Glucocorticoid-Induced Rat Model-Ⅰ Cistanche Deserticola اور اس کے رائس وائن سٹیمنگ پروڈکٹس کے Neuroendocrine-immune function پر مطالعہ

1. تعارف

Cistanche deserticola، جسے "صحرائی ginseng" کہا جاتا ہے، ایک روایتی چینی دوا ہے جو صدیوں سے یانگ ٹانک جڑی بوٹی کے طور پر استعمال ہوتی رہی ہے۔گردے کو متحرک کرتا ہے اور یانگ کو مضبوط کرتا ہے۔[1]۔ آٹھ پرجاتیوں اور ایک تغیرCistanche Herba صرف چین میں ریکارڈ کیا گیا ہے۔Cistanche deserticolaYC Ma اورCistanche tubulosa(Schenk) وائٹ چینی فارماکوپیا [2] میں درج ہیں۔ فارماسولوجیکل اسٹڈیز نے یہ ثابت کیا۔Cistanches Herbaنیوروپروٹیکٹو [3]، امیونوموڈولیٹری [4]، کارڈیو پروٹیکٹو [5]، اینٹی تھکاوٹ [6]، اینٹی انفلامیٹری [7]، ہیپاٹوپروٹیکٹو [8]، اینٹی آکسیڈیٹیو [9]، اینٹی بیکٹیریل [10]، جلاب [11]، اور اینٹی ٹیومر کی نمائش اثرات [12]۔ وسیعاس جینس کی رپورٹ شدہ حیاتیاتی سرگرمیوں کے سپیکٹرم کو اس کی پیچیدہ اور متنوع فائٹو کیمیکل ساخت سے منسوب کیا گیا ہے۔Cistanche deserticolaphenylethanol glycosides، iridoids، polysaccharides [13]، وغیرہ پر مشتمل ہے۔ phenylethanoid glycosides کا مواد اصل دواؤں کے مواد میں سب سے زیادہ ہے [14]۔

گردے کو تقویت بخشنے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ایکٹ 12%

چینی میٹیریا میڈیکا (سی ایم ایم) کی پروسیسنگ روایتی چینی طب کے نظریہ کے مطابق علاج، تقسیم اور تیاری کے لیے مختلف تقاضوں کو پورا کرنے کے لیے ایک روایتی دواسازی کی تکنیک ہے۔ ان پروسیس شدہ مصنوعات کو کاڑھی کے ٹکڑوں کا نام دیا جاتا ہے، جو کلینک میں استعمال ہوتے ہیں۔ پروسیسنگ کا مقصد خام ادویات کی زہریلا کو کم کرنے کی افادیت کو بڑھانا ہے۔ 2015 چینی فارماکوپیا نے ریکارڈ کیا کہ کلینک میں سیستانچے کے موٹے سلائسس (سی ڈی) اور چاول کی شراب سے ابلی ہوئی سیستانچے (ڈبلیو سی ڈی) کو کاڑھی کے ٹکڑوں کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ہمارے تحقیقی گروپ نے ظاہر کیا کہ جلاب اثر سے نجات ملی، اور Cistanche کو چاول کی شراب کے ساتھ ابالنے کے بعد اینٹی ایجنگ اور کڈنی یانگ کو متحرک کرنے والے اثرات میں اضافہ ہوا [15]۔

ہائپوتھیلمس-پیٹیوٹری-ایڈرینل غدود-تھیمس غدود (HPAT) محور کا فعل گردے یانگ کی کمی کے سنڈروم میں خراب ہوتا ہے [16]۔ گردے یانگ کی کمی والے مریضوں میں بھی وسیع پیمانے پر مدافعتی کمزوری ہوتی ہے۔ HPA محور کی خرابی کا امیونو کی کمی سے گہرا تعلق ہے۔ Neuroendocrine-immune network (NEI) تھیوری سے پتہ چلتا ہے کہ مدافعتی اور neuroendocrine نظام بہت سے ligands اور ریسیپٹرز کا اشتراک کرتے ہیں [17]، اور ہائپوتھیلمس کو نیورو اینڈوکرائن کو مدافعتی نظام سے جوڑنے کا محور سمجھا جاتا ہے۔

