آٹوفیگی کو دلانے کے ذریعہ این اے ایف ایل ڈی پر ایکٹوسائڈ (سسٹانچے صحرا میں ایک فعال جزو) کے اثر پر مطالعہ کریں

خلاصہ:

 

مقصد:سسٹانچے صحرا میں فعال اجزاء ایکٹوسائڈ (ایکٹ) کے آٹوفیگی دلانے والے فنکشن اور غیر الکوحل فیٹی جگر کی بیماری (این اے ایف ایل ڈی) پر اس کا اثر۔

طریقےایکچیکوسائڈ لینے اور تحقیقی آبجیکٹ کے طور پر کام کرنے کے لئے ، مداخلت کے علاج کے ل 1 1 {{15} 0 μmol/l ایکٹ اور ایکیناکوسائڈ (ECH) کو آٹوفیگی-لیسوسوم انابیمائٹن A1 کے ساتھ ملایا گیا۔ پروٹین امیونو بلوٹنگ کا استعمال آٹوفیگی مارکر پروٹین مائکروٹوبول سے وابستہ پروٹین 1 لائٹ چین 3 (LC 3- II) کے متعلقہ اظہار کی سطح کا پتہ لگانے کے لئے کیا گیا تھا۔ ہیپ جی 2 خلیوں کو وٹرو میں ایکٹ کی مختلف حراستی کے ساتھ مداخلت کی گئی تھی ، اور ٹیٹرازولیم نمک کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے سیل کی اہلیت کا پتہ چلا تھا۔ بالوفلوکسین A1 کے ساتھ مل کر ایکٹ کی مختلف حراستی کے ساتھ ہیپ جی 2 خلیوں کی وٹرو مداخلت ، اور ایل سی {9 {9}} II پروٹین اظہار کی سطح کا پتہ لگانے سے پروٹین امیونوبلٹنگ ٹکنالوجی کا استعمال کیا جاتا ہے۔ منشیات کی مداخلت کے ساتھ وٹرو میں تعمیر کردہ ایک NAFLD ماڈل کا استعمال تیل کے سرخ O داغدار طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے لیپڈ بوندوں کو داغنے کے لئے کیا گیا تھا اور انٹرا سیلولر ٹرائگلیسیرائڈ کی سطح کا پتہ لگایا گیا تھا۔ امیونو فلوروسینس ٹیکنالوجی کے ذریعہ LC3 پروٹین اور لیپڈ بوندوں کے لوکلائزیشن کا مشاہدہ کریں۔ نتائج ایکٹ ہیپ جی 2 خلیوں میں آٹوفیجی کو نمایاں طور پر دلاتا ہے ، اور ایل سی 3- II پروٹین کے اظہار کی سطح کو کنٹرول گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھایا جاتا ہے (صرف ایکٹ کے ساتھ سلوک کیا جاتا ہے) (1.36 ± 0} {3 3 3 32 {3 {3 {3 {3 28 ± {0. بالترتیب) ، اعداد و شمار کی اہمیت (P0.05) کے ساتھ۔ 50 μmol/l ایکٹ نے ہیپ جی 2 خلیوں میں نمایاں طور پر آٹوفیجی کی حوصلہ افزائی کی ، اور LC 3- II پروٹین کے اظہار کی سطح میں نمایاں اضافہ کیا گیا (بالترتیب 1.83 ± 0.53 ، 0.35 ± 0.18)۔ ایکٹ مداخلت گروپ (19.11 ± 1.68) میں HEPG2 خلیوں کی TG کی سطح NAFLD میں وٹرو سیل ماڈل گروپ (34.15 ± 1.90) کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھی ، اور یہ اختلافات اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم تھے (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

کلیدی الفاظ:غیر الکحل فیٹی جگر کی بیماری ؛سسٹانچے صحرا;ایکٹیوسائڈ؛ آٹوفیگی

 

غیر الکوحل فیٹی جگر کی بیماری (این اے ایف ایل ڈی) کے علاج کے لئے ٹی سی ایم ہرب سسٹانچی

مزید تفصیلات حاصل کرنے کے لئے تصویر پر کلک کریں

 

