافہ نہیں کیا۔ لہذا، ہم نے آٹوفجی فلوکس کو مکمل طور پر روکنے کے لیے 16 گھنٹے سے زیادہ 50 μM CQ محرک استعمال کیا، اور اس وقت، LC3-Sidt2+/+گروپ اور Sidt2−/− گروپ کے درمیان LC کے فرق غائب ہو گئے۔ MPC5 اور SV40 MES 13 سیل۔ اسی طرح، 50 μM CQ پروسیسنگ کے بعد، Sidt2 کو حذف کرنے کی وجہ سے P62 کے اختلافات بھی غائب ہو گئے (تصویر 4G, H, J, K)۔ آٹوفجی فلوکس کے اعدادوشمار سے پتہ چلتا ہے کہ اس میں کمی واقع ہوئی جب Sidt2 غائب تھا (تصویر 4I, L)، جس نے مزید تصدیق کی کہ Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد LC3-II اور P62 اظہار میں اضافہ آٹوفجی کلیئرنس کی ناکامی کی وجہ سے ہوا تھا۔ آٹوفجی میں سطح میں اضافے کے بجائے (آٹوفیجی کو چالو کرنا)۔

Sidt2 کے حذف ہونے کے بعد وٹرو میں آٹوفاگوزوم-لائسوسوم فیوژن میں خلل کلیئرنس اور انحطاط آٹوفجی کے عمل کے درمیانی اور دیر کے مراحل ہیں، جس میں Sidt2 (تصویر 5D) کے حذف ہونے کے بعد کم ہونے کے ساتھ آٹوفاگوزوم کا فیوژن شامل ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ فیوژن کا فیوژن autophagosomes اور lysosomes خراب ہو گیا تھا.

تصویر 1گردے کا نقصاناور Sidt2-/- چوہوں میں autophagolysosome جمع۔ ایک Cre-LoxP سسٹم جین جس کی منصوبہ بندی کو نشانہ بنایا جاتا ہے۔ اوپر B Sidt2 جین ناک آؤٹ ماؤس ٹیل DNA کا برآمد شدہ ترتیب خاکہ ہے۔ ذیل میں ترتیب کا نقشہ ہے، تیر لاپتہ جین کے مقام کی نشاندہی کرتا ہے۔ WT چوہوں کے مقابلے میں، exon 2 میں 199 bp جین کا نقصان ہوتا ہے۔ سیڈٹ 2 کی ڈی این اے سطح کی تصدیق (ٹیل ٹشو سے نکالا گیا)۔ پرائمر ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ بنیادی ناک آؤٹ ریجن پر مشتمل ہے، جسے Sidt2+ /+(WT)، Sidt2+/-، یا Sidt2−/− کے طور پر دکھایا گیا ہے۔ ویسٹرن بلاٹ کے ذریعے Sidt2 پروٹین ایکسپریشن لیول کا پتہ لگانے کے لیے ڈی پروٹین لیول کی تصدیق؛ WT اور Sidt2-/- چوہوں میں E گردے 24 گھنٹے پیشاب پروٹین؛ WT چوہوں (a, f) اور Sidt2-/- چوہوں (g–n) کے گردوں کی F الٹرا مائکرو مورفولوجیکل ڈھانچہ۔ WT ماؤس کے مقابلے میں، Sidt2−/− ماؤس گردے پاؤں کے عمل کے فیوژن، تہہ خانے کی جھلی کو گاڑھا ہونا (g, h)، گردوں کے نلی نما اپکلا سیل ورم، مائکروویلی نقصان (i، j)، مائٹوکونڈریل تباہی (k، l)، اور autophagolysosome جمع (m, n)؛ G WT اور Sidt2-/- چوہوں میں رینل آٹوفاگولیسومز کی کل تعداد۔ *P < 0۔{20}}5، **P <0.01۔