اس مطالعے میں، ہم نے ماڈل چوہوں میں کڈنی یانگ کی کمی کو exogenous corticosteroid انجیکشن کے ساتھ نقل کیا اور اینڈوکرائن امیون فنکشن کے نقطہ نظر سے Cistanche deserticola کے مختلف پروسیسڈ پروڈکٹس کے جواب میں کڈنی یانگ کی کمی کا طریقہ کار دریافت کیا۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 مواد اور ری ایجنٹس

Cistanche deserticola 2019.5 میں الاشان نیمینگگو سے جمع کیا گیا تھا اور پروفیسر یانجن زہائی (اسکول آف فارمیسی، لیاؤننگ یونیورسٹی آف روایتی چینی طب، چین) کے ذریعہ Cistanche deserticola YC Ma کے خشک مانسل تنوں کے طور پر شناخت کیا گیا تھا۔ واؤچر کے نمونے لیاوننگ پروسیسنگ انجینئرنگ ٹیکنالوجی سینٹر میں محفوظ کیے گئے تھے۔

اجوگول کے معیاری مرکبات Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China) سے خریدے گئے تھے۔ cistanoside F،echinacoside، cistanoside A، اور isoacteosideمسٹ کمپنی (سیچوان چائنا) سے خریدے گئے تھے۔ ایکٹیوسائڈ ڈالیان میلون بائیو سے خریدا گیا تھا۔ کمپنی، لمیٹڈ (ڈیلین، چین)۔ ایم ایس گریڈ ایسٹونیٹرائل اور میتھانول مرک کے جی اے اے (ڈرمسٹادٹ، جرمنی) سے خریدے گئے تھے۔ HPLC گریڈ فارمک ایسڈ مرک KGaA (Darmstadt، Germany) سے خریدا گیا تھا۔ چاول کی شراب Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China) سے خریدی گئی تھی۔

کورٹیکوسٹیرون (CAS: 50-22-6, purity > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan pills (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), چوہا ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2, اور IL-10 ELISA کا پتہ لگانے والی کٹس Nanjing Jiancheng Co., Ltd سے خریدی گئی تھیں۔ چوہا کورٹیسول ELISA کٹ BOSK کمپنی نے فراہم کی تھی۔ چوہا CD4 اینٹی باڈی، CD8a اینٹی باڈی (نمبر 561833 اور 559976)، RBC lysate (Solarbio, R1010)، PBS بفر سلوشن (Solarbio، P1020-500)، TRIzol (MAN0001271)، CaM، اور -ایکٹین ڈاؤن اسٹریم اپ اسٹریم Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (نمبر RR037A) اور cDNA سنتھیسز کٹ (نمبر 10000068167) کے ذریعے فراہم کیے گئے تھے بولے لائف میڈیسن پروڈکٹس (شنگھائی) کمپنی، لمیٹڈ کلوروفارم، آئسوپروپینول، 75٪ ایتھنول، اور تمام حل تجزیاتی طور پر خالص تھے اور سائنو فارم کیمیکل ریجنٹ کمپنی لمیٹڈ کے ذریعہ تیار کیے گئے تھے۔ الٹرا پیور پانی ملی-کیو سسٹم (18.2 MΩ، ملی پور، MA، USA) کے ذریعے تیار کیا گیا تھا۔

2.2 تجرباتی آلات

ایک انزائم مارکر (تھرمو، ماڈل 3530911931)، خودکار پلیٹ واشر (ماڈل HBS- 4009)، ڈیجیٹل ڈسپلے پش پل فورس میٹر (ماڈل VICTOR- 50N)، ہائی اسپیڈ فریزنگ سینٹری فیوج (ماڈل سگما 3k15) )، الٹرا مائیکرو سپیکٹرو فوٹومیٹر (ماڈل B-50Q)، جین ایمپلیفائر (ماڈل L96G)، ریئل ٹائم فلوروسینس مقداری PCR (ماڈل StepOne)، فلو سائٹو میٹر (ماڈل AC66051710132)، پیرافین مائیکرو ٹوم (ماڈل لا اوکاسمپ)، ، ماڈل BS-53)، اور ایک خالص پانی کا آلہ (ماڈل F7JA36507) استعمال کیا گیا تھا۔