پچھلی چند دہائیوں میں ، غیر الکوحل فیٹیجگر کی بیماری(NAFLD) سب سے عام بن گیا ہےجگر کی دائمی بیماری، بالغوں کی تقریبا 25 ٪ آبادی کے عالمی سطح پر پھیلاؤ کے ساتھ ، اور اسے میٹابولک سنڈروم [1] سے قریب سے متعلق سمجھا جاتا ہے۔ اگرچہ این اے ایف ایل ڈی کے مریضوں میں جگر سے متعلقہ پیچیدگیوں کا امکان 10 فیصد سے کم ہے ، لیکن این اے ایف ایل ڈی جگر سے متعلقہ بیماریوں جیسے سرہوسس اور بنیادی جگر کے کینسر کے لئے ایک خطرہ عنصر ہے ، جو مریضوں پر بہت بڑا معاشی بوجھ ڈالتا ہے [2-5]۔ این اے ایف ایل ڈی پر بڑھتی ہوئی توجہ کے باوجود ، ایک اہم دائمی بیماری کے طور پر این اے ایف ایل ڈی کو اتنی توجہ نہیں ملی ہے۔ لہذا ، این اے ایف ایل ڈی کے روگجنن اور علاج معالجے کی موثر حکمت عملیوں کی تلاش کے بارے میں مزید گہرائی سے تفہیم [6-7] کو حل کرنے کے لئے فوری مسائل بن چکے ہیں۔

حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ سیلولر آٹوفیگی جگر کے جسمانیات اور پیتھالوجی [8] میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے۔ آٹوفیجی dysfunction یا dysregulation کا تعلق جگر کی متعدد بیماریوں جیسے سے ہوتا ہے جیسےالکحل سے متعلق جگر کی بیماری[9] ، این اے ایف ایل ڈی [10] ، غیر الکوحل اسٹیٹو ہیپیٹائٹس [11] ، اور ہیپاٹوسیلولر کارسنوما [12]۔ این اے ایف ایل ڈی کی پیتھولوجیکل خصوصیات غیر الکوحل محرک کے تحت ہیپاٹائکائٹس میں ٹرائگلیسیرائڈس (ٹی جی) اور دیگر غیر جانبدار لپڈ بوندوں (ایل ڈی) کی ضرورت سے زیادہ جمع ہیں۔ جگر کے لئے ، ان ایل ڈی کے کیٹابولزم کو منظم کرنے والے دو اہم راستے لیپولیسس اور آٹوفیگی ہیں۔
لیپولیسس راستہ سائٹوپلاسمک غیر جانبدار لیپیسس ، جیسے ہارمون حساس لیپیس اور ایڈیپوز ٹی جی لیپیس کے ذریعہ باقاعدہ ہے۔ اسی طرح کے لیپوتو فجی راستے میں ، ایل ڈی ایس کو آٹوفگی سے متعلق پروٹینوں کو براہ راست بھرتی کرکے آٹوفیگوسومز بنانے کے لئے لیا جاسکتا ہے ، اور پھر آٹوفیگوسومز کے ذریعہ شامل ایل ڈی ایس کو مزید لیسوسومس میں ڈلیوز کیا جاتا ہے اور لیسوسومز میں ایسڈ لیپیس کے ذریعہ گل جاتا ہے۔ لہذا ، ہیپاٹائوسائٹس میں لیپوتو فجی کو چالو کرنا این اے ایف ایل ڈی کی روک تھام اور علاج کے لئے ایک موثر حکمت عملی بن گیا ہے۔