تصویر 3 Sidt2 کو حذف کرنے سے آٹوفجی کے راستے میں خلل پڑتا ہے۔ ویسٹرن بلاٹ کے ذریعے ڈبلیو ٹی اور سیڈٹ2-/- سیل آٹوفجی سے متعلق پروٹین کے اظہار کی سطح کا پتہ لگانا؛ مغربی بلاٹ ٹیسٹ کے نتائج کے B شماریاتی چارٹ؛ WT اور Sidt2-/- چوہوں کے گردے کے ٹشوز میں C P62 mRNA اظہار کی سطح؛ Sidt2 ناک آؤٹ سے پہلے اور بعد میں MPC5 سیل آٹوفجی پاتھ وے پروٹین کی D اظہار کی سطح؛ (D) چارٹ کا ای شماریاتی گراف؛ SV40 MES 13 سیلز میں Sidt2 ناک آؤٹ سے پہلے اور بعد میں آٹوفجی پاتھ وے پروٹین کی F اظہار کی سطح؛ (F) چارٹ کا جی شماریاتی چارٹ؛ Sidt2 ناک آؤٹ سے پہلے اور بعد میں MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز میں H P62 امیونو فلوروسینس؛ I امیونو فلوروسینس کے نتائج کے شماریاتی چارٹ؛ Sidt2 ناک آؤٹ سے پہلے اور بعد میں MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز میں J P62 mRNA اظہار کی سطح۔ *P <0.05، **P <0.01، ***P <0.001۔

Ad-mچیری-GFP-

LC3B فلوروسینس ڈبل لیبلنگ سے پتہ چلتا ہے کہ Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد آٹوفاگولیسوسوم کی تشکیل اور اس کے انحطاط کا راستہ بند کر دیا گیا تھا۔ آٹوفیجی کے عمل کے دوران، mCherry-GFP-LC3B آٹوفاگوزوم جھلی پر جمع ہوتا ہے اور فلوروسینس مائکروسکوپ کے نیچے پیلے دھبوں کی شکل میں ظاہر ہوتا ہے۔ جب آٹوفاگوسومز اور لائزوزوم کو آٹوفاگولیسومز بنانے کے لیے ملایا جاتا ہے، تو لائزوزوم کے اندر تیزابی ماحول GFP کے فلوروسینس کو بجھا دے گا تاکہ یہ سرخ دھبوں کی شکل میں خود کو ظاہر کرے۔ لہذا، LC3 کے پابند GFP کو صرف آٹوفاگوسومز کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جبکہ mCherry ایک ہی وقت میں آٹوفاگوسومز اور آٹوفاگولیسومز کا پتہ لگا سکتا ہے۔ جب سبز اور سرخ فلوروسینس دھبوں کو ملایا جاتا ہے اور پیلے رنگ کے فلوروسینس دھبوں کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے، تو یہ آٹوفاگوسوم کے مساوی ہوتا ہے۔ اس وقت، سرخ فلوروسینس آٹوفاگولیسووم کی نشاندہی کر سکتا ہے، اور یہ آٹوفاگولیسووم کی تشکیل کی ہمواری کی بھی نشاندہی کر سکتا ہے [27]۔ Sidt2+/+ اور Sidt2−/− دونوں گروپوں میں MPC5 سیلز اور SV40 MES 13 سیلز کو Ad-mCherry GFP-LC3B اڈینو وائرس سے تبدیل کیا گیا اور کنفوکل لیزر مائکروسکوپ (تصویر 6A) کے ساتھ تصویر کشی کی گئی۔ یہ پایا گیا کہ پیلے رنگ کے فلوروسینٹ نقطوں کی تعداد میں اضافہ ہوا ہے اور سرخ فلوروسینٹ نقطوں کی تعداد میں کمی آئی ہے (تصویر 6B، C) Sidt2 کو حذف کرنے کے بعد، دکھایا گیا ہے کہ Sidt2−/− گروپ میں آٹوفاگوسومز کی تعداد میں اضافہ ہوا ہے اور آٹوفاگولیسومز میں کمی واقع ہوئی ہے۔ اس کی وجہ یہ ہے کہ autophagolysosome کی تشکیل میں رکاوٹیں تھیں، اور autophagolysosome کے انحطاط کے راستے مسدود تھے، جس کی وجہ سے autophagosome کے انحطاط میں رکاوٹیں پیدا ہوئیں۔