2.3۔ UPLC-Q-TOF-MS اور فارماکولوجیکل تجربات کے لیے نمونوں کی تیاری

کے اسی بیچ سے ڈبلیو سی ڈی پر کارروائی کی گئی۔Cistanche deserticolaہماری لیبارٹری میں. ڈبلیو سی ڈی کی تیاری کے لیے، خشک سی ڈی کے ٹکڑوں (5 ملی میٹر موٹی) (100 گرام) کو چاول کی شراب (30 ملی لیٹر) کے ساتھ ملایا گیا، 4 گھنٹے کے لیے ہائی پریشر (1.25 کے پی اے) پر بھاپ دیا گیا، اور پھر 55 ڈگری پر خشک کیا گیا۔

CD اور WCD کے موٹے پاؤڈر کو 0.5 گھنٹے کے لیے 10 بار 95% ایتھنول میں بھگو دیا گیا، ہر بار 1 گھنٹے کے لیے 3 بار ریفلوکس نکالا گیا، اور فلٹر کیا گیا، اور فلٹریٹس کو 3 بار ملایا گیا۔ ایتھنول کو کم دباؤ کے تحت برآمد کیا گیا تھا، اور اقتباس انتظامیہ کے لیے حاصل کیا گیا تھا۔ نچوڑ (1 ملی لیٹر) کو 50% میتھانول میں شامل کیا گیا، جس سے کل حجم 20 ملی لیٹر ہو گیا، اور مواد کے تجزیہ کے لیے 4 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا۔

جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4 UPLC-QqQ-MS CD اور WCD اقتباسات کے تجزیہ کے لیے شرائط

2.4.1 LCThMS تجزیاتی حالات

MassLynx 4.1 تجزیہ کار سافٹ ویئر کے ساتھ UPLC-MSThMS سسٹم ڈیٹا کے حصول اور پروسیسنگ کو انجام دینے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ تجزیاتی کالم 40 ڈگری C کے درجہ حرارت پر ایکویٹی UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) تھا۔ موبائل مرحلہ تھا 0.1% فارمک ایسڈ آبی محلول (A) اور acetonitrile جس میں 0.1% فارمک ایسڈ (B) تھا۔ ایلیوشن گریڈینٹ 0 تھا۔ 12% B کے ساتھ }} منٹ، 3.01–4۔{34}} 15% B کے ساتھ منٹ، 4.01–5۔ % B، 6.01–8۔{49}} منٹ 25% B کے ساتھ، اور 8.01–9۔

الیکٹرو سپرے آئنائزیشن (ESI) سورس سے لیس واٹرس ٹرپل کواڈرپل ماس اسپیکٹومیٹر (Xevo TQD، Waters Corp., Milford, MA, USA) کو منفی آئن موڈ میں استعمال کیا گیا تھا۔ 250 ڈگری کے درجہ حرارت پر 500 LThh کے بہاؤ کی شرح کے ساتھ ناپاک گیس نائٹروجن تھی۔ تمام دریافت شدہ مرکبات کو ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی (MRM) موڈ میں ماپا گیا تھا؛ جدول 1 توانائی کے پیرامیٹرز کو ظاہر کرتا ہے، اور جدول 2 تجزیہ شدہ اجزاء کے لیے انشانکن منحنی خطوط کو ظاہر کرتا ہے۔