سسٹانچے صحراؤں کو ایک قیمتی چینی جڑی بوٹیوں کی دوائی ہے جو روایتی چینی طب کے فارمولوں میں کلینیکل پریکٹس میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی رہی ہے۔ ایک ہی وقت میں ، یہ طویل عرصے سے ہیلتھ فوڈ ضمیمہ کے طور پر استعمال ہوتا رہا ہے۔ سسٹانچے صحراؤں میں متعدد بائیوٹیکٹیو اجزاء شامل ہیں ، جن میں سب سے اہم سسٹانچے صحراؤں فینیلیٹھانول گلائکوسائڈز ہیں۔ فینیلیٹھانائڈ گلائکوسائڈس کے نمائندوں کی حیثیت سے ، ایکچینکوسائڈ (ای سی ایچ) اور ورباسکوسائڈ (ایکٹ) کے بارے میں بتایا گیا ہے کہ ان میں بہت سے اہم حیاتیاتی سرگرمیاں ہیں ، جیسے اینٹی آکسیڈینٹ ، نیوروپروٹیکٹو ، امیونوومیڈولیٹری ، اور جگر کے تحفظ [13]۔ جگر کے تحفظ کے معاملے میں ، مطالعات سے پتہ چلا ہے کہ ای سی ایچ سوزش ثالثوں کو کم کرکے ، تبدیلی کے عنصر کو روکنے ، اور جگر کے فبروسس سے متعلق جینوں کے اظہار کی سطح کو کم کرکے جگر کی حفاظت کرسکتا ہے۔ ایکٹ کا کیمیائی اور منشیات کی حوصلہ افزائی جگر کے نقصان ، جیسے الکحل ، کاربن ٹیٹراکلورائڈ ، اور لیپوپولیساکرائڈ پر ایک اہم حفاظتی اثر پڑتا ہے۔ ایکٹ زہریلا کیمیکلز کی وجہ سے آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کرتا ہے ، جگر میں جمع ہونے والے رد عمل آکسیجن کو دور کرتا ہے ، اور مالڈیالڈہائڈ حراستی کو کم کرتا ہے۔ ایک ہی وقت میں ، اس سے جگر کے سپر آکسائیڈ کو ختم کرنے والی سرگرمی میں نمایاں اضافہ ہوتا ہے اور گلوٹاتھائن مواد کو کم کیا جاتا ہے ، اور جگر کے ہسٹوپیتھولوجیکل نقصان اور اپوپٹوسس کو نمایاں طور پر بہتر بنایا جاتا ہے۔ تاہم ، اس بارے میں کوئی متعلقہ ادب کی اطلاع نہیں ہے کہ آیا سسٹانچے صحرا کے فینیلیٹھانائڈ گلائکوسائڈس جگر کے تحفظ کو استعمال کرنے میں آٹوفیجی کے عمل میں شامل ہیں یا نہیں۔ اس کی بنیاد پر ، اس مطالعے میں روایتی سیل حیاتیات کے طریقوں اور ایک ان وٹرو سیل ماڈل کا استعمال کیا گیا تھا تاکہ وہ سسٹانچے صحرائے صحرا فینیلیٹھانائڈ گلائکوسائڈس کے آٹوفجی کو متاثر کرنے والے اثر کو ابتدائی طور پر تلاش کرسکیں اور اس کے ممکنہ فارماسولوجیکل افعال کی کھوج کی ، جس کا مقصد مستقبل میں منشیات کی نشوونما کے لئے سائنسی بنیاد فراہم کرنا ہے۔