Rapamycin نے Sidt2 کو حذف کرنے کی وجہ سے P62 کے جمع ہونے میں بہتری نہیں لائی بلکہ اس میں اضافہ کیا ہے Rapamycin (RAPA) mTOR کی روک تھام کرنے والا ہے اور آٹوفجی کو چالو کرتا ہے۔ جب RAPA نے Sidt2+/+اور Sidt2−/− گروپوں کے MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز پر عمل کیا، تو اس نے دونوں گروپوں میں LC3-II کی مقدار میں اضافہ کیا۔ اس کا مطلب یہ تھا کہ RAPA آٹوفجی کے اپ اسٹریم راستے کو چالو کرسکتا ہے۔ اسی طرح، ہم نے پایا کہ RAPA کے ساتھ Sidt2−/- گروپ میں LC3-II کی سطح میں اضافہ کنٹرول (Sidt2+/+گروپ) سے زیادہ واضح تھا، یہ ظاہر کرتا ہے کہ جب RAPA نے کام کیا Sidt2-/- گروپ پر، آٹوفاگوسوم کے انحطاط کو اب بھی بہتر نہیں کیا گیا تھا۔ دریں اثنا، ہم نے P62 میں ہونے والی تبدیلیوں کا بھی مشاہدہ کیا اور پتہ چلا کہ جب RAPA نے MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز کے Sidt2+/+ گروپ پر عمل کیا، P62 میں نمایاں تبدیلی نہیں آئی، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ آٹوفجی فلوکس نارمل تھا۔ جب RAPA نے Sidt2−/− گروپ پر عمل کیا، P62 کے اظہار کی سطح انتظامیہ سے پہلے کے مقابلے میں مزید بڑھ گئی تھی اور RAPA کے علاج کے بعد کنٹرول میں ہونے والے اس سے بھی زیادہ واضح تھی (تصویر 7A, B, D, E)۔ اس کے بعد، Sidt2+/+ اور Sidt2−/− گروپ کے ساتھ RAPA کے علاج کے بعد P62 پروٹین کے متضاد اظہار کی وجوہات کو تلاش کرنے کے لیے، ہم نے P62 کے mRNA کی سطح کی پیمائش کی اور پایا کہ سطح میں اضافہ ہوا ہے۔ Sidt2+/+ اور Sidt2−/- گروپوں میں RAPA کے علاج کے بعد، اور Sidt2+/+ گروپ میں Sidt2−/- گروپ (تصویر 7C) سے زیادہ سطح تھی۔ , F)، جو مزید ثابت کر سکتا ہے کہ سڈٹ2+/+ گروپ میں آٹوفجی کا بہاؤ ہموار تھا، جبکہ آٹوفجی فلو ڈس آرڈر Sidt2−/− گروپ میں آٹوفجی کے اختتام پر واقع ہوا، یعنی آٹوفگولیسومز انحطاط۔ لنک. ہم نے ایکٹیویٹڈ آٹوفجی کی حالت میں گردے کے خلیوں کے پھیلاؤ اور اپوپٹوسس پر Sidt2 کے اثر کا بھی مطالعہ کیا اور پتہ چلا کہ آٹوفجی کے سیرم فری میڈیم انڈسڈ سیل ایکٹیویشن کے بعد، کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، Sidt2-/- کا پھیلاؤ۔ گروپ کو مزید روک دیا گیا تھا، اور apoptosis زیادہ واضح تھا (ضمنی شکل 2)۔

تصویر 5 سیڈٹ 2 کو حذف کرنے کے بعد آٹوفاگوزوم اور لائسوزوم فیوژن کو روکا جاتا ہے۔ Sidt2 ناک آؤٹ سے پہلے اور اس کے بعد MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز میں LC3B اور LAMP1 کی امیونو فلوروسینس کو-لوکلائزیشن، پیئرسن کے ارتباط کے گتانک کے ساتھ تجزیہ؛ MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز میں Sidt2 ناک آؤٹ سے پہلے اور بعد میں LC3B فلوروسینس پوائنٹس کا B موازنہ؛ MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز میں Sidt2 ناک آؤٹ سے پہلے اور بعد میں پیئرسن کے ارتباطی گتانک کا C موازنہ؛ MPC5 اور SV40 MES 13 سیلز میں Sidt2 ناک آؤٹ سے پہلے اور بعد میں فیوژن ریٹ کا موازنہ (LAMP1 اور LC3B کے LAMP1 کے فلوروسینٹ دھبوں کی تعداد کے ساتھ مقامی فلوروسینٹ دھبوں کی تعداد کا تناسب)؛ *P <0.05، **P <0.01۔

Wecistanche کی معاون خدمت - چین میں سب سے بڑا cistanche برآمد کنندہ:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

واٹس ایپ٪ 2ftel٪3a٪7b٪7b0٪7d٪7d

مزید تفصیلات کے لیے خریداری کریں:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

گردے کے لیے 25% ایکیناکوسائیڈ اور 9% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ قدرتی آرگینک سیسٹانچ ایکسٹریکٹ حاصل کریں