2.4.2 حوالہ مادہ کی تیاری

Tubuloside A (302 mg)، echinacoside (3.00 mg)، 2′-acetylacteoside (2.34 mg)، acteoside (2.45 mg)، isoacteoside (0.61 mg)، cistanoside F ( 2.14 ملی گرام)، سیلیڈروسائیڈ (3.39 ملی گرام)، جینیپوسائیڈک ایسڈ (2.84 ملی گرام)، اجوگول (1.58 ملی گرام)، اور کیٹلپول (2.39 ملی گرام) کو میتھانول میں تحلیل کرکے اسٹاک سلوشن تیار کیا گیا۔ ورکنگ اسٹینڈرڈ سلوشنز کے لیے مناسب ارتکاز حاصل کرنے کے لیے اسٹاک سلوشن کو میتھانول سے پتلا کیا گیا تھا۔ تمام تیار حل استعمال سے پہلے 4 ڈگری پر محفوظ کیے گئے تھے۔

2.5 جانوروں کے ماڈلز کی تیاری اور گروپ بندی

SD نر چوہے (180–220 g) Liaoning Changsheng Biotechnological Co., Animal permit number: SCXK (Liao) 2015–0001 سے خریدے گئے تھے۔ تمام چوہوں کو 25 ڈگری پر خوراک اور پانی تک مفت رسائی اور 30-50٪ کی نسبتہ نمی کے ساتھ برقرار رکھا گیا تھا۔ تجربات سے پہلے جانوروں کو 7 دن تک رکھا گیا تھا۔

ایک سو چوہوں کو تصادفی طور پر 10 گروپوں میں تقسیم کیا گیا: خالی کنٹرول (BC) گروپ، ماڈل کنٹرول (MC) گروپ، مثبت کنٹرول (PC) گروپ، رائس وائن کنٹرول (WC) گروپ، CD ہائی ڈوز (CD) -HD) گروپ، CD مڈل ڈوز (CD-MD) گروپ، CD لو ڈوز (CD-LD) گروپ، WCD ہائی ڈوز (WCD-HD) گروپ، WCD مڈل ڈوز (WCD-MD) گروپ، اور WCD کم خوراک (WCD-LD) گروپ۔ CD-HDThWCD-HD، CD-MDTh WCD-MD، اور CD-LDThWCD-LD کی خوراکیں بالترتیب 5.48 gTh (kg ∙ d)، 2.74 gTh (kg ∙ d)، اور 1.37 gTh (kg ∙ d) تھیں۔ PC گروپ کے لیے خوراک 1.646 gTh(kg ∙ d) تھی، اور WC گروپ کے لیے 40 دنوں کے لیے 1 mLTh100 g۔ انتظامیہ کے 6 ویں دن، چوہوں کو کورٹیکوسٹیرون واٹر سسپنشن (کورٹیکوسٹیرون + 0.1% ڈائمتھائل سلفوکسائڈ + 0.1% ٹوین-80 + 0.9% سوڈیم کلورائڈ) کے ساتھ ذیلی طور پر انجکشن لگایا گیا تھا۔ BC گروپ کے لیے [18]۔ کورٹیکوسٹیرون کا ارتکاز 5 gThL تھا، اور خوراک 0.1 mLTh100 g تھی۔ BC گروپ کے چوہوں کو ایک ہی خوراک میں انجیکشن کے ذریعے نارمل نمکین + 0.1% dimethyl سلفوکسائیڈ + 0.1% Tween- 80 + 0.9% سوڈیم کلورائیڈ دیا گیا تھا۔

2.6۔ HPA محور کے افعال کا تعین

2.6.1 وزن، درجہ حرارت، اور ہولڈنگ پاور ٹیسٹ

وزن کا ٹیسٹ ہر 3 دن میں کیا جاتا تھا، اور درجہ حرارت ہر 6 دن بعد لیا جاتا تھا۔ تجربے کے دوران. 39 ویں دن، پچھلے اعضاء کی زیادہ سے زیادہ طاقت کو گرفت میٹر سے ماپا گیا۔ چوہوں کو ہموار پلیٹ فارم پر رکھا گیا تھا، جس سے ان کے پچھلے اعضاء کھمبے کو پکڑ لیتے تھے۔ جب دم کھینچا جاتا ہے تو چوہے کسی بھی چیز کو فطری طور پر پکڑ لیتے ہیں تاکہ پیچھے کی طرف بڑھنے سے روکا جا سکے جب تک کہ پل کی قوت گرفت سے زیادہ نہ ہو جائے۔ جب چوہا اپنی گرفت کھو دیتا ہے، تو پریمپلیفائر خود بخود زیادہ سے زیادہ گرفت کی قوت کو ریکارڈ کر سکتا ہے۔