 

1 مواد اور طریقے

1.1 مواد

1.1.1 ریسرچ مضامین ایچ اور ایکٹ کو تحقیقی مضامین کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

1.1.2 میٹریلز ہیپ جی 2 سیل ووہان پنوسائی لائف سائنس کمپنی ، لمیٹڈ ، ای سی ایچ (بیچ نمبر: بی 21209) اور ایکٹ (بیچ نمبر: بی 20715 ، ایچ پی ایل سی پیورٹی سے زیادہ یا اس کے برابر) سے خریدے گئے تھے ، شنگھائی یوکی بائیوولوجیکل کمپنی ، ڈی ایم ای ایم ہائی گلوکوز میڈیم (بی ایم ای ایم ایچ پی ایچ پی پی پی پی پی پی پی پی پی پی پی پی پی پی پی پی ایچ پی ایل سی پیفٹی۔ اور ٹرپسن کو ہائکلون کمپنی ، امریکہ سے خریدا گیا تھا ، برانن بوائین سیرم (بیچ نمبر: 04-002-1 a) بائی کمپنی ، اسرائیل ، پینسلن/اسٹریپٹومیسن (بیچ نمبر: SV30010.01) سے خریدا گیا تھا ، ہائکلون کمپنی ، M810: M810 (BACH نمبر: M810) سے خریدا گیا تھا۔ بیجنگ ، چین ، ٹی جی (بیچ نمبر: بی سی 0625) پتہ لگانے والی کٹ سولیباؤ کمپنی ، بیجنگ ، چین ، آئل ریڈ او (لاٹ نمبر: او 0625-100 جی) ، ڈیمیتھل سلفوکسائڈ (لاٹ نمبر: بی سی بی زیڈ 1685) سے سگما الڈرچ سے خریدی گئی تھی۔ آٹوفیگی-لیسوسوم انبیبیٹر بافیلومائسن A1 (BAFA1 ، LOT نمبر: TLRL-BAF1) انویٹروجن ، USA سے خریدا گیا تھا۔ آٹوفیگی ایکٹیویٹر ریپامائسن (لاٹ نمبر: S17098) شنگھائی یوانی بائیوٹیکنالوجی کمپنی ، لمیٹڈ ، چین سے خریدا گیا تھا۔ مائکروٹوبول سے وابستہ پروٹین 1 لائٹ چین 3 (LC3 ، لاٹ نمبر: L7543 ، پرجاتیوں: خرگوش ، کمزوری تناسب: 1: 1 000}) اور ایکٹین (لاٹ نمبر: Zrb1312 ، پرجاتیوں: خرگوش ، استعمال: 1: {33}}}) ہارسریڈش پیرو آکسیڈیس لیبل لگا ہوا سیکنڈری اینٹی باڈی (لاٹ نمبر: 4010-05 ، پرجاتیوں: بکری اینٹی خرگوش ، کمزوری کا تناسب: 1: {39}}) سدرن بائیوٹیک ، یو ایس اے کمپنی ، الیکسا فلور فلوروسینٹ لیبلڈ سیکنڈری اینٹی باڈی سے خریدا گیا تھا (لاٹ نمبر: 4332 1: 1000) سگما الڈرچ کمپنی ، امریکہ ، اور بوڈیپی 493/501 (لاٹ نمبر: D3922) سے انویٹروجن کمپنی ، USA سے خریدا گیا تھا۔

 

1.2 طریقے

1.2.1 سیل کلچر

ہیپ جی 2 خلیوں کو ڈولبیکو کے ترمیم شدہ ایگل ہائی گلوکوز میڈیم میں مہذب کیا گیا تھا جس میں 10 ٪ برانن بوائین سیرم ، 100 یو/ایم ایل پینسلن اور 100 یو جی/ایم ایل اسٹریپٹومائسن 37 ڈگری ، 5 ٪ کاربن ڈائی آکسائیڈ انکیوبیٹر پر مشتمل تھا۔ جب سیل کا سنگم 85 ٪ تک پہنچ گیا تو ، ذیلی ثقافت ، چڑھانا ، مداخلت اور دیگر کاروائیاں انجام دی گئیں۔

 