2.6.2 سیرم میں T، CRH، ACTH، CORT، اور Cortisol کی سطح کا تعین

آخری انتظامیہ کے ایک گھنٹہ بعد، چوہوں کو urethane کے محلول (20 gTh100 mL) کے انٹراپریٹونیل انجیکشن کے ذریعے بے ہوشی کی گئی۔ اس کے بعد، خون کے نمونے جمع کیے گئے، سیرم حاصل کرنے کے لیے 3500 r پر 15 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا، اور −20 ڈگری پر محفوظ کیا گیا۔ T، CRH، ACTH، CORT، اور cortisol کے ارتکاز کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق چوہا ELISA کٹس سے ماپا گیا۔

2.6.3 خوردبین مشاہدات

ایڈرینل غدود کے بافتوں کی شکلیاتی ساخت کا مشاہدہ HE داغ لگا کر کیا گیا۔ ایڈرینل ٹشو کو 10% پیرافارمیلڈہائڈ میں طے کیا گیا تھا، ایتھنول میں پانی کی کمی کی گئی تھی، اسے زائلین محلول کے ذریعے شفاف بنایا گیا تھا، روایتی طریقوں سے سرایت کیا گیا تھا، 4 μm موٹی سلائسوں میں کاٹا گیا تھا، زائلین محلول کے ساتھ ڈیویکس کیا گیا تھا، ایتھنول گریڈینٹ کے ساتھ ہائیڈریٹ کیا گیا تھا، اور پھر ایتھنول کے ساتھ داغدار کیا گیا تھا داغدار حل. xylene کے ساتھ شفاف ہونے کے بعد، پلیٹ کو غیر جانبدار گم کے ساتھ سیل کر دیا گیا تھا اور ایک خوردبین کے تحت مشاہدہ کیا گیا تھا.

2.6.4 ایڈرینل غدود میں Bax، Bcl-2، Caspase-3، Fas، اور FasL پروٹین کے اظہار کا امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ

فارملین فکسڈ، پیرافین ایمبیڈڈ چوہے کے ایڈرینل حصوں کو 4 μm کی موٹائی میں کاٹنے کے بعد ڈیپرافینائز اور ری ہائیڈریٹ کیا گیا تھا۔ اینڈوجینس پیرو آکسیڈیز کی سرگرمی کو روکنے کے لیے، حصوں کو 10 منٹ کے لیے ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ بلاک میں پہلے سے لگایا گیا تھا۔ حصوں کو 0.01 M سائٹریٹ (pH 6.0) میں ڈبو دیا گیا اور ابلتے ہوئے گرم کیا گیا۔ عمل کو 5-10 منٹ کے بعد دہرایا گیا۔ ٹھنڈا ہونے کے بعد، حصوں کو PBS (pH 7.2–7.6) سے 1–2 بار دھویا گیا، کمرے کے درجہ حرارت پر تقریباً 5 منٹ کے لیے چھوڑ دیا گیا، اور PBS (pH 7.2–7.6) سے 2–3 بار دھویا گیا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 5٪ BSA بلاک کرنے کا حل شامل کیا گیا تھا، اور سیکشن پر موجود اضافی مائع کو 20 منٹ بعد ہلا دیا گیا تھا۔ FasTh FasL، Bcl-2ThBax، اور کیسپیس-3 (PBS کے ساتھ 1:100 پتلا) کے لیے مخصوص پرائمری اینٹی باڈیز کو شامل کیا گیا اور رات بھر 1 گھنٹے یا 4 ڈگری کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ حصوں کو پی بی ایس (پی ایچ 7.2–7.6) کے ساتھ 2–3 بار دھویا گیا۔ اس کے بعد، بایوٹینیلیٹڈ بکری اینٹی ماؤس IgG شامل کیا گیا، اور حصوں کو 20-37 ڈگری پر 20 منٹ تک خشک کیا گیا اور PBS (pH 7.2–7.6) سے 4 بار 5 منٹ تک دھویا گیا۔ پی بی ایس میں اچھی طرح سے دھونے کے بعد، حصوں کو 30 منٹ تک ری ایجنٹس A اور B کے مرکب کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا، PBS کے ساتھ 45 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا، اور آخر کار ڈی اے بی سبسٹریٹ (DAKO) کے ساتھ 30 منٹ تک ہیماتوکسیلین سے تھوڑا سا مقابلہ کرنے سے پہلے تیار کیا گیا، پانی کی کمی، اور نصب.

جنسی احساس کو بڑھانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7۔ مدافعتی افعال کا تعین

2.7.1 امیون آرگن انڈیکس کا حساب کتاب

آخری انتظامیہ کے ایک گھنٹہ بعد، چوہوں کو urethane کے محلول (20 gTh100 mL) کے intraperitoneal انجیکشن کے ذریعے بے ہوشی کی گئی، اور پھر تلی اور thymus غدود کو ہٹا دیا گیا اور فوری طور پر جراثیم سے پاک ہڈ میں وزن کیا گیا۔ تلی یا thymus کے وزن کے گتانک (%) � تلی یا thymus وزن (mg) جسمانی وزن (g)۔

2.7.2 پیریفرل خون میں ٹی لیمفوسائٹ سبسیٹ کا پتہ لگانا

اندھیرے میں 30 منٹ کے لئے مونوکلونل اینٹی باڈیز اینٹی سی ڈی 4 (پی ای) اور اینٹی سی ڈی 8 (ایف آئی ٹی سی) کے ساتھ اسپلینوسائٹس اور ہیموسائٹس کو انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ 2 ملی لیٹر erythrocyte lysate شامل کیا گیا، اور محلول کو بھنور کے ذریعے ملایا گیا۔ محلول کو 10 منٹ کے لیے اندھیرے میں چھوڑ دیا گیا اور 5 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو ضائع کر دیا گیا، اور پھر اس محلول کو 3 بار برف کے ٹھنڈے پی بی ایس سے دھویا گیا اور پی بی ایس پارمیبلائزنگ سلوشن میں دوبارہ معطل کر دیا گیا۔ کم از کم 10،000 سیلز کا تجزیہ بہاؤ سائٹوومیٹری کے ذریعے ہر Mab سٹیننگ کے 1 گھنٹے کے اندر کیا گیا۔

2.7.3 سیرم میں IL-10، IL-6، IL-2، TNF- اور IFN-c کی سطح کا تعین

آخری انتظامیہ کے ایک گھنٹہ بعد، چوہوں کو urethane کے محلول (20 gTh100 mL) کے intraperitoneal انجیکشن کے ذریعے بے ہوشی کی گئی، اور پیٹ کی شہ رگ سے خون لیا گیا۔ سیرم حاصل کرنے کے لیے خون کو 3500 r پر 15 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا اور −20 ڈگری پر محفوظ کیا گیا۔ IL-10, IL-6, IL-2, TNF- اور IFN-c کی تعداد کا پتہ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق چوہا ELISA کٹس کے ساتھ کیا گیا تھا۔

2.8۔ Hypothalamus اور Hypophysis ٹشوز میں CaM کا اظہار

کل آر این اے TRIzol کے ذریعہ ہائپوتھیلمس اور ہائپوفیسس ٹشوز سے نکالا گیا تھا۔ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کل RNA کے 10 μL پر ریورس ٹرانسکرپشن کیا گیا تھا۔ cDNA کی مساوی مقدار کا تجزیہ qPCR کے ذریعے dsDNA-binding dy (Promega, USA) اور CFX 96 ریئل ٹائم PCR سسٹم (Bio-Rad, USA) کی موجودگی میں کیا گیا تاکہ مختلف جینز کو ابتدائی ایکٹیویشن کے حالات میں دیکھا جا سکے۔ 10 منٹ کے لیے 95 ڈگری، 15 سیکنڈ کے لیے 95 ڈگری پر ڈینیچریشن کے 40 چکر، اور 1 منٹ کے لیے 60 ڈگری پر اینیلنگ ایکسٹینشن۔