1.2.2 پروٹین امیونو بلوٹنگ کا پتہ لگانا

1.2.2.1 ایکٹ اور ای سی ایچ کا علاج

ایل سی 3- ⅱ ہیپ جی 2 خلیوں میں پروٹین اظہار کی سطح BAFA1 ، بطور پروٹون پمپ روکنے والا ، LC 3- ⅱ پروٹین کو خلیوں میں بڑی مقدار میں مجموعی کرنے کا سبب بن سکتا ہے ، اور اس طرح آٹوفیگی انڈکشن کی صلاحیت کو بڑھاوا دیتا ہے۔ لہذا ، BAFA1 کے مشترکہ استعمال کو آٹوفجی انڈکشن کی صلاحیت کا اندازہ کرنے کے لئے آٹوفجی مانیٹرنگ سسٹم کے طور پر استعمال کیا جاسکتا ہے۔ راتوں رات کی ثقافت کے لئے لوگرتھمک نمو کے مرحلے میں HEPG2 خلیوں کو 3.5 سینٹی میٹر سیل کلچر ڈشوں میں منتقل کیا گیا تھا۔ 100 μmol/L ایکٹ ، ایکٹ اور بی اے ایف اے 1 کو 12 گھنٹے کے لئے مداخلت کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ خلیوں کو پہلے سے ٹھنڈا فاسفیٹ بفر حل (پی بی ایس) سے دھویا گیا تھا اور فوری طور پر 10 منٹ کے لئے ریپا پروٹین لیسس بفر میں لیس کیا گیا تھا۔ سپرنٹنٹنٹ سینٹرفیوج کیا گیا تھا اور کل پروٹین کی حراستی کا تعین بائکنچونینک ایسڈ پروٹین حراستی پرکھ کٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ سوڈیم ڈوڈیسیل سلفیٹ بفر کے ساتھ مقدار کی مقدار کے بعد ، نمونے کو 95 ڈگری پر 10 منٹ کے لئے پروٹین کی تردید کرنے کے لئے گرم کیا گیا تھا۔ اس کے بعد نمونہ کا 30 μL مائکروپیپیٹ کے ساتھ لیا گیا تھا اور اسے پولی کریلیمائڈ جیل پر الیکٹروفوریس کیا گیا تھا۔
الیکٹروفورسس کے بعد ، پروٹین کو جیل سے نائٹروسیلوز جھلی میں منتقل کیا گیا ، راتوں رات 1 0 ٪ دودھ کے ساتھ بلاک کیا گیا ، جو کمرے کے درجہ حرارت پر ایک مخصوص پرائمری اینٹی باڈی کے ساتھ 1 H کے لئے ایک مخصوص پرائمری اینٹی باڈی کے ساتھ تیار کیا گیا تھا ، جس میں 0.5 ٪ ٹریٹن پر مشتمل فاسفیٹ بفر کے ساتھ دھویا جاتا تھا ، اور ایک مخصوص ثانوی اینٹی باڈی پر مشتمل ہوتا ہے۔ ای سی ایل کا طریقہ رنگ کی نشوونما کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ انہیں خالی کنٹرول گروپ ، ریپامائسن گروپ ، ایکچ گروپ ، ایکٹ گروپ ، ریپامائسن+بی اے ایف اے 1 گروپ ، ای سی ایچ+بی اے ایف اے 1 گروپ اور ایکٹ+بی اے ایف اے 1 گروپ کے طور پر ترتیب دیا گیا تھا۔

 

1.2.2.2 ایکٹ کی مختلف حراستی نے LC 3- ⅱ HEPG2 خلیوں میں پروٹین کے اظہار کی سطح میں مداخلت کی

راتوں رات کی ثقافت کے لئے لوگرتھمک نمو کے مرحلے ہیپ جی 2 خلیوں کو 3.5 سینٹی میٹر سیل کلچر ڈشوں میں منتقل کیا گیا تھا ، اور 25 ، 50 ، اور 100 μmol/L ایکٹ BAFA1 کے ساتھ مل کر 12 H کے لئے مداخلت کے علاج کے لئے استعمال کیا گیا تھا ، اور LC {3- ⅱ پروٹین کے اظہار کی سطح کو پروٹین امیونوبلاٹنگ نے تلاش کیا تھا۔ کنٹرول گروپ (کون گروپ ، خالی کنٹرول) ، فاقہ کشی گروپ (ایس ٹی اے گروپ ، فاقہ کشی کا علاج ہیپ جی 2 سیل) ، 25 ، 50 ، اور 100 μmol/L ایکٹ گروپ ، اور BAFA1 کے ساتھ مل کر 25 ، 50 ، اور 100 olmol/L ایکٹ گروپ قائم کیا گیا تھا۔

1.2.3 MTT طریقہ 24 اور 48 H کے لئے ایکٹ کی مختلف حراستی کے ساتھ علاج شدہ ہیپ جی 2 خلیوں کی بقا کی شرح کا پتہ لگانے کے لئے
لوگرتھمک نمو کے مرحلے میں ہیپ جی 2 خلیوں کو 96- اچھی پلیٹ میں ایک اعتدال پسند ٹیکہ لگانے کی کثافت کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا تھا اور 12 گھنٹے کے لئے انکیوبیٹر میں مہذب تھا۔ 2 0 ، 40 ، 60 ، 80 ، اور 100 μmol/L ایکٹ 24 اور 48 H کے لئے شامل کیا گیا تھا۔ 0.5 ملی گرام/ملی لیٹر ایم ٹی ٹی حل ایک تاریک ماحول میں شامل کیا گیا تھا اور ایک انکیوبیٹر میں انکیوبیٹڈ تھا۔ 4 گھنٹے کے بعد ، سپرنٹنٹنٹ کو ضائع کردیا گیا ، ہر کنویں میں 100 μl ڈیمیتھائل سلفوکسائڈ شامل کیا گیا ، اور خلیوں کو 10 منٹ کے لئے 37 ڈگری پر مستقل درجہ حرارت شیکر میں ہلا دیا گیا۔ 490 ینیم کی طول موج پر آپٹیکل کثافت (او ڈی) کی قیمت کا پتہ انزائم مارکر کے ذریعہ کیا گیا تھا ، اور سیل کی بقا کی شرح کا حساب لگایا گیا تھا۔