CaM اور -actin کے پرائمر ٹیبل 1 میں دیئے گئے ہیں، اور -actin کو اندرونی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ ہر نمونے کو ہدف جین اور ایکٹین کے مابین اہم حد (سی ٹی) میں فرق کا استعمال کرکے معمول بنایا گیا تھا۔ نتیجہ کو بیان کرنے کے لیے درج ذیل مساوات کا استعمال کیا گیا تھا: ΔΔCt � (Ct ہدف جین − Ct -actin جین) تجرباتی گروپ − (Ct ہدف جین − Ct -actin جین) کنٹرول گروپ۔ اس کے بعد اظہار 2- ΔΔCt ہدف جین کا استعمال کرتے ہوئے، ہر نمونے کی mRNA سطحوں کا موازنہ کیا گیا۔ ہر گروپ کے نتائج کا اوسط لیا گیا (ٹیبل 3)۔

2.9 شماریاتی تجزیہ

تمام ڈیٹا کا تجزیہ SPSS سافٹ ویئر (ورژن 19۔{1}}، SPSS Institute Inc., Chicago, IL) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ گروپوں کے درمیان اختلافات کا یک طرفہ بار بار پیمائش کے تغیرات کے تجزیہ (ANOVA) کے ساتھ تجزیہ کیا گیا۔ گراف پیڈ پرزم سافٹ ویئر (ورژن 6۔{5}}، San Diego, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے نتائج کو اوسط ± معیاری انحراف (SD) کے طور پر ظاہر کیا گیا۔ 0.05 سے کم P قدر والے فرق کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔

3. تجرباتی نتائج

3.1 UPLC-QqQ-MSAnalysis

بہترین علیحدگی، چوٹی کی شکل، اور ایک مختصر تجزیہ کا وقت حاصل کرنے کے لیے، ہمارے ابتدائی تجربے میں کالم، موبائل فیز، اور گریڈینٹ پروگرام سمیت کرومیٹوگرافک حالات کا مطالعہ کیا گیا۔ ایم آر ایم موڈ کے ساتھ عام کرومیٹوگرامس کو شکل 1 میں پیش کیا گیا ہے۔

جدول 4 سے، ہم دیکھ سکتے ہیں کہ WCD میں phenylethanoid glycosides کے مواد میں CD کے مقابلے میں اضافہ ہوا ہے، خاص طور پر echinacoside اور acteoside کے لیے، جبکہ WCD میں iridoids کے مواد میں کمی واقع ہوئی ہے۔

3.2 HPA ایکسس فنکشن کے لیے ضابطہ

3.2.1 وزن، درجہ حرارت، اور ہولڈنگ پاور ٹیسٹ

ایم سی گروپ اور تجرباتی گروپوں کے چوہوں نے کورٹیکوسٹیرون دیے جانے کے بعد آہستہ آہستہ گردے یانگ کی کمی کی علامات ظاہر کیں۔ سی ڈی اور ڈبلیو سی ڈی گروپس میں علامات، جیسے وزن میں کمی، ہائپوتھرمیا، بالوں کی چمک کا جھڑنا، روح کا جھک جانا، ردعمل میں وقفہ، اور پانی کے استعمال اور سرگرمی میں نمایاں کمی۔ شکل 2(a) وزن میں تبدیلیوں کو ظاہر کرتا ہے۔ منشیات کے گروپوں میں سے ہر ایک کا وزن بڑھ گیا، خاص طور پر CDHD اور WCD-HD گروپوں میں۔ ایم سی گروپ میں وزن میں اضافہ سب سے کم تھا۔ شکل 2(b) درجہ حرارت کی تبدیلیوں کو ظاہر کرتا ہے، جو MC گروپ میں سب سے کم تھے، اور WCD-HD، WCD-MD، اور WCD-LD گروپوں میں درجہ حرارت میں اضافہ ہوا۔