 

1.2.4 نفلڈ سیل ماڈل کی وٹرو تعمیر میں

100 ملی میٹر/ایل پی اے اسٹاک حل تیار کرنے کے لئے آئسوپروپنول کے ایک خاص حجم میں پیلمیٹک ایسڈ (پی اے) کا ایک خاص وزن وزن اور مکمل طور پر تحلیل کیا گیا تھا ، جسے بعد میں استعمال کے ل {-20 ڈگری ریفریجریٹر میں تقسیم اور محفوظ کیا گیا تھا۔ پی اے اسٹاک حل کو مکمل ثقافت کے میڈیم کا استعمال کرتے ہوئے 100 μmol/L میں گھٹا دیا گیا تھا ، اور 1 ٪ فیٹی ایسڈ فری بائیوین سیرم البومین شامل کیا گیا تھا۔ خلیوں کو انڈکشن حل تیار کرنے کے لئے 3 ڈگری پر 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ راتوں رات کی ثقافت کے ل a ایک مناسب کثافت میں لوگرتھمک نمو کے مرحلے میں ہیپ جی 2 خلیوں کو 3.5 سینٹی میٹر سیل کلچر ڈش میں منتقل کیا گیا تھا ، اور پھر تیار کردہ انڈکشن حل کو مداخلت کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔

 

1.2.5 وٹرو سیل ماڈل ٹی جی کا پتہ لگانے اور آئل ریڈ اے داغدار میں ایکٹ مداخلت NAFLD

 

1.2.5.1 ٹی جی کا پتہ لگانا

خالی کنٹرول گروپ ، ماڈل گروپ اور ایکٹ مداخلت گروپ کے مطابق ، لوگرتھمک نمو کے مرحلے میں ہیپ جی 2 خلیوں کو ثقافت کے لئے 3.5 سینٹی میٹر سیل کلچر ڈش میں منتقل کیا گیا تھا۔ ماڈل گروپ کو 100 μmol/L PA انڈکشن حل کے ساتھ آمادہ کیا گیا تھا ، اور ایکٹ مداخلت گروپ کو 100 μmol/L PA انڈکشن حل کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی تھی اور اسی وقت 50 olmol/L ایکٹ شامل کیا گیا تھا۔ مداخلت کا وقت 24 گھنٹے تھا۔ پرانے ثقافت کے درمیانے درجے کو آہستہ سے ہٹا دیں ، ایک بار پری ٹھنڈا پی بی ایس کے ساتھ آہستہ آہستہ سیل کی سطح کو دھوئے ، پہلے سے ٹھنڈا ریپا لیسس حل کی 100 μl/ڈش شامل کریں ، 15 منٹ کے لئے برف پر مکمل طور پر لیز ، 4 ڈگری پر سنٹرفیوج اور 10 منٹ کے لئے 12 000 r/کم سے کم ، 10 منٹ کے لئے 10 μl لیں ، ٹی جی کی سطح کا پتہ لگائیں ، 10 μL لیں ، انزیمیٹک پتہ لگانے کے لئے 10 μl لیں ، 10 μl لیں ، 10 μL کو تلاش کریں ، 10 μl لیں ، 10 μL کو 10 μl لیں تاکہ 10 μl کو حاصل کریں ، 10 μl کو 10 μl لیں تاکہ 10 μl لیں ، 10 μL کو 10 μl لیں تاکہ 10 μl لیں ، 10 μl کو 10 μl لیں۔ ٹی جی کٹ ہدایات پر ، اور آخر میں ٹی جی سطح کو فی ملی گرام پروٹین کو درست کریں۔