شکل 2(c) سے پتہ چلتا ہے کہ BC گروپ اور تجرباتی گروپوں میں سے ہر ایک کے لیے ہولڈنگ پاور میں اضافہ ہوا، اور WCD-MD گروپ سب سے زیادہ تھا، جس نے یہ ظاہر کیا کہ انتظامیہ کے بعد گردے یانگ کی کمی سے پیدا ہونے والی کمزوری کی علامات میں بہتری آئی ہے۔

3.2.2 T، CRH، ACTH، CORT، اور Cortisol کی سطحیں۔

شکل 3 سے پتہ چلتا ہے کہ BC گروپ کے مقابلے میں، چوہے کے سیرم میں T، CRH، ACTH، اور CORT کی سطح کم ہوئی (P < 0۔{3}}1) اور کورٹیسول کی سطح کم ہوئی (P < 0۔{11}}5) MC گروپ میں۔ MC گروپ کے مقابلے میں، WCD-HD اور WCD-MD گروپوں میں T کی سطح میں اضافہ ہوا (P < 0۔{21}}1)، WCD-LD میں CRH کی سطح، WCD-MD، اور WC گروپس بہتر ہوئے (P < 0.01)، CD-HD، WCD-MD، اور WCD-HD گروپس (P <0.01) میں ACTH کے مواد میں اضافہ ہوا، CORT کی سطح کو اپ گریڈ کیا گیا۔ CD-MD، WCD-MD، اور WCD-HD گروپس (P <0.01) اور CDHD اور WCD-LD گروپس (P <0.05) میں اضافہ ہوا، اور ہر دوائی گروپوں میں کورٹیسول کی سطح میں اضافہ ہوا۔

3.2.3 خوردبین مشاہدے کے نتائج

ایڈرینل غدود کے ٹشو کو کارٹیکل پرت اور میڈولا پرت میں تقسیم کیا جاسکتا ہے۔ کارٹیکل تہوں میں گلوبلولر، بنڈل اور ریٹیکولر پرتیں شامل ہیں۔ خلیوں میں زیادہ لپڈ ہوتے ہیں، اور میڈولا کی تہہ زیادہ تر فیوکروموسیٹوما خلیات اور تھوڑی مقدار میں ریشے دار ٹشو پر مشتمل ہوتی ہے۔ جیسا کہ شکل 4 میں دکھایا گیا ہے، ہم نے پایا کہ BC گروپ میں سب کچھ نارمل تھا، جب کہ MC گروپ میں، ایڈرینل کورٹیکس میں واضح ہائپرپالسیا، سیلولر ایٹروفی، اور بڑھتی ہوئی کثافت تھی۔ بلبس کی پٹی موٹی ہو گئی، اور پارباسی فاسکیکولر زون، تنگ زونا ریٹیکولرس، اور چھوٹے خلیات نے غیر مساوی رنگ اور کیپلیری بھیڑ کو ظاہر کیا۔ پی سی گروپ میں، کارٹیکل اور میڈولر حدود نظر آتے تھے. گلوبلر اور بنڈل بینڈ کے خلیات کو یکساں طور پر ترتیب دیا گیا تھا، اور مورفولوجیکل ڈھانچہ بحال کر دیا گیا تھا۔ WCD گروپوں میں اسی طرح کی بہتر بحالی دیکھی گئی، اور WCD-MD گروپ میں اثرات WCD-HD اور WCD-LD گروپوں کے مقابلے بہتر تھے۔ سی ڈی گروپس میں ایڈرینل گلینڈ کی مورفولوجی اتنی اچھی نہیں تھی جتنی ڈبلیو سی ڈی گروپس میں۔

جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%