1.2.5.2 آئل ریڈ اے داغ

لوگرتھمک نمو کے مرحلے میں ہیپ جی 2 خلیوں کو 3.5 سینٹی میٹر کلچر ڈش میں منتقل کیا گیا تھا جس میں راتوں رات کی ثقافت کے لئے جراثیم سے پاک کورلپ کے ساتھ احاطہ کیا گیا تھا۔ 100 μmol/L PA خلیوں کو لپڈ بوندوں کی تشکیل کے لئے آمادہ کرتا ہے۔ ایک ہی وقت میں ، 24 گھنٹے کے لئے مداخلت کے لئے 50 μmol/L ایکٹ شامل کیا گیا تھا۔
سیل سلائیڈز کو جمع کیا گیا ، 3 بار پہلے سے ٹھنڈا پی بی ایس کے ساتھ دھویا گیا ، کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لئے 4 for فارملڈہائڈ کے ساتھ طے کیا گیا ، پی بی ایس کے ساتھ سیل کی سطح کو دھویا ، 15 منٹ کے لئے اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر داغدار تیل کے سرخ رنگ کے کام کے حل کو ، ڈبل ڈبل او کے داغے ہوئے حل کے ساتھ دھویا گیا ، جس سے زیادہ داغدار حل کو دھویا جاتا ہے۔ آست پانی ، اور مہر بند ، اور ایک خوردبین کے نیچے فوٹو گرافی کی۔

 

1.2.6 ایکٹ ٹریٹمنٹ کے بعد آٹوفاگوسومس اور لپڈ بوندوں کا امیونو فلوروسینس مشاہدہ

لوگرتھمک نمو کے مرحلے میں ہیپ جی 2 خلیوں کو 3.5 سینٹی میٹر کلچر ڈش میں منتقل کیا گیا تھا جس میں راتوں رات کی ثقافت کے لئے جراثیم سے پاک کورلپ کے ساتھ احاطہ کیا گیا تھا۔ خلیوں میں لیپڈ بوندوں کی تشکیل کو دلانے کے لئے 1 0 0 μmol/L PA استعمال کیا گیا تھا۔ ایک ہی وقت میں ، 24 گھنٹے کے لئے مداخلت کے علاج کے لئے ایکٹ شامل کیا گیا تھا۔ سیل سلائڈز کو جمع کیا گیا ، 3 بار پہلے سے ٹھنڈا پی بی ایس کے ساتھ دھویا گیا ، کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لئے 4 formal 4 for فارملڈہائڈ کے ساتھ طے کیا گیا ، کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لئے کمرے کے درجہ حرارت پر ایک پیرمیبلائزیشن بفر ، جس میں 0.1 sp ساپونن پر مشتمل ہے ، کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ کے لئے مخصوص ہے {1 H کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 1 H ​​کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 1 H ​​کے درجہ حرارت پر لگایا جاتا ہے L LC کے ساتھ LC کے درجہ حرارت پر لگایا جاتا ہے L LC کے ساتھ 1 H کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر لگایا جاتا ہے۔ پی بی ایس ، اور ایک مخصوص فلورسنٹ لیبل لگا ہوا ثانوی اینٹی باڈی کے ساتھ شامل کیا گیا ، جو کمرے کے درجہ حرارت پر اور 1 گھنٹہ کے لئے روشنی سے دور ہوتا ہے۔ اینٹی باڈی انکیوبیشن کے بعد ، سلائڈز کو پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھویا گیا ، جس میں لیپڈ بوند بوند سے متعلق مخصوص تحقیقات باڈیپی 493/503 کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لئے ، پی بی ایس کے ساتھ دھویا گیا ، اور اینٹی فیڈنگ سگ ماہی میڈیم کے ساتھ مہر لگا دی گئی ، اندھیرے میں ہوا سے بھری ہوئی ، لیزر کنفوکل مائکروسکوپ کے ساتھ مشاہدہ کیا گیا۔ خالی کنٹرول گروپ ، ریپامائسن ٹریٹمنٹ گروپ اور ایکٹ مداخلت گروپ مرتب کیا گیا تھا۔

 

1.3 شماریاتی تجزیہ

SPSS25. 0 اعداد و شمار کے تجزیہ کے لئے شماریاتی سافٹ ویئر استعمال کیا گیا تھا۔ مقداری اعداد و شمار کو x ± s کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ تغیر اور LSD-T ٹیسٹ کا یکطرفہ تجزیہ استعمال کیا گیا تھا۔ پی<0.05 was considered statistically significant.